RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES
OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL y
Verificar Verifica r la calidad de los alimentos haciendo uso de los parámetros coliformes totales y coliformes fecales
OBJETIVOS ESPECIFICOS y
y
Determinar el número de colonias colonias formadas de coliformes totales y fecales en los los diferentes medios de cultivo como ser PDA, PCA, PCA, MC MC Verificar Verifica r el crecimiento de coliformes totales y fecales fecale s en los caldos verde bilis brillante y caldo E.C. respectivamente
INTRODUCCION Coliformes Totales
La denominación genérica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que tienen ciertas características bioquímicas en común e importancia relevante como indicadores de contaminación del agua y los alimentos.
Hábitat del grupo coliforme
Las bacterias de este género se encuentran principalmente en el intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir, homeotermos, pero también ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente en suelos, semillas y vegetales.
Los coliformes se introducen en gran número al medio ambiente por las heces de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse que la mayoría de los coliformes que se encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, existen muchos coliformes de vida libre.
Los coliformes como indicadores
Tradicionalmente se los ha considerado como indicadores de contaminación fecal en el control de calidad del agua destinada al consumo humano en razón de que, en los medios acuáticos, los coliformes son más resistentes que las bacterias patógenas intestinales y
porque su origen es principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica que el agua es bacteriológicamente segura.
Asimismo, su número en el agua es proporcional al grado de contaminación fecal; mientras más coliformes se aislan del agua, mayor es la gravedad de la descarga de heces.
Los coliformes son una familia de bacterias que se encuentran comúnmente en las plantas, el suelo y los animales, incluyendo a los humanos. En general, las bacterias coliformes se encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o en los sedimentos del fondo. Por su amplia diversidad el grupo coliformes ha sido divido en dos grupos: coliformes totales y coliformes fecales.
Bacterias que integran el grupo
El grupo coliforme está formado por los siguientes géneros:
1.Escherichia 2.Klebsiella 3.Enterobacter 4.Citrobacter
FUNDAMENTO TEORICO
Existen diversos métodos para cuantificar el número de microorganismos presentes en muestras líquidas y sólidas. Dentro de las técnicas más comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia, así como los procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintéticos sólidos o líquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) o la estimación por el método del Número Más Probable (NMP). El método del número más probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este método fue empleado para estimar el número de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que también puede ser aplicado para la determinación de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este método es aplicable para estimar el número de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias. Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces
de fermentar la lactosa a 44º C en vez de 37 ºC como lo hacen los totales. Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces están formados por Escherichia coli y ciertas especies deKlebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminación fecal. Éstos últimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas más elevadas. Esta es la característica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotérmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgánica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminación fecal. Su presencia se interpreta como una indicación de que los organismos patógenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades. En alimentos, la identificación de una concentración elevada de Coliformes Fecales en un alimento es indicador de su contaminación y por tanto su mala manipulación, de ser esto así, se debe declarar al alimento en cuestión como No Apto para el Consumo Humano. La Organización Mundial de la Salud indica que la problemática de la contaminación de mares y ríos por aguas servidas y desagües a puesto en alto riesgo a la población acuática de directo consumo humano, estando entre ellos los peces. La contaminación producida también contamina la carne de dichos animales, estando por tanto contaminados en su mayor parte desde su fuente de extracción. Es por tanto de mucha importancia en la actualidad pruebas que descarten la presencia de microorganismos contaminantes tan peligrosos como son los Coliformes Fecales El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gram negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo esta conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.
El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h. de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más prominente es Escherichia coli . La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y diferenciales. Escherichia coli es
un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patógenas que provocan enfermedades diarreicas. Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli enterotoxigénica (ETEC) E. coli enteropatógena (EPEC) y y
y y y y
E. coli enterohemorrágica (EHEC) E. coli enteroinvasiva (EIEC) E. coli enteroagregativa (EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC).
Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados. Escherichia coli enterotoxigénica
ETEC
La infección puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetales frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jóvenes y ancianos la dosis infectiva puede ser más baja. Escherichia coli enteropatógena
ECEP . Es causa importante de diarrea en los lactantes
particularmente en los países en vías de desarrollo. Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y productos cárnicos. En estudios con voluntarios se encontró que la dosis infectiva es de 106 microorganismos. EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente relacionado con el género S higella, produce una enfermedad Escherichia coli enteroinvasiva
similar a la shigelosis. La enfermedad se presenta comúnmente en niños de países subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC provoca la enfermedad (diarrea disentérica invasiva) al invadir las células epiteliales de la mucosa intestinal. La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas. Escherichia coli enterohemorrágica
EHEC produce verotoxina, denominada así
por su efecto citotóxico sobre las células Vero, una línea de células renales de monoverde africano. Existen al menos dos variantes antigénicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis hemorrágica La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis hemorrágica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la cocción completa de la carne
MATERIALES
Reactivos
Materiales y Equipos
Violeta Rojo Bilis Lactosado
(VRBL)
8Cajas
Plate Country Agar
(PCA)
Papa Dextrosa Agar
(PDA)
8
Petrie desechables
Tubos de Ensayo
Caldo
E.Coli
(CEC)
5 Pipetas Volumétricas de 1mL y 10 mL
Caldo
Verde Bilis Brillante
( CVBB)
1 Matraz Erlenmeyer 250 mL
Agua Peptona
Muestra
1 Mechero 1 Asa de Aguja 1 Agitador
1 Estufa
Queso menonita
PROCEDIMIENTO
Protegerse adecuadamente antes de comenzar la práctica es decir colocándose barbijo, gorro y guantes, para posteriormente desinfectar el area de trabajo Tritura lo mas posibles la muestra de queso menonita Pesar 25 gramos de queso y agregar a 225 mL de agua peptonada, agitando vigorosamente Agregar 9 mL. De agua peptonada a 4 tubos de ensayo los cuales tendrán una concentración de 10 -2, 10-3, 10-4, 10-5 Enumerar las concentraciones con las que se va a trabajar en las placas petry PCA: 10-3, 10-4, 10-5 PDA: 10-2, 10-3 MC : 10-3, 10-4, 10-5 y y y
Para el medio PCA se pipetea 1mL de la solución madre y se vierte al primer tubo de concentración 10 -2 Del tubo de concentración 10-2 es extraído 1mL con otra pipeta , la cual es depositada en el tubo de concentración 10 -3
De la misma manera que la anteriores del tubo de concentración 10 -3 se extrae 2 mL. con una nueva pipeta y es vertido 1 ml al tubo de concentración 10 -4 y el 1 mL. Restante a la caja petry de concentración 10 -3 TENIENDO SIEMPRE EN CUENTA QUE EN TODAS LAS DILUCIONES SE TRABAJA DETRÁS DEL MECHERO Y QUE PARA CADA DILUCION DE HACE USO DE OTRA PIPETA
Terminado de depositar las diluciones se procede a vaciar el PCA mas o menos que tenga 3-5 mm de espesor y realizar movimientos leves en forma de 8 y 5
Se procede de la misma manera para el medio PDA y MC con la varienta de que las concentraciones en las placas petry son distintas
del tubo de concentración 10 -4 se pipetea 2 mL. con la pipeta ya descontaminada y es vertido a la caja petri de concentración 10 -4 y el otro 1 ml al tubo de concentración 10 -5 Finalmente del tubo de concentración 10 -5 se pipetea 1 mL. Y se lo vierte a la caja petry de concentración 10 -5
Una vez que las muestras son depositadas en las cajas petri se proceden a destaparlas no por completo y a verter el agar (agua en esta práctica) lentamente hasta que tenga un espesor de 2 cm., luego se tapa la caja y se realizan movimientos en forma de 8 unas 5 veces verticalmente y 3 veces horizontalmente , este procedimiento se realiza con todas las muestras depositadas
SEGUNDA PARTE
Una vez que se hubiesen formado las colonias en el medio MC se verifica la presencia de coliformes totales y coliformes fecales en el caldo verde bilis brillante y caldo EC respectivamente Para ello se elige una placa petri la cual se encuentre dentro del rango y se toman 2 colonias enumerando cada una, a partir de ahí se elige una colonia para hacer la inoculación en el caldo EC y Caldo verde bilis brillante
Después de haber transcurrido 24 horas después de la siembra se procede con la inoculación de la siguiente manera
Se esteriliza todo el medio con el que se va a trabajar es decir mesones y se protege uno adecuadamente (barbijo , guantes y gorro)
Posterior a ello se esteriliza el asa en un mechero se deja enfriar y se destapa la placa petry de concentración 10 -3 se pincha la colonia uno y se le agrga al tubo de ensayo verde bilis brillante teniendo el cuidado de calentar la boquilla en el mechero antes y después de la inoculación
Se vuelve a esterilizar el asa en el mechero dejando que enfrie por unos segundos y se vuelve a pinchar la colonia 1 se destapa el tubo de ensayo que contiene el caldo EC y se lo agrega se agita levemente y se tapa el tubo teniendo el cuidado de calentar la boquilla antes y después de la inoculación
De la misma manera se procede con la colonia # 2 inoculando en los 2 tubos
CALCULOS Y RESULTADOS MEDIO: PCA -3
Dilución 10
Dilución -4
10
Dilución -5
10
Incontable 24 HORAS
Incontable
Incontable 341
48 HORAS
Incontable
Incontable
Debido a que los datos obtenidos en nuestras diluciones en caja petry sobrepasan el rango se trabajara con estos por motivos de practica RTBAM: 3.4*107 UFc/g
MEDIO: PDA -2
Dilución 10
MyL
=
Dilución -3
10
24 HORAS
Incontable
Incontable
48 HORAS
Incontable
420
4.2*105
MEDIO: MC
-3
Dilución 10
96
24 HORAS
Dilución -4
-5
10
10
3
0
VERIFICACION
CALDO VERDE BILIS BRILLANTE (Presencia de CT ) CALDO E.C. (Presencia de CF)
Dilución
COLONIA #1
COLONIA #2
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
MEDIO : MC PARAMETRO: Coliformes totales
CT
=
96*(2/2)* 103
=
9.6 * 10 4 UFc
PARAMETRO: Coliformes fecales
CF 96*(2/2)* 103 =
=
9.6 * 104 UFc
MEDIO: PCA
10-2 24 HORAS
48 HORAS
10-3
MEDIO: PCA 24 HORAS
48 HORAS
MEDIO MACONKEY
10-3
24 HORAS
10-4
10-5
OBSERVACIONES
Las colonias típicas de coliformes presentan un halo rojo En el medio PCA hubo crecimiento de mohos En los medio PCA y PDA los microorganismos no se encontraban dentro del rango de la ISO para hacer el recuento correspondiente Los caldo VBB presentan turbidez Los caldos EC inicialmente eran de color amarillo tenue después de la inoculación se tornan de un blanco lechoso con presencia de precipitado El caldo EC inicialmente tiene una coloración verde
CONCLUSIONES
La muestra de queso tiene 9.6 * 10 4 UFc/g en coliformes totales como coliformes fecales lo cual nos indica que no es apta para el consumo
El medio utilizado en la practica es el MC que es una medio selectivo diferencial para la detección de organismos coliformes y patógeno entéricos.
