VECTORES DE CLONACIÓN Los vectores son, esencialmente, moléculas de DNA transportadoras. Para servir de vector, una molécula de DNA debe tener unas determinadas características: 1. Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de DNA que tr ansporta. 2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restricción, presentes sólo una vez en el vector. Estos sitios de restricción se cortan con una enzima de restricción y se utilizan para insertar segmentos de DNA cortados con la misma enzima. 3. Debe tener algún marcador de selección (normalmente genes de resistencia a antibióticos o genes de enzimas que la célula huésped no tiene) para poder distinguir las células huésped que transportan el vector de las que no lo contienen. 4. El vector de la célula huésped debe ser fácil de recuperar. Un fósmido es un tipo de vector empleado en biotecnología. Básicamente es un fagémido
introducido por sustitución en un vector de tipo fago lambda. Esto permite usarlo igual que un fago lambda, pero con la posibilidad de excindir el fagémido y poder manejar el inserto como plásmido. Muy utilizados en la construcción de genotecas, en la que es indispensable una alta eficiencia de introducción de las moléculas de ADN recombinante en las células para obtener clones de tantos fragmentos del genoma original como sea posible, asegurando así una buena representatividad. La eficiencia de introducción del DNA mediante fago lambda (por infección) es muy superior a cualquier otra técnica no viral. Sin embargo resulta más interesante disponer de una genoteca en forma de clones bacterianos en lugar de clones virales, por lo que frecuentemente se purifica el ADN recombinante de un clon viral, se libera el inserto y se clona en un plásmido. Con el empleo de fósmidos esto no es necesario, ya que basta con excindir el fagémido (empleo de un fago auxiliar) y creciendo en medio selectivo tan sólo obtendremos bacterias con el fagémido. Los plásmidos son fragmentos extracromosómicos de ácidos nucléicos (ADN o ARN) que aparecen
en el citoplasma de algunos procariotas. Son de tamaño variable aunque menor que el cromosoma principal. De manera natural se encuentran en las bacterias en tamaños que van desde 5,000 hasta 10,000pb y contienen de 2 a 30 genes. Algunos tienen la capacidad para incorporarse o salir del cromosoma bacteriano. Cada bacteria puede tener uno o varios a la vez. Los plásmidos tienen una conformación circular o con estructura superenrrollada. El control de la replicación del plásmido depende del tipo de plásmido, existiendo plásmidos cuya replicación está acoplada con la replicación del cromosoma bacteriano y plásmidos cuya replicación no está relacionada con la del cromosoma (generalmente son de este ultimo tipo). El tipo de genes que portan los plásmidos es variado, tratándose generalmente de genes que aportan ventajas adaptativas a la bacteria que los porta: genes de resistencia a antibióticos, genes de producción de sustancias tóxicas para ot ras bacterias o genes que codifican enzimas útiles para degradar sustancias químicas. Se denomina
episoma a un plásmido incorporado al cromosoma bacteriano. Los plásmidos se replican en manera similar al cromosoma bacteriano. Los plásmidos son herramientas muy útiles en ingeniería genética para la transformación génica y la manipulación genética de procariotas y eucariotas. Los plásmidos empleados en ingeniería genética se llaman vectores. Son muy útiles para sintetizar en grandes cantidades proteínas de interés, como la insulina o los antibióticos, mediante un procedimiento conocido como transformación. El proceso de transformación comienza con la selección de un plásmido adecuado, en el que se introducen los genes que se quieren expresar con protocolos específicos que usan enzimas de restricción y DNA ligasa. Posteriormente se transforma un tipo de bacteria con el plásmido modificado y se seleccionan las bacterias transformadas que produzcan las sustancias deseadas. Estas bacterias se cultivan en sistemas de tipo biorreactores para su crecimiento en grandes cantidades. En este proceso se eligen plásmidos con características que permitan seleccionar las bacterias transformadas en un medio de cultivo como por ejemplo plásmidos con genes de resistencia a antibióticos o con genes de enzimas que sinteticen compuestos coloreados. Aunque los plásmidos no pueden sintetizar una envoltura proteica y se transfieren con dificultad de una célula a otra se ha hipotetizado que podrían ser los precursores de los primeros virus. Los cósmidos son vectores híbridos construidos utilizando partes del cromosoma del fago lambda y de DNA plasmídico. Los cósmidos contienen la secuencia “cos” del fago lambda, necesaria para
el empaquetamiento del DNA del fago dentro de su cubierta proteica, y secuencias plasmídicas de replicación y de genes de resistencia a antibióticos, que permiten identificar las células huésped que los contienen. El DNA de los cósmidos que contiene insertos de DNA se empaqueta en la cápside proteica de lambda para formar partículas fágicas infectivas. Una vez el cósmido entra en la célula huésped, se replica como un plásmido. Puesto que la mayoría del genoma de lambda se ha delecionado, los cósmidos pueden transportar insertos de DNA mucho más grandes que los que lambda puede llevar. Los cósmidos pueden transportar casi 50kb de DNA insertado, mientras que los vectores fágicos pueden acomodar insertos de DNA de unas 15kb y los plásmidos generalmente están limitados a insertos de 5-10kb. Cromosoma artificial bacteriano (BAC): Es un vector de clonación generado en el laboratorio que
permite insertar segmentos largos de ADN, de 100 000 a 300 000 bases, provenientes de otras especies en el genoma de bacterias. Una vez que este ADN ha sido clonado dentro de la bacteria huésped puede replicarse junto con el genoma bacteriano y así se pueden obtener muchas copias de él. Grandes fragmentos de ADN pueden ser clonados en vectores que contengan los componentes necesarios para propagarse como cromosomas artificiales en las bacterias. De esta manera, se pueden clonar fragmentos de ADN que tengan de 100.000 a 200.000 pares de bases, como BACs (por sus siglas en inglés). El ADN clonado en los BACs es por lo general más pequeño. Sin embargo, los BACs ofrecen ventajas importantes como por ejemplo, son más manipulables para ciertos tipos de estudios en el laboratorio. Los BACs se usan a gran escala para construir mapas físicos de alta
resolución de los cromosomas humanos, con el fin de establecer la secuencia completa del genoma humano. Cromosoma artificial de levadura (YAC): Es un cromosoma artificial que se emplea como vector
de clonación de grandes fragmentos de ADN de otras especies en el genoma de la levadura. Los YACs se propagan junto con los otros cromosomas de la célula de levadura. Cromosomas artificiales en levadura o YAC son grandes pedazos de ADN que contienen los componentes necesarios que le permiten propagarse como cromosomas en la levadura. Así, se pueden clonar en la levadura, fragmentos de ADN foráneo de hasta un millón de pares de base de longitud o incluso más. El ADN clonado se propaga entonces como si fuera simplemente otro cromosoma en la célula de la levadura. Cuando uno arma rompecabezas, es más fácil ensamblar un número pequeño de pedazos grandes que un número grande de pedazos pequeños, y lo mismo pasa cuando se hacen mapas físicos de cromosomas. Los YACs proporcionan pedazos más grandes del cromosoma y por lo tanto se necesitan menos de ellos para ensamblar el mapa físico de un cromosoma. Por esa razón, los YACs han resultado particularmente útiles en la fase temprana del Proyecto Genoma Humano, donde se han usado para construir mapas físicos completos de todos los cromosomas humanos.
Referencias
Thomas M. Devlin, Bioquimica con aplicaciones clínicas 4Ed., Editorial REVERTE, 2006, pp. 290-307 (DNA recombinante y biotecnología). http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/DNArecombinante/Tecnica%20DNA%20reco mbinante.pdf consultado por ultima vez 18/abril/2012.
