Universidad Universidad de Chile Facultad de Ciencias Depto. Química
“Cinética Enzimática: Enzimática: Actividad Actividad enzimática En Peroxidasa Peroxidasa de Rábano Rábano””
Autores: Muriel Andrade Katherine Soto Profesora: María Cecilia Rojas
Fecha: 10/06/10
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Introducción
En los organismos vivos, y en particular dentro de la célula, con requeridos distintos tipos de reacciones para poder llevar a cabo distintos tipos de procesos. Un tipo de reacciones son las REDOX que a modo general ocurren por la transferencia de electrones desde un Agente Reductor a un Agente Oxidante.
En particular estas reacciones de oxidorreducción pueden ser catalizadas por un tipo especial de enzimas llamadas Oxidoreductasas, estas se clasifican de acuerdo al grupo sobre el cual actúan, ya sea quitando o entregando electrones. De esta clasificación se destacan las Deshidrogenasas, las Reductasas y las Peroxidasas. Las peroxidasas según su clasificación actúan con un peróxido como aceptor de los electrones y en su gran mayoría corresponden a hemoproteínas. La Peroxidasa de Rábano (HRP), es una hemoproteina y actúa sobre Peróxido de hidrógeno como aceptor de los electrones siguiendo un mecanismo radicalario de acuerdo a las siguientes reacciones: HRP + H 2 O 2
⇔
Complejo I + H 2 O
Complejo I + AH 2
⇔
Complejo II + AH ⋅
Complejo II + AH 2
⇔
HRP + AH ⋅ + H 2 O
2AH 2
+
H 2O2
→
2AH ⋅ +2H 2 O
Donde AH2 representa a un sustrato que puede ser algún fenol u otro compuesto aromático, en el caso particular de este trabajo, corresponde al Guayacol (2-metoxifenol) un derivado incoloro del Catecol (1,2-dihidroxibenceno) el cual al oxidarse por la combinación de los radicales libres de los producto entre si, produce un compuesto de color rojo ladrillo. 2AH ⋅ → A + AH 2
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En el presente informe, se muestra una serie de experimentos realizados para comprobar la acción de una enzima en la oxidación del guayacol en presencia de peroxido de hidrogeno. Para esto se mide el tiempo de la reacción catalizada por la enzima, luego se hacen controles variando la presencia de algunos de los dos sustratos o de la enzima misma, también se verificó la actividad enzimática con ensayos utilizando un inhibidor o variando las condiciones de reacción como son la temperatura, el pH y concentración de enzima
Objetivos Generales: -
Determinación cualitativa de las propiedades cinéticas de la enzima Peroxidasa de rábano (HRP).
-
Diseñar protocolos para demostrar que se trata de una reacción enzimática.
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Desarrollo Experimental
Experimento 1: Preparación del medio de incubación, observación y desarrollo de reacciones a modo de control. T = 16ºC. Objetivo: Comprobar que la reacción corresponde a una reacción enzimática.
i- Preparación del medio de incubación.
Tabla 1: Concentraciones de cada reactivo Compuesto Citrato de Sodio (pH 5) Guayacol H2O2 Extracto de Rábano H2O Volumen Total (mL)
Concentración Inicial (M) 0,5 0,05 8,82x10-4 (3%) -
Concentración Final (M)* 0,05 5E-3 8,82x10-5 (0,3%) -
Volumen requerido (mL) 0,3 0,3 0,3 0,2 1,9 3
Tabla 2: Intensidad del color con respecto al tiempo. Tiempo (s)
0 (sin enzima) 3 20 63 110 170 240 300 480 600
Intensidad Relativa**
0 + ++ +++ ++++ +++++ ++++++ +++++++ ++++++++ +++++++++
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ii- Controles.
Control:
1. Reacción sin H2O2. 2. Reacción sin Extracto de Rábano (Enzima). 3. Reacción sin Guayacol 4. Reacción con Extracto de Rábano hervido.
Tabla 3: Volúmenes de los componentes para los diferentes controles realizados. Compuesto Control 1 Control 2 Control 3 Control 4
Citrato de sodio pH 5 (mL) 0,3 0,3 0,3 0,3
Guayacol
H2O2
0,05 M
(mL)
0,3 0,3 0,3
0,3 0,3 0,3
Extracto de Rábano (mL) 0,2 0,2 0,2
H2O (mL)
2,2 2,1 2,2 1,9
Tabla 4: Resultados de los controles. Control 1 2 3 4
Observaciones
No aparece coloración. No aparece coloración. No aparece coloración. No aparece coloración.
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Experimento 2: Diseñar y realizar ensayos variando: concentración de enzima, pH y en presencia de un inhibidor. T = 16ºC. Objetivo: Comprobar el efecto de las variaciones del medio sobre la cinética enzimática.
a. Ensayo 1: Variación del pH del medio de incubación usando buffer de Citrato de sodio a pH 4, 5 y 6.
Tabla 5: Volúmenes utilizados. Volumen total 3 ml. Comp. Tubo Tubo Tubo
Tampón pH 4 0,3 -
Tampón pH 5 0,3 -
Tampón pH 6 0,3
Guayacol
H2O2
Enzima
H2O
0,05 M
(mL)
(mL)
(mL)
0,3 0,3 0,3
0,3 0,3 0,3
0,2 0,2 0,2
1,9 1,9 1,9
Tiempo (s) 320 400 510
b. Ensayo 2: Variación de la concentración de enzima
Tabla 6: Volúmenes usados. Volumen total 3 mL. Comp. Tubo Tubo Tubo
Extracto de rábano (mL) 0,1 0,2 0,3
Tampón pH 5 (mL) 0,3 0,3 0,3
H2O2
Guayacol 0,05
H2O
(mL)
M (mL)
(mL)
0,3 0,3 0,3
0,3 0,3 0,3
2 1,9 1,8
Tiempo (s) 720 265 160
c. Ensayo 3: reacción en presencia de un inhibidor
Tabla 7: Volúmenes usados. Volumen total 3 mL. Compuestos Tubo 1 Observaciones
Guayacol
Ac. Ascórbico
Tampón
H2O2
Enzima
H2O
0,05 M (mL)
0,05 M (mL)
pH 5 (mL)
(mL)
(mL)
(mL)
0,3
0,3
0,2
1,6
0,3 0,3 No se produce coloración.
*Cálculos de concentraciones usando: Ci ⋅ Vi = Cf ⋅ Vf ** Intensidades interpretadas en una escala arbitraria desde 0 a 9 + siendo 0 la solución incolora y 8 el máximo de intensidad alcanzado por la solución en el período de observación. *** Tiempo estimado en que el color deja de cambiar significativamente alcanzando la coloración máxima.
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Concusiones.
En la primera experiencia es posible apreciar la aparición del compuesto de guayacol oxidado (tetraguayacol), compuesto que al ser coloreado servirá de indicador de la reacción, el tiempo que se midió hasta no observar mas cambio de color en la solución. Este tiempo indica la velocidad de reacción en las concisiones de incubación utilizadas.
A partir de los resultados de los controles realizados, se puede afirmar que la oxidación del guayacol en esta experiencia es una reacción enzimática, ya que al quitar alguno de los componentes no se produce la reacción. De control 1 y 3 podemos extraer que la enzima necesita de ambos sustratos para catalizar la reacción, el peroxido de hidrogeno no puede ser reemplazado por el oxigeno del aire, la enzima no tendrá a quién entregar los electrones liberados de la reacción. Además al realizar la experiencia sin el guayacol se puede observar que no hay otro sustrato dentro del extracto de rábano que pueda reaccionar e interferir con los resultados de las otras experiencias. El control 2 indica que el guayacol y H2O2 no formarán el compuesto coloreado, al menos en un tiempo prudente y en las condiciones empladas. Del cuarto ensayo se puede observar que la enzima del extracto de rábano es una enzima proteica, ya que al hervirla, la proteína se desnaturaliza y ya no puede catalizar reacciones.
Al variar entre los distintos valores de pH se pudo apreciar que la actividad de la enzima se vio potenciada a pH=4, lo que se tradujo en un menor tiempo para que se alcanzara la coloración máxima, esto indica que a este pH la afinidad de la enzima por el sustrato es mayor debido principalmente a que los grupos ionizables más cercanos al sitio activo le dan a este una conformación más afín con el sustrato. Según nuestros resultados se podría esperar que el pH óptimo de la enzima se encuentre más cerca de 4 que de 6.
A mayor volumen de extracto mayor concentración de enzima, y a mayor concentración de enzima menos tiempo tarda el sistema en alcanzar la coloración máxima. Con este ensayo se comprueba que la reacción ocurre más rápido cuando hay más enzima, es decir, la velocidad de reacción es proporcional a la concentración de enzima. Esto ocurre porque cuando la concentración de enzima es mayor hay más sitios catalíticos y más sustrato puede ser llevado a producto en menos tiempo.
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Al preparar un medio de reacción en donde además hubiera Acido Ascórbico no apareció coloración, esto indica cierto tipo de inhibición. El acido ascórbico es conocido por su efecto antioxidante y por se un atrapador radicalario, además es sustrato de la HRP. según esto, el efecto del acido ascórbico se puede manifestar de 3 formas: 1- Atrapando los radicales AH· y evitando que estos formen el producto coloreado; 2- Compitiendo con el guayacol por el sitio activo de la enzima, es decir, tomando el rol de AH 2 (inhibición competitiva); y 3- Desactivando los complejos I y II.
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