NTC-4458 Recuento Coliformes Totales y E. Coli

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 4458 2007-12-12

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES. MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE COLIFORMES O Escherichia coli O O AMBOS. TÉCNICA DE RECUENTO DE COLONIAS UTILIZANDO MEDIOS FLUOROGÉNICOS FLUOROGÉNICOS O CROMOGÉNICOS

E:

MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING STUFFS. HORIZONTAL METHOD FOR THE ENUMERATION OF COLIFORMS AND/OR ESCHERICHIA COLI . COLONY COUNT TECHNIQUE USING FLUOROGENIC OR CHROMOGENIC CULTURE MEDIA.

CORRESPONDENCIA: DESCRIPTORES: DESCRIPT ORES:

método horizontal; método de análisis; microbiología; análisis microbiológico; recuento; recuento en placa; escherichia coli ; coliformes; alimentación animal.

I.C.S.: 07.100.30 Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC) Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435

Prohibida su reproducción

Primera actualización Editada 2007-12-21

PRÓLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último caracterizado por la participación del público en general. La NTC 4458 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo de 2007-12-12. Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través de su participación en el Comité Técnico 25 Microbiología. ACEGRASAS S.A. ALIMENTOS POLAR COLOMBIA S.A. ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A. ANNAR DIAGNOSTICA IMPORT LTDA. ARCHIVO DE BOGOTÁ ASBIOQUIM LTDA. ASEBIOL LABORATORIO LTDA. ASINAL LTDA. ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA COSMÉTICA -ACCYTEC ASOCIACIÓN DE MICROBIÓLOGOS JAVERIANOS AVESCO KOKORICO S.A. BIANALISIS BIOCONTROL LTDA. BIOMERIEUX COLOMBIA S.A. BIOQUILAB LTDA. CALIDAD INDUSTRIAL LTDA. CARULLA VIVERO S.A. COLOMBINA S.A. COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A. CREPES & WAFLES S.A. DON MAÍZ S.A. ENZIPÁN DE COLOMBIA LTDA. FRIGORÍFICOS COLOMBIANOS S.A. FRIGORÍFICOS GUADALUPE S.A. IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA.

JHONSON DIVERSEY COLOMBIA LTDA. KOYOMAD S.A. LA CAMPIÑA S.A. LABCONTROL E.U. LABFARVE LABORATORIO DE FARMACOLOGÍA VEGETAL LABORATORIO DE GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR LABORATORIO EMICAL LTDA. LABORATORIOS GRAM LTDA. LABORATORIOS MICROLAB LTDA. LESNIAK E.U. MERCADEO DE ALIMENTOS DE COLOMBIA S.A. MERCK S.A. MICROBIÓLOGOS ASOCIADOS LTDA. NULAB LTDA. PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS LTDA. QUIK LTDA. SOLUCIONES INTEGRALES MICROBIOLÓGICAS E.U. -SIMSUIZO S.A. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES UNIVERSIDAD MANUELA BELTRÁN UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las siguientes empresas: 3M COLOMBIA S.A. ALGARRA S.A. AQUALAB ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE MICROBIOLOGÍA BAVARIA S.A. BIOTRENDS LABORATORIOS CASA LUKER S.A. CENICAÑA CENTROAGUAS S.A. E.S.P. CERCAL LTDA. CERVECERÍA LEONA S.A. CONGELAGRO CONSULTORA BLANCA USECHE COOPERATIVA DE GANADEROS DE CARTAGENA LTDA. DU PONT QUALICON COLOMBIA S.A. EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ FABRICA DE ESPECIAS Y CONDIMENTOS EL REY S.A. FRUGAL S.A. HOSPITAL DEPARTAMENTAL DE VILLAVICENCIO INGENIO PICHICHI S.A. INGENIO RIOPAILA INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO ICA INSTITUTO NACIONAL DE SALUD -INS INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS INVIMA-

LA CONSTANCIA COLOMBIA S.A. LABORATORIO MICROBIOLÓGICO SIS LABORATOTORIO MICROBIOLÓGICO DE BARRANQUILLA LARKIN LTDA. LEVAPÁN S.A. LLOREDA GRASAS S.A. MEDIIMPLANTES LTDA. MICROLABY LTDA. MINISTERIO DE LA PROTECCIÓN SOCIAL. NESTLÉ DE COLOMBIA S.A. PASIFLORA COLOMBIANA S.A. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA PRODUCTORA DE CONCENTRADOS Y JUGOS DE FRUTA QUALA S.A. QUIOS LTDA. REPRESENTACIONES BIOTECNOLÓGICAS LTDA. RICA RONDO, INDUSTRIA NACIONAL DE ALIMENTOS S.A. SCHERING COLOMBIANA S.A. SECRETARÍA DISTRITAL DE SALUD DE BOGOTÁ TECNIMICRO LABORATORIO DE ANÁLISIS UNIVERSIDAD CATÓLICA INGECAL VIKINGOS S.A.

ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados. DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN


NTC 4458 (Primera actualización)

CONTENIDO Página 1.

OBJETO .......................................................................................................................1

2.

REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................1

3.

TÉRMINOS Y DEFINICIONES .....................................................................................2

4.

PRINCIPIO....................................................................................................................2

4.1

BACTERIAS COLIFORMES FRENTE A UN MEDIO CROMOGÉNICO .....................2

4.2

Escherichia coli

4.3

Escherichia coli

FRENTE A UN MEDIO FLUOROGÉNICO .....................................2 FRENTE A UN MEDIO TRIPTONA BILIS X-GLUCORÓNIDO .......3

4.4

GENERALIDADES.......................................................................................................3

5.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTE .......................................................................3

5.1

GENERALIDADES ......................................................................................................3

5.2

DILUYENTE..................................................................................................................3

5.3

MEDIO SELECTIVO SÓLIDO: AGAR - LACTOSA - BILIS - ROJO NEUTRO CRISTAL VIOLETA, VRBL - PARA COLIFORMES....................................................3

5.4

MEDIO SELECTIVO SÓLIDO: AGAR-LACTOSA-BILIS-ROJO NEUTRO-CRISTAL VIOLETA, + MUG – PARA COLIFORMES Y E COLI.................4

5.5

MEDIO SELECTIVO SÓLIDO: AGAR CON TRIPTONA BILIS X GLUCORÓNIDO ...5

6.

EQUIPO Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO…………………………...6

6.1

APARATO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN EN HÚMEDO (AUTOCLAVE) ......................................................................................6

6.2

INCUBADORA..............................................................................................................6



Página 6.3

CAJAS DE PETRI .......................................................................................................6

6.4

PIPETAS DE SUMINISTRO TOTAL O MICROPIPETAS ............................................6

6.5

BAÑO DE MARÍA ........................................................................................................6

6.6

EQUIPO DE RECUENTO DE COLONIAS ...................................................................6

6.7

MEDIDOR DE pH .........................................................................................................6

7.

MUESTREO..................................................................................................................6

8.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO.......................................................6

9.

PROCEDIMIENTO........................................................................................................7

9.1

SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES ......................................................................7

9.2

INOCULACIÓN E INCUBACIÓN .................................................................................7

9.3

RECUENTO DE LAS COLONIAS................................................................................7

10.

EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS ........................................................................8

10.1

Escherichia coli

10.2

Escherichia coli

10.3

Escherichia coli

11.

MÉTODO DE CÁLCULO..............................................................................................8

11.1

CASO GENERAL .........................................................................................................8

11.2

CASO EN EL QUE CADA CAJA CONTIENE MENOS DE 15 COLONIAS CARACTERÍSTICAS....................................................................................................9

11.3

ESTIMACIÓN DE NÚMEROS PEQUEÑOS……………………………………………….9

11.4

COLONIAS NO CARACTERÍSTICAS .......................................................................10

- MEDIO FLUOROGÉNICO .............................................................8

– MEDIO CROMOGÉNICO..............................................................8

– MEDIO AGAR CON TRIPTONA BILIS X GLUCORÓNIDO 5-BROMO-4-CLORO-3-INDOLIL-D-GLUCURONIDO .................8



Página 12.

PRECISIÓN ................................................................................................................10

12.1

CAJAS QUE CONTENGAN ENTRE 15 Y 150 COLONIAS CARACTERÍSTICAS..................................................................................................10

12.2

CADA CAJA CONTIENE MENOS DE 15 COLONIAS CARACTERÍSTICAS ...........10

13.

INFORME DEL ENSAYO ...........................................................................................10

ANEXOS ANEXO A (Normativo) LÍMITES DE CONFIANZA PARA LA ESTIMACIÓN DE NÚMEROS PEQUEÑOS DE COLONIAS.......................................................................................................................11 ANEXO B (Informativo) BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................12



MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES. MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE COLIFORMES O E s c h e r i c h i a c o l i O AMBOS. TÉCNICA DE RECUENTO DE COLONIAS UTILIZANDO MEDIOS FLUOROGÉNICOS O CROMOGÉNICOS

1.

OBJETO

Esta norma da directrices generales de un método horizontal para el recuento de coliformes, Escherichia coli , o ambos, presentes en productos destinados al consumo humano o alimentación de animales, por medio de la técnica de recuento de colonias en un medio sólido cromogénico o fluorogénico después de su incubación a 35 °C ± 1 °C. NOTA

2.

Esta norma no aplica para la detección de E. coli H7 O157 (véase la NTC 4899).

REFERENCIAS NORMATIVAS

Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicación de este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica únicamente la edición citada. Para referencias no fechadas, se aplica la última edición del documento normativo referenciado (incluida cualquier corrección). NTC 4206, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Reglas Generales para los análisis microbiológicos (ISO 7218). NTC 4491-1, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Preparación de muestras para ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para análisis microbiológico. Parte 1. Reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y de diluciones decimales. NTC 4491-2, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Preparación de muestras para ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para análisis microbiológico. Parte 2. Reglas específicas para la preparación de carne y productos cárnicos. NTC 4491-3, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Preparación de muestras para ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para análisis microbiológico. Parte 3. Reglas específicas para la preparación de pescado y productos de la pesca. NTC 4491-4, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Preparación de muestras para ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para análisis microbiológico. Parte 4. Reglas específicas para la preparación de productos diferentes de leche, productos lácteos, carne, productos cárnicos, pescados y productos de la pesca. 1 de 12

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 3.


TÉRMINOS Y DEFINICIONES

Para los propósitos de esta norma se aplican las siguientes definiciones: 3.1 Coliformes. Grupo de bacterias que presentan ciertas características bioquímicas en común e importancia relevante como indicadores de contaminación del agua y los alimentos. Se encuentran comúnmente en las plantas, el suelo y los animales, incluyendo a los humanos. El grupo coliforme está conformado por los siguientes géneros tales como Escherichia, Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter. NOTA Se define como coliformes fecales, aquellos microorganismos que fermentan la lactosa a 44,5 °C - 45,5 °C, análisis que permite descartar a Enterobacter , puesto que ésta no crece a esa temperatura. Si se aplica este criterio crecerán en el medio de cultivo principalmente E. coli (90 %) y algunas bacterias de los géneros Klebsiella y Citrobacter . La prueba de coliformes fecales positiva indica un 90 % de probabilidad de que el coliforme aislado sea E. coli . Sirven como indicadores de contaminación fecal.

3.2 E s c h e r i c h i a c o l i . Bacilo corto gram negativo que forma parte de la flora normal de intestino de animales de sangre caliente. Es aerobio facultativo, de metabolismo fermentativo, O-Nitrofenli-β-D- galactopiranósido positivo y su crecimiento óptimo es a 37 °C. Algunas cepas pueden producir enterotoxinas y tiene otros factores de virulencia de colonización e invasión por lo cual pueden causar enfermedades diarreicas, así como infecciones urinarias y nosocomiales. 4.

PRINCIPIO

4.1

BACTERIAS COLIFORMES FRENTE A UN MEDIO CROMOGÉNICO

Cuando se utiliza la técnica enzimática, el grupo coliforme se define como toda bacteria que posea la enzima β-D galactosidasa; la cual tiene la propiedad de actuar sobre el substrato cromogénico, formado en la liberación del cromógeno. 4.2

FRENTE A UN MEDIO FLUOROGÉNICO

Escherichia coli

Cuando se utiliza la técnica enzimática, la Escherichia coli es definida, como toda bacteria que da respuesta positiva al grupo coliforme y posee además la enzima B-Glucoronidasa, la cual tiene la propiedad de abrir el substrato fluorogénico, resultando en la liberación del fluorógeno. Un substrato fluorogénico tal como 4-metil-umbeliferil- β-D-glucorónido (MUG) es utilizado para detectar la enzima B-glucoronidasa la cual es producida por E. coli . La enzima B-glucoronidasa hidroliza el substrato y da un producto fluorescente cuando es revelado bajo luz ultravioleta de onda larga (366 nm). La presencia de fluorescencia indica una prueba positiva para E.coli . El medio de cultivo utilizado se basa en la tecnología del substrato definido, el cual emplea nutrientes - indicadores que producen color, fluorescencia, o ambos, al ser metabolizados por los microorganismos coliformes y E. coli ; los cuales son detectados simultáneamente. El reactivo proporciona dos nutrientes-indicadores específicos: ONPG (O- nitrofenil - β-dgalactopiranósido) y MUG (4-metil-umbeliferil- β- d- glucorónido). Durante la metabolización de éstos nutrientes por la enzima Coliforme β-D galactosidasa y β- glucoronidasa de E. coli , se produce un color amarillo (del ONPG) y fluorescencia (del MUG). Con lo cual queda confirmada la presencia de coliformes y de E. coli respectivamente. 2

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NOTA

4.3


Definiciones tomadas de la NTC 4772 coliformes en agua SM 9221F.

FRENTE A UN MEDIO TRIPTONA BILIS X-GLUCORÓNIDO

Escherichia coli

La presencia de la enzima β-D-glocoronidasa diferencia la E. coli de los otros coliformes. E. coli absorbe el sustrato cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indol- β-D-glocorónido (X-β-D-glocorónido). La enzima β-glucoronidasa rompe los enlaces entre el 5-bromo-4-cloro-3-indolil cromóforo y el β-D-glocorónido. Las colonias de E. coli se tornan de color verde azuloso. La flora acompañante de microorganismos gram positivos, es inhibida por el uso de sales biliares y la incubación a una temperatura de 44 °C. 4.4

GENERALIDADES

4.4.1 Se realizan siembras utilizando un medio de cultivo selectivo y empleando una cantidad especificada de la muestra de ensayo si el producto inicial es líquido, o una cantidad especificada de una suspensión inicial en el caso de otros productos. Se realizan otras siembras en las mismas condiciones, usando diluciones decimales de la muestra de ensayo o de la suspensión inicial. 4.4.2 Se incuban las placas a 35 °C ± 1 °C durante 24 h. NOTA

Para productos lácteos la incubación de los coliformes debe hacerse a 32 ± 1 °C durante 24 ± 2 h.

4.4.3 Se calcula el número de coliformes y E. coli por mililitro o por gramo de muestra a partir del número de colonias obtenido en las cajas seleccionadas (véase el numeral 10). 5.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTE

5.1

GENERALIDADES

Para los procedimientos de laboratorio corrientes, véase la NTC 4206 (ISO 7218). 5.2

DILUYENTE

Véanse las normas NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3, NTC 4491-4 y la norma específica relacionada con el producto sometido a análisis. 5.3

MEDIO SELECTIVO SÓLIDO: AGAR - LACTOSA - BILIS - ROJO NEUTRO CRISTAL VIOLETA, VRBL - PARA COLIFORMES

NOTA Se utiliza el medio VRBL o cualquier otro similar preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

5.3.1 Composición del medio VRBL Peptona

7,0 g

Extracto de levadura

3,0 g

Lactosa

10,0 g

Cloruro de sodio

5,0 g 3



Sales biliares

1,5 g

Rojo neutro

0,03 g

Cristal violeta

0,002 g 12 g a 18 g 1

Agar Agua destilada o desionizada

1 000 ml

5.3.2 Preparación Se procede como se indica a continuación, para conservar la capacidad selectiva y especificidad del medio. Se mezclan muy bien en agua, los componentes o el medio completo deshidratado, y se dejan reposar durante varios minutos. Se verifica el pH después del calentamiento, este debe ser 7,4 ± 0,2 a 25 °C. Se permite que ebulla hasta su disolución y se enfría inmediatamente el medio en un baño de maría (véase el numeral 6.5) a 45 °C ± 1 °C. Verificar la preparación según las instrucciones del fabricante. En consecuencia, no se debe esterilizar en autoclave y se debe verificar la esterilidad del medio en el momento de su uso (véase el numeral 9.2.2). El medio se debe usar dentro de un lapso máximo de 3 h desde el momento de su preparación. Verificar si hay evidencia que después de las tres horas se ven afectados los recuentos. 5.4

MEDIO SELECTIVO SÓLIDO: AGAR-LACTOSA-BILIS-ROJO NEUTRO-CRISTAL VIOLETA, + MUG – PARA COLIFORMES Y E . c o l i

5.4.1 Composición del medio VRBL + MUG Peptona

7,0 g

Extracto de levadura

3,0 g

Lactosa

10,0 g

Cloruro de sodio

5,0 g

Sales biliares

1,5 g

Rojo neutro

0,03 g

Cristal violeta

0,002 g

4 metilumbeliferil β-D glucorónido MUG

1

De acuerdo con la resistencia del gel del agar.

0,1 g

4


NTC 4458 (Primera actualización) 12 g a 18 g 2

Agar Agua destilada o desionizada

1 000 ml

5.4.2 Preparación Se procede como se indica a continuación, para conservar la capacidad selectiva y especificidad del medio. Se mezclan muy bien en agua, los componentes o el medio completo deshidratado, y se dejan reposar durante varios minutos. Se verifica el pH después del calentamiento, este debe ser de 7,4 ± 0.2 a 25 °C. Se permite que ebulla hasta su disolución y se enfría inmediatamente el medio en un baño de maría (véase el numeral 6.5) a 45 °C ± 1 °C. Se debe evitar el calentamiento excesivo del medio. En consecuencia, no se debe esterilizar en autoclave y se debe verificar la esterilidad del medio en el momento de su uso (véase el numeral 9.2.2). El medio se debe usar dentro de un lapso máximo de 3 h desde el momento de su preparación. 5.5

MEDIO SELECTIVO SÓLIDO: AGAR CON TRIPTONA BILIS X GLUCORÓNIDO

5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-glucuronido 5.5.1 Composición del medio Peptona

20,0 g

Sales biliares

1,5 g

X B-D glucorónido

0,075 g

Agar

15,0 g

Agua destilada o desionizada

1 000 ml

5.5.2 Preparación Se mezclan muy bien en agua, los componentes o el medio completo deshidratado, y se dejan reposar durante varios minutos. Se verifica el pH después del calentamiento, este debe ser 7,4 ± 0,2 a 25 °C. Se permite que ebulla hasta su disolución y se enfría inmediatamente el medio en un baño de maría (véase el numeral 6.5) a 45 °C ± 2 °C. Autoclavar a 121 °C por 15 min o según las directrices de la casa comercial. NOTA La determinación de coliformes, E. coli o ambos puede realizarse también por los siguientes métodos: siembra en membranas hidrofóbicas con MUG, PCR ó inmunoprecipitación (VIP), enzimoinmunoensayos (EIA).

2

De acuerdo con la resistencia del gel del agar.

5



EQUIPO Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO

NOTA El equipo y material desechable es una alternativa aceptable frente al material de vidrio reutilizable si cumple con las especificaciones adecuadas.

Se utiliza el equipo y material usual de laboratorio microbiológico y, en especial, lo siguiente. 6.1

APARATO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN EN HÚMEDO (AUTOCLAVE)

Véase la NTC 4206 (ISO 7218). 6.2

INCUBADORA

Con capacidad de operar a 35 °C ± 1 °C. 6.3

CAJAS DE PETRI

De vidrio o plástico, con diámetro de 90 mm a 100 mm. 6.4

PIPETAS DE SUMINISTRO TOTAL O MICROPIPETAS

Con capacidad nominal de 1 ml. 6.5

BAÑO DE MARÍA

O equipo similar, con capacidad de operar a 45 °C ± 2 °C (para mantener los medios de cultivo antes de la siembra). 6.6

EQUIPO DE RECUENTO DE COLONIAS

Consistente en una base iluminada y un contador digital mecánico o electrónico. 6.7

MEDIDOR DE pH

Con aproximación a ± 0,1 unidad de pH a 25 °C. 7.

MUESTREO

El muestreo se debe haber efectuado de acuerdo con la norma específica apropiada para el producto que se estudia ó de acuerdo con la AOAC ( Oficial Methods of Análisis of AOAC International ). Si no existe una norma específica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto. 8.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO

La muestra de ensayo se debe preparar de acuerdo con las normas de la colección NTC 4491 para muestras microbiológicas o normas que traten acerca del producto que interese. Si no existe norma específica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este punto.

6



9.

PROCEDIMIENTO

9.1

SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES

Véanse las normas NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3, NTC 4491-4 y la norma específica apropiada para el producto que interese. 9.2

INOCULACIÓN E INCUBACIÓN

9.2.1 Se toman dos cajas de Petri estériles (véase el numeral 6.3). Usando una pipeta estéril (véase el numeral 6.4), se transfiere a cada caja 1 ml de la muestra de ensayo, si el producto es líquido o 1 ml de la suspensión inicial en el caso de otros productos (véase el numeral 9.1). Se toman otras dos cajas de Petri estériles. Usando otra pipeta estéril, se transfiere a cada caja 1 ml de la primera dilución decimal (10 -1) de la muestra de ensayo, si el producto es líquido o 1 ml de la primera dilución decimal (10 -2) de la suspensión inicial en el caso de otros productos. Se repite el procedimiento descrito con las diluciones adicionales, usando una pipeta estéril para cada dilución decimal. 9.2.2 Se vierten aproximadamente entre 10 ml a 15 ml del medio (véase el numeral 5.3), a 45 °C ± 2 °C, en cada caja de Petri. El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión inicial (o de la dilución 10 -1 si el producto es líquido) y el momento en que el medio (véase el numeral 5.3) se vierte en las cajas no debe ser mayor de 20 min. Cuidadosamente se mezcla el inóculo con el medio y se deja solidificar la mezcla, estando las cajas de Petri sobre una superficie horizontal fría. 9.2.3 Después de que se complete la solidificación, se vierten aproximadamente 4 ml de medio de cultivo que cubra la superficie (véase el numeral 5.3, 5.4, 5,5) a 45 °C ± 2 °C, sobre la superficie del medio inoculado. Se deja solidificar como se describió anteriormente. Se pretende dejar una doble capa para visualizar mejor las colonias. 9.2.4 Se invierten las cajas preparadas y se incuban a 35 °C ± 1 °C durante 24 h ± 2 h. 9.2.5 Si el objeto del análisis es solo la determinación de E. coli , para una mejor recuperación de bacterias injuriadas, incubar a 35 °C ± 1 °C (si son productos lácteos incubar a 30 °C ± 1 °C) las primeras 4 horas y después incubar a 44 °C ± 1 °C por 18 h a 20 h. 9.3

RECUENTO DE LAS COLONIAS

Después del período especificado de incubación (véase el numeral 9.2.4), se cuentan las colonias coliformes características en cada caja que contenga no más de 150 colonias 3, ya sean características o no, usando el equipo para el recuento de colonias. Mediante la utilización de una lámpara de fluorescencia de 360 nm a 366 nm hacer la lectura de las bacterias E. coli fluorescencia positiva. NOTA Después de la incubación durante 24 h, las colonias características son de color rojo púrpura con un diámetro de 0,5 mm o mayor, y algunas veces están rodeadas de una zona rojiza de bilis precipitada.

3

Por encima de este número existe el riesgo de que las colonias coliformes tengan una apariencia atípica.

7



EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

Después del periodo especificado de incubación (véanse los numerales 9.2.4 para coliformes y 9.2.5 para E.coli ), realizar el conteo de coliformes, incluyendo la E. coli y expresar independiente el conteo de bacterias coliformes del conteo de bacterias E. coli glucoronidasa positivas, utilizando el equipo para el recuento de colonias (véase el numeral 6.6). 10.1

- medio fluorogénico

Escherichia coli

Examinar las cajas de petri usando una lámpara de luz ultravioleta (preferiblemente de 6 watios, de onda larga (366 nm)). La presencia de fluorescencia es una prueba positiva para E. coli. Si la fluorescencia es cuestionable incubar por un periodo adicional de 4 h para la prueba con ONPG y hasta por un periodo adicional de 20 h para verificar la fluorescencia intensificada como prueba de resultado positivo. 10.2

– medio cromogénico

Escherichia coli

Examinar las cajas de petri que presentan colonias de color azul verdosas (T,B,X, D glucorónido). Se presume que la prueba es positiva para la presencia de E. coli. 10.3

– medio agar con triptona bilis x glucorónido 5-bromo-4-cloro-3indolil-D-glucuronido Escherichia coli

Examinar las cajas de petri que presentan colonias de color verde azuladas (D-glucorónido). Se presume que la prueba es positiva para la presencia de E. coli. 11.

MÉTODO DE CÁLCULO

11.1

CASO GENERAL

Cajas que contengan entre 15 colonias y 150 colonias características. Se seleccionan las cajas que contengan no más de 150 colonias características en dos diluciones consecutivas. Es necesario que una de estas cajas contenga al menos 15 colonias características. Se calcula el número N de colonias por mililitro o por gramo de producto, dependiendo del caso, usando la siguiente ecuación: N =

∑ C (n1 + 0,1 n2 )d

en donde Σ C

=

es la suma de colonias contadas en todos los cajas retenidos;

n1

=

es el número de cajas retenidos en la primera dilución;

n2

=

es el número de cajas retenidos en la segunda dilución;

d

=

es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución.

8



Se redondea el resultado calculado con dos cifras significativas. Se toma como resultado el número de unidades formadoras de colonias, UFC/ml o UFC/g de producto, expresado como un número entre 1,0 y 9,9 multiplicado por 10 x donde x es la potencia apropiada de 10. EJEMPLO Un recuento de coliformes dio los siguientes resultados: -

en la primera dilución seleccionada (10-2): 83 y 97 colonias

-

en la segunda dilución seleccionada (10-3): 13 y 8 colonias N =

83 + 97 +13 + 8 201 ∑ C = = = 9136 (n1 + 0,1 n2) d (2 + 0,1 x 2 ) x 10 − 2 0,022

Al redondear el resultado como se indicó antes, se obtiene 9 100 ó 9,1 x 10 3 UFC/ml o UFC/g de producto. 11.2

CASO EN EL QUE CADA CAJA CONTIENE MENOS DE 15 COLONIAS CARACTERÍSTICAS

Si cada una de las cajas seleccionadas, contiene menos de 15 de colonias características, se calcula el número estimado N E de coliformes usando la ecuación presentada en el numeral 11.1. EJEMPLO Un recuento de colonias de coliformes dio los siguientes resultados: -

En una dilución de 10-4 : 140 y 145 colonias, de las cuales 5 y 3 respectivamente fueron características.

-

En una dilución de 10 -5 : 11 y 8 colonias, de las cuales 0 y 1 respectivamente fueron características. N E =

5 + 3 + 0 + 1 (2 + 0,1 x 2) x 10 −4

=

9 2,2 x 10 −4

= 40 000

Al redondear el resultado como se especificó en el numeral 10.1.1, da 4,0 x 10 -4 UFC/ml o UFC/g del producto. 11.3

ESTIMACIÓN DE NÚMEROS PEQUEÑOS

Si las dos cajas, correspondientes a la muestra de ensayo (productos líquidos) o a la suspensión inicial (otros productos) contienen menos de 15 colonias características, los resultados se reportan así: -

< 15 UFC/ml (productos líquidos);

-

< 15 x 1/d UFC/g (otros productos), en donde d es el factor de dilución de la suspensión inicial.

9

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 11.4


COLONIAS NO CARACTERÍSTICAS

Si las dos cajas correspondientes a la muestra de ensayo (productos líquidos) o a la suspensión inicial (otros productos) no contienen colonias características, se informa el resultado como sigue: -

<1 UFC/ml (productos líquidos);

-

<1 x 1/d UFC/g (otros productos), donde d es el factor de dilución de la suspensión inicial.

12.

PRECISIÓN

12.1

CAJAS QUE CONTENGAN ENTRE 15 Y 150 COLONIAS CARACTERÍSTICAS (véase el numeral 11.1)

Solamente por razones estadísticas, en el 95 % de los casos los límites de confianza de este método varían desde ± 16 % hasta ± 52 % (Cowell y Morisetti, J. Sci. Fd. Agric., 1969, Vol. 20, p. 573). En la práctica, se puede encontrar variación aún mayor especialmente entre resultados obtenidos por diferentes microbiólogos. 12.2

CADA CAJA CONTIENE MENOS DE 15 COLONIAS CARACTERÍSTICAS (véase el numeral 11.2)

Consúltese la Tabla A.1. Para obtener los límites de confianza, se multiplican los límites superior e inferior dados por 1/d, en donde d es el factor de dilución. 13.

INFORME DEL ENSAYO

El informe de ensayo debe especificar: -

toda la información necesaria para la completa identificación de la muestra;

-

el método de muestreo utilizado, si se conoce;

-

el método de ensayo utilizado, con referencia a esta parte de la norma;

-

-

todos los detalles operativos no especificados en esta parte de la norma, o considerado como opcional, cualquier incidente detallado que pueda haber influenciado los resultados del ensayo; el resultado obtenido.

10


NTC 4458 (Primera actualización) ANEXO A (Normativo)

LÍMITES DE CONFIANZA PARA LA ESTIMACIÓN DE NÚMEROS PEQUEÑOS DE COLONIAS En la Tabla A.1 se dan los límites de confianza al nivel del 95 % para la estimación de números pequeños, cuando el número de colonias en las cajas seleccionadas es menor de 15. Tabla A.1

Número de coliformes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Límites de confianza al nivel del 95 % Inferior

Superior

<1 <1 <1 1 2 2 2 3 4 4 5 6 7 7 8

2 4 5 6 9 10 12 13 14 16 18 19 20 21 23

11


NTC 4458 (Primera actualización) ANEXO B (Informativo) BIBLIOGRAFÍA

[1]

The Scientific Association Dedicated to Analytical Excellence, Official Methods of Analysis of AOAC International. Method 996.02. Colifrms and E. coli in food, plate count technique. Chapter 17. 18th Edition, 2005.

[2]

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology. General Guidance for the Enumeration of Coliforms. Colony Count Technique. Geneva: ISO, 12 pp. (ISO 4832:2006).

[3]

GTC 125, Guía de referencias de métodos horizontales de análisis microbiológicos para bebidas, alimentos y alimentos para animales. Tabla No. 8. 2006.

[4]

Fluorocult® LMX Broth modified acc_ to MANAFI and OSSMER.htm. 2006-11-12.

[5]

http://www.epa.gov/nerlcwww/online.htm . 2006-11-12.

[6]

http://www.bergeys.org/. 2006-11-12.

[7]

William B. Whitman. Bergey's Manual Trust. Department of Microbiology. 527 Biological Sciences Building. University of Georgia. Athens, GA 30602-2605. USA.

12

NTC-4458 Recuento Coliformes Totales y E. Coli

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