INVERTASE] [ ESTUDO DA CINÉTICA DA ENZIMA INVERTASE
Bioquímica I
Índice 1.
Objectivo ........................................................................................................................................... 3
2.
Introdução ......................................................................................................................................... 3
3.
Material e Reagentes ......................................................................................................................... 5
4.
5.
3.1. Reagentes ...............................................................................................................................................
5
3.2. Material .................................................................................................................................................
6
Procedimento Experimental ............................................................................................................. 6 4.1 Recta de calibração de DNS para o açúcar invertido ............................................................................
6
4.2 Estudo da variação da actividade da enzima com a concentração do substrato ...................................
7
Apresentação e tratamento de resultados ......................................................................................... 8 5.1. Recta de calibração do DNS para o açúcar invertido ...........................................................................
8
5.2. Traçar o gráfico da actividade da enzima ( μmol de “açúcar invertido” formado por minuto, por ml de extracto de enzima, i.e., velocidade da reacção), em função da concentração de substrato (mol.dm-3) e calcular K M e vmax (Curva de Michaelis-Menten). ...................................................................................... 10 5.3. Traçar o gráfico de Lineweaver-Burk e determinar os valores de KM e Vmax.
................................. 15
6.
Discussão /Conclusão ...................................................................................................................... 17
7.
Bibliografia...................................................................................................................................... 19
8.
Anexos ............................................................................................................................................. 21 8.1. Anexo 1- Segurança e riscos ................................................................................................................
21
8.2. Anexo 2- Dedução da equação de Lineweaver-Burk ...........................................................................
22
8.3. Anexo 3- Preparação de soluções .......................................................................................................
23
Grupo V; PL4
2
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Bioquímica I
1. Objectivo O objectivo da actividade experimental é estudar a cinética enzimática invertase num substrato de sacarose, ou seja, determinar o valor da velocidade máxima e a respectiva afinidade enzimática para o substrato.
2. Introdução Com o desenvolvimento da bioquímica fortaleceu-se a ideia de que dentro dos seres vivos, existiam substâncias capazes de catalisar de modo muito específico determinadas reacções químicas.3 Uma enzima é um catalisador biológico, que mesmo em baixas concentrações aumenta a velocidade da reacção.4 As enzimas diminuírem a energia de activação, mas não afectam o equilíbrio da reacção.4 A invertase (β-fructofuranosidade) é uma enzima que catalisa a hidrólise da sacarose em “açúcar convertido”, isto é, nos seus dois monómeros constituintes: glicose e frutose (figura 1). 2,5 O seu substrato preferencial é a sacarose porém, também, pode hidrolisar ramonose e estaquiose.7
Figura 1 - Hidrolise da sacarose catalisada pela invertase. A glicose e a frutose f rutose são açúcares redutores.
A invertase encontra-se presente nos animais, mas também em plantas superiores, fungos e bactérias.5 É possível obter o extracto não purificado da enzima, destruindo as células de fermento por autólise e removendo os detritos celulares por centrifugação, após a qual a invertase ficará no líquido sobrenadante.5 Existem actualmente várias aplicações desta enzima, principalmente na indústria alimentar, onde a enzima usada tem origem na levedura.2 A cinética enzimática estuda a acção das enzimas, a sua actividade catalítica e seu estudo é feito in vitro.3 Para esses estudos podem ser usados, como fonte de enzima, preparações que a contenham em estado mais ou menos purificado, no entanto, quanto mais purificada estiver a preparação enzimática mais fácil será o seu estudo cinético.3 O mecanismo mais simples para explicar a acção enzimática é o modelo de MichaelisMenten:
Neste modelo a enzima (E) liga-se ao substrato (S) para formar um complexo enzimasubstrato (E-S). A quantidade de produto (P) formada, assim como a velocidade da reacção
Grupo V; PL4
3
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Bioquímica I
vão depender directamente da concentração em complexo E-S, isto é, da concentração de enzima que se liga ao substrato. 4,8 O modelo de Michaelis-Menten parte da hipótese que o passo limitante da velocidade é a quebra do complexo E-S para formar o produto e a enzima livre. 9 (1) A equação de Michaelis-Menten (equação 1) permite, após a determinação experimental das variações de V em função da concentração de substrato ([S]), obter o valor de velocidade inicial máxima (Vmáx), e calcular a constante de Michaelis (Km).4,8 De forma geral, os valores de Km, estão compreendidos entre 10 -2M e 10-8.4,8 A representação gráfica da velocidade da reacção em função da concentração de substrato (gráfico 1) é uma hipérbole. A assímptota horizontal corresponde à Vmáx. O valor de K m também pode ser obtido através do gráfico, uma vez que quando a [S]= K m , a equação de Michaelis-Menten prevê que velocidade de reacção é metade de Vmáx.4,8 Km é uma medida de afinidade da enzima para o substrato e essa afinidade é igual a 1/ K m.4,8 Para um Km elevado, Gráfico 1. Variação da velocidade de existe uma baixa afinidade (é necessária uma elevada [S] reacção em função da concentração de para se atingir a V igual na 1/2Vmáx, para um Km baixo substrato existe uma elevada afinidade.4,8 O gráfico de velocidade vs [S] mostrado anteriormente não é linear, pelo que se torna difícil estimar os valores de Km e Vmáx , sendo assim necessário desenvolver métodos de linearização da equação de Michaelis-Menten. . Podemos transformar a equação de Michaelis-Menten, invertendo-a: (2) O gráfico de Lineweaver-Burk (gráfico 2) é a forma mais comum, e simples, de mostrar os dados cinéticos, apesar de não ser o mais fiável. Como se pode observar pelo gráfico 2, não se podem tomar valores negativos para 1/[S], sendo o mínimo valor possível é 1/[S] = 0, que corresponderia a uma concentração infinita de substrato, e daí 1/v = 1/V max. O valor do ponto de intersecção entre a recta e o eixo x é uma extrapolação de dados experimentais. Assim sendo, os gráficos de Lineweaver-Burke distorcem as medidas realizadas a baixas concentrações de substrato e isto pode dar lugar a estimativas não muito exactas de Vmax e de K m.10 Grupo V; PL4
Gráfico 2. Gráfico de Lineweaver-Burk.
4
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3. Material e Reagentes 3.1. Reagentes Tabela 1- Características gerais dos reagentes utilizados Massa Fórmula Grau de Reagentes Molar Química Pureza (%) (g/mol)
Solução aquosa de invertase diluída 1:400
Ácido 3,5dinitrosalicílic o (DNS)
Densidade (g/cm3)
Riscos e Segurança1
Hidrogenocarbonato de sódio
NaHCO3
84,01
99,5
2,159
-
Hidróxido de Sódio
NaOH
39,997
98,6
2,13
Corrosivo R: 35 S: 2-26-37/39
Ácido 3,5dinitrosalicílico (DNS)
C7H4N2O 7
228,12
99
-
Nocivo R: 22 S: 22-24/25
Tartarato de sódio e potássio tetrahidratado
C4H4KNa O6.4H2O
282,23
99-102
-
-
Irritante Acetato de sódio
CH3COO Na
82,03
99
1,52 Corrosivo
Tampão acetato
Solução de sacarose Solução equimolar de glucose/frutose Água Destilada
1
R: 36/37/38 S: 16-29/56 Ácido Clorídrico (37%)
HCl
36,46
37
1,19
Corrosivo R: 34-37 S: 26-45
Sacarose
C12H22O 11
342, 30
-
1,587
-
Frutose
C6H12O6
180,16
-
1,54
-
Glucose
C6H12O6.
180,16
99,5
-
H20
18,02
-
1
-
Anexo 1
Grupo V; PL4
5
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3.2. Material
Tubos de ensaio Suporte para tubos de ensaio Micropipetas Pipetas graduadas Pipetador Vórtex
Banho com água 100°C Banho com água fria Espectrofotómetro Cronómetro Placa de aquecimento Pompete
4. Procedimento Experimental 4.1 Recta de calibração de DNS para o açúcar invertido Para a construção da recta de calibração preparar 5 tubos de ensaio de acordo com a tabela 1. Tabela 2- Preparação de soluções
Vsol (mL) Gluc/frut 0,0025M H2O dest. Tampão acetato Sacarose 0,25M DNS
Tubo1 (branco)
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
0,00
0,10
0,40
0,70
2,00
1,90
1,60
1,30
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
Tubo 5 1,00
Perfazer com água destilada o volume total de 2 ml
Agitar no vórtex. Aquecer os tubos num banho com água a 100°C durante 5 minutos exactos . Arrefecer num banho com água fria. Adicionar 4mL de água destilada a cada tubo e agitar no vórtex. Vsol (mL)
Tubo1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
4,00
4,00
4,00
4,00
(branco) H2O dest. Grupo V; PL4
4,00
6
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Bioquímica I
Ler absorvância a 540 nm (Calibrar com tubo 1).
4.2 Estudo da variação da actividade da enzima com a concentração do substrato Para o estudo da actividade enzimática preparar 7 tubos de ensaio de acordo com a tabela 2. Tabela 3- Preparação de soluções
Vsol (mL) Sacarose 0,25M H2O dest. Tampão acetato
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
Tubo 7
0,00
0,05
0,10
0,20
0,40
0,80
2,00
1,95
1,90
1,80
1,60
1,20
0,40
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,60
Perfazer com água destilada o volume total de 2 ml
Incubar a 25°C durante 5 minutos. Em intervalos de 60s adicionar.
Vsol (mL) Enzima 1:400
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
Tubo 7
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
Agitar no vórtex. Incubar a 25°C durante 10 minutos exactos. Em intervalos de 60s adicionar.
Grupo V; PL4
7
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Bioquímica I
Vsol (mL)
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
Tubo 7
DNS
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
Agitar no vórtex. Aquecer em banho com água a 100°C durante 5 minutos exactos . Arrefecer em banho de água fria. Adicionar 4mL de água destilada e agitar no vórtex.
Vsol (mL) H2O dest.
Tubo1 (branco) 4,00
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
4,00
4,00
4,00
4,00
Ler absorvância a 540 nm (usar tubo 1 como branco).
5. Apresentação e tratamento de resultados 5.1. Recta de calibração do DNS para o açúcar invertido
[solução equimolar de glicose/frutose] (M)
[solução]conc. = 0,0025M Vfinal = 10mL
Tubo 2 Vinicial 2 = 0,10mL
[solução]tubo 2 = ?
Grupo V; PL4
8
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Tubo 3 Vinicial 3 = 0,40mL
[solução]tubo 3 = ?
Tubo 4 Vinicial 4 = 0,70mL
[solução]tubo 4 = ?
Tubo 5
Vinicial 5 = 1,0mL [solução]tubo5 = ?
Grupo V; PL4
9
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Bioquímica I
Tabela 4 – Registo de resultados com os dados necessários á construção da recta de calibração do DNS para o açúcar invertido
Tubo
Vsolução equimolar de glicose/frutose
[solução equimolar de glicose/frutose]
Absorvância
1 - Branco
0
0
0
2
0,1
0,000025
0,005
3
0,4
0,0001
0,134
4
0,7
0,000175
0,293
5
1
0,00025
0,433
Recta de calibração do DNS para o açucar invertido 0.500 ) m0.400 n ( a 0.300 i c n â v r 0.200 o s b 0.100 A
0.000 0.0000
y = 1801.2x - 0.0251 R² = 0.9904 0.0001
0.0002
0.0003
concentração equimolar de glicose /frutose (M)
Gráfico 3 – Recta de calibração do DNS para o açúcar invertido
5.2. Traçar o gráfico da actividade da enzima ( μ mol de “açúcar invertido” formado por minuto, por ml de extracto de enzima, i.e., velocidade da reacção), em função da concentração de substrato (mol.dm-3) e calcular K M e v max (Curva de Michaelis-Menten). 5.2.1. Cálculos necessários à construção da curva Michaelis-Menten
Cálculo da concentração de açúcar invertido após os 10 minutos de incubação com a enzima
Pela lei Lambert-Beer, a absorvância em função da concentração deve ser uma linha recta, logo existe uma relação entre a lei e a equação da recta. y=m.x+b
A= Grupo V; PL4
Ɛ . l . c 10
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Este cálculo é feito com base na recta de calibração do gráfico 3 e com as absorvâncias medidas experimentalmente substituindo-as na equação obtida:
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
Tubo 7
] [
Cálculo do número de moles de açúcar invertido presentes em solução após os 10 minutos de encubação com a enzima.
Tubo 2
Tubo 3
Grupo V; PL4
11
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Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
Tubo 7
Cálculo da actividade enzimática durante o tempo de encubação (10 minutos)
A enzima encontrava-se diluída 1:400, pelo que para a realização do cálculo da actividade enzimática tem de entrar em linha de conta esse factor de diluição. Assim:
Tubo 2
Tubo 3
Grupo V; PL4
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Bioquímica I
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
Tubo 7
Tabela 5 – Dados utilizados para construção da curva de Michaelis-Menten
0,000
[Açúcar Invertido] 0,000
n açúcar invertido 0,000
Activ. Enz -1 -1 (μmol.min mL ) 0,000
1,25E-03
0,003
1,560E-05
1,560E-07
6,240
0,10
2,50E-03
0,022
2,615E-05
2,615E-07
10,460
4
0,20
5,00E-03
0,213
1,322E-04
1,322E-06
52,876
5
0,40
1,00E-02
0,381
2,255E-04
2,255E-06
90,184
6
0,80
2,00E-02
0,528
3,071E-04
3,071E-06
122,829
7
1,60
4,00E-02
0,616
3,559E-04
3,559E-06
142,372
Tubo
V Sac (mL)
[Sac] (M)
Absorvância
Branco
0,00
0,000
2
0,05
3
Grupo V; PL4
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5.2.2. Construção do gráfico da curva de Michaelis-Menten
) 1 L 160.0 m 1 140.0 n i m . 120.0 l o m100.0 μ ( o 80.0 ã ç a e r 60.0 a d 40.0 e d a 20.0 d i c o 0.0 l e 0.000 V
Activ. Enz (μmol.min-1mL-1)
0.010
0.020
0.030
0.040
0.050
Concentração de sacarose (M)
Gráfico 4 – Curva de Michaelis-Menten
5.2.3. Determinação dos valores de KM e Vmax (pela representação Michaelis-Menten) A equação de Michaelis-Menten permite uma visualização rápida e directa, mas não muito precisa dos valores de V máx e de Km, uma vez que esta depende do observador. A velocidade atingirá o ponto máximo quando a enzima estiver saturada, ou seja, quando todos os locais de ligação do centro activo estiverem ocupados com os ligandos e quando a concentração de substrato não influenciar a velocidade. Como a curva relativa ao gráfico de Michaelis-Menten tende para o infinito, não existe um valor preciso para Vmáx mas sim uma estimativa deste. Neste caso, o valor foi de aproximadamente 145 μmol.min-1mL-1 O Km corresponde ao valor da concentração de substrato (eixo xx) lido a partir de V 0 (eixo dos yy) que equivale à metade de V máx. Assim:
Observando o gráfico, extrapolou-se que o Km será de aproximadamente 0,0075 M
Grupo V; PL4
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5.3. Traçar o gráfico de Lineweaver-Burk e determinar os valores de KM e Vmax.
Cálculos necessários à construção do gráfico de Lineweaver-Burk
A dedução da equação de Lineweaver-Burk a partir da equação de Michaelis-Menten é dada por:
Y = m
x + b
Assim, esta é a equação de uma recta onde 1/v representa a ordenada, 1/[S] a abcissa, o declive é dado por KM /vmax e a ordenada na origem 1/ v max. Tabela 6 - Dados usados para a construção da recta de Lineweaver-Burk
1/[sacarose]
800
400
200
100
50
25
1/V
1,602E-01
9,561E-02
1,891E-02
1,109E-02
8,141E-03
7,024E-03
Recta de Lineweaver- Burk 0.180 y = 0.0002x - 0.0053 R² = 0.9662
0.160 ) 0.140 L m . 0.120 n i m0.100 1 l o m0.080 ( V0.060 / 1 0.040
0.020 0.000 0
200
400
600
800
1000
1/[sacarose] (M-1)
Gráfico 5 - Representação gráfica da equação Lineweaver-Burk
Visto que o valor de b obtido é negativo, não é possível calcular o valor de V máx e consequentemente o valor de Km, uma vez que o valor da velocidade calculado daria negativo, o que é impossível.
Grupo V; PL4
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[ ESTUDO DA CINÉTICA DA ENZIMA INVERTASE]
Bioquímica I
Tabela 7 - Dados usados para a construção da recta de Lineweaver-Burk desprezando 2 pontos 1/[sacarose]
800
400
50
25
1/V
1,602E-01
9,561E-02
8,141E-03
7,024E-03
Recta de Lineweaver-Burk ) L m . n i m 1 l o m ( V / 1
0.180 0.160 0.140 0.120 0.100 0.080 0.060 0.040 0.020 0.000
y = 0.0002x + 0.003 R² = 0.989
0
200
400
600
800
1000
1/[sacarose] (M-1)
Gráfico 6 - Representação gráfica da equação Leneweaver-Burk desprezando 2 pontos
De forma a obter um valor de velocidade máxima aceitável, foi desprezado o ponto 3 e
4, obtendo a recta:
Tabela 8 – Resultados obtidos pela curva de Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk
Vmáx KM
Grupo V; PL4
Michaelis-Menten 145 0,0075
Lineweaver-Burk 333,33 0,0667
16
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6. Discussão /Conclusão Com o intuito de realizar esta experiência laboratorial e para efectuar o cálculo dos parâmetros cinéticos relativos à enzima invertase, onde se relaciona a velocidade reaccional com a concentração do substrato presente, procedeu-se à realização de uma recta de calibração. Esta recta relaciona a concentração de glucose/frutose com as absorvâncias lidas para cada uma das concentrações padrão. Na segunda parte do trabalho e com recurso a esta recta, foi possível calcular efectivamente a concentração do produto da reacção (concentração de glucose/frutose derivado da degradação da sacarose pela invertase) e efectuar de novo a leitura das absorvâncias para as amostras com diferentes concentrações de substrato. Dependendo da concentração de substrato presente na amostra, a concentração dos produtos foi variando no decurso da reacção enzimática, o que nos permitiu estudar a actividade da enzima invertase para com o substrato, ou seja, a sua afinidade para com este. O estudo desta mesma actividade enzimática foi feito com recurso a duas representações gráficas: a curva de Michaelis-Menten e a recta de Lineweaver-Burk. O gráfico 4 mostra a variação da [Sacarose] quando a [Invertase] é constante. Como se pode observar, para concentrações relativamente baixas de sacarose, V0 aumenta quase linearmente com o aumento da [Sacarose], fruto da grande quantidade de enzima livre que se pode ligar ao substrato. Para concentrações elevadas deste mesmo substrato, V0 aumenta cada vez menos em resposta ao aumento da concentração de sacarose, atingindo um patamar que representa o valor de V máx. Esta tendência para o infinito representa o momento em que os centros activos da invertase se encontram todos ligados à sacarose (saturação da enzima), em que a velocidade reaccional não aumenta mais independentemente dos aumentos da concentração da sacarose. Este gráfico permitiu então uma determinação empírica das constantes cinéticas
enzimática: Km e Vmáx. No nosso caso, os valores foram 0,0075 M e 145 µmol.min 1
.mL-1, respectivamente. Contudo, estes parâmetros não são muito precisos dado que
Vmáx não é um valor preciso mas sim assimptótico (tende para o infinito) e por consequência, Km também não é rigoroso porque depende de V máx. De forma a colmatar as falhas relativas a esta observação empírica, recorreu-se a uma das formas linearizadas da equação de Michaelis-Menten – Equação de Lineweaver-
Grupo V; PL4
17
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Burk (inverso de Michaelis-Menten). Esta equação permite uma leitura mais correcta dos parâmetros cinéticos Km e Vmáx (cálculos matemáticos). Não obstante, no nosso trabalho prático, os valores acima referidos não puderam ser calculados uma vez que a equação que representa a recta de Lineweaver-Burk tinha o parâmetro b negativo (-0,0053) (gráfico 5). Se assim fosse, V máx daria negativo (Vmáx =1/b) bem como K m (Km = m xVmáx). Uma possível explicação para este facto ocorrido é de que este método provoca uma distorção do erro experimental – para baixos valores de V 0, um pequeno erro em V 0 corresponde a um enorme erro em 1/V 0; pelo contrário, para valores elevados de V0, o mesmo pequeno erro em V 0 corresponderá a erros desprezáveis em 1/V0. Se pelo contrário desprezássemos dois pontos da recta de Lineweaver-Burk (nomeadamente o 3º e 4º pontos), obteríamos um b positivo (0,003) (gráfico 6), o que nos permitiria obter valores de Vmáx
333,33 µmol.min
-1
valor calculado esta dentro do limite teórico previsto (
.mL-1 e Km = 0,0667 M. Este
a M). No entanto,
como não existem valores de referência para actividade enzimática da invertase não se pode inferir quanto aos erros analíticos cometidos, nem à exactidão dos resultados experimentais. Tendo em conta o valor obtido para Km (
, tem-se uma má
actividade enzimática visto que este se aproxima do limite superior teórico previsto (
). Todavia, este resultado não pode ser considerado
estatisticamente significativo, uma vez que foram desprezados 2 pontos e o r 2 é inferior a 0,999 (correlação fiável). Outro motivo para os resultados não serem considerados fiáveis é que segundo o descrito na literatura, a enzima invertase não tem uma actividade significativa (24%), mesmo na capacidade máxima de actuação (actividade óptima). De referir ainda que apesar da baixa actividade, o pH óptimo ( 4,5) foi proporcionado pelo tampão acetato de sódio. Outra ilação que podemos retirar da realização deste trabalho prático foi que a sacarose não foi precisa para a preparação da recta de calibração (gráfico 3), uma vez que só os açúcares glucose e frutose têm a capacidade de reduzir o DNS devido à presença de carbonos anoméricos (carbonos capazes de participar na formação de ligações glicosídicas). Pelo contrário, como a sacarose já apresenta uma ligação glicosídica, não apresenta o carbono livre necessário à redução do DNS. No entanto, utilizou-se a Grupo V; PL4
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sacarose nesta primeira parte da experiência para que na medição das absorvâncias houvesse os mesmos constituintes em ambas as partes do trabalho, pois na segunda parte a enzima invertase não é capaz de degradar a sacarose na sua totalidade. De referir ainda que os valores não foram de encontro ao esperado, possivelmente por terem ocorrido erros sistemáticos e experimentais, tais como: má preparação das soluções-padrão, desfasamento temporal entre a primeira parte e a segunda da experiência, más leituras no espectrofotómetro devido a células danificadas e mau funcionamento do aparelho. Em suma, podemos então afirmar que os parâmetros cinéticos podem ser calculados tanto pela curva de Michaelis-Menten como pela recta de Lineweaver-Burk. Pela curva de Michaelis-Menten o calculo de Km não é rigoroso, pois depende da determinação do Vmáx que é calculada por aproximação, sendo que também exige um numero elevado de determinações. Contudo, o segundo método é mais expedito, rigoroso e rápido e são necessárias menos leituras experimentais, pois o traçado da recta exige um menor número de pontos da curva. Para além disto, a recta de Lineweaver-Burk não implica aproximações, mas sim cálculos matemáticos.
7. Bibliografia 1. Adão, M. H. et al. (1997). Bioquímica. LIDEL- Edições Técnicas. ISBN: 972757-042-9; 2. http://legion.geleia.net/Guia_Laboratorios.pdf; 3. http://users.med.up.pt/ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados_anos_anteriores/20062007/enzimas_e_cinetica_enzimica.pdf; 4. Nelson, D.L., Cox, M.M. (2001). “Lehninger, Principles of Biochemistry”, 3a edição, Worth Publishers,; 5. Protocolo da actividade prática fornecido pelos docentes da cadeira; 6. Fiedurek, J.; Pielecki, J.; Skowronek, M. (2000). Direct methods for selecting mutants with increased production of invertase from mutagenised cultures of Aspergillus fumigatus. Journal of Basic Microbiology, v. 40, p. 111-118; 7. http://www2.ufp.pt/~pedros/bq/Enzimas.htm; 8. Campos L. (1999). “Entender a Bioquímica”Escolar Ed, 2ª edição,. Capítulo 2, Cinética das Reacções Bioquímicas; Grupo V; PL4
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9. http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/apostilas/Apostila_cinetica_e nzimatica_ju.pdf; 10. Tseng SJ, Hsu JP. (1990). A comparison of the parameter estimating procedures for the Michaelis – Menten model.
J Theor Biol. Aug 23;145(4):457 – 64. PMID
2246896; 11. http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S010466322000000400051&script=sci_artt ext
Grupo V; PL4
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8. Anexos 8.1. Anexo 1- Segurança e riscos
NaOH:
R 35: Provoca queimaduras graves. S 2: Manter fora do alcance das crianças. S 26: Em caso de contacto com os olhos lavar imediata e abundantemente em água e chamar um especialista.
S 37/39: Usar luvas adequadas e protecção para os olhos/cara Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS): R 22: Nocivo por ingestão.
S 22: Não respirar o pó S24/25: Evitar o contacto com os olhos e com a pele Ácido Cloridrico: R34: Provoca queimaduras
R37: Irritante para as vias respiratórias. S26: Em caso de contacto com os olhos lavar imediata e abundantemente em água e
chamar um especialista S45: Em caso de acidente ou indisposição consultar imediatamente um médico (se
possível mostrar-lhe o rótulo do produto)
Acetato de sódio:
R 36/37/38: Irritante para os olhos, vias respiratórias e pele. S 16: Conservar longe de fontes de ignição - Não fumar. S 29: Não deitar os resíduos no esgoto S56: Não despejar na rede de esgotos nem no meio aquático. Utilizar para o efeito um local apropriado para o tratamento dos resíduos
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8.2. Anexo 2- Dedução da equação de Lineweaver-Burk Dedução da equação de Lineweaver-Burk por linearização da equação de MichaelisMenten.
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8.3. Anexo 3- Preparação de soluções
Extracto não purificado de enzima
Homogeneizar muito bem 50 g de fermento de padeiro em 100 ml de solução NaHCO3 0,1 M, durante 1 ou 2 minutos. Transferir a mistura para um erlenmeyer de 250 ml, vedar com um pouco de algodão e incubar num banho termostatizado a 40ºC, durante 24 h. Após a autólise da células de fermento, centrifugar a mistura durante 15 min. Transferir o líquido sobrenadante, límpido, para uma proveta e registar o volume, guardando este extracto de enzima no frigorífico.
Reagente de DNS Dissolver 1 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico em 200 ml de NaOH 2 N, aquecendo e
agitando vigorosamente (solução A). Dissolver 300 g de tartarato de sódio e potássio em 500 ml de água destilada (solução B). Misturar 30 ml da solução A com 75 ml da solução B e perfazer o volume para 150 ml com água destilada.
Tampão acetato 20 mM, pH 4.5 Pesar a quantidade de acetato de sódio necessária para preparar 500 ml de solução 20
mM, colocar num copo de 500 ml, adicionar cerca de 400 ml de água e homogeneizar. Verificar o pH da solução resultante com o medidor de pH. Se necessário, acertar o pH no valor pretendido (4.5), adicionando pouco a pouco, com um conta gotas, ácido clorídrico concentrado, agitando continuamente a solução através de um agitador magnético. Transferir a solução para um balão de 500 ml e aferir com água destilada. Homogeneizar.
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