IMUNOLOGIE LUCRĂRI PRACTICE
CUPRINS Teste imunologice în laboratorul clinic Reacţia antigen-anticorp
A. Reacţii imnochimice folosite în laboratorul clinic 1. Reacţia de precipitare a) Reacţia de precipitare în mediul solid - Difuzia în gel - Imunodifuzia radială simplă - Dubla difuzie în gel - Difuzia combinată cu migrarea electroforetică - Imunoelectroforeza - Contraimunelectroforeza - Electroimunodifuzia - Imunofixarea b) Reacţia de precipitare în mediul lichid - Reacţia de precipitare în inel - Imunonefelometria 2. Reacţia de aglutinare a) Reacţia de aglutinare directă b) Reacţia de aglutinare indirectă c) Reacţia de inhibare a aglutinării d) Reacţia de aglutinare mediată de anticorpi anti-imunoglobuline 3. Reacţia de neutralizare 4. Reacţii ce utilizează complement a) Reacţia de fixare a complementului b) Testul de imunohemoliză pasivă în prezenţa complementului c) Determinarea imunohemolitică a complementului 5. Reacţii cu reactivi marcaţi a) Reacţia de imunofluorescenţă - Reacţia de imunofluorescenţă directă - Reacţia de imunofluorescenţă indirectă - Reacţia de imunofluorescenţă cu fixarea complementului b) Analiza radioimunologică c) Analiza imunoenzimatică -Tehnica ELISA 6. Tehnica Western Blot
B. Metode şi tehnici de imunocitologie 1. Tehnica pentru celule lupice 2. Testul reducerii NBT 3. Chemiluminiscenţa 4. Testul inhibiţiei aderenţei leucocitelor 5. Imunofenotiparea cu ajutorul citometriei în flux 6. Testul de transformare blastică a limfocitelor 7. Reacţia de limfocitotoxicitate
C. Principalele reacţii antigen-anticorp şi aplicaţiile acestora
Teste imunologice în laboratorul clinic Imunologia clinică foloseşte numeroase tehnici pentru studiul proteinelor care mediază imunitatea umorală, ca şi pentru studiul celulelor care uau parte la imunitatea celulară Analiza imunologică este considerată ca una dintre cele mai de vârf tehnici din domeniul biomedical. Fiind foarte costisitoare, aceasta a pătruns cu dificultate în laboratoarele clinice. Complexitatea şi evoluţia rapidă a acestor tehnici au făcut necesară conturarea unui departament specializat în cadrul laboratorului clinic, care se ocupă cu metodele imunologice de diagnostic (imunodiagnostic). Domeniile mai nou dezvoltate sau în curs de dezvoltare în laboratoarele clinice cuprind: imunochimia, imunocitologia, histocompatibilitatea, radioimunoanaliza, enzimimunoanaliza. Imunitatea celulară se studiază printr-o serie de teste de imunocitologie. Metodele de imunochimie aduc informaţii asupra unor proteine din sânge şi alte lichide biologice. De obicei se folosesc antigenul (Ag) necunoscut şi reactivul, anticorpul (Ac) cunoscut. Metodele de analiză imunochimică cuprind operaţiile de obţinere şi purificare a Ag şi Ac şi de măsurare a reacţiilor dintre acestea. Măsurarea reacţiei Ag-Ac permite atât estimarea cantitativă a Ag cât şi caracterizarea acestuia sub aspect imunochimic. Metodele cele mai utilizate în analiza imunochimică se bazează pe reacţia Ag-Ac Reacţia dintre un Ag şi un Ac presupune legarea grupării determinante a Ag (epitop) de situsul de combinare al Ac (paratop). Legarea este dependentă de complementaritatea sterică a Ag şi Ac şi se realizează cu participarea unor forţe de legătură necovalente (forţe van der Waals, forţe electrostatice, legături de hidrogen şi legături hidrofobe) care asigură stabilitatea complexului Ag-Ac. Caracteristica generală a reacţiei Ag-Ac este specificitatea, adică capacitatea ac de a discrimina Ag omolog de alt Ag. Specificitatea ag nu este absolută. Reacţia încrucişată are loc când un ag reacţionează cu un Ac format faţă de un alt Ag. Ag care reacţionează cu un Ac produs faţă de un alt Ag se numeşte Ag cross-reactiv sau Ag cu reactivitate încrucişată. Reacţia încrucişată a Ag este datorată faptului că Ag posedă în comun anumite grupări determinante, fie că între grupările determinante există o asemănare chimică ce nu poate fi decelată de Ac. Reacţiile încricişate de tip I. Capacitatea a două Ag de a reacţiona cu acelaşi situs de combinare de pe aceeaşi moleculă de Ac (ex. Ag proteice ce dau reacţii încrucişate din cauza diferenţei foarte mici a secvenţei de aminoacizi glicina nu poate fi deosebită de alanină) Reacţiile încricişate de tip II. Capacitatea unui Ag de a reacţiona cu o subpopulaţie de Ac dintr-un ser heterolog care conţine Ac faţă de un alt Ag parţial asemănător cu primul Reacţia Ag-Ac se desfăşoară în unul sau mai multe stadii: - interacţiunea primară se datoreşte legării efective a ac cu ag şi depinde de cantitatea şi afinitatea Ac. Tehnicile care evidenţiază interacţiunea primară ag-ac sunt tehnici curente de diagnostic (ex. nefelometria). In vivo, interacţiunile primare participă la protecţia gazdei (neutralizarea toxinelor, inhibarea acţiunii unor virusuri sau bacterii) sau la declanşarea unor reacţii anafilactice
-
-
interacţiunea secundară urmează celei primare (după aprox. 30 min.). Produsul final este complexul ag-Ac insolubil. Interacţiunea secundară stă la baza tehnicilor imunochimice (reacţiile de precipitare aglutinare, fixare de complement, neutralizare). interacţiunea terţiară prezintă o complexitate mai mare decât cea secundară. Depinde de variabilele gatdei (receptori pentru Ag, complement, mastocite). Pot determina protecţia gazdei (neutralizarea virusurilor, imobilzarea bacteriilor) sau degranularea celulelor (fenomenul Arthus, şocul anafilactic) Reacţia antigen-anticorp
Imunochimia disciplină de graniţă a imunologiei şi biochimiei studiază substanţele şi procesele chimice ce participă la reacţiile imunologice. Metodele cele mai utilizate în analiza imunochimică se bazează pe reacţia Ag-Ac, utilizînd procedee care rezultă din îmbinarea tehnicilor fizico-chimice cu cele imunologice, primele conferind analizei precizie şi acurateţe, iar ultimele asigurând sensibiliate şi specficitate. Datele furnizate de metodele imunochimice (calitative sau cantitative) pot conduce uneori la informaţii preţioase pentru diagnostic, adesea rezultatul de laborator capaătă valoarea informativă reală numai dacă interpretarea acestuia se face în contextul clinic. 1. Reacţia antigen-anticorp (Ag-Ac) are o mare putere de rezoluţie. În fapt, prepararea anticorpilor prin imunizarea repetată a unui animal (iepure, şoarece, capră, etc…) cu un antigen dat conduce în general la obţinerea anticorpilor puternici şi specifici, adică capabili să recunoască selectiv antigenul în prezenţa numeroaselor substanţe, astfel prin reacţia Ag-Ac, să detectăm şi să dozăm selectiv în ser o proteină (hormon, enzimă, etc.) prezentă la o concentraţie de câteva picograme/ml, ceea ce reprezintă mai puţin de o miliardime din conţinutul proteic al serului. Această caracteristică cu rezoluţie crescută ţine de energia crescută a reacţiei Ag-Ac (reacţie sigur non-covalentă dar datorată unei adăugări de numeroase legături unitare ca legături electrostatice, punţi de hidrogen, interacţii hidrofobe) şi altor forme reduse (complementaritate între structura epitopului Ag şi aceea a situsului Ac). 2. Selectivitatea fiecărei reacţii nu este absolută. Aceasta admite o anumită degenerescenţă: un Ac dat poate recunoaşte mai multe Ag puţin diferite cu preţul unei diminuări a energiei de legare. În practică, acest fenomen fundamental este descris prin observarea reacţiei “încrucişate” dintre diferite substanţe faţă de acelaşi Ac. Înaintea oricărei aplicaţii a reacţiei Ag-Ac trebuie să ne asigurăm de specificitatea funcţiei verificând că în condiţiile de utilizare, singurul Ag vizat este semnificativ recunoscut. 3. Reacţia Ag-Ac prezintă un domeniu de aplicare extrem de larg: - detectarea antigenelor sau anticorpilor: se poate aplica la dozarea medicamentelor, hormonilor peptidici, antigenelor virale sau bacteriene şi chiar Ac când, de exemplu, se poate explora răspunsul individului la un element patogen (serodiagnostic)
evaluarea cantitativă a Ag şi Ac: reacţia Ag-Ac este de fapt adaptabilă la dozarea proteinelor plasmatice foarte reprezentate (imunoglobuline, transferina, etc.), de asemenea, pentru substanţe foarte rare (anumiţi markeri virali, hormoni, etc.). Concentraţiile fiind între 10-4 şi 10-12 M). 4. Reacţia Ag-Ac necesită obţinerea unui semnal secundar pentru a fi detectabilă. Aceasta poate să se formeze în timpul reacţiei (ex. hemaglutinarea), fie să fie preformată prin marcarea prealabilă a Ag sau Ac prin markeri radioactivi, enzimatici sau alţii. Reacţiile din prima categorie fac în general apel la formarea unei reţele Ag-Ac de dimensiune mare, prin prezenţa de cel puţin două situsuri Ac pe imunoglobulină şi de cel puţin doi epitopi pe Ag. Această reţea se traduce prin aglutinare (eritrocitele acoperă Ag) sau prin precipitarea (cazul antigenului macromolecular care formează o reţea cu Ac). Reacţiile din a doua categorie se subdivid în două subtipuri: - Reacţii prin competiţie: o cantitate limitată de unul sau doi compuşi (ex.: Ac) este pusă în prezenţa eşantionului de dozat şi o cantitate minimă de element marcat (ex.. Ag radioactiv). Concentraţia de Ag din eşantion va influenţa negativ valoarea de legare a Ag marcat cu Ac (prin efect de competiţie pentru o cantitate limitată de situsuri). Antigenul marcat fiind singurul decelabil (în contorul de radioactivitate), nivelul său de legare va servi la stabilirea etalonajului reacţiei (ex.: dozarea de medicamente). - Reacţiile prin imunoextracţie: reactivii (ex. Ac) sunt din contră în exces şi capteză în totalitate substanţa de dozare. Cazul clasic este dozarea “în sandwich” unde antigenul de dozat este fixat prin doi Ac care servesc la insolubilizarea pe o suprafaţă (peretele eprubetei) şi altul aduce semnalul detectabil (Ac marcaţi prin izotop sau o enzimă). În acest caz, semnalul va fi funcţionarea directă a concentraţiei de Ag şi acesta este Ac marcat vcare permite etalonarea; Tehnicile de imunofluorescenţă pe cupe sunt un alt exemplu de imunoextragere: antigenul (parazit, bacterie, virus) prezent în preparatul etalat pe lamă este recunoscut de Ac marcat (produs fluorescent). Spălarea rapidă permite să eliminăm Ac în exces (nefixaţi) apoi fixarea este relevată la microscopul cu fluorescenţă pentru diagnosticul direct. Numeroase tehnici utilizate în imunologie sunt asemănătoare celor din ştiinţele biologice (ex: metodele de izolare a antigenelor şi anticorpilor sunt asemănătoare cu cele din biochimie utilizate pentru separarea fracţiunilor proteice). Totuşi, în imunologie se utilizează şi tehnici proprii, cum sunt reacţiile Ag-Ac (ex: tehnicile de imunofluorescenţă, imunodifuzie în gel, radioimunologice şi imunoenzimatice). În funcţie de natura Ag şi de metodele aplicate pentru evidenţierea reacţiei AgAc, acestea se pot împărţi în reacţii de precipitare, aglutinare, neuralizare, reacţii care folosesc complement sau reactivi marcaţi (fluorocromi, izotopi, enzime). -
A. Reacţii imnochimice folosite în laboratorul clinic Reactivii imunochimici sunt produse biologice (Ac, Ag, C, hematii), ce se utilizează pentru determinări calitative sau/şi cantitative de Ag sau Ac. Pentru a furniza informaţii corecte, reactivii imunochimici trebuie folosiţi conform instrucţiunilor de utilizare. Persoanele care execută tehnici imunochimice trebuie să verifice în permanenţă instrucţiunile de utilizare a produselor, încât permanenta optimizare a acestora se reflectă şi în modificarea instrucţiunilor respective. Manipularea reactivilor imunochimici trebuie făcută ţinând cont de toate normele de protecţia muncii în vigoare) Reacţia de precipitare În cazul reacţiei de precipiatere, Ag este o macromoleculă solubilă. Reacţia de precipitare poate avea loc în mediul solid (difuzia în gel) sau în mediul lichid. Formarea precipiatului depinde de: cantitatea şi concentraţia Ag, calitatea şi concentraţia Ac, temperatura, molaritatea, pH-ul, volumul de reacţie, conţinutul în lipide al antiserului, etc. Compoziţia precipitatului imun, proporţia de combinare a Ag cu Ac sunt variabile în funcţie de zona în care a avut loc precipitarea: exces de Ag, echivalenţă sau exces de Ac. a) Reacţia de precipitare în mediul solid Difuzia în gel Difuziile în gel se grupează în trei categorii: difuzia simplă, difuzia dublă, difuzia combinată cu migrarea în câmp electric. Se utilizează gel de agar sau agaroză în concentraţie de 0,8-1,6 g % (conţinutul mare de apă permite moleculelor de Ag şi Ac să migreze liber în gel). Difuzia poate fi accelerată de aplicarea unui câmp electric (contraimunoelecroforeză). În cazul dublei difuzii, are loc difuzia ambilor reactanţi. În acazul difuziei simple are loc difuzia unuia către celălalt reactant înglobat în faza solidă. Într-o zonă relativ îngustă se creează datorită gradientului de concentraţie condiţii optime pentru imunoprecipitare. În gelul transparent apar linii sau zone opace. Liniile se pot deplasa până când se ajunge la echilibrul sistemului ag-Ac. Nivelul liniilor corespunde numărului minim de sisteme Ag-Ac. Imunodifuzia radială simplă Imunodifuzia radială simplă sau imunodifuzia simplă bidimensională a fost imaginată de Mancini, Carbonara şi Heremans în 1965. Această metodă presupune difuzia unui reactant (în faza lichidă) într-un gel în care este înglobat celălalt reactant. În această tehnică Ac trebuie să fie în stare pură.
Dimensiunea haloului de precipitare este direct proporţională cu concentraţia Ag ce difuzează şi invers proporţională cu concentraţia şi înălţimea de gel în care sunt înglobaţi. Existenţa unei proporţionalităţi directe între concentraţia Ag şi diametrul zonei de precipitare pentru difuzia completă Mancini permite trasarea curbei etalon prin măsurarea diametrelor de precipitare a cel puţin trei concentraţii ale unui Ag de referinţă. Pentru obţinerea unei dimensiuni convenabile a zonei de precipiatre şi un contur bine delimitat, concentraţia Ac înglobat în gel trebuie aleasă în funcţie de titrul antiserului şi concentraţia Ag testat. Cantitatea de Ag introdusă în godeuri nu trebuie să depăşească capaciatea de legare a Ac înglobat. Timpul necesar difuziei complete este în funcţie de temperatura la care are loc reacţia (370C), de greutatea moleculară şi concentraţia Ag. Imunodifuzia radială simplă efectuată în condiţii optime prezintă coeficientul de variaţie sub 10%, iar sensibilitatea este de 2 µ g/ml. Concentraţia Ag (proteinei) se stabileşte în funcţie de curba etalon trasată cu trei diluţii ale serului dereferinţă. Rezultatele metodei se exprimă în mg/dl. Aplicaţii posibile sunt determinările cantitative pentru: imunoglobuline (IgG, IgA, IgM), complement (C3), alfa-1 antitripsină, siderofilină, proteina C-reactivă (CRP), etc. Dubla difuzie Ouchterlony Dubla difuzie a fost imaginată de Ouchterlony şi Elek în 1948. Tehnica se poate efectua în mai multe variate. În laboratorul clinic se foloseşte tehnica cu 4-6 godeuri rotunde dispuse în jurul unui godeu central. Liniile de precipitare se formează la distanţe constante pentru fiecare sistem AgAc. Se descriu trei tipuri de reacţii: - reacţia de identitate completă în care cele două Ag sunt complet identice: antiserul conţine Ac specifici faţă de Ag; liniile de precipitare deviază şi fuzionează complet în zona centrală - reacţia de neidentitate, absenţa deviaţiei liniilor. Antiserul conţine Ac diferiţi faţă de cele două Ag neînrudite, liniile de precipiatre se intersectează - reacţia de identitate parţială (fuziune parţială a liniilor). Cele două Ag prezintă un număr de grupări determinante comune, dar conţin şi unele distincte; antiserul are Ac faţă de cele două grupări Ag; linia de precipitare este curbată ca urmare a fuziunii parţiale a celor două linii şi prezintă un mic pinten. Aplicaţii posibile sunt determinările calitative pentru: proteinele Bence-Jones tip kappa şi lambda, crioglobuline. Difuzia combinată cu migrarea electroforetică Mobilitatea proteinelor în gelul supus câmpului electric se datoreşte încărcării electrice a proteinelor şi curentului electroendosmotic (migrarea tamponului spre catod). La pH-ul la care se efectuează electroforeza (EF), agarul se încarcă negativ, tamponul din porii acestuia se încarcă pozitiv şi la aplicarea câmpului electric migrează spre catod.
Deplasarea tamponului este inversă mişcării proteinelor, care la pH-ul neutru sau alcalin migrează spre anod (+). Dacă electroendosmoza este mai mare decât viteza de deplasare a proteinelor spre anod, acestea vor fi deplasate spre catod (-), deşi sunt încărcate tot negativ (ex. gamma globulinele se deplasează catodic la imunoelctroforeză şi contraimunoelectroforeză). Viteza fluxului osmotic este direct proporţională cu diferenţa de potenţial şi concentraţia gelului şi invers proporţională cu forţa ionică a tamponului. Viteza curentului electroendosmotic este de trei ori mai scăzută în gelul de garoză comparativ cu cel de agar, probele trebuie analizate, nu trebuie plasate la mijlocul lamei aşa cum se procedează în cazul gelului de agar. Imaginile de electroforeză se citesc cu ochiul liber (intensitatea spoturilor migrării), către anod a albuminei; către catod alfa, beta, gama globulinele. Imunoelectroforeza Metoda a fost imaginată de Grabar şi Williams în 1953. Transformarea într-o microvariantă executată pe lame de microscop se datoreşte lui Scheidegge în 1955. Imunoelectroforeza reprezintă asocierea electroforezei cu dubla difuzie. În prima etapă are loc electroforeza proteinelor, urmată de dubla difuzie cu un antiser corespunzător. Reacţia Ag-Ac se vizualizează prin linii de precipitare corespunzătoare sistemelor Ag-Ac din reacţie. Imunoelectroforeza (IEF) oferă numai informaţii calitative în diagnosticul gamapatiilor monoclonale. Metoda ilustrază în cazul componentei monoclonale a Ig, clasa şi tipul de Ig patologice. Metoda se foloseşte pentru studiul purităţii unui Ag sau Ac. Imunoelectroforeza bidimensională cantitativă a fost imaginată de Ressler (1960), Laurell (1965), Clarke şi Freeman (1968). Metoda combină EF în gel de agaroză cu imunodifuzia. Contraimunelectroforeza Metoda a fost imaginată de Bussard (1959), CIEF reprezintă o dublă difuzie în care deplasarea Ag şi Ac este accelerată de un câmp electric. În gelul de agar sau agaroză la pH 8,2-8,6 Ac se deplasează spre catod (-), Ag migrează către anod (+). Reacţia este mai sensibilă şi mai rapidă decât dubla difuzie. CIEF oferă informaţii calitative şi semicantitative. Electroimunodifuzia EID a fost imaginată de Laurell (1965). Se realizează prin electroforeza Ag în strat de gel ce conţine Ac monospecifici. Preciptatul Ag-Ac apare sub formă de rachete (conuri) a căror înălţime ste direct proporţională cu concentraţia Ag şi invers proporţională cu cea a Ac. Reacţia are sensibilitate mai mare decât IDRS. În cazul Ig se utilizează ca suport agarul sau agaroza. IgG migrează anodic în gelul de agar. IgA şi IgM migrează către anod în gelul de agaroză.
Reacţia prezintă unele dificultăţi la efectuare. Imunofixarea Metoda a fiost imaginată de Alper şi Johnson (1969). Cuprinde un grup de tehnici imunochimice care au comun EF probei în gel, combinată cu imobilizarea (fixarea) unui reactant de către celălalt (imobilizarea Ag de către ac cunoscut, fie invers). Precipitatele se evidenţiază după colorare. Metoda se utilizează pentru stabilirea clasei şi tipului de Ig monoclonală pentru diagnosticul imunochimic al bolii lanţurilor grele şi pentru diagnosticul deiferenţial al hipergamaglobulinemiilor monoclonale. b) Reacţia de precipitare în mediul lichid Urmare a reacţiei Ag-Ac în mediul lichid se formează complexe care precipită când cei doi reactanţi se găsesc în anumite proporţii. Inhibarea reacţiei este determinată de excesul unuia dintre aceştia. Reacţia este mai sensibilă pentru evidenţierea Ag (Ac participă la formarea complexelor în proporţie mai mare). Reacţia de precipiatre în mediul lichid presupune existenţa a cel puţin doi determinanţi antigenici pe molecula de Ag. Curbele de precipitare. Prin adăugarea unr concentraţii crescătoare de ag la concentraţii constante de Ac, în urma izolării şi analizării precipitatelor şi supernatantelor obţinute, se pot trasa curbe de precipiatre ce relevă existenţa a trei zone distincete. - zona excesului de Ac (precipitatul creşte la o nouă adăugare de Ag) - zona de echivalenţă (precipitatul rămâne constant la o nouă adăugare de Ag) - zona excesului de Ag (precipiatul scade la o nouă adăugare de Ag) Se cunosc două tipuri de curbe de precipiatre în mediul lichid. - curba de tip iepure. Prezintă un maxim rotunjit, indiferent de natura chimică a ag. Precipiatul este mai mult sau mai puţin solubil în exces de Ag, dar insolubil în exces de Ac. - curba de tip cal (curba de floculare). Curba pentru Ag proteice nu trece prin origine. Precipitatul este solubil atât în exces de Ac cât şi în exces de Ag. Reacţia de precipitare în inel Ag şi Ac se pun în contact încât să nu se amestece. La interfaţa celor doi reactanţi apare un inel de precipiare. Reacţia de precipitare în mediul lichid se efectuează în tubul capilar. Imunonefelometria În prezenţa unei cantităţi fixe de Ac sau Ag, complexele Ag-Ac precipitate într-o suspensie, modifică intensitatea şi dispersia luminii proporţional cu concentraţia Ag sau Ac.
Complexarea Ag cu Ac specific atinge o valoare maximă stabilă în aprox. 60 sec. Deoarece formarea complexelor care dispersează lumina este dependentă de prezenţa în proporţii optime a moleculelor de Ag şi Ac pentru o cantitate constantă de Ac (respectiv Ag), gradul de complexitate creşte proporţional cu cantitatea de Ag (respectiv de Ac) până la un maximum, după care Ag în exces determină scăderea progresivă a complexităţii; din această cauză se recomandă ca determinările nefelometrice să fie executate în exces moderat de Ac. Avantajele constau în rapiditatea obţinerii rezultatelor (automatizarea determinărilor). Evaluarea se exprimă în mg/l, automat în funcţie de curba existentă în memoria nefelometrului Dezavantajele nefelometriei constau în costul ridicat al aparaturii şi imposibilitatea determinării directe a proteinelor în probele icterice, hemolizate sau lactescente. Metoda este limitată şi de deficienţe ce pot să apară în sistemele mecanice şi electronice ale instalaţiei. 2. Reacţia de aglutinare Aglutinarea reprezintă agregarea de particule prin Ac. Ac reacţionează cu Ag (natural sau fixat artificial) de la suprafaţa unor particule (bacterii, hematii, latex) şi determină aglutinarea acestora. Aglutinarea depinde de o serie de factori: valenţa Ac (Ac din clasa IgM sunt mult mai aglutinanţi decât cei care aparţin clasei IgG), densitatea determinanţilor antigenici de la suprafaţa particulei, forţa ionică a mediului în care are loc reacţia. Aglutinarea se datorează scăderii forţelor de respindgere electrostatice dintre particule şi creeri unor punţi de legătură prin intermediul Ac. Reacţia de aglutinare are sensibilitatea mai mare decât reacţia de precipitare (Ag este o particulă şi nu o moleculă solubilă), excesul de Ag nu inhibă reacţia, concentraţiile mari de ac pot inhiba reacţia şi produce fenomenul de prozonă, raportul între Ag-Ac este tot în favoarea ac (ca şi la precipitare). Ac reacţionează numai cu determinantul Ag specific. Alături de Ac aglutinanţi există Ac neaglutinanţi (blocanţi sau incompleţi) şi Ac care aglutinează numai la rece (+40C). Reacţia de aglutinare directă Aglutinarea directă (aglutinarea simplă, clasică) este aglutinarea Ag naturale ale unor particule de către Ac specifici (ex. determinarea grupelor sanguine, aglutinarea bacteriană) Sensibilitatea acestui tip de aglutinare poate fi crescută prin tratarea celulelor cu enzime sau prin executarea reacţiei în mediul cu vâscozitate crescută. Reacţia de aglutinare indirectă Aglutinarea indirectă (pasivă) este o reacţie ce presupune particule naturale sau artificiale (hematii, stafilococ proteină A, latex) încărcate in vitro cu Ag sau Ac. Particulele sunt aglutinate de către Ac, respectiv Ag omolog din probă.
Hemagluinarea pasivă este o metodă deosebit de sensibilă de cercetare a Ac serici, imaginată de Gzegibes şi Sehon. Ac care nu pot produce reacţii vizibile cu Ag din cauză că se găsesc în ser în cantităţi reduse, pot fi evidenţiaţi prin metode de aglutinare pasivăă, crescând cantitatea de Ag prin absorbţia acstora pe un substrat inert. În acest fel, cantităţi mici de Ac produc aglutinări vizibile. Reacţia de inhibare a aglutinării Reacţia de aglutinare a particulelor încărcate cu Ag solubil este inhibată în cazul în care Ac reacţionează în prealabil cu Ag omolog (ex. diagnosticul imunologic de sarcină prin inhibarea aglutinării hematiilor sau prin inhibarea aglutinării latexului). Diferenţa principală între hemaglutinarea pasivă şi tehnica de inhibare a hemaglutinării este aceea că în prima metodă (hemaglutinarea) se investighează prezenţa Ac, în timp ce în a doua (inhibarea) se investighează prezenţa Ag. Reacţia de aglutinare mediată de anticorpi anti-imunoglobuline Ac anti-imunoglobuline aglutinează particule încărcate (natural sau artificia)l cu Ac (ex. decelarea FR prin reacţia Waaler-rose sau Latex-FR, decelarea Ac incompleţi fixaţi la suprafaţa hematiilor prin reacţia coombs). Reacţia de aglutinare poate fi calitativă de screening (ex. latex-FR, reacţia coombs) sau cantitativă (ex. reacţia Waaler-Rose, reacţia Coombs). Reacţia Latex-FR este mai sensibilă, iar reacţia Waaler-Rose este mai specifică. 3. Reacţia de neutralizare Antigenul este reprezentat de un imunogen cu proprietăţi biologice (toxină, enzimă, virus). Ac specifici determină (in vivo sau in vitro) blocarea acestor proprietăţi. Reacţia de neutralizare depinde de aviditatea Ac, adică de viteza cu care Ac se poate combina cu Ag şi de gradul de stabilitate a legăturii ag-Ac. Neutralizarea efectelor biologice ale Ag se constată numai în cazul în care situsul (toxic sau enzimatic) responsabil de activitatea biologică a Ag este identic cu situsul Ag. În laborator, acest tip de reacţie se utilizează pentru determinarea Ac antistreptolizină O prin reacţia ASLO (etapa finală de vizualizare este hemoliza) şi pentru identificarea unor virusuri. Testul ASLO este o reacţie de neutralizare (inhibare a hemolizei). Se bazează pe proprietatea streptolizinei de a produce liza hematiilor de diverse specii. 4. Reacţii ce utilizează complement În laboratorul clinic se execută patru reacţii de acest tip:
Reacţia de fixare a complementului Reacţia de fixare a complementului (RFC), hemoliză directă. J. Bordet a imaginat o metodă de vizualizare indirectă a unei reacţii Ag-Ac, folosind complement (C) şi un sistem indicator (hemolitic). Complexul Ag-Ac fixează C, iar hematiile sensibilizate adăugate ulterior rămân intacte (absenţa hemolizei înseamnă reacţie pozitivă), în lipsa complexului Ag-Ac specific (iniţial), C se fixează pe hematiile sensibilizate (sistemul indicator) producând hemoliza (hemoliza înseamnă reacţie negativă). Fixarea C pe complexul Ag-Ac este evidenţiată indirect prin absenţa hemolizei sistemului indicator din a doua etapă a reacţiei (ser antihematii berbec-hematii berbec) Activitatea anticomplement se datoreşte prezenţei complexelor Ag-Ac preformate, agregatelor de Ig şi a altor substanţe care pot activa calea clasică sau calea alternativă de activare a C. Testul de inhibare a hemolizei imune pasive în prezenţa complementului Testul este analog testului de inhibare a hemaglutinării, deosebirea esenţială constă în desfăşurarea reacţiei în prezenţa C. În cazul în care în prima etapă a reacţiei se formează complexul Ag-Ac nu mai rămân disponibili Ac care să reacţioneze cu hematiile sensibilizate, astfel încât în ultima etapă, C nu este cuplat cu hematiile sensibilizate şi acestea nu sunt lizate. În acest caz rezltatul testului este considerat pozitiv. În situaţia în care nu se formează complexul Ag-Ac, Ac liberi reacţionează cu hematiile sensibilizate şi are loc liza acestora, rezultatul testului este considerat negativ. În testul de imunohemoliză pasivă, interpretarea rezultatului se face în funcţie de gradul hemolizei obţinute, luându-se în considerare dimensiunile sedimentului de hematii şi intensitatea culorii supernatantului. Testul de inhibare a hemolizei imune pasive în prezenţa C investighează prezenţa Ag în ser, în timp ce testul clasic investighează prezenţa Ac în ser. Testul de imunohemoliză pasivă în prezenţa complementului Ca şi în cazul testului de hemaglutinare pasivă, Ag este fixat pe hematie şi reacţionează cu Ac specific, formându-se în acest fel complexe Ag-Ac. Realizarea acestui complex în prezenţa C determină liza hematiilor sensibilizate cu Ag. Determinarea imunohemolitică a complementului Se referă la reacţia Ag-Ac numai în măsura în care se foloseţte ca indicator sistemul hemolitic (hematii de berbec sensibilizate cu ser anti-hematii berbec). Reacţia măsoară activitatea hemolitică totală a sistemului complement. Metoda are ca punct final hemoliza 50%. Citirea se face la spectrofotometru.
5) Reacţii cu reactivi marcaţi Detectarea, localizarea şi identificarea antigenelor se poate realiza utilizând anticorpi care recunosc şi se leagă specific de antigenele respective. Vizualizarea complexului Ag-Ac format poate fi realizată prin marcarea Ac. Marcarea Ac trebuie să îndeplinească două condiţii: 1) să permită detectarea unor cantităţi infime de substanţă 2) să nu altereze capacitatea de legare a Ac la Ag corespunzătoare. În aceste reacţii se utilizează Ag sau Ac marcaţi: izotiocianatul de fluoresceină (produce strălucire caracteristică la examenul microscopic în lumina ultravioletă, Coons, 1942), izotopi radioactivi (Zalow şi Berson, 1960), şi enzime (au activitate asupra unui substrat-cromogen specific (Engwall şi Perlman, 1972). a) Reacţia de imunofluorescenţă În reacţia de imunofluorescenţă (IF) unul dintre reactanţi (Ag sau Ac de cercetat) trebuie să constituie o parte dintr-o structură biologică (celulă sau ţesut), reactivul marcat cu fluorocrom relevând reacţia Ag-Ac. Vizualizarea complexului Ag-Ac format poate fi realizată prin marcarea Ac. Substanţele fluorescente (fluorocromii) absorb lumina incidentă de diferite lungimi de undă şi emit o lumină vizibilă care este în funcţie de fluorocromul utilizat: albastră, verde, galbenă, roşie sau albă. Reacţia se poate realiza direct, indirect, cu fixarea complementului Reacţia de imunofluorescenţă directă Metoda directă (Coons) permite identificarea Ag specifice în preparate cu ajutorul conjugatului fluorescent anti-Ac. Se folosesc secţiuni de ţesuturi, seruri fluorescente antiIg şi anti-C. Reacţia de imunofluorescenţă indirectă Reacţia de imunofluorescenţă indirectă (IFI) vizualizează reacţia Ag-Ac prin aplicarea unui conjugat fluorescent anti-Ac. Se foloseşte pentru detectarea Ac fixaţi pe Ag. Serul de bolnav se pune în contact cu un substrat celular (tisular). Urmează incubarea preparatului cu un ser antiglobulină umană marcat cu izotiocianat de fluoresceină care vizualizează în lumină ultravioletă reacţia Ag-Ac. Testul poate fi folosit atât pentru determinarea Ag necunoscut cu ser imun cunsocut cât şi pentru detectarea ac necunoscuţi cu ag cunoscut. Reacţia de imunofluorescenţă cu fixarea complementului Complexul Ag-Ac fixează C. Metoda fixării C pe secţiuni de ţesut este derivată din metoda indirectă prin adăugarea C, apoi a serului marcat care va vizualiza complexul Ag-Ac-C.
b) Analiza radioimunologică Analiza radioimunologică (RIA) este o tehnică de determinare cantitativă a unui număr mare de substanţe prezente în lichidele biologice în cantitate foarte mică. RIA este o tehnică obiectivă, cu mare sensibilitate, parţial automatizată, aparatură costisittoare (echpament nuclear), reactivi scumpi, cu durată de utilizare scurtă, personal cu calificare specială, supusă unei legislaţii speciale (radioizotopi). c) Analiza imunoenzimatică În 1966, Avrameas şi Uriel introduc în histochimie marcarea enzimatică cu peroxidază, iar în 1971, Van Weemen şi independent Engwall şi Perlmann utilizează enzimele ca marker pentru reacţiile Ag-Ac. Analiza imunoenzimatică (EIA) se poate realiza în sistem omogen sau heterogen. -reacţia imunoenzimatică în sistem omogen constă în competiţia pentru Ac între Ag marcat enzimatic şi Ac de determinat (din probă). Activitatea enzimatică este invers proporţională cu concentraţia Ag din probă. -reacţia imunoenzimatică în sistem heterogen poate fi utilizată atât pentru determinatrea Ac cât şi a Ag. Activitatea enzimatică a conjugatului nu este influenţată de reacţia Ag-Ac şi necesită o etapă de separare. Avantajele EIA: obiectivă, poate fi automatizată, foloseşte reactivi cu valabilitate convenabilă, aparatura este simplă, are sensibilitate crescută, nu este supusă unei legislaţii restrictive ca RIA. Tehnica ELISA În cazul utilizării sistemelor de fază solidă pentru separarea moleculelor libere şi a celor marcate, tehnica este denumită ELISA (enzime linked immunosorbent asssay). Tehnica imunoenzimatică ELISA este bazată pe reacţia Ag-Ac. Sistemul de analiză constă din mai multe reacţii: - Ag sau Ac este imobilizat pe suport solid (plăci de pastic cu godeuri) - Ag sau Ac din proba de testat se leagă specific de reactantul imobilizat - reactantul marcat enzimatic reacţionează cu complexul reactant imobilizat-Ag (sau Ac) din probă. Reactantul marcat enzimatic format din Ag (sau Ac) conjugat cu o enzimă este activ atât imunologic cât şi enzimatic şi reacţionează atât cu Ag (sau Ac) din probă imobilizat pe suportul solid cât şi cu substratul corespunzător enzimei. Vizualizarea reacţiei dintre reactantul enzimatic şi complexul Ag-Ac iniţial se realizează prin adăugarea unui substrat corespunzător enzimei utilizate. Formarea complexului este identificată prin reacţia de culoare care apare la adăugarea substratului specific (p-nitrofenilfosfat disodic pentru fosfataza alcalină şi tetrametilbenzidina pentru peroxidază). Intensitatea culorii indică prezenţa sau absenţa Ag, respectiv Ac din probă (se citeşte spectrofotometric folosind un cititor de plăci ELISA).
Tehnica ELISA se poate folosi pentru evidenţierea Ac (boliinfecţioase, autoimune) sau a Ag (boli infecţioase, neoplazice, endocrinologice, farmacologie). 6. Tehnica Western Blot Tehnica cuprinde trei etape: separarea Ag prin electroforeză, transferul Ag, testarea probei de ser utilizând tehnica RIA sau ELISA. Numai partea a treia este efectuată în laboratoarele clinice. Tehnica WB este disponibilă sub formă de truse comerciale.
B. Metode şi tehnici de imunocitologie 1. Tehnica pentru celule lupice Tehnica pentru celule lupice (LE) este o tehnică morfologică de decelare a Ac antinucleari - gamaglobuline cu proprietăţi antinucleare (factorul Haserick) - ce apar în serul pacienţilor cu lupus eritematos sistemic (LES). Acest factor seric acţionează asupra nucleilor de leucocite şi îi transformă în corpusculi omogeni, care pierd structura cromatiniană şi îşi modifică colorabilitatea (corpusculi LE). Corpusculii LE sunt apoi fagocitaţi de leucocite intacte şi astfel apare imaginea caractertistică pe care o numim celulă LE. Procesul de omogenizare a nucleului şi de fagocitoză are loc in vitro. Interpretarea preparatelor presupune o experienţă temeinică de mIcroscopist (cunoaştere exactă a morfologiei celulelor LE). Celula LE este de obicei mai mare decât un polimorfonuclear. Caracteristică este culoarea roz-violacee a corpusculilor LE care nu prezintă nici o structură. În jurul corpusculilor LE apare, ca o semilună, nucleul celulei fagocitante, cu structura şi culoarea obişnuite. Imaginea de rozetă este gruparea leucocitelor în jurul unui corpuscul LE. 2. Testul reducerii NBT Determinarea procentului de granulocite care produc intracelular anion superoxid datorită activării oxidazelor celulare. La microscopul optic se determină procentul de celule care conţin depozite intracelulare albastre de formazan. 3. Chemiluminiscenţa Formarea speciilor reactive de oxigen (ROS) de către granulocitul PMN este asociată cu emisia de energie luminoasă. Emisia luminoasă poate fi intensificată cu ajutorul luminolului sau lucigeninei şi convertită de către un chemiluminometru în semnal electric. Rezultatele se exprimă în mV.
4. Testul inhibiţiei aderenţei leucocitelor Testul inhibiţiei aderenţei leucocitelor investighează răspunsul imun mediat celular în prezenţa unui Ag tumoral. Rezultatele sunt exprimate sub formă de indice de deviaţie a aderenţei (exprimă procentual creşterea sau scăderea aderenţei faţă de proba martor). 5. Imunofenotiparea cu ajutorul citometriei în flux Citometria în flux reprezintă o abordare tehnică de mare complexitate ce permite determinarea simultană a mai multor parametri fizici şi chimici caractweristici unei singure celule aflate în mişcare într-un curent de lichid. Metoda permite caracterizarea pe baze morfologice şi fenotipice a populaţiilor celulare din sângele periferic (limfocite, monocite, granulocite, etc.). Prin citometria în flux se pot determina procentele seturilor şi subseturilor limfocitare din sânge. 6. Testul de transformare blastică a limfocitelor Dacă o suspensie de limfocite prelevate de la un subiect sensibilizat se cultivă în vitro în prezenţa unui Ag se constată după un interval de timp creşterea numărului de celule blastice cu numeroase mitoze. Transformarea blastică a celulelor in vitro se datoreşte stimulării metabolismului celular ca urmare a reacţiei dintre Ag şi structura membranei limfocitelor. În urma cuplării Ag cu receptorii pe suprafaţa limfocitelor sensibilizate, membrana celulară se activează, declanşând transmiterea unui semnal spre nucleu, ceea ce determină iniţierea sintezei de ADN. Ca urmare, are loc creşterea dimensiunilor celulelor, nucleul devenind mai mare cu cromatina laxă şi citoplasma bazofilă. 5. Reacţia de limfocitotoxicitate Metoda a fost descrisă de Gorer, apoi a fost aplicată la om de Terasaki. Reacţia constă în a incuba la 370C o suspensie de limfocite în prezenţa C şi a antiserului. Dacă antiserul întâlneşte Ag corespunzător pe suprafaţa limfocitelor membrana celulelor este alterată şi permite trecerea colorantului în citoplasmă, colorând celulele. Citirea se face la microscopul optic. Testul este pozitiv când există un anumit procentaj de celule colorate. Testul serveşte pentru determinarea Ag de histocopatibilitate (HLA).
C. Principalele reacţii antigen-anticorp şi aplicaţiile acestora Testul pentru determinarea grupelor sanguine ABO şi Rh Reactivi pentru grupele de sânge ABO Reactivi Anti-A, Anti-B, Anti-AB sunt derivaţi din liniile de celule hibridizate care sunt obţinute prin fuzionarea anticorpilor de şoarece ce produc limfocite B cu celule de mielom. Anticorpii derivaţi dintr-o singură clonă (celulele apărute din celula hibrid), precum şi amestecul de diferiţi anticorpi derivaţi de la diferite clone sunt desemnaţi ca monoclonali: Anti-A, Anti-B, Anti-AB. Reactivii Anti-A, Anti-B, Anti-AB au fost evaluaţi în toate tipurile de teste, incluzând sisteme automate în paralel cu reactivii ABO convenţionali, policlonali. Nu s-au observat reacţii fals-pozitive şi fals-negative între serul monoclonal şi cel policlonal. Afinitatea serului reactiv a fost adesea mai puternică decât a serului policlonal, în mod special faţă de celulele de nou-născuţi şi subgrupele cu reactivitate slabă. Material biologic Se foloseşte sânge total (puncţie în deget) Modul de lucru I. Testul pe lamă A.Testul rapid -Se pune o picătură de anti-A, Anti-B, Anti-AB pe o lamă de sticlă -Se adaugă o picătură mică de sânge total şi se omogenizează bine -Se roteşte uşor lama timp de 2 min. -Se observă apariţia aglutinării. Aglutinarea apare între 30-60 sec Rezultatele negative pot fi semnalate după 2 min. B.Testul cu incubare -Se prepară o suspensie de celule 5-10% în soluţie salină izotonică sau se foloseşte sânge total -Se pune o picătură din fiecare reactiv Anti-A, Anti-B, anti-AB pe o lamă -Se adaugă o picătură de suspensie ori o picătură mică de sânge şi se amestecă bine -Se incubează 15-30 min. la temperatura de 200C -Se amestecă uşor şi se observă apariţia aglutinării II. Testul în tub -Se prepară o suspensie de celule de 3-5% în soluţie salină izotonică -Se pune o picătură de Anti-A, Anti-B, Anti-AB în tubul notat corespunzător -Se adaugă în fiecare tub o picătură din suspensia de celule şi se omogenizează bine -Se centrifughează 2 min. la 1000 rpm sau 20 sec. La 3000 rpm ori se incubează 20 min. la temperatura de 200C
-Se dislocă uşor butonul de celule şi se observă apariţia aglutinării Reactivul anti-D Anticorpi monoclonali umani din clasa IgM, obţinuţi din culturi celulare Se păstrează la 2-80C Conservare cu NaN3-0,1% Reactivul este pentru diagnosticul in vitro Reactivi Conţine anticorpi monoclonali de origine umană din clasa IgM, obţinut din culturi celulare. Specificitatea şi reproductibilitatea sunt proprietăţi bine cunoscute la anticorpii monoclonali. Majoritatea reactivilor anti-D monoclonali aparţin clasei de IgM. Modul de lucru I. Testul pe lamă A. Testul rapid Testul trebuie efectuat pe o suprafaţă ce are temperatura cuprinsă între 20-370C -Se pune o picătură de reactiv Anti-D pe lamă -Se adaugă o picătură mică de sânge total. Se omogenizează bine. -Se roteşte energic lama 2 min. Se observă dacă apare aglutinarea -Se citeşte rezultatul după 2 min. (suprafaţa uscată poate fi interpretată ca o reacţie falspozitivă. B. Testul cu incubare Se poate folosi sânge total sau suspensia de celule -Se prepară o suspensie de 5-10% din celule ce trebuie testate în soluţie salină izotonică sau se foloseşte sânge total -Se pune câte o picătură de reactiv anti-D în cerculeţele lamei, ce se vor folosi -Se adaugă o picătură de suspensie sau o picătură mică de sînge total şi se omogenizează bine -Se incubează 30 minla 20-370C -Se agită uşor lama şi se observă aglutinarea II. Testul în tub -Se pregăteşte o suspensie 3-5% din celule ce trebuie testate în soluţie salină izotonică -Se pune o picătură de reactiv anti-D în tubul-probă -Se adaugă în fiecare tub o picătură din suspensia de celule şi se omogenizează bine -Se centrifughează 2 min. la 1000 rpm -Se dislocă uşor butonul de celule şi se observă prezenţa aglutinării. Dacă reacţia este negativă se incubează tubul 15 min. la 200C, se centrifughează 2 min la 1000 rpm, se dislocă uşor butonul de celule şi se observă aglutinarea.
Grupa A Grupa B Grupa O Grupa AB
Anti-A + +
Anti-B + +
Anti-AB + + +
Testul pentru determinarea anticorpilor antistreptolizina O Reacţia ASLO Test calitativ şi cantitativ pentru explorarea stării de imunitate antitoxică faţă de toxinele streptococului. Testul este bazat pe reacţia de aglutinare. Testul permite stabilirea diagnosticului anginei streptococice sau de infecţii streptococice, ca şi a celui de reumatism articular acut (RAA). Menţinerea titrului ASLO crescut chiar şi la câteva luni după puseul reumatismal permite stabilirea diagnosticului retrospectiv al bolii. Principiul metodei Reactivul folosit este o suspensie de particule latex de polistiren încărcate cu streptolizina O stabilizată. Reactivul a fost astfel preparat încât, în prezenţa unui titru ASLO normal de 200 ui/ml sau mai crescut, să dea o aglutinare vizibilă a particulelor latex, fără diluarea serului. Reactivi 1 flacon cu reactiv latex de 5 ml 1 flacon cu control pozitiv de 1 ml 1 flacon cu control negativ de 1 ml 1 plăcuţă pe care se efectuează reacţia Material biologic Serul de cercetat trebuie să fie clar şi proaspăt. Plasma, serul lipemic ori contaminat poate determina erori în obţinerea rezultatelor. Dacă testul nu poate fi efectuat imediat, atunci serul se păstrează la 2-80C, maximum 72 ore. Pentru o perioadă mai îndelungată serul trebuie să fie păstrat congelat. Modul de lucru I.
Testul ASLO calitativ
-Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei înaintea folosirii cu 30 min -Se pun 2 picături (50 µ l) de control (+) în unul din cercurile plăcuţei de testare.
-Se pun 2 picături (50 µ l) de control (-) în al doilea cerc. -Cu o pipetă se pun câte o picătură de ser (45 µ l) din fiecare probă în cercurile următoare. -Se agită uşor suspensia de reactiv latex şi se pune în fiecare cerc folosit câte o picătură de reactiv. Pentru omogenizare se foloseşte un beţişor pentru fiecare test în parte. -Se roteşte plăcuţa 2 min şi se citeşte aglutinarea imediat lângă o sursă de lumină. II.
Testul ASLO cantitativ
-Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei, înainte de folosire cu 30 min. -Se diluează probele 1/2; 1/4; 1/8 1/16 în soluţie salină izotonică. Se pot face diluţii şi mai mari dacă este necesar -Se pune 1 picătură (45 µ l) din fiecare diluţie în succesiunea de cercuri ale plăcuţei de testare -Se agită reactivul latex şi se adaugă o picătură de reactiv în fiecare cerc de testare. -Se omogenizează cele două picături folosind un beţişor pentru fiecare probă -Se roteşte uşor placa 2 min. şi se citeşte rezultatul imediat în dreptul unei surse de lumină Interpretarea testului Reacţia ASLO negativă: obţinerea unei suspensii lăptoase, fără aglutinare, ca cea observată la controlul negativ Reacţia ASLO pozitivă: obţinerea unei aglutinări observată în cercul probei asemănătoare cu cea observată la controlul pozitiv. Reacţia ASLO indică starea de imunitate antitoxică faţă de streptococ. Valori normale: între 0-200 ui Valori crescute: I. > 200 ui La pacienţii care au avut în ultimele trei luni o angină streptococică sau alte infecţii streptococice II. > 300 ui În infecţii streptococice: glomerulonefrită acută streptococică, scarlatină, purpură reumatoidă III. 600-2500 ui În reumatismul articular acut, reacţia ASLO ajută în stabilirea diagnosticului retrospectiv al bolii, deoarece titrul anticorpilor antistreptolizină O se menţine crescut timp de câteva luni după puseul reumatismal acut. Titrul ASLO creşte odată cu evoluţia puseului reumatismal. Reacţia ASLO este pozitivă în stenoză mitrală, amigdalită acută streptococică, endocardita streptococică lentă. Observaţii Reactivii conţin azidă de sodiu ce se poate combina cu Cu şi Pb, putând asfel deveni explozibili.
Controlul pozitiv şi negativ a fost preparat din ser uman care a fost testat folosind metoda licenţiată FDA şi s-a demonstrat că nu reacţionează cu anticorpii pentru AgHBs şi HCV. Toate probele umane pot fi considerate potenţial infectate. Reactivii şi controalele sunt stabile până la data expirării, dacă sunt păstrate la temperatura de 2-80C. Reactivii nu se păstrează la congelator. Testul pentru identificarea proteinei C reactive Testul este utilizat pentru identificarea proteinei C reactive (CRP) în ser pentru diagnosticul unor afecţiuni inflamatorii sau pentru monitorizarea inflamaţiei. Principiul metodei Reactivul CRP este o suspensie de particule latex de polistiren, marcate cu o fracţiune de gamaglobulină a serului anti-uman CRP specific. Când CRP este prezentă în probă, se observă o aglutinare ce indică un conţinut de 6 mg/l. Reactivi 1 flacon cu reactiv latex de 5 ml 1 flacon cu control pozitiv de 1 ml 1 flacon cu control negativ de 1 ml 1 plăcuţă pe care se efectuează reacţia Material biologic Se foloseşte ser clar şi proaspăt. Plasma, serul lipemic, ori contaminat poate duce la erori în obţinerea rezultatelor. Dacă testul nu poate fi făcut imediat, serul se păstrează la 2-80C, pentru 72 de ore. Pentru o perioadă mai îndelungată, serul trebuie păstrat congelat. Modul de lucru -Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei înaintea folosirii cu 30 min. -Se pun 2 picături (50 µ l) de control (+) în primul cerc şi 2 picături în al doilea cerc al plăcuţei de testare -Se pune o picătură (45 µ l) de ser nediluat din fiecare probă în cercurile ce urmează -Se agită uşor suspensia de reactiv latex -Se pune în fiecare cerc folosit o picătură (45 µ l) Pentru omogenizare se foloseşte un beţişor pentru fiecare test efectuat -Se roteşte plăcuţa 2 minute şi se citeşte rezultatul imediat în dreptul unei surse de lumină Interpretarea rezultatelor Reacţia negativă: apariţia unei suspensii lăptoase, fără aglutinare, ca cea observată în controlul negativ Reacţia pozitivă: orice aglutinare observată la proba asemănătoare celei observate la controlul pozitiv Proteina C reactivă nu este prezentă în serul pacienţilor aparent sănătoşi.
Determinarea CRP poate servi la monitorizarea activităţii inflamatorii, fie ca rezultat al terapiei, fie al remisiunii spontane Valori normale: <6 mg/l Valori crescute: I. În faza iniţială a inflamaţiei în -infecţii bacteriene: pneumonii -infarct miocardic, stări postoperatorii, afecţiuni maligne, mielom multiplu, lupus eritematos sistemic (LES) II. Alte afecţiuni -febre reumatice, afecţiuni reumatice diverse, colagenoze, tuberculoza activă Observaţii Reactivii conţin azidă de sodiu ce se poate combina cu Cu şi Pb, putând deveni explozibili. Controlul pozitiv şi negativ din ser uman, a fost testat prin metoda licenţiată FDA şi s-a demonstrat că nu reacţionează cu anticorpii pentru AgHBs şi HIV. Toate probele umane pot fi considerate potenţial infectate. Reactivii şi controalele sunt stabile până la data expirării, dacă sunt păstrate la temperatura de 2-80C, maximum 72 de ore. Reactivii nu se păstrează congelaţi. Testul pentru identificarea factorului reumatoid Principiul metodei Reactivul pentru factorul reumatoid (FR) este o suspensie de particule latex de polistiren încărcate cu IgG uman. Sensibilitatea reactivului FR detectează o concentraţie minimă de 8 ui/ml, în acord cu WHO Internaţional Standard, fără diluarea probei. În mod practic, particulele de polistiren-latex învelite cu gamaglobulină denaturată sunt aglutinate de seruri ce conţin FR. Reactivi 1 flacon cu reactiv latex de 5 ml 1 flacon cu control pozitiv de 1 ml 1 flacon cu control negativ de 1 ml 1 plăcuţă pe care se efectuează testul Material biologic Se foloseşte ser clar şi proaspăt. Plasma, serul lipemic sau contaminat poate duce la erori în obţinerea rezultatelor. Dacă testul nu poate fi făcut imediat, serul se păstrează la 2-80C, pentru 72 de ore. Pentru o timp mai îndelungat, serul trebuie păstrat congelat. Modul de lucru -Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei înaintea folosirii cu 30 min -Se pun 2 picături (50 µ l) de control (+) în primul cerc şi 2 picături în al doilea cerc al plăcuţei de testare
-Se pune o picătură (45 µ l) de ser nediluat din fiecare probă în cercurile ce urmează -Se agită uşor suspensia de reactiv latex -Se pune în fiecare cerc folosit o picătură (45 µ l) Pentru omogenizarea conţinutului se foloseşte un beţişor pentru fiecare test efectuat -Se roteşte plăcuţa 2 minute şi se citeşte rezultatul imediat în dreptul unei surse de lumină Interpretarea rezultatelor Reacţia negativă: apariţia unei suspensii lăptoase, fără aglutinare, ca cea observată în controlul negativ Reacţia pozitivă: orice aglutinare observată la proba întocmai celei observate la controlul pozitiv Factorii reumatoizi sunt imunoglobuline cu activitate de anticorpi. FR sunt prezenţi la pacienţii care prezintă poliartrită reumatoidă (PR). În continuare se recomandă folosirea testului Waaler-Rose-test specific pentru determinarea FR împotriva IgG de animal Factorul reumatoid este prezent şi la persoanele aparent sănătoase. Peste vârsta de 60 de ani, frecvenţa FR este de 5-6% Valori normale: între 0-6 ui/ml Valori patologice: Reacţia pozitivă: poliartrită reumatoidă; boli de colagen (la 10-50%), ex: lupus eritematos sistemic, sclerodermie; unele disglobulinemii (ex: Kala-Azar, maladia Waldenström) Reacţia negativă: gută, reumatism articular acut, artroze Observaţii Reactivii conţin azidă de sodiu ce se poate combina cu Cu şi Pb, putând deveni explozibili. Controlul pozitiv şi negativ din serul uman, a fost testat prin metoda licenţiată FDA şi s-a demonstrat că nu reacţionează cu anticorpii pentru AgHBs şi HIV. Toate probele umane pot fi considerate potenţial infectate. Reactivii şi controalele sunt stabile până la data expirării, dacă sunt păstrate la temperatura de 2-80C. Reactivii nu se congelează. Serurile contaminate sau citirea mai târziu de 3 min., pot da reacţii fals-pozitive. Nu se poate pune un diagnostic doar pe baza unui singur test, este necesară corelarea cu datele clinice. Testul pentru identificarea Factorul Reumatoid (FR) în serul şi lichidul articular cu reactivul Waaler-Rose Principiul metodei Reactivul Waaler-Rose este o suspensie stabilizată de hematii de oaie sensibilizate la rândul lor cu anti IgG de şoarece. Sensibilitatea reactivului este pentru a detecta o cantitate minimă de FR de 6 ui/ml în acord cu WHO Internaţional Standard), fără diluarea probei. Material biologic
Se foloseşte serul clar şi proaspăt. Plasma, serul lipemic, ori contaminat poate duce la erori în obţinerea rezultatelor. Dacă testul nu poate fi făcut imediat, serul se păstrează la 2-80C, pentru 72 de ore. Pentru un timp mai îndelungat, serul trebuie păstrat congelat. Modul de lucru I.
Testul calitativ
-Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei înaintea folosirii cu 30 min. -Se agită bine reactivul astfel încât particulele să se disperseze -Se pun 2 picături (50 µ l) de ser nediluat din fiecare probă în cercurile plăcuţei de testare -Se adaugă o picătură de reactiv în fiecare cerculeţ utilizat -Se omogenizează conţinutul cu un beţişor pentru fiecare test efectuat -Se pune plăcuţa pe o suprafaţă plană 2 min. -După expirarea timpului se apleacă plăcuţa la 450 şi se aşteaptă 1 min. -Se citeşte prezenţa sau absenţa aglutinării vizibile aparută în acest timp. Dacă se depăşeşte timpul, atunci se va citi o reacţie de aglutinare nespecifică. Prezenţa aglutinării indică prezenţa în ser a unei cantităţi de FR egal cu 6 ui/ml. Scăderea intensităţii aglutinării indică un nivel mai scăzut. II.
Testul semicantitativ
Acest test se realizează prin efectuarea unor diluţii succesive ale serului în soluţie salină izotonică. Diluţii Serul probei Soluţie salină 100 µ l
12
14
100 µ l
100 µ l 100 µ l 100 µ l
18
100 µ l
116 100 µ l
100 µ l
Volumul probei
50 µ l
50 µ l
50 µ l
50 µ l
Calcularea conc.
6x2
6x4
6x8
6x16
Factorii reumatoizi sunt imunoglobuline cu activitate de anticorpi. Factorii reumatoizi sunt prezenţi la majoritatea pacienţilor cu poliartrită reumatoidă (PR). Interpretarea rezultatelor Valori normale: între 0-6 ui/ml
Valori patologice: poliartrita reumatoidă (95% dintre cazuri), în unele colagenoze (lupusul eritematos sistemic, dermatomiozită), în unele forme de neoplasm şi unele hemopatii maligne, intr-un numar mare de afecţiuni reumatismale ale copilăriei (spondilartrita anchilozantă), boli infecţioase (sifilis, TBC, hepatita virală), boli respiratorii (astm bronşic, fibroza pulmonară, bronşite). Observaţii Reactivii conţin azidă de sodiu ce se poate combina cu Cu şi Pb, putând deveni explozibili. Controlul pozitiv şi negativ din ser uman, a fost testat prin metoda licenţiată FDA şi s-a demonstrat că nu reacţionează cu anticorpii pentru AgHBs şi HIV. Toate probele umane pot fi considerate potenţial infectate. Reactivul se va agita bine înainte de folosire, astfel încât suspensia să fie bine omogenizată. Sensibilitatea testului depinde de volumul picăturii (50 µ l). Reactivii şi controalele sunt stabile până la data expirării, dacă sunt păstrate la temperatura de 2-8 0C. Reactivul nu se păstrează congelat. Serurile contaminate sau citirea mai târziu de 3 min., pot da reacţii fals-pozitive. Nu se poate pune un diagnostic doar pe baza unui singur test, este necesară corelarea cu datele clinice. Testul pentru identificarea AgHBs Principiul metodei Testul pentru identificarea AgHBs este un test rapid se efectuează din ser, este util în diagnosticul infecţiei cu virusul hepatitic B. Rezultatul testului poate fi citit vizual, fără niciun instrument. Testul se bazează pe principiul determinării semicantitative a AgHBs din ser, cu ajutorul metodei imunoenzimatice de tip “sandwich”. Anticorpii monoclonali şi policlonali sunt folosiţi pentru identificarea AgHBs cu o înaltă sensibilitate. Testul durează aprox. 15 min. Reactivi 25 de plăcuţe imunocromatografice Reactivul 1=enzima conjugată Reactivul 2=soluţia de spălare Reactivul 3=soluţia revelatoare Material biologic Pacientul nu necesită o pregătire prealabilă. -Se recoltează sânge fără anticoagulant -Se lasă sângele să se coaguleze -Se separă serul Dacă probele nu pot fi testate în ziua recoltării, serul se păstrează în frigider sau congelat. Nu se recomandă congelare şi decongelare repetată. -După decongelare, serul se omogenizează bine.
Modul de lucru -Se aduc toţi reactivii, plăcuţa şi toate materialele necesare la temperatura camerei înainte de efectuarea testului cu 30 min. Nu se amesteca capacele eprubetelor ce conţin probe -Se adaudă 300-400 µ l de ser în situsul de testare. Se lasă serul să se absoarbă complet -Se adaugă 2 picături Reactiv 1 (Enzima conjugată). -Se lasă soluţia să se absoarbă complet. Se aşteaptă 10 min. -Se adaugă 8 picături Reactiv 2 (Soluţia de spălare) în situsul de testare. -Se lasă ca soluţia să se absoarbă complet. -Se îndepărtează filtrul -Se adaugă 3 picături Reactiv 3 (Revelator de culoare) în situsul de testare. -Se lasă ca soluţia să se absoarbă complet. -Se adaugă încă 5 picături Reactiv 3 -Se citeşte rezultatul după 3 min. Interpretarea rezultatelor Negativ: sunt vizibile doar cele 3 spoturi mici Intens pozitiv: toate cele trei spoturi mici şi spotul mare sunt vizibile, iar spotul mare este intens colorat Slab pozitiv: apar cele 3 spoturi mici şi spotul central, dar spotul mare nu foarte intens colorat Neconcludent: când spotul central este vizibil, dar cele mici nu sau când nu apare nici un spot. Se repetă testul Observaţii Kitul trebuie păstrat la temperatura de 2-80C. După deschiderea pachetului, kitul poate fi păstrat la temperatura camerei o săptămână, dar nu la temperaturi mai mari de 300C. Flaconul cu reactiv reprezintă enzima conjugată şi trebuie păstrată la 2-80C. Testul calitativ pentru identificarea AgHBs Principiul metodei Reactivul este o suspensie de particule latex de polistiren ]nc[rcate cu gamaglobulină anti-HBs înalt purificată. Când AgHBs este prezent în probă se observă o aglutinare evidentă. Reactivi 1 flacon cu reactiv latex de 5 ml 1 flacon cu control pozitiv de 1 ml 1 flacon cu control negativ de 1 ml 1 plăcuţă pe care se efectuează reacţia Material biologic
Se foloseşte ser clar şi proaspăt. Probele pot fi păstrate la 2-80C pentru 48 de ore, înainte de efectuarea testului. Pentru o perioadă mai lungă serul trebuie păstrat congelat Modul de lucru -Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei cu 30 min. înaintea folosirii -Se agită uşor reactivul pentru dispersia particulelor şi pentru omogenizare -Pentru fiecare probă se pregăteşte o eprubetă etichetată şi se adaugă în 2 ml soluţie salină izotonică, 50 µ l de probă (diluţie 1/40) -Se pipetează 1 picătură de control negativ şi pozitiv nediluat în câte un cerculeţ al plăcuţei. -Se pipetează 50 µ l de probă diluată într-un cerculeţ al plăcuţei şi 50 µ l de probă nediluată într-un alt cerculeţ -Se adaugă o picătură de suspensie latex AgHBs în fiecare cerculeţ utilizat. Se amestecă ambele picături de pe plăcuţă cu un beţişor -Se roteşte plăcuţa manual sau cu un rotator (60-80 rpm) timp de 5 min. -Se citeşte imediat lângă o sursă de lumină aglutinarea -Sensibilitatea testului descreşte proporţional cu temperatura camerei Rezultatul testului calitativ:
Negativ Pozitiv Conc. scăzută Conc. medie Conc. mare
Proba nediluată
Proba diluată
Aglutinare.-
Aglutinare –
Aglutinare + Aglutinare+ Aglutinare -
Aglutinare – Aglutinare + Aglutinare +
Observaţii Reactivii conţin azidă de sodiu care în contact cu plumbul şi cuprul ţevilor poate forma azidă metalică explozivă. După îndepărtarea reactivilor se spală sistemul de scurgere cu un volum mare de apă. Reactivii se aruncă sub jet de apă pentru a preveni formarea de azidă metalică explozivă . Controlul pozitiv prezintă caracteristicile antigenice nu şi pe cele infecţioase. Totuşi, nici o metodă de testare nu poate oferi siguranţa absolută. Toate probele umane pot fi considerate potenţial infectate. Testul pentru identificarea anticorpilor anti-HBs Principiul metodei Acesta este un test rapid pentru identificarea anticorpilor anti-HBs în ser, fiind util în diagnosticul infecţiei cu virusul hepatitic B. Rezultatele pot fi citite vizual. Testul se bazează pe principiul determinării semicantitative a anticorpilor antiHBs în ser cu ajutorul metodei imunoenzimatice de tip “sandwich”. Anticorpi sintetici şi
recombinaţi sunt folosiţi pentru identificarea specifică a anticorpilor anti-HBs, metoda prezintă o sensibilitate crescută. Anticorpii anti-HBs mai mici de 10 mui/l pot fi detectaţi în 10-15 min. Spotul mare sau linia celor 3 spoturi mici ne ajută la citirea rezultatelor pozitive şi negative. Cele 3 spoturi mici servesc pentru controlul intern. Spotul mic central este un control slab pozitiv, celelalte 2 spoturi laterale sunt pentru controlul intens pozitiv. Aceste spoturi apar cînd reacţia imunoenzimatică este completă Reactivi 25 de pliculeţe imunocromatografice R1 Enzima conjugată R2 Soluţia de spălare R3 Soluţia de developare Kitul se păstrează la temperatura de 2-80C. După deschiderea pachetului, acesta poate fi păstrat la temperatura camerei o săptămână, dar nu la temperaturi mai mari de 300C. Flaconul cu enzima conjugată trebuie păstrat la 2-80C. Material biologic Pacientul nu necesită în prealabil o pregătire. Se recoltează sânge într-o eprubetă fără anticoagulant. Se lasă sângele să se coaguleze şi se separă serul. Dacă probele nu pot fi lucrate în ziua recoltării, serul se păstrează în frigider sau congelator. Se evită congelarea şi decongelarea repetată. După decongelare serul trebuie să se omogenizeze. Modul de lucru -Se aduc toţi reactivii, plăcuţa, probele şi toate materialele necesare la temperatura camerei înainte de efectuarea testului. Pentru fiecare test se foloseşte o singură casetă. -Cu pipeta se adaugă 3 picături de soluţie de spălare (R2) în dispozitivul de testare. Se lasă să se absoarbă complet soluţia înaintea continuării testării. -Se adaugă 300-400 µ l de ser în situsul de testare. -Se adaugă 2 picături de Reactiv 1 (Enzima conjugată). Se lasă reactivul să se absoarbă complet (se aşteaptă 10 min). -Se adaugă 8 picături de Reactiv 3 (Soluţia de developare) în situsul de testare. Din nou se lasă să se absoarbă complet -Se adaugă alte 5 picături de Reactiv 3. Se lasă 2 min -Se citeşte rezultatul Interpretarea rezultatelor Negativ: sunt vizibile doar cele 3 spoturi mici Intens pozitiv: Sunt vizibile toate cele 3 spoturi mici şi spotul mare. Spotul mare este intens colorat Slab pozitiv: Apar cele 3 spoturi mici şi spotul mare central, dar spotul mare nu este foarte intens colorat Neconcludent: Când spotul central este vizibil, dar cele mici nu sunt vizibile sau când nu apare nici un spot. În această situaţie se recomandă repetarea testului.
Testul pentru identificarea anticorpilor anti-HCV Principiul metodei Este un test rapid pentru identificarea anticorpilor anti-HCV din ser, care ajută la diagnosticul infecţiei cu virusul hepatitic C. Se bazează pe principiul reacţiei imunoenzimatice, determinându-se anticorpii anti-HCV în ser. Antigenele sintetice şi recombinate HCV sunt folosite pentru identificarea specifică a anticorpilor anti-HCV cu înaltă specificitate. Testul durează 3 min. Anticorpii anti-HCV nu reacţionează cu IgM, iar IgG este marker pentru HCV. Formarea unui spot mare (Ref. A) şi o linie cu 3 spoturi mici indică un rezultat pozitiv sau negativ. Cele 3 spoturi mici servesc ca un control intern. Spotul central mic indică un control slab pozitiv şi cele 2 spoturi laterale indică un control intens pozitiv. Acestea apar după ce reacţia imunoenzimatică este completă. Reactivi 25 de teste (fiecare plăcuţă imunocromatografică este pentru un test) 2 flacoane cu soluţie conjugată de aur coloidal Material biologic Recoltarea probelor nu necesită pacientului o pregătire specială. Recoltarea sângelui se face într-o eprubetă fără anticoagulant. Se foloseşte numai ser. Modul de lucru -Se aduc toţi reactivii, plăcuţa, probele şi orice alte materiale necesare la temperatura camerei înainte de efectuarea testului -Se adaugă 10 picături de soluţie conjugat în spaţiul de reacţie de pe plăcuţă -Se adaugă 30 µ l ser peste soluţia conjugat şi se agită -Folosind o pipetă se transferă toată soluţia din spaţiul de reacţie respectiv peste prefiltrul care acoperă spaţiul în care se găseşte hârtia imunocromatografică -Se lasă ca probele să fie absorbite complet de pre-filtru -Se aşteaptă să apară spoturile de control înainte de a continua următoarea etapă. -Se adaugă 10 picături de soluţie conjugat peste prefiltru -Se lasă să se absoarbă toată soluţia -Se îndepărtează prefiltrul plăcuţei -Se citeşte rezultatul Interpretarea rezultatelor Negativ: dacă numai cele 3 spoturi mici de pe linia de control sunt vizibile. Uneori datorită concentraţiei crescute a probei poate să apară şi un spot superior liniei de control, mai puţin intens colorat Pozitiv: spotul superior şi linia de control sunt vizibile Slab pozitiv: spotul superior apare mai puţin intens, dar este însoţit de linia de control
Neconcludent: când apare doar spotul central şi linia de control nu apare sau când atât spotul central cât şi linia de control nu apare. În acest caz se recomandă repetarea testului. Testul pentru identificarea anticorpilor anti-Helicobacter pylori Principiul testului Este un test vizual, rapid, pentru identificarea calitativă a IgG specifice antiHelicobacter pylori în serul uman. Acest kit este utilizat pentru diagnosticul infecţiei cu Helicobacter pylori la pacienţi cu simptome gastro-intestinale. Testul este conceput pentru detectarea anticorpilor specifici anti-Helicobacter pylori din serul uman. Folosirea corectă a testului permite detectarea infecţiei cu Helicobacter pylori la pacienţi simptomatici. Această informaţie poate fi folosită în urmărirea de către medic a evoluţiei bolii. Testul este destinat detectării infecţiei prin interpretarea vizuală a culorii apărute în dispozitivul de testare, care este o fază solidă de tip “sandwich” colorată prin conjugare într-o reacţie imună neenzimatică. Membrana a fost acoperită cu antigen de Helicobacter pylori în zona benzii testului şi cu anticorpi de capră anti-şoarece în regiunea benzii de control. În timpul testului, serul diluat al pacientului este lăsat să reacţioneze cu conjugatul colorat (antigenul de Helicobacter pylori – coloidul de aur conjugat), care a fost precolorat în conţinutul din interiorul casetei. Amestecul va circula in membrana cromatografică prin capilaritate. Când anticorpii specifici, adică IgG sunt prezente în probă, va apărea o bandă colorată cu complexele antigen-anticorp. Pe de altă parte, o bandă colorată va apare intotdeauna în zona de control. Această bandă de control este un indicator al utilizării corecte a testului. O culoare distinctă apărută în regiunea benzii-test indică un rezultat pozitiv, iar absenţa benzii colorate în regiunea testului reprezintă un rezultat negativ Reactivi Dispozitivul testului: Fiecare casetă conţine o bandeletă de testare cu antigen Helicobacter pylori, acoperită cu agentul colorant. Soluţia de diluţie: fosfat tamponat salin, cu Tween 20 şi conservant Material biologic Sângele recoltat prin flebotomie este colectat intr-o eprubetă fără anticoagulant. Se lasă sângele să se coaguleze. Se separă serul prin centrifugare. Serul se păstrează la 280C până la 2 săptămâni. Serul poate fi păstrat la –200C până la 1 an. Modul de lucru -Inainte de testare, plăcuţa-test şi proba de ser a pacientului se aduc la temperatura camerei (20-300C). -Se scoate plăcuţa-test din punga de protecţie -Se etichetează testul cu numele sau numărul de identificare al pacientului -Se pipetează 20 µ l din proba de ser în 180 µ l soluţie de diluţie -Se adaugă în dispozitivul de testare 3-4 picături de soluţie peste 20 µ l ser
-Se citeşte rezultatul în 5 min Interpretarea rezultatelor Negativ: când apare o singură bandă roşie în zona benzii de control. Nu apare nici o bandă roşie în zona benzii de testare Pozitiv: în afara benzii de control, apare o bandă roşie în regiunea liniei de testare Neconcludent. Cînd nu apare nici o bandă în nici una din regiuni, procedura de testare a fost probabil nerespectată sau reactivii au fost probabil alteraţi Majoritatea subiecţilor care prezintă infecţia cu Helicobacter pylori au nivelurile de IgG crescute. Se estimează că Helicobacter pylori este prezent la 50% din populaţia globului. Incidenţa anticorpilor anti-Helicobacter pylori este în funcţie de vârstă, rasă, zona geografică, starea clinică. O parte relativ mare de pacienţi care au valori pozitive ale nivelurilor de anticorpi sunt asimptomatici, deşi sunt infectaţi cu Helicobacter pylori. Nivelurile de anticorpi nu se corelează cu severitatea simptomelor clinice Observaţii Kiturile trebuie să fie păstrate la frigider (2-80C) sau la temperatura camerei (15300C) în punga de garanţie cu 1g deshidratant pentru păstrarea valabilităţii. Kitul este folosit numai pentru diagnosticul in vitro. A nu se folosi după data expirării. A nu se deschide punga casetei cu teste până nu sunteţi gata să efectuaţi testul. Serurile icterice, lipemice, hemolizate sau contaminate pot furniza rezultate eronate. Testul imunologic pentru identificarea antigenului de Chlamydia Principiul metodei Testul este imunologic, calitativ, rapid, bazat pe principiul imunocromatografiei. Principiul testului constă în plasarea probei într-un tub de reacţie ce conţine soluţia A. După 2 min se adaugă în tub soluţia de extracţie B. După ce s-a realizat extracţia, se adaugă 3 picături (aprox. 200 µ l) din proba obţinută în locaşul pentru probă al casetei-test. În caseta-test, în regiunea benzii de testare, membrana se acoperă în prealabil cu anticorpi monoclonali anti-antigen specific lipopolizaharidic (LPS), iar în regiunea benzii de control, cu anticorpi de capră anti-şoarece. În timpul testării, proba va reacţiona cu particulele de aur coloidal care au fost acoperite cu anticorpi monoclonali anti-Chlamydia, complexul rezultat difuzând lateral în membrană prin capilaritate. Dacă proba conţine antigenul de Chlamydia, pe membrană în regiunea bandă a testului, se va forma o bandă colorată ce conţine complexul anticorp Chlamydia-anticorp particulă de aur coloidal. Dacă antigenul de Chlamydia nu este prezent, nu se va forma nici o linie în regiunea bandă a testului. Întotdeauna, indiferent de prezenţa Chlamydiei, va apărea în regiunea de control o bandă colorată, servind drept control. Reactivi Fiecare kit conţine tot ce este necesar pentru efectuarea a 20 probe 20 casete-test/kit 1 fiolă soluţie de extracţie A: sticluţă picurătoare de plastic (12 ml) cu hidroxid de sodiu 0,2 M
1 fiolă soluţie de extracţie B: sticluţă picurătoare de plastic (12 ml) cu acid clorhidric 0,2 M 20 aplicatoare sterile 1 fiolă control pozitiv (1 ml): Chlamzdia inactivată termic, în tampon, azidă de sodiu 0,1% 1 fiolă control negativ (1 ml): Streptococ grupa B inactivat, în tampon, azidă de sodiu 0,1% 20 de tuburi de extracţie 1 ambalaj Material biologic Calitatea probelor recoltate are o mare importanţă. Detectarea antigenului de Chlamydia cere ca tehnica de recoltare prin care se obţine material celular să fie altfel decât pentru lichidele biologice (viguroasă şi suficientă). Recoltarea probei de la nivelul zonei endocervicale -Se foloseşte aplicatorul din kit. Înainte de recoltarea probelor se înlătură excesul de mucus din zona endocervicală cu un tampon de vată -Se introduce aplicatorul steril în canalul endocervical, trecând de joncţiunea scuamocilindrică, până când cea mai mare porţiune a aplicatorului nu mai este vizibilă. Aceasta permite recoltarea de celule cilindrice sau cuboidale, care sunt principalele sedii ale Chlamydiilor în organism. -Se roteşte ferm aplicatorul 10-15 sec., apoi aplicatorul poate fi scos cu atenţie, fără a contamina proba cu celule exocervicale sau vaginale. Ca o alternativă, probele endocervicale pot fi recoltate cu ansa citologică. Nu se folosesc ansele citologice la pacientele însărcinate. După curetarea exocervixului cu aplicatorul, se introduce ansa citologică în canalul endocervical, depăşind joncţiunea scuamocilindrică. -Se lasă pe loc 2-3 sec., se roteşte ansa citologică de două ori, apoi se retrage ansa fără să se atingă pereţii vaginului. -Se introduce aplicatorul sau ansa în tubul de extracţie numai dacă testul se efectuează imediat. Recoltarea probei de la nivelul uretrei -Se recomandă pacientului să nu urineze cu cel puţin o oră înainte de recoltarea probei. Aplicatorul sau ansa citologică se pot folosi şi pentru recoltarea probei uretrale. -Se introduce aplicatorul în uretră circa 2-4 cm. Se roteşte timp de 3-5 sec., apoi se retrage. -Se introduce aplicatorul în tubul de extracţie, dacă proba trebuie testată imediat. Dacă nu este posibilă determinarea imediat, proba pacientului poate fi introdusă într-un tub uscat pentru păstrare sau transport. Proba poate fi păstrată 4-6 ore la temperatura camerei (15300C) sau 24-72 de ore la frigider (2-80C). Proba nu se congelează. Toate probele vor fi aduse la temperatura camerei înainte de testare. Recoltarea probelor de urină la bărbaţi Prima urină de dimineaţă este de preferat, deoarece probabilitatea identificării prezenţei antigenului de Chlamydia este cea mai mare.
-Se recomandă pacientului să recolteze minimum 20-40 ml din prima urină din ziua analizei într-un container steril şi fără conservant. Dacă probele de urină nu pot fi testate imediat, acestea trebuie păstrate la frigider până la 24 de ore. Modul de lucru Toţi reactivii şi probele trebuie aduse la temperatura camerei înainte de începerea analizei Probele urinare trebuie centrifugate pentru a colecta toate particulele ce pot conţine celule cu Chlamydia -Se centrifughează urina (minimum 15 ml) timp de 10 min. -Se înlătură cu atenţie supernatantul -Se adaugă 5 picături de soluţie de extracţie A în tub şi se amestecă sedimentul cu o pipetă de unică folosinţă, până la omogenizarea suspensiei -Se lasă 2 minute la temperatura camerei -Se transferă suspensia într-un tub de extracţie folosind o pipetă de unică folosinţă -Se adaugă 5 picături de soluţie de extracţie B -Se scoate testul din folia protectoare şi se pune pe o suprafaţă plană, uscată şi curată -Se etichetează testul -Se adaugă 3 picături (200 µ l) din proba obţinută în caseta de testare -Se aşteaptă să apară benzile colorate. Rezultatul testului trebuie să fie citit în 10 min după adăugarea extractului de suspensie. În funcţie de numărul de microorganisme de Chlamydia prezente pe aplicator unele rezultate pozitive pot deveni vizibile după numai 1 min. Totuşi pentru a confirma rezultatele negative este necesar un timp de reacţie de 10 min. Rezultatele nu se interpretează după 15 min. Interpretarea rezultatelor Negativ: în regiunea test nu apare nici o bandă colorată clar şi distinct în roz. Aceasta arată că nu a fost detectat antigenul de Chlamydia Pozitiv: în afară de banda roz din regiunea control a testului apare o altă bandă roz clar prezentă în regiunea test. Aceasta indică că proba conţine antigen de Chlamydia Neconcludent: dacă nu apare nici o bandă în regiunea control, analiza trebuie repetată. Aceasta indică o posibilă eroare în efectuarea testului. În acest caz se poate recolta o probă nouă sau dacă nu a trecut mai mult de o oră de la recoltarea probei, se poate efectua încă o determinare pe aceeaşi probă. Observaţii Se prelucrează toate probele chiar dacă conţin agenţi infecţioşi. După terminarea testării, se aruncă aplicatoarele numai după autoclavarea acestora la 1200C, cel puţin 20 min. Ca o alternativă, aplicatoarele pot fi tratate cu soluţie de hipoclorit de sodiu 0,5-1,0% o oră înainte de a fi aruncate. Persoanele care efectuează testul, trebuie să poarte îmbrăcăminte de protecţie cum ar fi halat şi mănuşi de unică folosinţă în timpul recoltării şi testării probelor. Nu se mănâncă, nu se bea, nu se fumează în aria unde sunt prelucrate probele şi reactivii kitului.
Soluţia de extracţie A conţine hidroxid de sodiu. Soluţia de extracţie B conţine acid clorhidric. Dacă una dintre cele două soluţii vine în contact cu pielea sau cu ochii, se recomandă spălarea cu multă apă. Se evită orice contact al mâinilor cu nasul sau ochii în timpul recoltării şi testării probelor. Controlul pozitiv şi negativ din kitul de testare conţine azidă de sodiu (NaN3) 0,1%, care în contact cu plumbul şi cuprul ţevilor poate forma azidă metalică explozivă. După îndepărtarea reactivilor se spală sistemul de scurgere cu un volum mare de apă. Se recomandă folosirea aplicatoarelor ori anselor citologice pentru obţinerea probelor endocervicale. Nu se amestecă reactivii sau componentele din loturi sau kituri diferite. Nu se schimbă dopurile sticlelor între ele. Nu se foloseşte kitul după expirarea datei indicată pe cutie. La fel ca în cazul tuturor testelor, diagnosticul definitiv nu trebuie să se bazeze doar pe rezultatul unui singur test şi acesta trebuie coroborat cu datele clinice. Kitul se va păstra la temperatura camerei (15-200C). Testul pentru evidenţierea Staphylococcus aureus Principiul metodei Principala deosebire dintre Staphylococcus aureus şi alte tipuri de stafilococi este existenţa unui factor de aglutinare. Staphylococcus aureus determină aglutinarea hematiilor învelite cu fibrinogen. Reactivi Reactiv T 2x2 ml hematii de oaie învelite cu fibrinogen Reactiv C 2x2 ml hematii de oaie Picător 4 buc Material biologic Se folosesc colonii bacteriene considerate de Staphylococcus aureus Modul de lucru -Se agită bine reactivii -Se deschid flacoanele şi se pun picătoarele -Se pune o picătură de Reactiv T (test) şi o picătură de Reactiv C (control) la fiecare capăt al lamei de sticlă -Folosind o ansă, se amestecă coloniile bacteriene cu fiecare picătură -Se înclină uşor lamela Interpretarea rezultatelor Reacţie pozitivă: suspensia din probă aglutinează în primele 15 sec, în timp ce suspensia de control rămâne fin dispersată: Rezultatul este Staphylococcus aureus prezent Reacţie negativă: atât suspensia din probă cât şi cea de control rămân fin dispersate, chiar după 1 min. Rezultatul este Staphylococcus aureus absent.
Reacţia echivocă: atât suspensia din probă cât şi cea de control au semne de aglutinare. În acest caz trebuie făcute testele clasice pentru identificare Observaţii Reactivii nedesfăcuţi sunt stabili la 2-80C până la data de expirare tipărită pe cutie. Testul imunochimic pentru detectarea sângelui ocult în probele de fecale Principiul metodei Hemoglobina umană din probele de fecale reacţionează cu un amestec de anticorpi monoclonali/policlonali. În caz de reacţie pozitivă apar două linii roz în zonele T şi C. Dacă nu există hemoglobină apare o singură linie vizibilă în zona de control C Sensibilitatea testului: 0,03 mg Hb/g de materii fecale, 0,2 mg Hb/ml de soluţie. Reactivi Stripsuri pentru test Tuburi colectoare (tampon)
5 buc. 5 buc.
Materialul biologic Recoltarea probelor -Se colectează materii fecale într-un recipient curat şi uscat -Se deşurubează capacul tubului colector şi se scoate beţişorul aplicator -Se recoltează 3 probe de materii fecale folosind beţişorul aplicator -Se înlătură excesul de probă de pe beţişorul aplicator, ştergându-l cu un material absorbant -Se introduce beţişorul aplicator înapoi în tubul colector. Proba astfel pregătită poate fi păstrată la 20-300C o săptămână Modul de lucru -Se scoate strip-ul de test din ambalaj -Se amestecă bine proba în tubul colector -Se taie vârful tubului colector şi se aruncă primele 2-3 picături de probă -Se poziţionează vertical tubul colector şi se dispersează 4 picături pe suprafaţa marcată S -Se aşteaptă 5 min. şi se citeşte rezultatul Interpretarea rezultatelor Pozitiv: apar linii colorate în zonele T (test) şi C (control) Negativ: o linie colorată este vizibilă numai în zona C (control) Neconcludent: nu există linie colorată nici în zona T nici în zona S. Testul trebuie repetat Observaţii -Pentru obţinerea rezultatului real nu sunt necesare restricţii dietetice -Probele nu trebuie colectate în timpul ciclului menstrual sau dacă pacientul suferă de hemoroizi sau hematurie (rezultatul apare fals-pozitiv)
-Tratamentul cu medicamente care pot cauza iritaţii gastro-intestinale trebuie întrerupt cu cel puţin 2 zile înainte de recoltarea probei -Testul este specific pentru hemoglobina umană. Până la 500 µ g/ml nu s-au observat interferenţe cu hemoglobina de pasăre, vacă, porc, capră, cal, iepure. Testul RPR carbon Principiul metodei Reactivul RPR Carbon este o suspensie stabilizată cu cristale de colesterol marcate cu cardiolipin lecitină şi particule de mangal (pentru îmbunătăţirea interpretării rezultatelor). Reactivul are rolul de antigen faţă de anticorpii prezenţi în organismul persoanelor infectate cu Treponema pallidum. Reactivi 1 flacon cu reactiv latex de 3 ml 1 flacon cu control pozitiv de 1 ml 1 flacon cu control negativ de 1 ml 1 set de plăcuţe pe care se efectuează testul 1 flacon pipeta pentru reactivul latex Material biologic Se foloseşte ser clar, obţinut prin centrifugarea sângelui recoltat fără anticoagulant. Probele pot fi păstrate la 2-80C maximum 48 de ore înainte de efectuarea testului. Pentru o perioadă mai lungă, serul trebuie păstrat congelat. Serurile hemolizate, lipemice sau contaminate pot da erori la interpretarea rezultatelor. Modul de lucru -Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei, înainte de folosire -Se agită uşor reactivul pentru dispersarea particulelor -Se pune câte o picătură din controlul pozitiv şi negativ în câte un cerculeţ al plăcuţei -Se pune câte o picătură (50 µ l) de ser nediluat din fiecare probă în câte unul din cercurile plăcuţei -Se adaugă o picătură de reactiv RPR Carbon, ori se pipetează 20 µ l de reactiv în fiecare cerculeţ folosit -Se amestecă ambele picături, fără să se disperseze pe toată suprafaţa cercului -Se roteşte plăcuţa manual ori cu un rotor mecanic de 80-100 rpm, 8 min. -Se citeşte prezenţa aglutinării vizibile cu ochiul liber. O aglutinare nespecifică poate apare dacă testul este citit mai târziu de 8 min. Testul semicantitativ -Se poate efectua o diluţie succesivă cu soluţie salină izotonică -Titrul serului este diluţia cea mai mare care produce reacţia pozitivă Interpretarea rezultatului Rezultat pozitiv: prezenţa unor nori cenuşii pe albul plăcuţei Rezultat negativ: lipsa unei reacţii de floculare uniforme şi a unei culori cenuşii
Sifilisul este o boală cu transmitere sexuală, cauzată de Treponema pallidum. Observaţii Reactivii conţin azidă de sodiu ce se poate combina cu Pb şi Cu putând deveni explozibili. Controlul pozitiv şi negativ din ser uman a fost testat folosind metoda licenţiată FDA şi s-a demonstrat că nu reacţionează cu anticorpii faţă AgHBs şi HIV. Oricum, toate probele umane pot fi considerate potenţial infectate. Se pune reactivul de RPR Carbon în sticluţa specială înainte de folosire. Acesta trebuie foarte bine omogenizat, reactivul se agită bine înainte de folosire. Nu se folosesc decât picăturile care sunt puse perpendicular pe suprafaţa plăcuţei. Dacă nu se foloseşte sticluţa picurătoare, atunci se foloseşte pipeta automată pentru 20 µ l. Sensibilitatea acestui test depinde de volumul picăturii. Reactivul şi controalele se păstrează la 2-80C. Testul pentru depistarea precoce a sarcinii Principiul metodei Testul hCG (Gonadotrofina corionică umană) este un test calitativ, o reacţie imună în două straturi pentru determinarea hCG în urină. Membrana a fost acoprită cu anticorpi de capră anti-hCG în regiunea benzii de test şi anticorpi de capră anti-şoarece în regiunea benzii de control. În timpul testului urina pacientei este lăsată să reacţioneze cu anticorpii monoclonali anti-hCG coloraţi cu coloidul de aur aplicat pe bandeleta de test. Mixtura va migra în membrană prin capilaritate. Absenţa benzii colorate în regiunea benzii testului indică rezultatul negativ. Pentru controlul procedurii în regiunea de control va aparea întotdeauna o bandă colorată în prezenţa hCG în proba de urină. Reactivi Bandeletele de testare: bandeletă acoperită cu anticorpi anti-hCG de capră şi anticorpi monoclonali anti-hCG de şoarece în coloid de aur uscat. Material biologic Recoltarea probei Orice probă de urină este bună pentru testare, dar prima urină de dimineaţă este cea mai indicată, deoarece conţine cele mai mari concentraţii de hCG. Probele de urină pot fi recoltate într-un recipient curat, de plastic sau de sticlă. Dacă probele nu pot fi prelucrate imediat, acestea pot fi păstrate la frigider (20 8 C) până la 72 de ore.Nu este necesar să adăugăm prezervant probei de urină. Proba de urină trebuie lăsată la temperatura camerei înainte de efectuarea reacţiei. Probele de urină tulbure trebuie centrifugate sau filtrate înainte de folosire. Probele cu precipitate vizibile trebuie lăsate să se decanteze şi pentru testare se va folosi numai supernatantul clar.
Modul de lucru
-Se scoate bandeleta de testare din ambalaj -Se introduce bandeleta în urină, cu vârful săgeţii orientat spre urină. Nu se depăşeşte linia max (maximum) -Se poate lăsa bandeleta în urină sau se poate să o scoatem după min 3 sec şi să o lăsăm pe o suprafaţă curată, uscată, neabsorbantă (ex: marginea recipientului cu urină) -Se aşteaptă să apară banda colorată. Dependent de concentraţia de hCG din proba de urină, rezultate pozitive pot fi obsevate în 10-30 sec. Pentru confirmarea rezultatului negativ sunt necesare 5 min. pentru reacţie. Nu se interpretează rezultatele după 30 min. Interpretarea rezultatelor Negativ: doar o singură bandă colorată apărută în zona de control. Nu apare nici o bandă colorată în regiunea de testare Pozitiv: benzi distincte colorate apar în regiunea de control şi în regiunea de testare. Intensitatea culorii în regiunea de testare poate fi variabilă. Incorect: nici o bandă vizibilă sau nici o bandă vizibilă în regiunea de testare. Se repetă testul Observaţii Kitul de testare poate fi păstrat la temperatura camerei (20-300C) într-un container uscat până la data expirării. Bandeletele testului trebuie păstrate departe de umezeală, căldură şi razele soarelui. Capacul containerului de păstrare trebuie să conţină desicant pentru păstrarea bandeletelor uscate. Imediat după utilizare se repune cu grijă capacul. În anumite situaţii, altele decât sarcina, incluzând boala trofoblastică şi neoplasmele netrofoblastice, se pot produce niveluri ridicate de hCG. Aceste diagnostice trebuie luate în considerare dacă tabloul clinic le sugerează. Dacă probele de urină sunt prea diluate, pot să nu conţină niveluri semnificative de hCG. Dacă se menţine suspiciunea de sarcină trebuie repetat testul la 48-72 ore. Ca pentru toate testele diagnostice, un diagnostic clinic definitiv nu se poate baza pe un singur test şi trebuie pus numai de către medic după evaluarea datelor clinice şi de laborator. Testul FSH pentru diagnosticul menopauzei Principiul metodei Testul FSH pentru diagnosticul menopauzei este un test calitativ. o analiză imunologică de tip sandwich prin care se determină concentraţia hormonului foliculostimulant (FSH). Pe linia de test a membranei au fost fixaţi anticorpi anti-FSH, pe linia de control s-au fixat anticorpi de capră anti.FSH de măgar. În timpul testului, FSH din urina de la pacientă reacţionează cu conjugatul colorat în auriu (coloid de anticorp monoclonal anti-FSH) care se află sub formă preuscată pe banda de test. Amestecul migrează spre partea superioară a membranei cromatografice prin capilaritate. Dacă proba testată conţine FSH (în concentraţie semnificativă) va apărea în regiunea de test a membranei o linie colorată şi care reprezintă complexul conjugat anticorp FSH-FSH. În acelaţi timp va apărea o linie de culoare slabă în regiunea de control a membranei. Această linie de control reprezintă o referinţă a intensităţii culorii, echivalentă cu aprox. 25 mui/ml FSH.
Dacă intensitatea liniei de test este egală sau mai puternică decât cea a liniei de control, atunci rezultatul este pozitiv Reactivi 20 de casete de test cu membrana marcată cu anticorp de captură anti-FSH şi anticorp monoclonal anti-FSH colorat Material biologic Proba de urină trebuie să fie recoltată într-un vas curat şi uscat. Poate fi folosită urina din orice moment al zilei, totuşi se recomandă urina de dimineaţă, deoarece conţine concentraţia maximă diurnă de FSH. Probele de urină pot fi păstrate la frigider (2-80C) cel mult 72 ore înaintea efectuării testului. Dacă probele au fost ţinute la frigider înainte de a efectua testul, acestea vor fi aduse la temperatura camerei. Acele probe de urină unde se observă o precipitare, se filtrează sau se centrifughează sau se lasă să se sedimenteze până se vor obţine eşantioane clare care vor fi testate. Modul de lucru -Înainte de efectuarea testului, casetele de test, probele pacientelor, controalele şi probele de referinţă trebuie să fie aduse la temperatura camerei (20-300C). -Se scoate caseta de test din punga de protecţie (adusă în prealabil la temperatura camerei, pentru a evita formarea condensului pe membrana test în momentul deschiderii) -Se va înscrie pe fiecare casetă de test numărul de identificare al pacientului sau al controalelor -Se îndepărtează capacul de plastic roz pentru a avea liber vârful absorbant. -Se apasă cu degetul mare pe caseta de test, astfel încât vârful absorbant să fie direcţionat în jos. -Se introduce vârful absorbant în urină timp de 10 sec. -Se reacoperă caseta cu capacul roz şi se lasă pe o suprafaţă plană cu fereastra de test în sus şi se aşteaptă până se obţine rezultatul -Se citeşte rezultatul după minimum 3 min. (max. 10 min) Interpretarea rezultatelor Negativ: intensitatea culorii liniei de test este mai mică decât cea a liniei de control Pozitiv: intensitatea culorii liniei de test este egală sau mai mare decât a liniei de control Dacă nici linia de test, nici linia de control nu apar pe membrana casetei, atunci se elimină testul respectiv. Acest lucru s-a datorat fie unei proceduri neadecvate în timpul etapelor de testare, fir deteriorării reactivilor casetei. Se recomandă a se repeta testul 5-7 zile mai târziu (preferabil de recoltat urina la aceeaşi oră) pentru a determina dacă nivelul de FSH este încă ridicat
Observaţii Kitul se păstrează la frigider (2-80C) sau la temperatura camerei (până la 300C) în punga de plastic cu desicant. Testul LH de ovulaţie Principiul Testul este rapid şi uşor de folosit. Testul este calitativ, putând preciza când are loc o secreţie de hormon luteinizant şi când este probabilă ovulaţia. Pentru început trebuie determinată durata ciclului menstrual. Aceasta reprezintă numărul de zile cuprins între prima zi a ciclului şi ziua premergătoare apariţiei ciclului. Dacă ciclul este mai scurt de 21 zile ori mai lung de 38 zile, trebuie consultat medicul.. Dacă nu se cunoaşte durata ciclului, se începe testarea din a 11-a zi a ciclului, făcând o medie a celor 28 de zile. Se efectuează un test la fiecare a 5-a zi a perioadei sau după ce secreţia de LH a fost detectată Material biologic Nu se foloseşte prima urină de dimineaţă, deoarece LH este sintetizat în cursul nopţii şi va apare în urină mai târziu, în timpul zilei. Perioada cea mai bună pentru colectarea urinei este între orele 10.00-18.00. Se colectează urina la aceeeaşi oră în fiecare zi. Modul de lucru -Se lasă casetele test, proba de urină şi soluţia de control să atingă temperatura camerei (18-300C) -Se extrage urina cu ajutorul unui picurător pentru urină -Se adaugă 5 picături de urină în acest loc -Se lasă lichidul să migreze -Se aşteaptă să se coloreze şi să apară benzile Depinzând de concentraţia de LH, rezultatele pozitive pot fi observate după aprox 40 sec. Confirmarea rezultatelor negative este după ce a avut loc reacţia completă (10 min) Interpretarea rezultatelor Nu se secretă LH: apare o singură culoare în regiunea de control sau banda este strălucitoare Secreţie de LH: dacă apar 2 benzi colorate vizibile şi banda test este egală ca intensitate cu banda de control, atubnci cu siguranţă ovulaţia va avea loc în următoarele 24-48 ore. Test neconcludent: nu este nici o bandă vizibilă. Se recomandă repetarea testului. Durata ciclului (zile)
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38
Testul trebuie efectuat în ziua
6 6
7 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Determinarea crioproteinelor Principiul Incubarea serului la 40C timp de 24 ore, după care se urmăreşte prezenţa unui precipitat în ser (crioproteine). Serul cu crioprecipitat se centrifughează, apoi sedimentul este spălat la rce de mai multe ori, solubilizat la 37 0C, după care este testat în dubla difuzie cu antiseruri monospecifice anti-imunoglobuline. Prezenţa crioproteinelor reprezintă un semn de disproteinemie ce se manifestă în anumite situaţii patologice (ex. afecţiuni autoimune). BIBLIOGRAFIE Cristea V., Crişan M., Costin N., Olinescu A. Imunologie clinică. Editura Casa Cărţii de Ştiinţă, Cluj-Napoca, 2002 Dejica D. (sub red.) Tratat de imunologie clinică. Vol. I Ed. Dacia, Cluj-Napoca, 1997 Dejica D. (sub red.) Tratat de imunologie clinică. Vol. II Ed. Dacia, ClujNapoca, 1998 Drugărin D., Negru Ş., Koreck A., Mederle C. Imunologie moleculară. Ed. Mirton, Timişoara, 1998 Gluhovschi G. Actualităţi în imunologia clinică. Ed. Helicon, Timişoara, 1994 Moraru I. Imunologie. Ed. Medicală, Bucureşti, 1984 Olinescu A. Imunologie. Ed. Didactică şi Pedagogică, Bucureşti, 1995 Păunescu V., Tatu C.A., Stănescu D.I., Medrea D.P. Imunologie concepte fundamentale şi aplicative. Ed. Helicon, Timişoara, 1996 Pereţianu D., Saragea M. Imunologia în teoria şi practica medicinei. Vol I Ed. ALL, Bucureşti, 1996 Pereţianu D., Saragea M. Imunologia în teoria şi practica medicinei. Vol. II Ed. ALL, Bucureşti, 1998 Răpunteanu G. Imunologie – Imunopatologie. Ed. Genesis, Cluj-Napoca, 1996 Voiculescu C.(sub red.) Noţiuni de imunologie şi imunopatologie. Ed. Academiei Române, Bucureşti, 1999 Drugărin D., Negru Ş., Koreck A., Mederle C. Imunologie moleculară. Ed. Mirton, Timişoara, 1998 Moraru I. Imunologie. Ed. Medicală, Bucureşti, 1984 Olinescu A. Imunologie. Ed. Didactică şi Pedagogică, Bucureşti, 1995 Păunescu V., Tatu C.A., Stănescu D.I., Medrea D.P. Imunologie concepte fundamentale şi aplicative. Ed. Helicon, Timişoara, 1996 Pereţianu D., Saragea M. Imunologia în teoria şi practica medicinei. Vol I Ed. ALL, Bucureşti, 1996 Pereţianu D., Saragea M. Imunologia în teoria şi practica medicinei. Vol. II Ed. ALL, Bucureşti, 1998 Voiculescu C.(sub red.) Noţiuni de imunologie şi imunopatologie. Ed. Academiei Române, Bucureşti, 1999
