Transformación por choque térmico
La transformación de células competentes, es el proceso gracias al cual podemos introducir nuestro plásmido en la bacteria. La competencia es un estado fisiológico especial que presentan algunas bacterias de forma natural, y que podemos inducir en otras, y que las hace especialmente permeables a la entrada de plásmidos. Esta Esta permeabilidad permeabilidad se debe a alteraciones alteraciones que sufre sufre la membrana membrana celular.
Al ser un estado fisiológico especial, no todas las bacterias lo presentan, pero si podemos conseguir mediante el proceso de transformación que ciertas bacterias que no son competentes, adquieran este rasgo de forma forma temporal temporal.. En mis prácticas, prácticas, he convertid convertido o bacterias bacterias,, Escherichia Coli, en competentes mediante un choque térmico en un medio con cationes divalentes, entre ellos el Ca!. La combinación de la temperatura y los cationes, aumenta la porosidad de la membrana celular, facilita facilitando ndo la asimilac asimilación ión de los plásmidos plásmidos.. "e esta forma atravesar atravesarán án la membrana membrana celular cualquier cualquier plásmido que se encuentre en su forma circular o superenrollada. Los plásmidos #lineales$ tienen más dificultad para penetrar la membrana.
%ara la transformación seguimos el protocolo siguiente& '( )oma )oma la reacción de ligación ligación que tenemos en el hielo *ver el post de Ligación de un plásmido plásmido a un vector de clonación( y a+ade micro litro de ésta sobre el vial de células competentes. e debe me-clar, agitando muy suavemente el vial, nunca pipeteando. ( ncubamos /012 minutos en hielo. La duración duración de ésta etapa no afecta al rendimiento de la transformación transformación y asimilación. 1( e procede a reali-ar el choque choque térmico de las células células que provocará la aparición de poros, poros, con la ayuda del Ca, en las membranas que de3arán pasar a los plásmidos. Esto es debido a que el Ca se une mediante interacciones electrostáticas con el A"4 *cargado negativamente(, y a que tiene afinidad por los l5pidos de membrana *también con densidad de carga negativa(. "e ésta forma desestabili-a la membrana y acerca el A"4 a ésta. %ara ello debemos tener un ba+o de agua a 67 C, durante 12 segundos. 4o agitar, ni remover el vial.
%asado este tiempo se ponen ponen de de nuevo nuevo en el hielo rápidamente de forma suave. "e esta forma se cierran los poros. En éste paso mueren mueren una gran proporción de las células, por eso eso se deben coger cuando están en en la fase logar5tmica de crecimiento celular.
6( e a+ade /2 micro micro litro litro de medio medio .8.C .8.C al vial de célula células. s. El medio medio 8C es especi especial al para la transformación de las células competentes. Es un medio isotónico que cubre las necesidades de las células tras el estrés del choque térmico. )iene peptona, que aporta nitrógeno y aminoácidos9 e:tracto de levadura que aporta vitaminas, en especial del grupo ;9 sales minerales sulfato de magnesio *fuente de magnesio, necesario por e3emplo para la polimerasa(, cloruro de sodio y de potasio necesarios para el transporte y el equilibrio
osmótico9 y la glucosa que aporta la energ5a y es una fuente de C, utili-ada entre otras cosas para reparar la perforación de la membrana celular tras el choque térmico/. Triptona 20 g/l Extracto de levadura 5 g/l Glucosa 3! g/l "loruro pot#sico 0$%! g/l "loruro sódico 05 g/l "loruro magnésico 0&! g/l "omposición del medio '()(" .
/(
Crecer durante una hora en el vial a 1<7 C en agitación fuerte *22 rpm(.
=(
Coge 20/2 micro litro a medios selectivos de cultivo sólidos. e recomienda tomar dos vol>menes distintos para que al menos una de las placas tenga las colonias en la cantidad 3usta para poder picarlas sin problemas.
<(
"e3a crecer las colonias en estufas de cultivo a 1<7 C. i el antibiótico es ampicilina, basta con de3arlas crecer ? horas, para @anamicina es necesario cultivarlo toda la noche *las bacterias con ampicilina, también pueden de3arse toda la noche(. %asado el tiempo de crecimiento, ya se tienen los clones.
Transformación por electroporación
La electroporación o electropermeabili-ación consiste en provocar un aumento significativo de la conductividad eléctrica y la permeabilidad de la membrana plasmática celular mediante un campo eléctrico aplicado e:ternamente. Es habitual en biolog5a molecular como forma de introducción de diferentes sustancias en células, como por e3emplo sondas moleculares, un fármaco que puede cambiar las funciones celulares o un fragmento de "4A codificante, como puede ser un plásmido. Cuando el volta3e que atraviesa una membrana plasmática e:cede su rigide- dieléctrica se forman poros. i la fuer-a del campo eléctrico aplicado o la duración de la e:posición al mismo se eligen apropiadamente, los poros formados por el pulso eléctrico se sellan tras un corto per5odo, durante el cual los compuestos e:tracelulares tienen la oportunidad de entrar a la célula. in embargo, una e:posición e:cesiva de células vivas a campos eléctricos puede causar apoptosis o necrosis, procesos que provocan la muerte celular. En biolog5a molecular, el proceso de electroporación se usa frecuentemente para la transformación de bacterias, levaduras y protoplastos vegetales. Además de membranas lip5dicas, las bacterias también tienen una pared celular compuesta de peptidoglicano y sus derivados. in embargo, las paredes son porosas por naturale-a y sólo act>an como cora-as que protegen a la célula de impactos ambientales severos.
i se me-clan bacterias y plásmidos, éstos pueden transferirse al interior de las células durante la electroporación. En este proceso suelen emplearse varios cientos de voltios, que atraviesan una distancia de varios mil5metros. A continuación, las células deben manipularse cuidadosamente hasta que tengan la oportunidad de dividirse, produciendo nuevas células que contendrán copias del plásmido. Este proceso es apro:imadamente die- veces más efica- que la transformación por métodos qu5micos. Este procedimiento es también muy eficiente para la introducción de genes e:ternos en células en cultivo, especialmente en las de mam5fero. %or e3emplo, se usa en el proceso de producción de ratones knockout , as5 como en el tratamiento de tumores, terapia génica y terapias basadas en células.
Proceso
La electroporación se lleva a cabo en un electroporador, un aparato que crea un campo electromagnético a través de la suspensión celular *t5picamente bacterias, aunque se puede aplicar a otros tipos de células, como se ha comentado anteriormente(. La suspensión se pipetea en una cubeta de plástico o vidrio con electrodos de aluminio en los costados. %or e3emplo, para la electroporación de bacterias suelen utili-arse unos /2 L de suspensión celular. Antes de la electroporación las células se me-clan con los plásmidos con los que se quieren transformar. La me-cla se pipetea en la cubeta, se selecciona el volta3e en el electroporador *unos 62 voltios, por e3emplo( y la cubeta se inserta en el electroporador. nmediatamente después de la electroporación se a+ade ' ml de medio de cultivo a las bacterias *en la propia cubeta o en un tubo de microcentr5fuga( y se incuban a la temperatura óptima de las bacterias durante una hora o más para después e:tenderlas en una placa con agar. El é:ito de la electroporación depende en gran medida de la pure-a de la disolución de plásmido, especialmente de su contenido en sales. Las disoluciones impuras pueden causar una peque+a e:plosión *un arco eléctrico(, en cuyo caso las células morir5an. i esto ocurre a menudo, podr5a ser necesaria una sedimentación de las células antes de una nueva electroporación.
