MICROSCOPIO, TÉCNICAS PARA HACER PREPARACIONES MICROSCOPICAS
Integrantes: CLARA ANGULO DAZA DAYANA BURGOS FLOREZ JULIO CORDERO DANIEL PEREZ ISAZA
Profesor: (Biólogo) LUIS ALFONSO CAUSIL VARGAS
UNIVERSIDAD DE CORDOBA FACULTAD DE MVZ PROGRAMA MVZ ASIGNATURA BIOLOGIA CELULAR – LABORATORIO GRUPO
INTRODUCCIÓN
La biología es una ciencia netamente experimental, la que ha avanzado gracias a la implementación tecnológica, el éxito de su estudio depende de varios factores tales como la observación, el empleo de instrumentos y técnicas especiales; para lo cual es necesario apoyar las explicaciones teóricas con prácticas de laboratorio; en donde cada persona puede realizar sus propias observaciones e investigaciones y de esta forma llegar a sacar conclusiones. Debido a que los seres vivos presentan una gran variedad de tamaños, formas, estructuras y funciones, etc. Con relación al tamaño éste varía y el ojo humano logra identificar elementos de hasta 200 micras, por lo que se hace necesario recurrir a estos instrumentos ópticos los cuales faciliten la observación de objetos de menor tamaño. Todas estas dificultades se han podido resolver parcialmente permitiendo, aunque en casos limitados, la observación de especímenes vivientes mediante el microscopio electrónico. Al principio, el microscopio surgió como una lente que agranda la imagen (lupa), lo que dio origen al microscopio óptico compuesto, que consta de un juego de lentes (parte óptica), sostenida por estructuras metálicas (parte mecánica). Por su extraordinario poder de resolución, el microscopio electrónico es un instrumento ideal para el estudio de la estructura submicroscópica de la célula. Sin embargo, su uso está reducido por una serie de dificultades técnicas y de limitaciones. Una de ellas se debe al escaso poder de penetración que tienen los electrones. Si el espesor del material excede de 5000 A (0.5 u), la opacidad es casi total. El objeto debe depositarse sobre una película extremadamente fina (de 75 a 150 A de espesor) de celodión, carbón, etc., que actúa como material de sostén y que a su vez está apoyada sobre una fina grilla de metal. Otra limitación proviene del hecho de que el espécimen debo deshidratarse para ser colocado en el vacío. Ello hace casi imposible el estudio de células vivas. Para observar los objetos a través del microscopio óptico compuesto, es necesario colocarlos sobre una laminilla de vidrio (Porta objetos) y generalmente se le coloca otra laminilla de vidrio más delgada (Cubre objetos); en esta forma se obtiene la preparación microscópica; la que puede durar poco tiempo (preparación temporal), o puede ser guardada (preparación permanente), lo que nos da la clasificación de preparaciones de acuerdo a su duración. Las técnicas de preparación microscópica de los especímenes varían considerablemente. En biología existen dos clases principales de preparación: suspensiones de pequeñas partículas y objetos gruesos. Al estudiar suspensiones de partículas, como virus y macromoléculas, una de las dificultades es la tendencia que tienen las partículas en amontonarse entre sí durante la desecación sobre la película de sostén. Pueden obtenerse pequeñas gotas por medio de cierto tipo de atomizador.
OBJETIVOS
Conocer el microscopio óptico y aprender la función de cada una de sus piezas.
Conocer los conceptos elementales del microscopio y de sus partes fundamentales.
Identificar las partes ópticas y mecánicas del microscopio.
Reconocer el uso adecuado de cada una de las partes del microscopio óptico compuesto.
Adquirir entrenamiento en el uso y cuidado del microscopio y algunas técnicas relacionadas.
Realizar preparaciones microscópicas temporales.
Elaborar adecuadamente sus reportes de laboratorio.
MATERIALES
Microscopio óptico compuesto Cinta de enmascarar Porta Objetos y Cubre Objetos Corcho Flores con polen Hoja de lirio Cuchilla de afeitar nueva Pipeta pasteur Frascos gotero con agua destilada
MARCO TEORICO PREPARACION DEL MATERIAL BIOLOGICO PARA MICROSCOPIA ELECTRONICA: Por su extraordinario poder de resolución, el microscopio electrónico es un instrumento ideal para el estudio de la estructura submicroscópica de la célula. Sin embargo, su uso está reducido por una serie de dificultades técnicas y de limitaciones. Una de ellas se debe al escaso poder de penetración que tienen los electrones. Si el espesor del material excede de 5000 A (0.5 u), la opacidad es casi total. El objeto debe depositarse sobre una película extremadamente fina (de 75 a 150 A de espesor) de celodión, carbón, etc., que actúa como material de sostén y que a su vez está apoyada sobre una fina grilla de metal. Otra limitación proviene del hecho de que el espécimen debo deshidratarse para ser colocado en el vacío. Ello hace casi imposible el estudio de células vivas. Todas estas dificultades se han podido resolver parcialmente permitiendo, aunque en casos limitados, la observación de especímenes vivientes mediante el microscopio electrónico. Las técnicas de preparación de los especímenes varían considerablemente. En biología existen dos clases principales de preparación: suspensiones de pequeñas partículas y objetos gruesos. Al estudiar suspensiones de partículas, como virus y macromoléculas, una de las dificultades es la tendencia que tienen las partículas a amontonarse entre sí durante la desecación sobre la película de sostén. Pueden obtenerse pequeñas gotas por medio de cierto tipo de atomizador También pueden producirse gotas submicroscópica transformando la suspensión en un aerosol (coloide de líquido en aire) y luego depositando las partículas cargadas por medio electrostáticos sobre las grillas. Un método importante para el estudio de macromoléculas es la denominada técnica de monocapas de Kleinschmidt, en la cual las macromoléculas se extienden sobre una~interfase aire-agua antes de ser recogidas sobre una película. Este procedimiento ha dado excelentes resultados en la demostración de moléculas de ADN y ARN de distintos orígenes y tipos. Los especímenes gruesos son susceptibles de ser desintegrados por medios mecánicos, como la homogeneización, ondas sonoras, o supersónicas, etc. El material es dividido por estos medios a lo largo de sus planos de clivaje en fragmentos, suficientemente finos como para que sean en parte transparente a los haces de electrones.
Ultramicrotomia: El estudio de células y tejidos se logra también con el uso de cortes fino. La técnica es esencialmente similar a la que se emplea en preparaciones para el microscopio óptico, pero sus requisitos son mucho más críticos. Para cortar el tejido, ésta debe previamente fijarse o incluirse. La necesidad de realizar cortes ultrafinos ha conducido al uso de medios de inclusión de considerable dureza. Los más usados son los monómeros acrílicos o las resinas de epoxi, que impregnan los tejidos y luego se polimerizan por medio de catalizadores apropiados. Un medio hidrosoluble de glico-metácrilato ha sido
desarrollado para estudios citoquimicos, permitiendo la extracción selectiva de sustancias y la acción de diferentes enzimas. En los últimos años se han perfeccionado considerablemente los métodos de corte, construyendo diversos micrótomos que tienen un avance técnico o mecánico. Con ambos tipos, los cortes más finos que pueden realizarse están en el orden de los 200 A. Los factores que influyen aparentemente en la limitación son la inclusión apropiada y el filo de la cuchilla, En la actualidad se emplean generalmente las cuchillas de vidrio o diamante. Es posible asimismo realizar cortes ultrafinos a baja temperatura en material incluido simplemente en gelatina. Guía de Laboratorio de biología
Métodos para intensificar el contraste: Ciertos materiales biológicos como finas membranas, filamentos o macromoléculas (de 100 A o menos de diámetro), tienen un poder muy pequeño de dispersión electrónica debido a que son uniformemente delgados y están compuesto por átomos livianos. Se han utilizado métodos que tienden a corregir esta dificultad aumentando el contraste y demostrando detalles más finos de la superficie de los objetos. Una técnica de éstas, denominada de sombreado, consiste en colocar el espécimen dentro de una cámara de vacío y en evaporar metales pesados como cromo, paladio, platino o uranio, depositándola en un ángulo determinado, a partir de un filamento incandescente. De esta manera, el material se deposita sobre un lado de la superficie de las partículas del espécimen, mientras que del otro lado se produce una sombra cuya longitud permite calcular el espesor de dichas partículas. Las fotomicrografías de esos especímenes presentan un aspecto tridimensional que normalmente no se produce. Una de las técnicas más recientes e importantes en el estudio de los virus y macromoléculas es el de la "coloración negativa", en el cual el espécimen es embebido en una gota de material denso como el fosfotungstato. Este penetra en todos los espacios vacíos existentes entre las macromoléculas, que aparecen muy bien limitados en contraste negativo. Con dicha técnica se determinó el número de moléculas proteicas (capsómeras) de diferentes virus y se realizaron observaciones interesantes en algunas estructuras celulares.
PROCEDIMIENTO 1. MICROSCOPIO PARTES Y FUNCIONES Partes ópticas y mecánicas del microscopio
Partes Ópticas: OBJETIVOS: Son los elementos más importantes del microscopio. Están formados por la reunión de varias lentes para corregir las aberraciones. Deben tratarse con mucho cuidado, pues cualquier golpe puede variar la posición de las lentes y averiarlas. Se atornillan a la parte inferior del tubo o al revolver portaobjetivos. La lente inferior del objetivo denominase lente frontal. De ella depende principalmente la mayor o menor ampliación. Es siempre plano-convexa, de foco muy corto y de diámetro tanto menor cuanto mayor sea el aumento. Detrás de esta lente hay otras, que son las que corrigen las aberraciones cromáticas y esféricas. Son los que se emplean más OBJETIVOS EN SECO: corrientemente. Entre la lente frontal y el cubreobjetos solo hay aire. A este grupo pertenecen los objetivos de menores aumentos. Las lentes frontales tienen de 3 a 10 milímetros de diámetro. Poseen gran profundidad de foco, lo cual permite observar diferentes planos paralelos del objeto. OBJETIVOS DE INMERSION: Se llama así a aquellos en los cuales, para la observación, deben interponerse entre la lente frontal y la preparación un líquido que, por su índice de refracción apropiado, permita una mayor luminosidad. Este líquido puede ser agua, aceite, monobromuro de naftaleno, etc. Son, estos objetivos, de gran aumento y de gran poder definidor. Se emplean en Bacteriología y Parasitología. Requieren gran luminosidad y empleo de condensador. OBJETIVOS APOCROMATICOS: Todos los objetivos, secos o de inmersión, están acromatizados solo para dos rayos del espectro, el rojo y el azul. Son los llamados cromáticos, pero si conseguimos corregir este defecto para tres rayos, se elimina casi completamente el llamado espectro secundario, y tenemos los objetivos apocromáticos. OCULARES: Los forman dos lentes separadas por un diafragma, y van montados en la extremidad superior del tubo. La lente superior se llama lente ocular; la inferior, lente de campo. Hay dos tipos de oculares; los positivos o de Ramsden, que tienen dos lentes plano-convexas, y cuyas convexidades se oponen una a la otra y los negativos, o de Huyghens, que se llaman también de compensación, por tener compensadas las desigualdades del espectro y en los que las curvaturas de las lentes se dirigen al objeto. Tanto el microscopio simple como el compuesto pueden
ser binoculares; estos dan mejor calidad a la imagen y más cómoda visión. El tubo se bifurca, con los correspondientes prismas de reflexión total, y termina en dos oculares iguales. DIAGFRAGMA Y CONDENSADORES: El diafragma va montado bajo la platina. Es de sistema iris, y permite, por medio de una palanca, obtener a voluntad conos luminosos de distinto tamaño y, mediante condensadores, conos luminosos muy grandes. Los condensadores constan de un sistema de lentes de gran abertura sujetos a una montura y colocados entre la platina y el espejo, pueden subirse y bajarse a voluntad y tienen un diafragma unido al conjunto.
Partes Mecánicas: EL PIE: Es una pieza maciza y pesada, para asegurar la estabilidad del aparato y servir de soporte a sus demás partes. Suele estar provista de charnela, que permite la inclinación de la parte superior. LA PLATINA: Es una pieza metálica, redonda o cuadrada, donde se colocan las preparaciones; tiene en el centro una abertura circular por la que pasarán los rayos luminosos procedentes del sistema de iluminación. El pie se prolonga por encima de la platina, en arco más o menos curvo. La parte superior de este arco es la que sostiene el tubo y su mecanismo de traslación vertical. Esta tiene suma importancia, pues permite enfocar el objetivo mediante dos movimientos uno rápido, gracias a una cremallera, y otro lento, con un tornillo micrométrico. CARRO: En los microscopios corrientes la platina puede ser fija o estar endosada a un carro con dos tornillos y cremallera que permitan dos movimientos de translación, para centrarla, y también, si los tornillos están graduados, para medir sus desplazamientos. UÑAS O GANCHOS: La preparación se sujeta, en las platinas fijas, con dos palanquitas móviles, y en las platinas de carro, por un reborde, en forma de escuadra y pestillo, que le impide cualquier movimiento imprevisto. EL TUBO: En él está instalado el sistema óptico. Está constituido por dos tubos o cuerpos. Uno de ellos, externo, en el que se encuentran la cremallera y el ocular, y otro, interno, yuxtapuesto al anterior, donde está el objetivo. En la parte superior hay una división milimétrica que permite modificar la distancia entre objetivo y ocular. Facilitan la visión con los dos ojos, y los revólveres portaobjetivos, con los cuales se pueden cambiar los objetivos instantáneamente, sin desenfocar la preparación. TORNILLOS MACROMETRICO Y MICROMETRICOS: Son tornillos que permite el movimiento o desplazamiento del preparado, el macrométrico permite desplazamientos grandes y el micrometrico desplazamiento fino que ayudan a darle nitidez a la imagen. 2. ENFOQUE DEL MICROSCOPIO
1. Baje completamente la platina del microscopio. 2. Haciendo uso del mecanismo del revólver, coloque frente a la preparación el objetivo de menor aumento (4X). 3. Coloque la preparación microscópica sobre la platina sujetándola con las pinzas del carro y centre la preparación haciendo uso de los tornillos del carro. 4. Regule la luz mediante el uso del mecanismo del diafragma. 5. Haciendo uso del tornillo macrométrico suba al máximo la preparación hasta que encuentre tope sin observar por los oculares. 6. Observando a través del ocular, accione el tornillo macrométrico hasta que visualice la imagen en el campo microscópico. 7. Una vez enfocada la imagen, afine el enfoque microscópico, haciendo uso del tornillo micrométrico. 8. Si desea mayor detalle, cambie de aumento rotando el mecanismo del revolver a un objetivo que le proporcione el aumento deseado, corrigiendo el enfoque de imagen moviendo el tornillo micrométrico, y graduando la intensidad de luz con el diafragma. 9. Después de haber realizado la observación, se limpian las lentes con papel limpia lentes, se coloca el objetivo de menor aumento en posición de enfoque, se baja la platina, se desconecta y se guarda. PARA OBSERVAR EN UN MICROSCOPIO CORRECTAMENTE: se debe poner la mano derecha en los tornillos que mueven la platina y la mano izquierda en los tornillos macro y/o micrométricos se deben graduar los oculares a nuestros ojos si el microscopio es binocular, si es monocular la observación se debe hacer con los dos ojos abiertos. 3. PREPARACIONES MICROSCOPICAS TEMPORALES A) Preparación de corcho: Haga varios cortes delgados de corcho utilizando la hoja de afeitar nueva y escoja el más fino. En un porta objetos coloque una gota de agua destilada y coloque en él el pedazo de corcho seleccionado, y colóquele un cubre objetos, procurando que no lo quede burbujas de aire. Proceda a su observación microscópica. Haga su esquema correspondiente utilizando los objetivos DE 4x, 10x y 40x. Haga una breve descripción de lo observado.
4x
10x
40x
Descripción: Se pueden apreciar claramente las células muertas del corcho, solo contienen pared celular y están rellenas de aire, de tal manera que no contienen núcleo ni mucho menos citoplasma; Con el objetivo de 4x, se podría decir que las células son iguales aunque cambian un poco su forma, pero de manera que nos acercamos a ellas se puede observar con el objetivo de inmersión poco a poco la diferencia. Se podían observar las células del corcho encimadas, (formando una mancha negra), indicando que las células se encontraban amontonadas, formando esta mancha con la “pared celular”. Es por eso que el corte del corcho debió ser
muy delgado, para poder observar las células poliédricas que contiene el corcho, las cuales eran parecidas a un panal de abejas. B) Observación de granos de polen: Coloque granos de polen del estigma de una flor en un portaobjetos, con ayuda de un gotero ponga una gota de agua y observe al microscopio. Es necesario colocar el cubreobjetos. Esquematice sus observaciones utilizando los objetivos de 4x, 10x y 40x Describa las imágenes de estas con los diferentes aumentos.
4x
10x
40x
Descripción: se lograba apreciar en estas células una compleja arquitectura interna, notablemente presentaban separaciones del medio circundante por medio de una membrana celular, se encontraban juntas las unas con las otras dándole esto un aspecto de unas celdas. RESULTADOS
Preparación de corcho: se enfocó y observo con objetivos de 4x 10x 40x Observación de granos de polen: se enfocó y observo con objetivos de 4x 10x 40x -
Con el objetivo de 4X observamos el cuerpo a gran escala Al incrementar nuestro objetivo a 10X , logramos observar una mayor cobertura en el campo visual Luego aumentasmos nuevamente la intencidad de nuestro lente objetivo a 40X e inmediatamente pudimos observar la muestra, pero esta vez a una mayor escala, es decir a un mayor tamaño.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS En las células observadas anteriormente en la práctica de laboratorio, pudimos ver que aunque las dos células eran vegetales, la diferencia en el contenido de ella es muy notoria, ya que las células muertas del corcho, solo contienen pared celular y están rellenas de aire, de tal manera que no contienen núcleo ni mucho menos citoplasma como las células de la epidermis de la cebolla. Con el objetivo de 4x, podría decir que las células son iguales aunque cambia un poco su forma, pero de manera que nos acercamos a ellas hasta poder observarlas con el objetivo de inmersión, poco a poco se va notando la diferencia. Las técnicas de preparación de los especímenes realizadas durante el laboratorio variaron considerablemente. Existen dos clases principales de preparación: suspensiones de pequeñas partículas y objetos gruesos. Al estudiar suspensiones de partículas, como cortes delgados de corcho y granos de polen del estigma de una flor una de las dificultades que se presento fue la tendencia que tienen las partículas a amontonarse entre sí durante la desecación sobre la laminilla, para el caso del corcho, esto posiblemente originado debido a que las células se encontraban yuxtapuestas las unas con las otras, originando así una poca visibilidad en el campo visual. A diferencia de los granos de polen los cuales se encontraban juntos, pero con la diferencia de que se lograba ver la presencia de organelas celulares
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1. ¿Por qué es importante utilizar microscopio en el estudio de la biología? 2. ¿Qué diferencia encuentra entre las imágenes observadas al microscopio y observadas a simple vista? 3. ¿las imágenes observadas al microscopio son reales o virtuales? Explique 4. ¿llene los espacios en blanco en la imagen del microscopio (Fig. 1) 5. ¿elabore una conclusión a cerca de su trabajo en el trabajo en el laboratorio realizado 1. R/ Los hombres han intentado siempre hacer evidentes de una manera o de otra los fenómenos que estudian, sea por medio de diagramas, gráficos o escritos. El microscopio óptico había permitido ver los microorganismos y probar definitivamente su existencia. El microscopio revela no sólo que las plantas y animales están constituidos por células o por productos celulares si no que existe todo un mundo de pequeñas plantas y animales invisibles a simple vista. El microscopio electrónico permitiría poner en manifiesto la organización celular interna de los organismos, y más recientemente observar la organización molecular de los procesos vivos; El microscopio electrónico es el único instrumento que permite conocer directamente la ultraestructura biológica y submicroscópica de la célula, puesto que posee un poder de resolución mucho mayor que el del microscopio óptico y En el estudio de la biología ha sido de vital importancia debido a que con la ayuda de este se han descubierto infinidades de sucesos que han contribuido en la evolución del hombre como por ejemplo, el descubrimiento de enfermedades que serían imposible de detectar sin la ayuda de este instrumento; también nos ha facilitado el estudio de microorganismo átomos y otras entes las cuales no se encuentran al alcance de la vista humana, debido a que el tamaño de las células se encuentra por debajo del límite de resolución LR (LR es la mínima distancia a la que deben estar dos puntos para verlos de manera separada.) del ojo humano. El microscopio ha sido una de las herramientas más esenciales para el estudio de las ciencias de la vida. Dividió la intuición y la trascendencia humana hacia una nueva dimensión. 2. R/ la principal diferencia se halla en el tan alto aumento que la imagen logra obtener en el microscopio óptico el cual se debe principalmente por los objetivos, dejando como gran diferencia y muy claramente la poca apreciación que se logra obtener de las imágenes observadas a simple vista 3. R/ Dos lentes convexas bastan para construir un microscopio. Cada lente hace converger los rayos luminosos que la atraviesan. Una de ellas, llamada objetivo, se sitúa cerca del objeto que se quiere estudiar. El objetivo forma una imagen real aumentada e invertida. Se dice que la imagen es real porque los rayos luminosos pasan realmente por el lugar de la imagen.
4. R/ EL MICROSCOPIO (Fig. 1)
5. R/ Para concluir devemos recalcar que el microscopio es sin duda el elemento más importante en cualquier laboratorio. Nos permite, por ejemplo, ver células, microorganismos y bacterias, lo cual es imposible de observar a simple vista. La célula es una unidad básica y funcional la cual representa una gran complejidad, mucho más de lo que muchos pensamos, y su estudio así como su comprensión es más importante de lo que creemos. No todas las células tienen la misma forma, en unas es más difícil su estudio que en otras. Por lo tanto para apreciar y ver cómo están constituidas, es requerible de la utilización del microscopio, debido a que el ojo humano por sí solo no puede captar las dimensiones proporcionadas por estos individuos microscópicos, es por ello que se le atribuye al microscopio por la gran labor que desempeñada desde su creación hasta nuestros días y por todos los avances que por medio de este se lograron obtener. En esta práctica adquirida asimilamos como es la correcta utilización de un microscopio, así como las partes que tiene dicho instrumento y para que sirven, igualmente, lo valioso que son estos, su finalidad y la contribución que le brinda a la ciencia. De la misma manera aprendimos en qué tipo de observaciones o experimentos es necesario y/o requerible este instrumento, ya que sin este no se lograrían realizar múltiples investigaciones.
BIBLIOGRAFIA
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