Emma Suryati & Yusafir Hal a
Mar. Chem. Acta
Pseudomonas sp. Uji kemurnian dilakukan dengan menggunakan KCKT.
Isolasi dan pemurnian bakteri pada udang Isolasi bakteri dari udang dilakukan dengan mengambil hepatopankreas udang, kemudian di gerus dan diencerkan dengan 9 ml saline solution. Kemudian 0,1 ml sampel diinokulasikan pada plat media TSA dan TCBS, diinkubasi selama 48 jam. Bakteri yang tumbuh pada plat diisolasi dan dimurnikan berdasar kan bentuk dan warna koloni pada media agar miring TSA, diinkubasikan selama 4 jam. Uji karakteristik dilakukan dengan cara inkubasi selama 48 jam menggunakan media OF, TSI, SIM, MR-VP, King A, King B, Gelatin. Identifikasi genus dan spesies bakteri patogen mengacu pada buku kunci.
Identifikasi isolat murni Lytocarpus philippinus yang efektif sebagai bakterisida. Isolat murni yang diperoleh dari isolasi dan pemurnian, selanjutnya diklasifikasi berdasarkan reaksi penampak noda pada kromatografi lapis tipis, dan pengukuran secara spektrofotometri UV-Vis, IR, dan spektrometri massa. HASIL DAN BAHASAN
Hasil uji hayati dari ekstrak kasar Lytocarpus philippinus terhadap bakteri Pseudomonas sp menunjukkan zona hambatan sebesar 26,4 mm (20 µL) dan 31,0 mm (40µL). Sebagai pembanding, antibiotik yang sering digunakan, seperti Oxytetracyclin, hanya mampu menghambat pertumbuhan bakteri Vibrio sp dengan diameter hambatan 19,0 mm, kloramfenikol dapat meghambat pertumbuhan bakteri Vibrio sp dan Enterobacteriaceae masing-masing 24,6 mm dan 11,9 mm pada konsentrasi di atas 100 ppm. Malachite green dan prefuran tidak mampu menghambat pertumbuhan bakteri Vibrio sp dan Enterobacteriaceae pada konsentrasi yang sama (Madeali 1995). Bakterisida pada umumnya menghambat pertumbuhan bakteri dengan cara mengiritasi dinding sel, menggumpalkan protein bakteri serta terjadi hidrolisis dan difusi caiaran sel yang disebabkan karena perbedaan tekanan osmosis (Salle 1961).
Uji hayati zat bioaktif hydrozoan Hydrozoan Lytocarpus philippinus dikumpulkan dari perairan pantai dengan cara penyelaman, lalu diidentifikasi menggunakan buku kunci (Brusca et al , 1990). Sekitar 500 g dikoleksi dalam keadaan segar, dimasukkan ke dalam wadah yang berisi metanol 80% dan disimpan pada suhu rendah. Ekstrak kasar dibuat dengan menghaluskan hydrozoan kemudian direndam dalam larutan metanol 80% selama 3 kali 24 jam, selanjutnya diuji keaktifannya menggunakan bakteri bioindikator, Pseudomonas sp, yang telah diisolasi dari udang yang terinfeksi penyakit. Metode uji hayati yang digunakan adalah metode difusi agar yang telah dimodifikasi (Cowan, 1985), volume yang digunakan yaitu 20 dan 40 µL dari ekstrak yang konsentrasinya 1g/mL bahan segar. Isolasi dan pemurnian zat bioaktif Lytocarpus philippinus Pemurnian zat bioaktif Lytocarpus philippinus di lakukan melalui ekstraksi dan fraksionasi menggunakan pelarut air, heksan, etil asetat asam, basa, dan etil asetat netral (Suryati et al . 2002). Fraksi aktif lalu dipisahkan secara kromatografi kolom, lapis tipis (KLT), dan lapis tipis preparatif. Selanjutnya uji kemurnian dilakukan dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) yang diikuti dengan uji hayati menggunakan bioindikator bakteri yang sebelumnya telah diisolasi dari udang yang terinfeksi penyakit. Isolat yang digunakan setara dengan 20µL dan 40µL larutan yang mengandung 1 g/ml berat segar . Fraksi aktif dari Lytocarpus philippinus dipisahkan dengan teknik kromatografi kolom terbuka silika gel menggunakan campuran pelarut heksan, asam asetat, dan air dengan perbandingan 2,5 : 4,5 : 3,0. Fraksi aktif kemudian dipisahkan lagi dengan cara yang sama menggunakan campuran pelarut butanol, etil esetat, air dengan perbandingan 4 :2,5: 3 Setiap fraksi diuji keaktifannya menggunakan bakteri bioindikator
Tabel 1. Hasil fraksionasi Lytocarpus philippinus , dan uji hayati menggunakan bakteri bioindikator Pseudomonas sp
Fraksi aktif 1. Ekstak kasar 2. Fraksi heksan 3. Fraksi etil asetat asam 4. Fraksi etil asetat netral 4. Fraksi etil asetat basa 5. Fraksi air
Zona hambatan pada bakteri Pseudomonas sp, mm 20 µL
40 µL
28,7 ± 0.08 32,9 ± 0,05 -
38,7 ± 0,05 36,8 ± 0,05 -
K et er an g an:( - )T hambat an t t er had a p p er t )T id ak member ik an h p pe tu mbuhan bak t te r i
Dari hasil fraksioansi, masing-masing diperoleh empat fraksi, yaitu fraksi heksan yang dapat melarutkan senyawa-senyawa yang sangat tidak polar, fraksi etil asetat asam melarutkan senyawa-senyawa organik yang bersifat asam seperti asam fenolat, karboksilat, alkohol dan asam-asam organik lainnya. Fraksi etil asetat netral melarutkan senyawa-senyawa 5
Volume 2,3,4 No. 2
Isolasi Bioaktif Hydrozoan Lytocarpus Philippinus ...
netral seperti alkaloid, steroid, terpen dan senyawasenyawa yang bersifat netral lainnya. Dan terakhir, fraksi air yang dapat melarutkan senyawa-senyawa yang sangat polar seperti peptida, glikosida, amina, dan karbohidrat makromolekul lainnya. Hasil fraksionasi dan uji hayati dari Lytocarpus philippinus terhadap bakteri Pseudomonas sp menunjukkan fraksi yang aktif pada fraksi etil asetat basa. Hasil fraksionasi dan uji hayati dapat dilihat pada Tabel 1. Hasil uji hayati pada tahap fraksionasi Lytocarpus philippinus terhadap bakteri Pseudomonas sp menunjukkan fraksi yang aktif pada fraksi etil asetat basa dengan diameter hambatan pada bakteri Pseudomonas sp, berturut-turut 32,9 ± 0,05 mm dan 36,8 ± 0,05 mm pada volume 20 µL dan 40 µL,sedangkan fraksi lain tidak memberikan hambatan terhadap pertumbuhan bakteri. Senyawa yang larut pada etil asetat basa pada umumnya senyawa yang bersifat netral dan bersifat basa seperti senyawa alkaloid, terpen, poliketida , steroid, ketosteroid, dan turunan dari skualen. Senyawa-senyawa yang larut pada etil asetat asam pada umumnya senyawa-senyawa yang bersifat asam pula seperti asam karboksilat, asam fenolat, flavonoid, fenil propanoid, antosianin dan turunannya.
diameter hambatan berturut-turut sebesar 19,8 ± 0,05 mm dan 31,8 ± 0,05 mm pada volume 20 µL dan 40 µL dari larutan yang mengandung 1 g/mL, setara berat segar. Hasil Uji kemurnian dengan KLT dan KCKT berturut-turut memberikan satu noda dan satu puncak. Hal ini menunjukkan bahwa isolat yang diperoleh merupakan senyawa murni
Gambar 1. Kromatogram isolat murni Lytocarpus philipinus
Tabel 4. Hasil uji hayati fraksi etil asetat basa dengan kromatografi kolom terbuka menggunakan eluen campuran butanol, etil esetat, dan air
Fraksi hasil pemurnian, (nomor fraksi) etil asetat basa 1. A (1) 2. B (2-8) 3. C (9-12) 4. D (13-18) 5. E (19-26) 6. F (27-30) 7. G (31-33) 8. H (34-37) 9. I (38-49) 10. J (50-54) 11. K (55-57) 12. L (58-70) Keterangan
:
Zat bioaktif hydrozoan pada umumnya dihasilkan dari proses metabolisme sekunder biota laut tersebut. Selain itu, juga kemampuan zat bioaktif hydrozoan untuk menghambat pertumbuhan bakteri kemungkinan disebabkan karena sifat fisiologisnya yang dapat memanfaatkan bakteri dan biota lain sebagai sumber nutrien. Berdasarkan data yang ada, zat bioaktif hydrozoan mempunyai prospek yang cerah terutama sebagai bahan bekterisida pada komoditas perikanan. Hasil identifikasi menggunakan reaksi penampak noda pada KLT menunjukkan bahwa senyawa yang terdapat pada Lytocarpus philippinus memberikan respon terhadap golongan senyawa asam fenolat dan steroid. Pada umumnya asam fenolat dapat menghambat pertumbuhan bakteri karena dapat mengiritasi dinding sel pada bakteri, juga dapat mengkoagulasi protein sehingga dimanfaatkan sebagai bakterisida atau bakteriostatis. Hasil analisis menggunakan spektroskopi menunjukkan bahwa spektrum UV-Vis dari Lytocarpus sp memperlihatkan dua puncak, hal ini menunjukkan bahwa senyawa tersebut merupakan senyawa yang mengandung atom C yang terkonyugasi. Hasil pengukuran tersebut dapat dilihat pada Gambar 2.
Zona hambatan pada bakteri Pseudomonas sp, mm 20 µL 40 µL 24,4± 0,05 30,0 ± 0,05 19,8± 0,05 31,8 ± 0,05 -
(-) Tidak memberikan pertumbuhan bakteri
hambatan
terhadap
Hasil uji hayati dari fraksi aktif Lytocarpus philippinus dapat dilihat pada Tabel 4. Fraksi yang paling aktif menghambat pertumbuhan bakteri bioindikator Pseudomonas sp yaitu fraksi C dengan
6
Emma Suryati & Yusafir Hal a
Mar. Chem. Acta
Gambar 2. Spektrum UV-Vis Lytocarpus phillipi nus
Hasil pengukuran isolat Lytocarpus sp menggunakan IR, memperlihatkan hasil interpretasi spektrum antara lain rentangan OH pada daerah -1 panjang gelombang 3423,4 cm , kemudian ikatan rangkap dua C=C pada panjang gelombang 1637,5 cm 1 -1 , serta C=O pada panjang gelombang 1049,2 cm . Spektrum IR dari isolat tersebut dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 4. Kromatogram dan spektrum MS isolat a ktif dari Lytocarpus phillipinus
KESIMPULAN
Dari hasil penelitian isolasi zat bioaktif hydrozoan Lytocarpus philippinus terhadap bakteri penyebab penyakit pada udang diperoleh empat fraksi hasil, yaitu: fraksi air, heksan, etil asetat asam, netral, dan fraksi etil asetat basa. Fraksi etil asetat basa aktif menghambat pertumbuhan bakteri Pseudomonas sp. Hasil pe4murnian fraksi etil asetat basa memberikan hambatan dan isolat murni pada fraksi ke-3. Hasil identifikasi berdasarkan reaksi penampak noda pada KLT dan data spektroskopi menunjukkan bahwa isolat murni Lytocarpus philippinus adalah n-sikloheksil-3 betametksi-4-metiliden 4'5'1
Gambar 3. Spektrum IR isolat bioaktif Lytocarpus phillipi nus
Kromatogram dan spektrum isolat Lytocarpus sp menunjukkan bahwa isolat tersebut merupakan senyawa n-sikloheksil-3-betametksi-4-metiliden 4'5'1 sesuai data library yang ada pada spektroskopi massa yang digunakan. Kromatogram dan spektrum absorpsi dapat dilihat pada Gambar 4.
7
Volume 2,3,4 No. 2
Isolasi Bioaktif Hydrozoan Lytocarpus Philippinus ...
PUSTAKA
Brown, J.H. 1989. Antibiotics their use and abuse in aquaculture. Aquaculture 20(24) : 34-43. Brusca, R.C and G.J. Brusca.1990 . Invertebrates.Sinauer Associated ,Inc.,Mass.USA 922 p. Cimminiello. P., Ernesto. F, Silvana M., and Alvinso M. 1989. A Novel conyugatedketosteroid from the marine sponge Dyctionella incisa . J. of Natural Product.52 (6) : 1331-1333. Cowan, S.T. 1985 . Manual for the Identification of Medical Bacteria. Cambridge.
cambridge University Press.
Crispino, A., Deguillo, S De Rosa and G. Strazullo. 1989. A New Bioactive Derivation of Avarol from the marine sponge Dysidea avara . J. of Natural Product. 52 (6) : 646-648. Gunasekara, S.P., S. Cramck and R. Longlei. 1989 . Immunosuppre sive compounds from a deep water marine sponge, Agelas flabelliformis . J. of Natural Product 52 (4) : 757-761. Karuso. P., R.C. Cambic and B.F. Bowden. 1989. Chemisty of sponges VI Scalarane sestesterpenes from Hyatella intestinalis. J. of Natural Product 52 (2) : 289-293. Larkins, P.E. 1993. Shrimp diseases in North Sumatera Province . Symposium Perikanan Indonesia I. Jakarta. Madaio, A., V. Picciali and D. Sica. 1989. New Polyhydroxysterols from the Dictyoceratid sponges Hippospongia communis, Spongianella gracillis . J. Natural Product 52 (5) : 952-961. Madeali, M.I. 1995. Toleransi bakteri terhadap antibiotik . Laporan Hasil Penelitian Balai Penelitian Perikanan Pantai Maros. Partasasmita, S., M.I. Madeali, dan A. Tompo. 1988 . Inventarisasi parasit dan penyakit udang windu (Penaeus monodon) di panti benih dan tambak di Jawa dan Bali .J.Penel.Budidaya Pantai 4 (1) : 65-75. Salle, A.J. 1961 . Fundamental Principle of Bacteriologi . Mc Graw Hill Book. Company Inc., London. 479. Suryati, E., Muliani, dan T. Ahmad. 1997. Penapisan Bioaktif Spons untuk Bakterisida dalam Bidang Perikanan . Prosiding Seminar Nasional Pengelolaan Terumbu Karang, Panitia Program MAB Indonesia, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia. Jakarta. Suryati, E dan Y. Hala. 2002. Bioactive Substances of Mangrove Exoecaria agallocha as Schrimp Diseases Inhibitor . Mar.Chim.Acta. 2,3,4(1) : 9-14.
8
