PETRU CIANGA
TEH NICI UTILIZA UTI LIZATE TE IN IM UNO LOG
NOTIUNI INTRODUCTIVE
PETRU CIANGA
TEHNICI UTILIZATE IN IMUNOLOGIE NOTIUNI INTRODUCTIV
Editura Pim 2008
EDITURA
Soseaua Stefan cel Mare nr. 11 Iasi -700498 Tel. / fax: 0232-212740 e-mail:
[email protected] www.pimcopy.ro EDITURĂ ACREDITATĂ CNCSIS BUCUREŞTI
66/01.05.2006
Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României CIANGA, PETRU Tehnici utilizate în imunologie : noţiuni introductive / Petru Cianga. - Iaşi : PIM, 2008 Bibliogr. ISBN 978-606-520-214-6 612.017
Cuprins Reacţia Antigen-Anticorp................................................................1 1. Legături implicate în formarea complexului antigen-anticorp.......2 2. Factori care influenţează interacţiunea dintre antigen şi anticorp..8 2.1 Caracteristici structurale...............................................................9 2.1.1 Specificitatea situsurilor de legare a antigenului.......................9 2.1.2 Reactivitatea încrucişată............................................................9 2.1.3 Accesibilitatea antigenic ă........................................................10 2.1.4 Structura imunoglobulinelor....................................................10 2.1.5 Valenţa antigenelor..................................................................10 2.1.6 Concentraţia de antigene şi anticorpi.......................................11 2.2 Factori fizico-chimici care afecteaz ă legarea dintre antigen şi anticorp..............................................................................................12 2.2.1 Factori de mediu.......................................................................12 2.2.2 Concentraţia în săruri (for ţa ionică).........................................12 2.2.3 Potenţialul zeta.........................................................................13 Anticorpi monoclonali....................................................................14 Reacţia de precipitare.....................................................................24 1. Precipitarea în soluţie....................................................................24 2. Precipitarea în gel..........................................................................27 2.1 Dubla imunodifuzie (Oucthterlony)............................................27 2.2 Imunodifuzia radială simplă (Mancini).......................................30 3. Imunelectroforeza.........................................................................32 3.1 Imunelectroforeza.......................................................................35 3.2 Electroforeza de imunofixare (immunofixation electrophoresis IFE)...................................................................................................36 3.3 Electroforeza contracurent (countercurrent electrophoresis)......37 3.4 Electroforeza în rachetă (rocket electrophoresis)........................37 3.5 Focusarea isoelectrică (isolectric focusing)................................38 Reacţia de aglutinare......................................................................40 1. Aglutinarea directă........................................................................44 2. Aglutinarea indirect ă.....................................................................46 3. Aglutinarea pasivă.........................................................................47 4. Testele de inhibiţie a aglutinării....................................................48
5. Testul anti-imunoglobulinic (testul Coombs)...............................50 Teste de fază solidă - Solid phase assay.........................................52 1. RIA - Radio Immuno Assay..........................................................52 2. RIST – Radioimmunosorbent test.................................................53 3. RAST – Radioallergosorbent test.................................................54 4. ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay.........................56 4.1 ELISA indirectă..........................................................................57 4.2 ELISA sandwich.........................................................................59 4.3 ELISA competitivă.....................................................................60 4.4 ELISPOT.....................................................................................61 5. Chemiluminiscenţa........................................................................62 Imunohistochimia (Corina Cianga, Petru Cianga)..........................65 1. Noţiuni de enzimologie.................................................................67 2. Metode de colorare........................................................................70 2.1 Metoda directă.............................................................................70 2.2 Metoda indirectă în doi paşi........................................................71 2.3 Metoda indirectă în trei paşi........................................................72 3. Controale.......................................................................................73 4. Colorarea de fond (nespecifică sau background)..........................74 5. Contracolorarea.............................................................................77 6. Imunocitochimia...........................................................................77 7. Dubla/tripla coloraţie....................................................................78 Imunofluorescenţa..........................................................................80 1. Imunofluorescenţa directă............................................................82 2. Imunofluorescenţa indirectă.........................................................84 Microscopia confocală....................................................................85 Tissue FAXS....................................................................................86 Citometrie în flux (Flow cytometry)..............................................87 1. Principiu........................................................................................87 2. Sortarea particulelor......................................................................94 Aplicaţii ale citometriei în flux......................................................95 1. Imunofenotiparea.........................................................................95 2. Analiza conţinutului ADN (Ploidia ADN)...................................97
3. Investigarea unor molecule solubile............................................99 4. Medicina reproducerii.................................................................100 5. Cross-match................................................................................100 6. Biologia celular ă.........................................................................101 7. Analiza prolifer ării celulare........................................................101 8. Analiza mor ţii celulare prin apoptoz ă.........................................104 9. Analiza citotoxicităţii celulare....................................................104 10. Microbiologie............................................................................105 11. Botanică....................................................................................106 12. Farmacologie.............................................................................106 Histocompatibilitatea în transplant............................................107 Tiparea tisulară (tiparea HLA I şi II)........................................110 1. Citometria în flux.......................................................................110 2. Microlimfocitotoxicitatea sau citotoxicitatea dependentă de complement (CDC).................................................110 3. Metode de biologie molecular ă...................................................112 3.1 Metoda SSP - sequence-specific priming.................................113 3.2 Metoda SSOP - sequence-specific oligonucleotide probing.....114 3.3 SBT – sequence-based typing...................................................116 4. Cultura limfocitar ă mixtă............................................................116 Cross-match (X-match)................................................................117 Evaluarea funcţionalităţii componentelor sistemului imun......120 1. Limfocitele B..............................................................................120 1.1 Teste in vivo..............................................................................120 1.2 Teste in vitro.............................................................................122 2. Limfocitele T..............................................................................122 2.1 Teste in vivo..............................................................................122 2.2 Teste in vitro.............................................................................124 3. Celulele NK (natural killer)........................................................126 4. Fagocite.......................................................................................127 5. Bazofile.......................................................................................130 6. Sistemul complement (SC).........................................................131 Modele experimentale animale....................................................134 1. Animale inbred (singenice).........................................................135 2. Animale congenice......................................................................136 3. Animale chimerice (chimeras)....................................................138
4. Şoareci SCID (severe combined immunodeficiency– imunodeficienţa sever ă combinată)...............................................140 5. Şoareci nuzi.................................................................................141 6. Şoareci transgenici......................................................................143 7. Şoareci knock out (KO)..............................................................145 8. Şoareci knock-in.........................................................................146 Tehnici de biologie moleculară (manipulare a acizilor nucleici şi producţie de proteine) Metode de manipulare a genelor.................................................149 1. Extragerea ADN din ţesuturi şi culturi de celule........................149 2. Extragerea ARN-ului din ţesuturi sau culturi de celule..............151 3. Electroforeza ADN în gel...........................................................152 3.1 Electroforeza în gel de agaroză.................................................153 3.2 Electroforeza în gel de poliacrilamidă......................................156 3.3 Electroforeza în câmp electric pulsatil .....................................157 4. Southern blot...............................................................................157 5. Northern blot...............................................................................161 Metode de evidenţiere a secvenţelor nucleotidice în celule şi ţesuturi...........................................................................................161 1. Hibridizarea in situ......................................................................161 2. FISH – Fluorescence in situ hybridization..................................168 3. CISH – Chromogenic in situ hybridization.................................169 Manipularea enzimatică a ADN-ului..........................................170 1. Digestia cu enzime de restric ţie..................................................170 2. Utilizarea ligazelor în ingineria genetic ă....................................171 3. Amplificarea prin PCR................................................................172 4. RT-PCR (reverse transcription-PCR).........................................177 5. Real time PCR – PCR în timp real..............................................178 6. Secvenţierea ADN.......................................................................179 Metode de introducere a ADN-ului recombinant în bacterii şi celule eucariote 1. Vectori.........................................................................................182 1.1 Plasmide....................................................................................182 1.2 Virusuri.....................................................................................186
1.3 Bacteriofagi...............................................................................187 1.4 Cosmide....................................................................................188 1.5 Cromosomi bacterieni artificiali...............................................188 1.6 Cromosomii artificiali din drojdii (YACs)................................188 2. Transformarea bacteriană şi purificarea ADN-ului din plasmide....................................................................................189 Producerea proteinelor în gazde bacteriene 1. Inducerea sintezei proteice în gazde bacteriene..........................192 2. Purificarea proteinelor.................................................................193 2.1 Filtrarea în gel (cromatografie de excludere)............................194 2.2 Purificarea proteinelor cu ajutorul r ăşinilor schimbătoare de ioni.......................................................................195 2.3 Tehnologia Ni-NTA (nichel-acid nitriloacetic)........................195 3. Inhibitori de proteaze..................................................................199 4. Metode de caracterizare a produsului genelor manipulate..........201 4.1 Electroforeza proteinelor...........................................................206 4.2 Western blot..............................................................................203 4.3 Caracterizarea funcţională prin analiza asocierii cu alte proteine.....................................................................................205 4.4 Alte metode de analiz ă funcţională...........................................206 4.4.1 Analiza Farwestern................................................................206 4.4.2 Imunoprecipitarea..................................................................206 4.5 Surface plasmon resonance (SPR)............................................208 Bibliografie....................................................................................213
