Nasledne genetičke bolesti • Nasledne genetičke bolesti uzrokovane su mutacijama u genima koje se prenose sa jedne generacije na sledeću • Monogenska oboljenja su nasledne bolesti koje su prouzrokovane mutiranom formom samo jednog gena
• Poligenska oboljenja su determinisana kombinovanim delovanjem više genetičkih lokusa i uzrokovana su mutacijama u više različitih gena (od nekoliko do velikog broja gena)
Genetička heterogenost • Klinički definisani sindromi se ne uklapaju uvek u pojednostavljenu šemu: jedan gen-jedan sindrom • Postoji kompleksnost odnosa promena u odgovarajućim genima i sindroma koji su specifični za određena tkiva Mutacije na različitim lokusima mogu prouzrokovati istu kliničku sliku Različite mutacije na istom lokusu mogu dati različitu kliničku sliku Postoje variranja u kliničkoj slici čak i kod članova iste familije koji poseduju zajedničku mutaciju tako da ista mutacija ne mora uvek izazvati isti fenotip • Geni modifikatori (“modifier genes”) su geni čija ekspresija može uticati na fenotip koji je posledica mutacije na drugom lokusu
Metode za identifikaciju mutacija Molekularno-dijagnostičke metode obuhvataju: Indirektno testiranje (»gene tracking«) koje podrazumeva analizu vezanih markera kojima se testira da li je pacijent nasledio od roditelja hromozom koji nosi mutaciju. Ova metoda se primenjuje kada gen nije kloniran i okarakterisan i koristi se praćenje nasleđivanja mutiranog gena Direktno testiranja koje podrazumeva testiranje DNK pacijenta na prisustvo mutacije. Ovakvo testiranje se primenjuje kada su poznate mutacije u genu uzročniku pojave bolesti
Metode za detekciju mutacija zasnovane na PCR-u • Reakcija lančanog umnožavanja DNK (PCR) je metoda kojom se selektivno umnožavaju segmenti DNK • Metode za detekciju mutacija uključuju: Analizu amplifikata elektroforezom Analizu amplifikata elektroforezom nakon digestije restrikcionim enzimom (PCR-RFLP) Analizu konformacionog polimorfizma jednolančane DNK (SSCP) Elektroforezu na denaturišućem gradijentnom gelu (DGGE) Hemijsko sečenje na mestima stvaranja heterodupleksa Gubitak heterozigotnosti Test prekinutog proteina Sekvenciranje DNK
Detektovanje delecija korišćenjem PCR analize Gen za distrofin 1
2
3
4
5
6
7
broj egzona 48 51 43
45 50 53 47 60 52
prajmeri
Istovremena PCR analize 9 od ukupno 78 egzona gena za distrofin. 1-6: DNK iz 6 pacijenata sa Duchenne/Becker muskularnom distrofijom koji poseduju različite delecije u okviru gena za distrofin. 7: DNK zdrave osobe
Deletions in the dystrophin gene
PCR-RFLP ANALIZA Restriction Fragment Length Polymorphism normalni
mutirani
CTGGAG
CTGCAG
PCR 385 bp
385 bp Digestija restrikcionim enzimom Pst I
385 bp
121 bp 264 bp m/m
n/m
m/m m/m
n/n
Analiza konformacionog polimorfizma jednolančane DNK (SSCP) wt
m denaturacija
wt
m
-
+
n/m n/n n/n n/m n/n n/m n/n n/n
Detektovanje mutacija primenom elektroforeze na denaturišućem gradijentnom gelu (DGGE) wt
m +
denaturacija
hetero i homo dupleksi topljenje
wt
wt + m -
rastuće koncentracije denaturišućeg agensa +
Hemijsko sečenje na mestima stvaranja heterodupleksa
LOH (Loss of Heterozygosity) GUBITAK HETEROZIGOTNOSTI • Gubitak alela na jednom hromozomu koji se detektuje analizom markera koji je normalno prisutan u heterozigotnoj formi
Reads in frame
Test prekinutog proteina Protein truncation test (PTT)
Direktno sekvenciranje PCR produkta • Sekvenvenciranje DNK podrazumeva ”čitanje” redosleda nukleotida datog fragmenta DNK • PCR-om se mogu generisati dovoljne količine DNK za sekvenciranje • Sekvenciranje je metoda za direktnu detekciju mutacija kojom je moguće otkriti sve vrste mutacija u genima
T C
Metode za detekciju mutacija zasnovane na molekularnoj hibridizaciji • Molekularna hibridizacija je metoda za detektovanje hukleinskih kiselina koji su po nukleotidnom redosledu srodni obeleženoj probi • Metode za detekciju mutacija uključuju: “Southern” hibridizacija “Northern” hibridizacija FISH
Komparativna genomska hibridizacija
FISH (Fluorescentna in situ Hibridizacija)
• Visoko senzitivna metoda koja omogućava vizuelnu identifikaciju hromozoma ili delova hromozoma na mikroskopskim preparatima
Osnovni princip FISHa
FISH protokol • Priprema hromozomskih preparata na mikroskopskim pločicama - kultivisanje ćelija - razbijanje ćelija u hipotoničnom rastvoru - fiksiranje hromozoma na pločicama • Obeležavanje probe fluorohromom • Hibridizacija • Imunološka detekcija signala • Detektovanje fluorescentnih signala na mikroskopu
Izvor materijala • Limfociti periferne krvi • Plodova voda
• Biopsije tkiva
Primena FISH-a u fundamentalnim istraživanjima 1. MAPIRANJE GENA - Fizičko mapiranje niske i visoke rezolucija 2. EKSPRESIJA GENA -Praćenje ekspresije gena in situ hibridizacijom korišćenjem RNK proba 3. BIOLOGIJA RAZVIĆA -Praćenje promene ekspresije gena tokom razvića
Primena FISH-a u kliničkim istraživanjima 1. Klinička citogenetika - Detektovanje strukturnih i numeričkih hromozomskih aberacija - Identifikovanje marker hromozoma 2. Prenatalna dijagnostika 3. Dijagnoza kancera 4. Odredjivanje statusa nosioca oboljenja 5. Dijagnoza infektivnih bolesti - Detektovanje virusnih DNA ili RNA u ćelijama i tkivima (papiloma virus, CMV, EBV, koksaki, parvovirus, HIV)
Prednosti FISH-a Preciznost Brzina Pouzdanost Mogućnost analize genetičkog materijala u svim fazama ćelijskog ciklusa
Izvor materijala za FISH analize
Hromozomi u metafazi
Interfazna jedra
Bukalna sluzokoža
Histološki preparati
Primena FISH-a FISH se primenjuje kao dodatna metoda rutinskoj citogenetskoj analizi za postizanje visoke senzitivnosti i specifičnosti • U cilju potvrde citogenetskog nalaza • U identifikaciji marker hromozoma • U detekciji mozaičnih kariotipova • U identifikaciji mikrostrukturnih rearanžmana
Primena FISH-a u detekciji mozaičnih kariotipova
• Limfociti periferne krvi • Proba za centromerni region X hromozoma • Kariotip: 46,XX / 47,XXX
FISH i prenatalna dijagnostika •
U razvijenim zemljama smrtnost dece usled naslednih bolesti je 10 puta veća nego smrtnost od drugih bolesti • 95% svih promena u broju hromozoma koje dovode do radjanja dece sa genetički uslovljenim defektima su povezane sa hromozomima 21, 13, 18, X i Y
• Razvijene metode za prenatalnu detekciju hromozomskih aberacija: • Analiza horionskih čupica • Amniocenteza • Kordocenteza
Prenatalno testiranje
•
Analiza horionskih čupica (CVS) (izvodi se između 8 i 10 nedelje)
• Amniocenteza (izvodi se između 14 i 16 nedelje)
• Kordocenteza (izvodi se između nakon 20. nedelje)
AneuVysion test Panel 1:set proba koje detektuje centromerne regione hromozoma 18 (CEP 18), hromozoma X (CEP X) i hromozoma Y (CEP Y)
Panel 2: set proba koje detektuju jedinstvene sekvence na hromozomu 13 (LSI 13 - 13q14) i hromozomu 21 ( LSI 21 21q22.13)
Mikrodelecioni sindromi • Genetički sindromi koji su povezani sa malim hromozomskim delecijama koje obuhvataju jedan ili više gena
DETEKCIJA MIKRODELECIONIH SINDROMA - Mikrodelecije ne mogu da se detektuju standardnim citogenetičkim metodama i zahtevaju metode molekularne citogenetike za vizualizaciju - Metoda koja se primenjuje za detekciju – fluorescentna in situ hibridizacija (FISH) hibridizacija fluorohromom obeleženih specifičnih DNK proba i hromozomskih preparata
22q11.2 delecioni sindromi - DiGeorge sindrom (DGS) - Velokardiofacijalni sindrom (Shprintzen sindrom) - Conotruncal Anomaly Face sindrom (CTAF, Takao sindrom) - Caylor Cardiofacial sindrom - Autosomal Dominant Opitz G/BBB sindrom
Komercijalno dostupne probe za detekciju 22q11.2 delecije
TUPLE 1
46,XY del22q11.2
• TUPLE 1- 22q11.2 • ARSA control-22q13.3
ARSA
TUPLE 1
46,XY
Genomski imprinting • Genomski imprinting je reverzibilna forma inaktivacije gena koja dovodi do ekspresije samo jedne kopije gena, zavisno od toga od kojeg roditelja je ta kopija nasleđena. • Inaktivacija se dešava procesom metilacije i kopija gena koja će biti inaktivirana je okružena metil grupama. To se dešava pre procesa fertilizacije u jajnoj ćeliji ili spermatozoidu. • Samo 9 hromozoma poseduju regione ili gene koji će biti podvrgnuti procesu imprintinga
Prader-Willi Sindrom • Za neka genetički uslovljena oboljenja fenotip zavisi od toga da li je mutacija u genu koji će biti imprintovan, odnosno od toga da li je imprintovana kopija nasleđena od oca ili majke. • Klasični primeri oboljenja u kome imprinting igra važnu ulogu su PraderWilli (PWS) i Angelman syndromi (AS). • Oba sindroma su uslovljena delecijom ili nekom drugom mutacijom istog regiona na hromozomu 15. Deo tog regiona je inaktiviran na hromozomu nasleđenom od majke (PWS region) ili od oca (AS region) • Na primer, ako dete nasledi deleciju regiona na hromozomu 15 poreklom od oca, dete neće imati eksprimirane gene iz PWS regiona (majčina kopija je inaktivirana). Rezultat je pojava PWS sindroma kod deteta. • S druge strane, ako hromozom 15 poreklom od majke poseduje deleciju, ni jedan hromozom 15 neće eksprimirati gene iz AS regiona (očev hromozom inaktiviran) i dete će imati Angelmanov sindrom.
Dijagnostika Prader-Willi sindroma 46, XY
• SNRPN- 15q11 • PML control-15qter
46, XY del 15q11
Komparativna genomska hibridizacija (CGH)
•
•
•
Komparativna in situ hibridizacije se koristi za detektovanje regiona hromozoma koji su amplifikovani ili deletirani
•
CGH koristi različito obeležene DNK izolavane iz ćelija pacijenata i kontrolnih (normalnih) ćelija u kompetitivnom FISH-u
Korišćenjem “image-processing software” otkrivaju se regioni gde odnos FISH signala kod tumorske normalne DNK odstupa od očekivanog Tehnika izbora za tkiva koja nisu pogodna za klasičnu citogenetičku analizu (solidni tumori i hematološke neoplazme)
Komparativna genomska hibridizacija (CGH)
Analiza odnosa dobijenih Cy3 i Cy5 signala crveni zeleni
0.75
DNK pacijenta obeležena Cy3 bojom
Kontrolna DNK obeležena Cy5 bojom
Digitalna analiza dobijenih signala na fluorescentnom mikroskopu
1
1,25
amlifikacija
delecija
Istovremena hibridizacija jednake količine obeleženih DNK sa metafaznim hromozomima
Komparativna genomska hibridizacija na DNK matricama (array CGH) Analiza odnosa dobijenih Cy3 i Cy5 signala crveni zeleni amlifikacija DNK pacijenta obeležena Cy3 bojom
Kontrolna DNK obeležena Cy5 bojom
Digitalna analiza dobijenih signala primenom odgovarajućih Programa (image-processing software)
Istovremena hibridizacija jednake količine obeleženih DNK sa matricama uređenih DNK fragmenata delecija DNK matrica- mikroerej
CGH - Comparative Genome Hybridization
(A) Ćelijska linija poreklom iz kancera dojke koja nosi ekstra kopiju dugog kraka hromozoma 1 i deleciju 1p34-36 (B) Ćelijska linija poreklom iz kancera debelog creva koja pokazuje amplifikaciju MYC regiona na 8q24 (C) Ćelijska linija poreklom iz kancera pluća koja pokazuje amplifikaciju regiona 2p24
Projekat humani genom U martu 1986. g. DOE (US Department of Energy) je organizovao međunarodnu konferenciju u Santa Fe-u (New Mexico) na kojoj se diskutovalo o mogućnostima određivanja genetičke informacije sadržane u ćeliji čoveka. Ova konferencija je dovela do stvaranja HUMAN GENOME INITIATIVE u proleće 1987. g. što se smatra početkom međunarodnog projekta nazvanog HUMANI GENOM (Human Genome Project). Određivanje tačnog redosleda oko 3 milijardi baza u DNK čoveka-“Ĉitanje knjige života”
Međunarodni konzorcijum Udruženi međunarodni istraživački timovi iz SAD, Velike Britanije, Francuske, Nemačke i Japana Zadatak da se do 2010. g. odredi šifra sadržana u genomu čoveka
Postavljena 3 osnovna cilja ovog projekta Utvrđivanje tačnog broja gena čoveka i njihovo precizno mapiranje na hromozomima Određivanje sekvence genoma Razvoj tehnologija za izučavanje genoma kao i razvoj kompjuterskih sistema za obradu dobijenih podataka
Prošireni ciljevi projekta Humani genom Konstruisanje precizne genetičke mape humanog genoma Konstruisanje fizičkih mapa humanih hromozoma, kao i fizičko mapiranje genoma odabranih model organizama Sekvenciranje genoma čoveka i genoma odabranih model organizama Razvoj novih metoda za sakupljanje, skladištenje i analizu podataka dobijenih sekvenciranjem genoma Uporednu analizu sekvenci genoma različitih organizama u cilju sagledavanja procesa molekularne evolucije Proučavanje prirodnih varijacija sekvenci genoma kod ljudi Kreiranje odgovarajućih tehnologija neophodnih za ostvarivanje ovih ciljeva Razmatranje etičkih, zakonskih i socioloških aspekata vezanih za projekat sekvenciranja humanog genoma Razmatranje pitanja “vlasništva” nad sekvencom genoma čoveka i moguće genetičke diskriminacije
Novi putevi u istraživanjima
Otkrivanje informacije sadržane u genima čoveka Razumevanje tajne nastanka života Saznanja o mehanizmima koji omogućuju razviće oplođene jajne ćelije u odraslu jedinku.
Analiza razlika u genetičkom materijalu kod ljudi će omogućiti da se sazna šta leži u osnovi raznolikosti među ljudima i zašto je jedan organizam drugačiji od drugog Uporedna analiza informacija sadržanih u naslednim materijalima različitih vrsta doprineće boljem razumevanju molekularne evolucije.
Two routes to the genome • Clone-by-clone sequencing • The random “shotgun” approach • Sequencing applied to 150 000 bp fragments of human DNA • Sequencing one clone at the • Sequencing the whole human genome time directly • The public sequencing project • Private company Celera Genomics (US National Institute of Health, Departement of Energy, UK Wellcome Trust...)
Clone-by-clone sequencing
Clone-by-clone sequencing/The random “shotgun” approach •
The human genome is full of duplication of DNA sequences and contains about milion “interspersed repeats”
•
Short near identical copies of the same sequence make assembly of DNA sequence difficult because the wrong repeats can get matched when sequences are being assembled by computer
•
Working on one clone at the time simplifies the repeats problem concentrating on just those that are found in one clone
•
The private company Cellera genomics believes that the problem can be overcome with massive computing power
•
The fruitfly genome (about one-tenth of the human genome) has completed by using random sequencing (Cellera) The first human chromosome sequenced (chromosome 22) has been completed by clone-by-clone approach (the public sequencing project) Both sets of data can be combined to give the very clearest picture of the genome
• •
Dostignuća projekta Humani genom 2000.g. dobijena “prva verzija” sekvence humanog genoma (“draft sequence”) (Lander et al., 2001, Nature, 409: 860-912) Omogućila da se, u najvećoj meri, identifikuje zbirka svih gena i protumači zapis u naslednom materijalu čoveka. Utvrđeno da je broj gena značajno manji od pretpostavljenog
“Here we report the results of an international collaboration to produce and make freely available a draft sequence of the human genome. We also present an initial analysis of the data, describing some of the insights that can be gleaned from the sequence.”
- Procenjeno da genom čoveka sadrži oko 32 000
Značaj projekta Humani genom Identifikacija novih gena neverovatnom brzinom Razvoj nove ere medicinske genetike
Razvoj efektivnih načina za dijagnostiku, lečenje i eventualno sprečavanje bolesti Nova saznanja o patološkim promenama i procesima koji dovode do starenja. Otkrivanje genetičke osnove raznolikosti među ljudima
Etička i pravna pitanja Problem "vlasništva" nad sekvencom humanog genoma Mogućnosti patentiranja gena
Dostupnost genetičkog testiranja Genetička diskriminacija Podsticanje rasne i etničke diskriminacije.
Intelektualno vlasništvo nad sekvencom humanog genoma Svetska naučna javnost je, zahvaljujući učestalim pritiscima, uspela je 2000.g da pridobije čelnike privatnih kompanija da novo-generisane sekvence učine dostupnim svim istraživačima. Nakon mnogih debata, upućen je apel da se patentiranje gena, odnosne potpune kontrola nad profitom koji patent može da donese, ograniči samo na slučajeve koji će zakonski biti regulisani
To bi isključilo mogućnost patentiranja parcijalnih sekvenci gena, čime bi se sprečile različite zloupotrebe.
Patentiranje gena, genskih fragmenata, SNPova, proteina, genskih testova.... Podnosilac patenta mora: Identifikovati novu naslednu sekvencu
Okarakterisati produkt te sekvence
Specifikovati kako produkt funkcioniše u prirodi, odnosno odrediti njegovu funkciju.
Priložiti jasan plan za njegovu primenu
Zašto ne bi trebalo podržati patentiranje naslednog materijala? Nosioci patenata bi dobili mogućnost da patentiraju deo prirode, osnovni činilac života, što bi značilo da jedan organizam poseduje deo drugog organizma Vid bio-piraterije Patentiranjem delova naslednog materijala bili bi nagrađeni istraživači koji se bave rutinskim istraživanjima Patentiranje bi otežalo razvoj novih dijagnostičkih i terapeutskih pristupa
Privatne kompanije bi se našle u poziciji da monopolizuju određene genetičke testove Patentiranje bi zamenilo objavljivanje radova, čime bi se smanjio protok informacija dostupan javnosti
Etički, pravni i socijalni aspekti projekta Humani genom Promovisana potreba za kadrovima koji će se baviti genetičkim istraživanjima i razvojem politike u oblast zdravstvene zaštite vezane za: Genetičku varijabilnost i različitost među ljudima Integrisanje genetičkih tehnologija i informacija u sistem zdravstvene zaštitne Uticaj genetičkih informacija na formiranje filozofskih, teoloških i etičkih pristupa
Uticaj rasnih, etičkih i socio-ekonomskih faktora na primenu, razumevanje, interpretaciju genetičke informacije i korišćenje genetičkih servisa
Genetičko testiranje Obuhvata niz tehnika za analizu humane DNK u cilju identifikovanja promena u naslednom materijalu Dijagnostika naslednih oboljenja Utvrđivanje prirodnih varijacija
Moguće implikacije genetičkog testiranja Genetičke varijacije mogu imati posledice na koncept rasa i etničkih zajednica. Strahuje se da bi razlike u naslednom materijalu među ljudima mogle da se zloupotrebe za podsticanje rasne i etničke diskriminacije.
Genetička diskriminacija Po obavljenom genetičkom testiranju dobija se uvid u genetičku konstituciju ne samo testirane individue već i članova familije. Može se predvideti verovatnoća prisustva mutacije i u budućim generacijama. Strah od zloupotrebe genetičkih informacija za procenjivanje sposobnost pojedinaca
Važna pitanja vezana za mogućnost genetičke diskriminacije Ko poseduje kontrolu nad genetičkim
informacijama?
• Princip očuvanja privatnosti i poverljivosti genetičke informacije
Ko sme imati pristup ličnim genetičkim
informacijama i kako one mogu biti korišćene? • Strah od uvida u genetičke informacije od strane osiguravajućih društava, poslodavaca, sudova, škola, agencija za usvajanje dece, vojske.....
Genes and Justice
Kako sprečiti genetičku diskriminaciju?
Koje mere treba preduzeti da bi se sprečila zloupotreba genetičkih informacija. Zakonska regulativa izuzetno važna za zaštitu privatnosti i sprečavanja svakog vida genetičke The Growing Impact of the diskriminacije.
New Genetics on the Courts
Zakonska regulativa Mora omogućiti zaštitu prava pojedinaca da donese samostalnu odluku da li će pristupiti genetičkom testiranju i da li želi da sazna rezultat testiranja
Po obavljenom testiranju, mora se poštovati pravo pojedinca da donese nezavisnu odluku o tome da li i ko može imati uvid u rezultat testiranja (izbegavanje scenaria “velikog brata”)
Psihološki aspekt genetičkog testiranja Da li treba primeniti genetičko testiranje ako ne postoji odgovarajući medicinski tretman? Kako bi informacija da će neko oboleti od teške i neizlečive bolesti uticala na njegov dalji život i rad. Kakav je uticaj saznanja o genetičkoj informaciji na pojedinca i društvo? Pojedinci sa povećanim rizikom obolevanja mogu odbiti genetičke testove da bi izbegli dalje probleme
Pouzdanost genetičkih testova Koliko su genetički testovi pouzdani i da li se mogu interpretirati na
odgovarajući način od strane medicinskih radnika?
Kako je regulisana evaluacija genetičkih testova sa aspekta preciznosti,
pouzdanosti i primenjivosti?
Kako informisati javnost da bi ljudi mogli da naprave izbor i donesu
odluke vezane za testiranje?
Nesigurnost vezana za genetičke testove vezane za predispoziciju
nastanka kompleksnih oboljenja vezanih za veći broj gena i interakcije gen-okolina (na primer srčana oboljenja)?
Da li treba primeniti genetičko testiranje ako ne postoji odgovarajući
medicinski tretman?
Da li roditelji imaju pravo da testiraju svoju maloletnu decu za bolesti
koje se javljaju u poznim godinama života?
Koliko je pouzdano i korisno prenatalno genetičko testiranje?
Zaključci Značajno mesto u daljim istraživanjima biće posvećeno etičkim, pravnim i sociološkim aspektima vezanim za proučavanje humanog genoma.
U godinama koje slede očekuju se mnogobrojne polemike i debate koje će se baviti problemima patentiranja delova naslednog materijala čoveka i genetičkom diskriminacijom.
