Relatorio Cinética Enzimática da Invertase

Licenciatura em Biologia-Geologia 2010/2011

Bioquímica Estrutural

Actividade prática TL3

Docente Dr. Pedro Miguel Santos

Janeiro 2011

Grupo 3 Turno 1 Ana Cláudia Candeias, 62374 Joana Faria, 62349 Paula Gonçalves, 62345 Vera Soares, 62365


Índice

Resumo

p. 2

Introdução

p. 3

Resultados

p. 7

Discussão

p.13

Bibliografia

p.16

Anexos

p.17 1. Procedimento de determinação de condições ideias de funcionamento da catalase.

p. 17

2. Bomba sódio/potássio

p.19

1


Resumo Existentes praticamente em todos os organismos vivos, e com variadíssimas funções e especificidade, as enzimas, moléculas biológicas de natureza proteica, assumem um papel fundamental na manutenção da vida. A actividade prática realizada e o presente relatório referem-se à actividade catalítica de uma enzima em particular, a invertase (proveniente de

saccharomyces cerevisiae) que é responsável pela hidrólise da sacarose em glicose e frutose, tendo como objectivo a determinação de parâmetros cinéticos para a actividade da enzima em questão. A fonte de enzima utilizada foi fermento de padeiro comum. Como supramencionado, a invertase catalisa a hidrólise da sacarose (substrato) dando origem a frutose (β-D-frutose) e gli cose (α-D-glicose) (produtos da reacção). A actividade laboral dividiu-se em duas partes: a determinação do tempo de reacção e da concentração de células correspondente à estimativa correcta de velocidades iniciais de reacção e, posteriormente, a determinação dos parâmetros cinéticos de Vmáx e Km da invertase. Também neste protocolo foi utilizado o método DNS que permite a identificação de açúcares redutores, conferindo uma coloração alaranjada às amostras que contêm sacarose hidrolisada. O protocolo prático seguido foi fornecido pelo docente, sendo atribuído a cada um dos quatro grupos de trabalho diferentes concentrações de sacarose e de enzima para que fosse possível perceber de que forma a concentração de substrato e a concentração de enzima afectam a actividade enzimática. No entanto, é necessário salvaguardar que existem outros factores que condicionam a actividade de uma enzima, como por exemplo o pH e a temperatura. A determinação dos parâmetros cinéticos teve como resultado o valor de Vmáx de 8,64 mM min -1 e de Km de 22,68 mM.

2


Introdução O presente relatório segue no contexto da actividade laboratorial sobre a cinética enzimática, uma vez que as enzimas são um grupo de biomoléculas cuja funcionalidade adquire uma importância vital nos sistemas biológicos. Para facilitar a compreensão dos resultados obtidos experimentalmente é necessária uma elucidação teórica.

As enzimas são um grupo de proteínas que têm como função catalisar processos biológicos, isto é, baixam a energia de activação necessária e permitem que estes ocorram mais rapidamente, com reduzida formação de produtos laterais aos da reacção, possuindo ainda a capacidade de regular o seu funcionamento de acordo com a concentração de substrato existente no meio. [1,2] No que se refere à energia de activação, esta define-se como sendo a energia que é necessário fornecer ao sistema para se iniciar uma reacção química. A enzima interfere na velocidade a que a reacção ocorre e não no seu equilíbrio, recuperando o seu estado inicial no final da reacção. [3] A actividade catalítica de uma enzima está dependente da sua conformação nativa, isto é, do seu arranjo tridimensional que pode ser afectado por factores como o pH e a temperatura. Assim, cada enzima apresenta uma gama de condições fisiológicas para as quais a sua actividade é máxima, as condições óptimas de funcionamento da enzima. As enzimas, não estando sempre funcionais, necessitam de ser activadas. Para que tal aconteça é necessário que a estas se ligue o substrato. O substrato é um reagente com especificidade que se liga ao centro activo (menos de 5% da área superficial) de uma determinada enzima activando-a, formando-se assim o complexo enzima-substrato, que vai dar a funcionalidade à enzima. [3,4] Para além disso, algumas enzimas, para além dos resíduos aminoacídicos, necessitam ainda de um grupo adicional para se tornarem funcionais, os cofactores (maioritariamente iões inorgânicos) ou até complexos orgânicos conhecidos por coenzimas. Vários tipos de reacções podem ser catalisadas por enzimas, e consoante as reacções que catalizam, podem ser classificadas em: oxirredutases (catalisam reacções oxidação redução); tranferases (catalisam transferência de átomos ou grupos de átomos); hidrolases (catalisam reacções de hidrolise); liases (catalisam reacções aonde sai uma molécula que não é

3


a água); isomerases (catalisam a transformação transformação de um isómero no no outro), ligases (catalisam reacções em que há síntese de moléculas). 3

O estudo da cinética enzimática é uma constante na bioquímica. Este estudo consiste em determinar a velocidade de actuação de uma determinada enzima podendo ser avaliada pela diminuição da quantidade de substrato ou pelo aumento da quantidade do produto tendo em consideração factores como a temperatura e o pH óptimos dessa reacção. A cinética enzimática permite-nos representar graficamente o comportamento de uma dada enzima em diferentes condições de concentração de subtrato. A equação que nos elucida sobre esse comportamento é a equação de Michaelis-Menten, cujos valores de Vmáx, Vo e Km são conhecidos como parâmetros cinéticos. A equação é dada pela fórmula:

 

   

A constante Km (constante de Michaelis) indica a afinidade entre a enzima e o substrato. Um valor de Km elevado traduz uma baixa afinidade entre a enzima e o substrato e um valor de Km pouco elevado indica um forte afinidade enzima-substrato. O parâmetro Vmáx é a velocidade máxima que a reacção pode alcançar, isto é, a situação limite em que todas as enzimas se encontram “ocupadas” por substrato *19+.

Transformando a equação de Michaelis-Menten (através de uma inversão) obtemos a equação de Lineweaver-Burk

 



 



 

O gráfico 1/Vo versus 1/S é uma recta de declive positivo que origina a representação gráfica da equação de Lineweaver-Burk . A partir dela é possível calcular o Km e Vmáx, utilizando resultados experimentais.

Na actividade enzimática poderá ocorrer inibição i nibição e os parâmetros cinéticos Km e Vmáx podem ser utilizados para identificar o tipo de inibição presente. Os inibidores enzimáticos são moléculas que provocam a diminuição da velocidade de reacção. Essa inibição pode ser reversível ou irreversível. Relativamente à inibição reversível, esta pode ser de dois tipos: competitiva, em que há uma competição entre o substrato e o inibidor pelo coentro activo da enzima (o que implica uma grande semelhança estrutural entre inibidor e substrato) e não

4


competitiva, em que o inibidor não compete pelo centro activo, possuindo um outro local de ligação no complexo enzima-substrato já formado. Na inibição competitiva, o valor de Km aumenta e o valor de V max não se altera. Na inibição não competitiva (ou acompetitiva) o valor de Km diminui e Vmax aumenta. Existe também um terceiro tipo de inibição reversível, a inibição reversível mista, em que o inibidor se liga a um local especifico ou da enzima ou do já formado complexo enzima-substrato.

Na actividade laboratorial em questão, foi determinada a cinética enzimática da invertase na hidrólise da sacarose. A sacarose é um dissacarideo que tem função energética. Ao ser hidrolisada é obtido frutose (β-D-frutose) e glicose (α -D-glicose). A enzima invertase actua nesta reacção fazendo

com que a sua hidrólise ocorra mais rápido. A velocidade desta reacção pode ser determinada através da variação da quantidade de sacarose e de frutose ou glucose, ou pela variação da rotação óptica da sacarose.

As células utilizadas foram da Saccharomyces cerevisiae e estes organismos encontravam-se em fermento de padeiro onde seguidamente adicionamos tampão acetato, 0,02 pH 4.5. O tampão é utilizado para garantir que não ocorrem variações de pH ao longo da experiência, isto é, que este se mantém constante. Na actividade foi utilizado o método de DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico). Este método consiste na redução do DNS, a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico em que o grupo aldeído do açúcar é oxidado a grupo carboxílico. Ao reagir com o açúcar, vai perdendo a sua tonalidade amarelada ficando com uma tonalidade vermelho intenso, o que permite a sua leitura no espectrofotómetro. Quanto maior a concentração, mais intenso será o vermelho. Um espectrofotómetro é um dispositivo que mede a luz absorvida por determinada substância quando esta é atravessada por um feixe. Quanto maior for a concentração da substância na solução, maior será o valor de absorvância obtido, isto é, a quantidade de luz absorvida será também maior. O princípio da absorção da luz diz-nos que: a absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução e a absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância percorrida pelo feixe de luz. Assim surge a Lei de Lambert-Beer:

A λ = ξ λ . c . l

A

absorvância – coeficiente de extinção molar

c – concentração da substância (mol/L) l – distância percorrida pela luz através da substância (cm)

5


Todos os princípios supracitados permitiram analisar e interpretar os resultados que seguidamente serão apresentados.

6


Resultados

a) A primeira parte da actividade experimental tinha como objectivo determinar o tempo de reacção ideal para a que fosse possível observar correctamente o comportamento da invertase, no que se refere a cinética enzimática.

Através dos valores de absorvância lidos no espectrofotómetro, foi calculado o parâmetro V0, pela fórmula  

   

.

Os valores de absorvância obtidos assim como os valores de V0 foram compilados na tabela 1.

Tabela 1. Valores de absorvância obtidos e respectivos valores de V 0

Grupos 1 - (2 mg/ml) 2 - (5 mg/ml) 3 - (10 mg/ml) 4 - (20 mg/ml)

0 (min.)

2 (min.)

4 (min.)

6 (min.)

8 (min.)

12 (min.)

-0,073 0 -0,084 0,025

-0,062 0,025 -0,063 0,098

-0,064 0,035 -0,02 0,175

-0,054 0,052 0,082 0,232

-0,064 0,081 0,13 0,351

-0,069 0,129 0,154 0,439

Os valores de absorvância obtidos não deveriam ser negativos uma vez que previamente, o espectrofotómetro tinha sido calibrado com um branco. O valor absoluto mais negativo foi então somado a todos os valores (0.0840) para que o gráfico sacarose hidrolisada em função do tempo estivesse apenas na parte positiva de ambos os eixos, como se observa na figura 1.

Utilizou-se a recta de calibração, cuja recta de regressão linear é dada pela fórmula

                   (ver

anexo,

figura 6), para calcular a quantidade de sacarose hidrolisada pois esta é proporcional à quantidade de produto formado, isto é, glicose (α-D-glicose) e frutose (β -D-frutose).

7


40,00

2 mg /L

35,00 ) 30,00 M m ( ] 25,00 a d a s 20,00 i l o r d i 15,00 h e s o r 10,00 a c a s [

10 mg /L 20 mg /L 2 mg /L 5 mg /L

y = 1,4261x 1,4261x - 0,1574 0,1574 R² = 0,9167

10 mg /L 20 mg /L

y = 0,662x + 5,2093 R² = 0,9836

5,00

Linear (2 mg /L) Linear (5 mg /L)

y = 0,0099x + 1,2529 R² = 0,011

0,00 -5,00

5 mg /L

y = 2,2437x + 7,2523 R² = 0,9849

0

5

10 Tempo (minutos)

Linear (10 mg /L) 15

Linear (20 mg /L)

Figura 1 Gráfico concentração de sacarose hidrolisada – tempo, obtido utilizando uma recta de calibração para açúcares redutores que se apresenta na figura 6, em anexos

Com os resultados obtidos, concluiu-se que o tempo t empo de reacção mais favorável seria 6 minutos uma vez que foi neste intervalo de tempo que se obtiveram valores de ∆DO/∆t mais elevados. Assim, esse foi o tempo utilizado na parte seguinte da actividade experimental.

Seguidamente, procedeu-se à execução do gráfico que se apresenta em baixo, que se refere à velocidade da reacção em função da concentração celular utilizada. Os declives das rectas do gráfico da figura 1 correspondem ao parâmetro V0 e, através destes, foi possível determinar a actividade total (U) da enzima invertase, que corresponde ao gráfico da figura 2.

Actividade enzimática total da invertase 2,5 2 n i m / 1,5 M m 1 0 V 0,5

0 0

5

10

15

20

25

[células] mg/mL Figura 2. Gráfico da actividade enzimática total (U) da invertase

8


Sabendo que a actividade específica é igual ao quociente entre a actividade total e a quantidade

de

enzima,

ou

seja,

  

    

,

representamos graficamente a actividade específica da invertase, nos primeiros 6 minutos. Actividade específica da invertase

0,35

1 a 0,3 n i e t o r 0,25 p g m 0,2 1 n i 0,15 m M m 0 V

Actividade específica para os 6 min

0,1

0,05 0 0

5

10 15 [células] mg/mL

20

25

Figura 3. Actividade Específica da invertase, obtida através da representação gráfica dos valores de actividade enzimática total/quantidade de enzima

Após estimada a actividade específica da invertase, procede-se agora á segunda parte da actividade experimental que pretende determinar os parâmetros cinéticos da invertase.

b) Os parâmetros que se pretendiam determinar eram o Km e o Vmáx. Para isso, e depois de determinado o tempo de reacção a ser utilizado, foram preparadas 8 amostras, de diferentes concentrações de sacarose. Foi medida a densidade óptica, cujos valores se encontram compilados na tabela 2, procedeu-se à determinação da quantidade de sacarose hidrolisada, utilizando para isso a recta de calibração já utilizada na primeira parte da actividade experimental. Tabela 2. Valores de absorvância obtidos a t 0 e t6 , para diferentes concentrações de sacarose, em mM

Concentração de sacarose (mM)

Absorvância 0 (min.) 6 (min.)

0

-0,086

-0,078

1

-0,085

-0,083

3

-0,071

-0,049

10

-0,061

-0,028

30

-0,055

-0,032

100

-0,081

-0,033

300

-0,037

0,0118

1000

0,012

0,05 9


Seguiu-se o cálculo de V0, em função da concentração de enzima, dados esses que se apresentam na tabela 3. Tabela 3. Valores do parâmetro V 0 , em função das diferentes concentrações de sacarose

Concentração de sacarose (mM)

V0

0

1,33

1

0,33

3

3,67

10

5,50

30

3,83

100

8,00

300

8,13

1000

6,33

Utilizando os dados acima citados, foi possível traçar um gráfico V0 em função da concentração de sacarose, gráfico esse que equivale à equação de Michaelis-Menten, para a cinética enzimática. O valor de V0 correspondente à concentração de 30mM foi excluído para que fosse obtido um gráfico o mais aproximado possível de um comportamento hiperbólico.

Representação Representação da Equação de Michaelis - Menten 9,00 8,00 7,00 ) 1 n i m M m ( 0 V

6,00 5,00 V0 em função da [sacarose]

4,00 3,00 2,00 1,00 0,00

-150

50

250

450 [sacarose] (mM )

650

850

1050

Figura 4. Representação gráfica da equação de Michaelis – Menten, para a actividade da invertase

10


Através da equação de Michaelis-Menten obtemos a de Lineweaver-Burk que corresponde ao inverso da equação de Menten. A seguinte tabela apresenta o inverso de Vo 







( ) e o inverso da concentração de substrato, a sacarose ( ), valores estes que serão utilizados para fazer a linearização do gráfico da figura 4.

Tabela 4. Valores do inverso da concentração de sacarose e de V 0

1/[sacarose] mM 0

1/V0 -1 mM min 0,750

1

3,000

0,333

0,273

0,1

0,182

0,010

0,125

0,0033

0,123

0,001

0,158

Obtivemos assim a equação de Lineweaver-Burk que permitirá calcular os parâmetros cinéticos de interesse para a actividade da enzima invertase.

Equação de Lineweaver-Burk para actividade da invertase 3,500 3,000

y = 2,6252x + 0,1157 R² = 0,8467

) 1 - 2,500 n i m 2,000 M m / 1 ( 1,500 0 V / 1,000 1

0,500 0,000 0

0,2

0,4

0,6 0,8 1/[sacarose] (1/mM)

1

1,2

Figura 5. Linearização da equação de Michaelis - Menten, ou equação de Lineweaver - Burk, para a actividade da invertase

11


Através da recta obtida procede-se à determinação dos valores de Km e V 0 :  



 

Y = m



 





(Equação de Lineweaver-Burk)



x + b

A recta obtida na figura 5 foi: y = 2,6252x + 0,1157 Assim, 0,1157 =  

 

 Vmáx = 8,64 mM min

-1

    Km = 8,64 x 2,6252  Km = 22,68 mM = 22,68 x 10 3M

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Discussão Na primeira parte da actividade experimental, pretendia averiguar-se qual seria o tempo de reacção ideal para a determinação dos parâmetros cinéticos da enzima invertase. Assim, após preparação de tubos “falcon” com diferentes concentrações de células (e, consequentemente, de enzima), colocaram-se os tubos num banho a 40 °C, retirando para tubos de ensaio contendo DNS, 0,5 ml de suspensão de células aos seguintes tempos: t 0, t2, t 4, t6, t8 e t12. Os valores de absorvância obtidos para todas as amostras foram depois compilados e, pela análise da tabela 1 foi concluído que o tempo de reacção ideal para a determinação dos parâmetros cinéticos seria 6 minutos, com uma concentração celular entre os 5 mg/ml e os 10 mg/ml. Embora os valores da tabela 1 não estejam completamente em conformidade com o espectável, uma vez que não seriam esperados valores negativos, quase todos os grupos apresentam um aumento do valor de absorvância ao longo do tempo o que indica um aumento da quantidade de açúcares redutores (que implica o aumento da sacarose hidrolisada). O aparecimento de valores de absorvância negativos deve-se, provavelmente, a uma má preparação do branco ou a uma incorrecta calibração do espectrofotómetro. No que respeita à má preparação do branco, um dos erros mais comuns será o erro na pipetagem, erro esse que também se poderá ter repercutido nas amostras e levado, por sua vez, a um acentuar de resultados erróneos nas leituras de densidade óptica. Apesar disso, como a tendência dos valores parece ser a correcta, não comprometerão de forma muito acentuada as conclusões que se pretendem retirar em relaç ão ao parâmetro Vo. A determinação do Vo é utilizada para estimar a actividade enzimática total e, partindo dessa, estimar também a actividade enzimática específica. O valor de Vo não é, contudo, o valor de velocidade inicial real uma vez que isso só aconteceria se o valor do coeficiente de correlação (r2) fosse igual a 1 (o que significaria que todos os pontos coincidem com a recta de regressão linear). Analisando o gráfico correspondente à actividade enzimática total, percebe-se que a relação entre Vo e quantidade de células (que será o mesmo que dizer quantidade de enzima) é directa, isto é, quanto maior a quantidade de enzima presente, maior será a velocidade inicial para a reacção de hidrólise da sacarose. No que se refere a actividade específica da enzima, nos primeiros 6 minutos, a actividade a concentrações de enzima entre 5mg/ml e 10mg/ml estão claramente favorecidas o que poderá indicar serem estas as condições

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optimais de concentração enzimática para a invertase. Para concentrações muito elevadas de enzima invertase, ocorre uma redução da sua actividade.

Relativamente à segunda parte do trabalho, foi obtida uma representação gráfica que corresponde à equação de Michaelis – Menten para o comportamento cinético da enzima. Esse gráfico foi obtido partindo de valores de absorvância obtidos na leitura ao espectrofotómetro de amostras contendo diferentes concentrações de sacarose, num intervalo de 6 minutos. A representação obtida expressa o comportamento cinético da invertase. Verifica-se que para baixas concentrações de substrato (sacarose) a V0 aumenta de forma muito acentuada, aumento esse que se vai tornando mais moderado até atingir um máximo, correspondente ao parâmetro Vmáx para o qual todos os centros activos das enzimas invertase estão virtualmente ocupados. Verifica-se também que após alcançada a velocidade máxima do sistema de reacção, ocorre uma diminuição da actividade enzimática embora a concentração de substrato continue a aumentar. Tal facto poderá ser indicador de que, à medida que a sacarose vai sendo hidrolisada, a concentração dos seus produtos (glicose e frutose) vai aumentando no meio, o que poderá funcionar como inibidor da actividade originando a redução acentuada que se verifica na figura 4. Para determinar analiticamente os valores de Km e Vmáx foi necessário recorrer à linearização do gráfico de Michaelis-Menten, obtendo assim o gráfico de Lineweaver-Burk. Este gráfico corresponde ao valor de 1/Vo em função de 1/[sacarose]. A recta obtida,

y=2,6252x + 0,1157 foi utilizada para determinar os parâmetros cinéticos pretendidos uma vez que a equação de Lineweaver-Burk

 



 

y=mx+b. Assim, o valor de b obtido foi igualado a



 

  



 

é uma equação do tipo

e o valor de m foi igualado a

 

.

Os valores obtidos para Vmáx e Km são, respectivamente, 8,64 mM min-1 e 22,68 mM.

Apesar dos erros detectados no decorrer da actividade, não só erros de pipetagem mas também associados à adição de enzima aos tubos de ensaio que poderá não ter sido feita nos tempos pedidos, ou não ter sido realizada a temperatura ideal ou até mesmo o intervalo de tempo que decorria desde o momento que se adicionava a enzima aos tubos de ensaio e o momento em que eram colocadas no segundo banho, em água a ferver, poderá ter afectado os resultados. No entanto, apesar de alguns resultados apresentarem anomalias, foi possível

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determinar os parâmetros cinéticos pretendidos. Se o valor de coeficiente de correlação, isto é, de r2 fosse mais próximo de 1, os resultados seriam mais próximos dos valores reais. No entanto, um valor de r2 de , aproximadamente, 0,85 parece-nos ser aceitável. Quanto mais próximo das condições ideais de pH e temperatura for o funcionamento de uma enzima, maior será a sua actividade e mais facilmente serão interpretados os resultados. Assim, a determinação das condições ideias de funcionamento destes biocatalisadores é também de extrema importância em Bioquímica. Por esse mesmo motivo, segue em anexo um protocolo experimental que visa determinar as condições optimais de pH e temperatura para a enzima invertase. i nvertase.

15


Bibliografia *1+ Professor Professor Santos, Pedro. Aula 7 “Métodos de análise e caracterização de proteínas (continuação)”

[2] HALPERN, Manuel Júdice; Bioquímica, 1997, Lidel [3] NELSON, David L; COX, Michael M. (2005) “Lehninger – Principles of Biochemistry” ; chapter 6 “Enzymes”, 4ª edição, W.H. Freeman and Company, Company, New York

[4] BALDAIA et al (2009). “ Terra - Universo de vida”, Porto Editora *5+ NELSON, David L; COX, Michael M. (2005) “Lehninger – Principles of Biochemistry” ; chapter 11 “Biological Membranes and Transport”, 4ª edição, W.H. Freeman and Company, New York

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Anexos

Figura 6. Recta de calibração utilizada para calcular a quantidade de sacarose hidrolisada e cuja recta de regressão linear é [açúcares redutores, g/l] = 1,89 x DO 540 nm + 0,002

1 . Protocolo referente à determinação das condições optimais de pH e temperatura para a enzima invertase invertase

Utilizando os dados fornecidos pelo TL3, procede-se agora à determinação das condições ideais de pH e temperatura para a enzima invertase, sabendo que o tempo de reacção deverá ser 6 minutos e a concentração celular deverá situar-se entre 5mg/ml e 10mg/ml.

Procedimento: I.

Preparar, em quatro balões de 25 ml, quatro soluções de sacarose e tampão acetato 0,02M contendo, cada balão, tampão com pH 4; 5; 6 e 7, respectivamente.

II.

Pesar e ressuspender fermento de padeiro em tampão, com o respectivo valor de pH, -1

de modo a obter-se uma concentração de células de 10 mg ml no balão. III.

Transferir o conteúdo de cada balão para um tubo de Falcon e agitar no vórtex para homogeneizar.

IV.

Preparar 24 tubos de ensaio contendo 0,5 ml de DNS, e 0,5 ml de cada solução de sacarose (e tampão) com diferente valor de pH para cada tubo de ensaio, obtendo-se assim seis amostras para cada tampão acetato 0.02M a pH 4, 5, 6 e 7. Preparar também mais quatro brancos, cada um com respectivo tampão. Cada grupo de trabalho deverá, então, então, preparar 7 tubos tubos de ensaio ensaio (6 amostras + 1 branco) branco) com tampão do pH que lhes for atribuído.

17


V.

Colocar dois tubo de ensaio de cada solução com determinado valor de pH a temperatura ambiente, dois outros tubos num banho de água a 40 C e os dois últimos 

em gelo. Adicionar aos dois tubos de ensaio 0,5 ml de suspensão de células presente no tubo de Falcon a tempo zero, retirando um dos tubos. Agitá-lo no vórtex e proceder ao doseamento de açúcares redutores pelo método DNS (incubar a amostra durante 5 minutos, num banho de água a ferver. Deixar arrefecer, adicionar 5 ml de água desionizada e ler a respectiva absorvância a 540 nm). O outro tubo de ensaio deve permanecer à temperatura ambiente, num banho a 40 C ou em gelo durante mais 6 

minutos (após adição da suspensão de células). Ao fim desses 6 minutos, retirar os tubos de ensaio, agitar no vórtex e proceder ao doseamento de açúcares redutores por método DNS. Não esquecer de adicionar 0,5 ml de água desionisada antes de proceder à leitura de DO. Fazer este procedimento para todos os valores de pH em estudo. VI.

Proceder à leitura da absorvância a 540 nm num espectrofotómetro dos produtos formados em cada tubo de ensaio.

VII.

Determinar a concentração de açúcares redutores formados em cada amostra através da recta de calibração para açúcares redutores.

Após a análise dos resultados obtidos, verificar-se-ão as condições para as quais os valores de actividade enzimática foram mais elevados, isto é, as condições onde a taxa de formação de açúcares redutores foi mais acentuada. Deve, para isso, proceder-se à execução de um gráfico [sacarose hidrolisada] em função da temperatura, contendo os dados de todos os grupos, isto é, os valores de sacarose hidrolisada a pH 4, 5, 6 e 7.

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2. Gradiente electroquímico electroquímico e potencial de membrana

Para que os iões passem do meio interno da célula para o meio externo, ou vice-versa, têm que atravessar a membrana celular mas isso não é possível devido ao facto de os iões serem partículas electricamente carregadas. Para que ocorra este transporte é necessário que existam na membrana proteínas transportadoras ou canais. Os canais iónicos abrem e fecham de acordo com variações do potencial de membrana. O potencial de membrana é criado quando iões com cargas opostas são separados por uma membrana [5]. A direcção em que em que um soluto electricamente carregado tende a mover-se de forma espontânea depende quer do gradiente químico, isto é, da diferença de concentrações do soluto, quer do gradiente eléctrico, isto é, do potencial de membrana. Estes dois factores constituem o gradiente electroquímico.

Ao transporte de iões pode estar interligado o transporte activo. Este transporte requer o gasto de energia, ATP, pois é contra o gradiente de concentração. Isto implica a movimentação de substâncias do meio em que estão menos concentradas para o meio em que estão mais concentradas. +

+

Um exemplo do transporte de iões em transporte activo é a bomba de Na /K , que +

está presente em todas as membranas plasmáticas. O ião Na tem menor concentração em meio intracelular e o ião K+ tem menor concentração no meio extracelular, logo ocorre transporte do ião Na+ para fora da célula e do ião K+ para dentro. Mas a entrada e a saída +

destes dois iões não ocorre à mesma velocidade, enquanto saem 3 catiões sódio (Na ), entram +

2 catiões potássio (K ). Isto provoca uma maior densidade de carga positiva no meio extracelular o que gera uma diferença de potencial na membrana. A Bomba Na+/K+ - ATPase da membrana plasmática mantém baixa a concentração intracelular de sódio e alta a concentração intracelular de potássio. Em quase todas as células em repouso, a membrana plasmática é muito mais permeável ao potássio que ao sódio, de modo que o potencial de repouso da membrana é mais próximo de potencial de equilíbrio de potássio (-90mV). O bombeamento de sódio para o meio extracelular permite a manutenção do equilíbrio osmótico, sendo um mecanismo que protege as células da variação da pressão ósmótica.

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Relatorio Cinética Enzimática da Invertase

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