Transporte polar de la Auxina y su rol en la respuesta gravitrópica.
Un tipo de respuesta de la planta corresponde al fototropismo , que se evidencia en la curvatura de esta en respuesta a la luz. Particularmente, como se vio antes, es el coleóptilo quien responde a este estímulo. ¿Cómo participa la auxina de este proceso? Hay auxinas naturales y otros compuestos que actúan de forma similar a la auxina. Otro punto importante es que Auxina es el nombre genérico para la hormona (son un grupo o familia de fitohormonas), mientras que el ácido indol acético es una de las formas predominantes de auxina en las plantas. Hay muchas tipos de auxina en una planta, y demás hay otros compuestos químicos que inducen su producción, así como hay otros compuestos químicos que tienen actividad de auxina. Rol fisiológico de las Auxinas: Auxinas :
Regulan el crecimiento celular y la división celular. El crecimiento lo regulan por expansión o diferenciación celular. Genera patrones celulares en el embrión. Desarrollo y formación del tejido vascular (xilema) Participa en el desarrollo y maduración de los frutos. (Por ejemplo, en las frutillas el verdadero fruto son los aquenios [pepitas]. Los aquenios producen auxina. Si uno remueve los aquenios, de una frutilla en desarrollo, se obtendrán frutillas más pequeñas, de color y forma diferente. Si uno toma un fruto cuyos aquenios fueron removidos durante el desarrollo, pero se le r ocía con auxina, se verá un cierto grado de reversión en el fenotipo en términos del color, pero la forma ya no se recupera. ) Desarrollo de raíces principales y laterales (raíz principal crece hacia el fondo en busca de agua. En algunas plantas, esta se arboriza y genera raíces laterales para poder asentarse y además buscar agua) Regula algunas respuestas celulares como son, expansión y/o polaridad celular a través de efectos directos sobre el citoesqueleto y tráfico de proteínas a nivel de membranas. Regulas respuestas fototrópicas y gravitrópicas. g ravitrópicas. Regula la expresión de muchos genes que dirigen la mayoría de las respuestas con relación al desarrollo. Cambios a nivel postraduccional. (notar que respuestas foto y gravitrópicas son rápidas y no siempre dependen de transducción génica)
Las hormonas actúan en conjunto y bajo ciertas concentraciones (niveles hormonales) producen algún efecto en particular. Las hormonas no comandan procesos por sí mismas, sino que lo hacen en un contexto hormonal general de la planta. Rol de la auxina en el desarrollo: Tomando como ejemplo a Arabidopsis. Se tiene la estructura clásica de una planta: raíz, tallo, hojas y flores (S. reproductivo). La auxina participa a en todos los procesos pro cesos de desarrollo de todas estas estructuras: estr ucturas:
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Desarrollo floral, desarrollo de los frutos, desarrollo del embrión en semillas, filotaxis (patrón de crecimiento de las hojas), elongación de raíces (una de las imágenes se muestra una microscopia de fluorescencia que da cuenta del patrón de los niveles de auxina. En verde es donde hay más). Dominancia apical (número de tallos que genere la planta). Forma de las hojas y patrón de desarrollo de venas en ellas. Patrón de las raíces (tipos celulares presentes en las distintas zonas de una raíz, es decir, tejidos). Formación de raíces laterales. Desarrollo vascular, etc.
Transporte polar de la auxina Una vez que se descubrió la existencia de la auxina y su importancia en las respuestas fisiológicas, surgen las preguntas: ¿En qué tejido se produce? → En forma mayoritaria se
produce en el ápice de la planta, particularmente en el citoplasma de las células del ápice, pero su efecto es producido en otras células distintas. ¿A partir de qué metabolito deriva? → Triptófano Se hicieron experimentos para ver cómo viajaba la auxina hacia otras regiones de la planta. Lo que se vio fue que si uno cortaba el ápice, particularmente el hipocólito, y se ponía en la misma orientación en la que debía estar en la planta entre dos placas de agar (donde la placa de arriba contenía auxina marcada radioactivamente), había un transporte de auxina hacia la placa inferior. Si se invierte la orientación del hipocólito, pero se mantiene el orden de las placas (donante arriba- receptor abajo), no se encuentra transporte de auxina. Esto quiere decir que la auxina solo es transportada en un sentido: de ápice a base. Este sentido se conoce como basipétalo (porque va hacia la base) [el sentido contrario se le conoce como acropétalo]. Entonces, es lógico pensar que existe un mecanismo en las células de este tejido que permita el flujo en sentido basipétalo y no en el sentido contrario. [Auxina no se mueve por difusión, a diferencia del etileno] Inicialmente se pensaba que el transporte era por gravedad, sin embargo, en un experimento con tallos de bambú, donde se hacían crecer de forma invertida, pero de todos modos la raíz crecía arriba, lo que lleva a pensar que hay un grupo de células que está destinada a ser raíz, independiente de la orientación en la que se pongan. 2
Ahora se sabe que la diferenciación de la raíz requiere de auxina, y que esta debe ser transportada de forma polar, es decir, no se produce en cualquier sentido, ni tampoco es afectada por la gravedad. La auxina se mueve a través de la planta por medio del tejido vascular (floema). Pero también existe un transporte célula a célula (no por los espacios intercelulares) siempre en sentido apical a basal. Una vez que llega a la raíz, puede tener ambos tipos de transporte (basipétalo y acropétalo), es decir, devolverse desde la punta de la raíz hasta el ápice de la raíz. La auxina siempre se concentra en el ápice de la raíz, desde ahí difunde hacia los extremos y la base (pero luego se devuelve). En hojas, la auxina también se mueve en una sola dirección: desde el extremo de la hoja, hasta la base de esta (basipétalo). Procesos en el desarrollo son controlados por el flujo de auxina. En la imagen, las flechas indican el sentido en el que se mueve la auxina. e) En la raíz, la auxina fluye por el tejido central hacia la punta, y luego cambia su sentido y se devuelve. Si uno interfiere en este flujo normal, se va a observar que el patrón en los tejidos y la forma de la raíz cambian radicalmente. Entonces, tanto el flujo de la hormona, como la concentración en la que se encuentre, están muy ligados al crecimiento de la raíz en la tierra, y por ende también a la captación de nutrientes y la capacidad de la planta para crecer. En a) se muestra el desarrollo de una raíz lateral. También existe un transporte hacia la punta. Cuando se forma un nuevo órgano, los flujos pueden cambiar, sin embargo, una vez que se forma la raíz lateral, el flujo se restaura. Acá se ve el mismo fenómeno de transporte acropétalo. En b) se muestra un embrión. Se sabe que la auxina migra hacia la punta de los cotiledones, pero luego se devuelve.
Todos los procesos (funciones) señalados anteriormente, tiene que ver con la sensibilidad que poseen ciertos tejidos a distintas concentraciones de auxina. Pero también es importante la interacción con otras hormonas. La forma en cómo se combinan va a activar un cierto patrón de expresión génica que va a determinar la diferenciación hacia un tipo de tejido en particular o desarrollar algún tipo de proceso.
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La hipótesis quimiosmótica Ya se dijo que la auxina se mueve a través de los haces vasculares y por transporte célula-célula, siendo este último el más importante y el que tiene que ver con la respuesta fisiológica en las plantas. El medio extracelular posee un pH ~5.5 por lo que en este medio, la auxina se encuentra protonada. En esta condición, IAA-H es capaz de atravesar las membranas lipídicas. Sin embargo, en el citoplasma de la célula el pH ~7, esto hace que IAA se desprotone. IAA - es incapaz de atravesar la membrana. Existen transportadores en la membrana que permiten, por una parte, el ingrese de IAA- desde el espacio extracelular al citoplasma (Transportadores de entrada), y otros transportadores que permiten la salida de IAA- hacia el espacio extracelular (Transportadores de salida). En el transporte célula-célula, la auxina ingresa al citoplasma (ya sea porque está protonada o usando un transportador), ejerce su efecto al interior de la célula y luego es transportado hacia el otro lado del espacio extracelular, donde puede volver a ser captada por la célula ubicada abajo. Estos transportadores se ubican de forma específica en la membrana de forma asimétrica, lo que permite que el flujo de la hormona sea polar, es decir, que siga una dirección determinada. (No se transporta a través del plasmodesmo!). Es más adecuado hablar de facilitador de auxina, más que de transportador. Estas proteínas facilitan el paso de la auxina al interior o al exterior de la célula, pero no se ha comprobado si efectivamente la auxina se une a esta proteína. Un transportador requiere la unión del sustrato que involucra un cambio conformacional del transportador un translocación al interior de la célula, donde pierde afinidad por el sustrato y lo suelta, a diferencia de un canal que no requiere interacción directa (solo por cargas). Lo mismo pero un poco más detallado. Recordar que el crecimiento de la pared celular se da por una acidificación del medio. Esto hace que IAA pueda protonarse e ingresar pasivamente a la célula o ingresar mediante un transportador. Una vez dentro de la célula IAA se va a desprotonar. Estos H+ serán devueltos a la pared celular mediante ATPasas (bombas de H+), lo que permite conservar el pH en el citoplasma y 4
acidificar el medio de la pared lo que permite la elongación celular. IAA - será transportado al exterior de la célula mediante un facilitador, permitiendo que sea captado nuevamente por otra célula que esté abajo. Transportadores Los transportadores de entrada de denominan Influx, mientras que los de salida Efflux . En los primeros se cuentan los transportadores AUX y PGP, mientras que los transportadores PIN son los principales encargados de la salida (existe desde PIN1 al PIN8). En la imagen de abajo, se muestran distintas capas celulares de la raíz (tejidos). Se ve que existen filas de células que tienen la misma identidad, los cuales se disponen de forma concéntrica hasta llegar a la base de la planta. Estos patrones de tejidos se originan en el meristema (en rojo en la imagen) las células alrededor de esta zona están en activa división, más hacia arriba viene una zona de elongación celular y otra de diferenciación, lo que origina la formación de pelos radiculares, raíces laterales y otros órganos. Nuevamente se muestra con flechas el flujo de auxina a través de los distintos tejidos. Distintos transportadores PIN se localizan en diversos tejidos. Por ejemplo, en la epidermis (región café) se encuentra a PIN2 orientado hacia la base de la célula (imágenes de microscopÍa confocal. Transportadores PIN fueron marcados con GFP). Los transportadores PIN periten la salida de auxina, su orientación en la célula determinan el flujo polarizado de auxina. Como se mencionó antes, si se invierte el flujo de auxina en la raíz, se obtienen plantas con fenotipos bastante aberrantes. Por este motivo, los mecanismos que determinan la correcta localización de estos transportadores en la célula, son muy importantes. PIN4 permite el flujo solo hacia la base y se expresa en solo en la parte central de la raíz (estela). En el caso de PIN3 se ve que se expresa en todas las caras de la célula, esto ocurre porque se presenta en células del meristema, y acá el flujo de auxina ocurre hacia todos lados. En resumen: están las distintas capas celulares que forman la raíz, en cada una de ellas existe un patrón de flujo de auxina determinado por la orientación en la membrana de los distintos transportadores PIN. Esto permite distribuir la auxina de forma no homogénea. Según los niveles de auxina, la respuesta en las células es diferente. 5
A lo largo de casi toda la raíz, los transportadores PIN y AUX/PGP se ubican de forma opuesta en la membrana (lógico, por un lado entra IAA y por el otro sale). La única excepción son las células del meristema, en donde se ubican en cualquier posición ya que la auxina se distribuye en todas las direcciones. ¿Cómo se establece la polaridad en la localización de los transportadores en los distintos tejidos? Se sabe que estas proteínas poseen un péptido señal que las destina a la membrana plasmática. Sin embargo, esto no es suficiente para explicar por qué se ubican en una cara de la célula y en la otra no. Estas proteínas están constantemente yendo en vesículas desde la membrana hacia el endosoma y luego van de vuelta a la membrana. Cuando aumenta la concentración de auxina en el medio, este ciclaje es inhibido. Esto ocurre para proteínas influx y efflux, ubicadas ya sea en la cara basal o apical de la célula. En este experimento se muestran proteínas marcadas con GFP en células de la raíz. A tiempo 0, PIN1 se localiza en la base de la célula. Se realiza con fotoblanqueamiento de la proteína, sobre-excitándola y haciendo que el fluorósforo se inactive (que es lo que se observa a los 2 minutos). La inactivación es irreversible. Cuando uno espera una cierta cantidad de minutos, se sintetizan nuevas proteínas que vienen con el fluorósforo activo. A los 100 minutos es posible ver que la nueva proteína PIN recién sintetizada se localiza en todas las caras de la membrana, sin embargo, a los 200 minutos la proteína nuevamente empieza a localizarse de forma polarizada en la membrana. La polarización ocurre luego de haber pasado por el endosoma, según el tipo de proteína que sea. Hay que recordar que las proteínas tienen una cierta vida media, por lo que están constantemente siendo sintetizadas y degradadas. Como no es posible seguir una única proteína, no es posible determinar si esta proteína una vez que pasa por el endosoma se queda definitivamente en una de las caras de la membrana o si vuelve a ser endocitada. 6
También existe la opción de que la velocidad en que ocurre el proceso de destinación a una cara correcta de la membrana, luego de pasar por el endosoma, sea mayor a la velocidad con que las proteínas inmaduras son enviadas por primera vez a cualquier sitio de la membrana. Pero tampoco se sabe. Se han buscado proteínas accesorias que permitan entender cómo se establece la polaridad. En la imagen se muestran dos modelos, del proceso que ocurre normalmente en las células. PIN2 se ubica en la cara apical y PIN1 en la cara basal. Cuando hay un aumento de la concentración de auxina en el medio extracelular, ingresa mucha auxina al citoplasma, lo que significa que tiene que salir más. Entonces, se inhibe la endocitosis de los transportadores, y se destinan más de ellos hacia la cara correspondiente de la célula, permitiendo el flujo de auxina. Durante el proceso de internalización al endosoma de los transportadores PIN, existiría una interacción con otras proteínas y compartimentos subcelulares (seguir el sentido de las flechas en la imagen) que permiten la mantención o el enriquecimiento de una de estas proteínas en una cara de la membrana. Respuesta a Auxina Una vez que la auxina ingresa a la célula (protonada o desprotonada), se encuentra con un receptor de auxina: receptor SCF, que es un complejo proteico que posee actividad ubiquitina ligasa y que solo se activa en presencia de auxina. En el citoplasma están los factores de transcripción ARFs (Auxin response factors) que normalmente están formando complejos con las proteínas AUX/IAA (represores transcripcionales). Existen muchas proteínas tipo AUX/IAA así como muchos tipos de factores de transcipción tipo ARF que generan respuestas distintas en la célula. La diferencia en las respuestas celulares producidas por auxina estaría dada por el tipo de célula, la concentración de auxina, los tipos de AUX/IAA y ARFs que se estén expresando (que depende del pH celular) y el tipo de respuesta según el proceso celular. Cuando auxina se une al receptor SCF, este va a ubiquitinar a AUX/IAA que está unida a ARF. Dependiendo del proceso celular, se ubiquitinan a distintos AUX/IAA. Cuando AUX/IAA es ubiquitinada, pierde afinidad por ARF, 7
por lo que el complejo se disocia y entonces el represor va a ser degradado en el proteosoma. ARF libre puede viajar al núcleo y activar la transcripción de distintos genes, según la respuesta requerida. Acá se midió la actividad transcripcional de distintos genes según la concentración de auxina en el medio. En la primera imagen, los dos primeros genes se encuentran inactivos inicialmente, pero cuando se llega a una concentración umbral de auxina, se ve como se enciende la actividad transcripcional. En el tercer caso es un gen que se expresa constitutivamente, pero al llegar a una cierta concentración de auxina, la expresión aumenta considerablemente. En la segunda imagen se analiza un mismo gen y su expresión en el tiempo, en tratamientos con y sin auxina. En el primer caso, el gen se expresa constitutivamente, incluso en ausencia de auxina, al recibir el tratamiento, su expresión empieza a aumentar en el tiempo. En el segundo caso el gen se expresa solo en presencia de auxina. En el tercer caso, el tratamiento con auxina no afecta la expresión del gen, es insensible a auxina. Expresión de genes A partir de estos estudios se determinó que existen genes que se activan a los pocos minutos de recibir el tratamiento con auxina (genes tempranos) y otros que se activan horas después (genes tardíos)
Genes tempranos o genes de respuesta primaria: son genes que son estimulados por factores de transcripción preexistentes al momento de la exposición con la auxina (es decir, no requiere síntesis de proteínas para activar su expresión). La expresión de estos genes no puede ser bloqueada por inhibidores de síntesis de proteína Genes tardíos o genes de respuesta secundaria: Requeridos para respuesta a largo plazo. La expresión de estos genes requiere síntesis de proteína
Entonces, los genes tempranos permiten la síntesis de factores de transcripción que luego permitirán activar a los genes tardíos. En la imagen se muestran algunos de los genes tempranos activados por auxina. También se activan algunos genes de respuesta a estrés. Gravitropismo Se produce como repuesta a la polaridad en el transporte de auxina (determinado por la orientación polar de los transportadores en la membrana). Es la capacidad de las plantas de orientar su crecimiento según el vector de gravedad.
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En la imagen se muestra cómo plantas de Arabidopsis son capaces de reorientar el sentido del crecimiento de sus tallos (contra el sentido de la gravedad) a las pocas horas luego de cambiar la orientación de la maceta en la que crecen. El mismo tipo de respuesta se observa en raíces, orientándose a favor del vector de gravedad. La radícula, que es lo primero que crece en semillas recién germinadas, inicialmente crecerá en cualquier dirección (determinada por la posición del embrión en la semilla). Sin embargo, una vez que empieza a asentarse en la tierra, las raíces crecerán a favor del vector de gravedad y el tallo (cotiledones en este caso), crecerán en contra del vector de gravedad. Si se cambia el sentido del vector de gravedad, la planta se va a curvar, para restablecer el patrón de orientación original. La planta es capaz de sensar la gravedad por medio de los amiloplastos (si bien es cierto, hay plantas que no producen almidón, y que igual responden a los cambios gravitrópicos, su respuesta no es tan eficiente como en plantas que sí tienen amiloplastos). La curvatura se produce según la concentración desigual de auxina. El lado que posea una concentración mayor elongará produciendo la curvatura hacia el otro sentido. A nivel de transportadores PIN, en una célula del hipocotilo normal, estos se encuentran en la cara basal. Cuando se cambia la orientación de la planta, los receptores PIN también cambian su distribución en la membrana. Una planta que no ha sido graviestimulada tiene el crecimiento normal de su raíz, a favor de la gravedad. En la punta de la raíz existe una capa de células que cubren al meristema, llamada Cap de la raíz. Si se remueve totalmente el cap, la planta sigue creciendo, pero disminuye su tasa de crecimiento. Sin embargo, si se remueve solo la mitad del cap, la raíz se curvaba sin ser estimulada gravitrópicamente (figura A). Si ahora se cambia la orientación de la planta. Si la raíz tiene cap, esta es capaz de curvarse para crecer en el sentido de la gravedad. Si el cap fue removido totalmente, la raíz no se curvará y seguirá creciendo en el mismo sentido que tenía originalmente (figura B) En el cap de la raíz existe una distribución mayor de auxina. Recordar que en el transporte de auxina, una vez que llega a la base, esta se devuelve. El cap está asociado a este proceso.
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Hay transportadores PIN localizados en el cap. En este experimento se une GFP a un gen que responde a la concentración de auxina (entre más verde se ve, mayor concentración). En d) y e) se muestran plantas sin estimulación gravitrópica. Se aprecia una distribución bastante simétrica de auxina. Sin embargo, luego de graviestimular a las plantas (figura f), la distribución es desigual, siendo mayor en la parte inferior. En e) y g) se muestra la planta que se trató con una droga que inhibe la endocitosis de los transportadores; se ve que no solo hay más auxina, si no que en la punta hay mucha más en comparación al control. Cuando se aplica el estímulo, no ocurre una distribución asimétrica de auxina entre las caras de arriba y abajo, y además, estas plantas no son capaces de curvarse. A nivel molecular, en condiciones normales, los transportadores PIN3 del meristema se localizan en la cara basal. Cuando se produce el estímulo gravitrópico, estos transportadores ahora se localizan en uno de los laterales, de forma tal que ahora la distribución de auxina ya no será homogénea y se concentrará en la parte inferior. Además, también es necesario que exista un mayor número de transportadores PIN, para que puedan localizarse ahora en el lateral y permitir el flujo de auxina en esa dirección. Cabe preguntarse: ¿hay mayor producción de transportadores PIN en una cara de la membrana? O ¿hay mayor degradación de estos transportadores en la cara superior? En k) se ve que los transportadores ubicados en la cara superior son transportados hasta la vacuola para ser degradados (mirar en la página 7, la primera figura, que en la ruta el endosoma puede irse a la vacuola). Esto genera que el transporte de auxina sea mayoritariamente hacia la cara inferior, tal como se muestra en las figuras. En la imagen de más abajo, las flechas señalan la vacuola. En el caso de la raíz, se está creciendo menos donde hay más auxina . La auxina no promueve el crecimiento, sino
que lo regula, promoviéndolo o inhibiéndolo según el caso. El tipo de regulación positiva o negativa depende del tejido en el que actue.
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Un poco más de lo mismo. Se tiene a PIN2-GFP y se muestran plantas que fueron graviestimuladas y se observaron a los 90 y 360 minutos. En b), a los 90 min se observa que hay menos PIN en la cara superior. En c) se ve que a los 360 min, una vez que se reestablece el crecimiento a favor de la gravedad, también se reestablece la distribución de los transportadores PIN. En la tercera columna se ve el efecto de una droga que perturba el tráfico de PIN en la membrana y el endosoma. En estos casos, independiente de cuánto tiempo ha transcurrido, no se observa una distribución asimétrica de los transportadores debido a que no ocurre esta degradación diferencial en la cara superior. Estas plantas no son capaces de curvarse. Mecanotransduccion en células que sensan la gravedad
La células de la raíz poseen amiloplastos, que son estructuras densas al estar llenas de almidón, por eso se ubican en la base de la célula. Cuando se cambia la orientación de la planta, los amiloplastos son capaces de moverse. Por mucho tiempo se pensó que estos se caían debido a su peso, sin embargo, luego se descubrió que en realidad el movimiento está asociado al citoesqueleto. También existen mecanosensores que están en la membrana plasmática y que se asocian con los amiloplastos. Cuando los amiloplastos se mueven, cambiarían algunos parámetros en otros organelos asociados a ciertas regiones de la célula. Por ejemplo, presionando 11
distintos lugares del retículo endoplasmático y la vacuola tendría que reacomodarse en este espacio. Eso gatillaría cambios en las vías de transducción de las señales de los mecanosensores asociados al amiloplasto (mostradas como puntitos negros en el dibujo). En una curva de tiempo, al primer segundo estos mecanosensores se activarían, los amiloplastos empiezan a migrar al igual que los mecanosensores, que pueden viajar a la membrana plasmática o a organelos asociados a ella (retículo principalmente) iniciando una cascada de transducción de señales. Aún se desconocen cuáles son las proteínas que transducirían esa señal, sin embargo, lo que sí se sabe es que finalmente esta señalización permite reorganizar la orientación de las proteínas PIN en la membrana; en el meristema permitiría que PIN3 sea degradado preferencialmente en la cara de la raíz que queda hacia arriba, lo que origina el flujo desigual de auxina que inhibe el crecimiento en esa cara de la raíz. Los mecanosensores son proteínas asociadas en forma inactiva al amiloplasto. Cuando el amiloplastos se mueve, estos se activarían e irían a la membrana a activar a otras proteínas. La presión que ejerce el amiloplasto sobre el retículo al moverse, sería la señal que activaría a los mecanosensores. No todas las células son importantes para la respuesta gravitrópica asociada a amiloplasto. Se ha hecho un mapeo de cuáles células son importantes, mediante microcirugía, donde se van extrayendo células del tejido y luego se estimula la raíz para ver si responde o no. Hoy se sabe que solo algunas células en el meristema son importantes para esta respuesta. Es difícil establecer si es el aumento de auxina el que produce la curvatura, o si luego de la curvatura aumentan los niveles de auxina. En la parte apical de la planta, el hipocotilo también sensa la gravedad, solo que la curvatura se produce por mecanismos distintos, en estos casos, el aumento de auxina promueve el crecimiento (al revés que en la raíz). Se ha estudiado más la raíz, ya que el problema de ver el hipocotilo es que además del efecto de la gravedad, se tiene un efecto fototrópico actuando simultáneamente, en cambio en la raíz es mucho más fácil separar ambos procesos, aunque las raíces también son capaces de sensar la luz.
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