PRÁCTICA DE LABORATORIO DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y Escherichia coli
INTRODUCCIÓN El agua potable de suministro público y de uso domiciliario debe estar libre de microorganismos patógenos, minerales y sustancias orgánicas que puedan producir efectos fisiológicos adversos; además, debe ser estar exenta de turbidez, color, olor y sabor desagradables (Borchardt y Walton, 1971). En Venezuela, el Decreto 883, promulgado en el año 1995, hace referencia a “Normas para la Clasificación y el Control de los Cuerpos de Agua y Vertidos o Efluentes”; en él se presenta lo concerniente al rango de medición y control de los parámetros para el agua potable. La Norma Covenin 3047:1993. Agua Potable. Método de Determinación del Número Más Probable de Bacterias Coliformes contempla el método de ensayo de rutina para la determinación del Número Más Probable de Bacterias coliformes. La Norma Covenin 1104:1996, Determinación del Número Más Probable de Coliformes, Coliformes Fecales y de Escherichia coli (2da Revisión), contempla el método de ensayo para la determinación del Número Más Probable (NMP) de bacterias Coliformes, Coliformes Fecales y de Escherichia coli en alimentos mediante la utilización de medios líquidos. Los aspectos contemplados en estas normas deben ser tomados en cuenta para el control y monitoreo de la calidad del agua de consumo. La técnica del Número más Probable o NMP para el contaje de Coliformes Totales, Coliformes Fecales y Escherichia coli, a través del método de dilución en tubos múltiples, además de estar contemplado en las Normas COVENIN 3047:1993 y 1104:1996, está señalado en el Standard Methods bajo el código 9221B y para Escherichia coli el código 9223 (APHA y col., 2005).
OBJETIVOS
Determinar los organismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli en una muestra de agua.
Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua mediante la indagación
de los
coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.
Realizar el informe de las actividades.
FUNDAMENTO La determinación de microorganismos coliformes totales por la técnica del Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35° C, durante 48 h, utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. En esta técnica los resultados de la fermentación en tubos múltiples se expresan en términos de Número Más Probable (NMP) de microorganismos existentes. La determinación de NMP consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio, el cual permite la activación de los microorganismos en la muestra que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo bilis verde brillante, el cual es selectivo y sólo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la fase presuntiva en la cual se emplea como medio de cultivo caldo bilis verde brillante el cual es selectivo y sólo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44,5o C por un período de 24 a 48 h. La Escherichia coli se determina a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por extensión en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina
azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas del IMVIC (Indol, Rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato) a las colonias típicas.
PROCEDIMIENTO 1. Prueba presuntiva
Agitar la muestra y transferir 1mL (y/o sus diluciones) en cada uno de los 10 tubos volúmenes con caldo lauril sulfato de sodio. Agitar los tubos para homogeneizar la muestra.
Incubar los tubos a 35 ± 0,5° C. Examinar los tubos a las 24 h y observar si hay formación de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se observa producción de gas, incubar 24 h más. Observar nuevamente y considerar como tubos positivos, aquellos que presenten gas en la campana de Durham.
2. Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva, a otro tubo de 16 x150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante, con campana de Durham.
Agitar los tubos para su homogeneización.
Incubar a 35 ± 0,5º C durante 24 a 48 h.
Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.
Consultar la Tabla de NMP para conocer el número más probable de organismos coliformes totales/100 mL.
3. Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo campana de Durham.
Agitar los tubos para su homogeneización.
Incubar a 45± 0,2º C en incubadora o un baño de agua durante 24 a 48 h.
Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.
Consultar la tabla de NMP para conocer el número más probable de organismos coliformes fecales/ 100 mL.
4. Prueba confirmativa para Escherichia coli
Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por estría cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
Incubar las placas invertidas a 35± 1º C por 18-24 h.
Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología colonial: Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metálico. Si no hay colonias con morfología típica, probar una o más colonias lo más parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar de conteo estándar para realizar las pruebas de morfología microscópica y pruebas bioquímicas.
Incubar las placas a 35±1º C por 18-24 h.
Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos o cocobacilos Gram-negativos.
4. Identificación bioquímica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC). a. Producción de indol (I)
Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35° C por 24 ± 2 h.
Adicionar entre 0,2 y 0,3 mL de reactivo de Kovacs.
La presencia de un color rojo oscuro en la superficie del tubo se considera una prueba positiva.
b. Producción de ácidos mixtos (Rojo de metilo, RM)
Inocular (1 mL) a un tubo adicional con caldo RM-VP e incubar a 35° C por 48 ± 2 h.
Adicionar 5 gotas de solución de rojo de metilo.
Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo es una prueba negativa.
c. Producción de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)
Inocular (1 mL) a un tubo con caldo RM-VP e incubar a 35° C por 48 ± 2 h.
Adicionar 0,6 mL de solución alfa naftol al 5% y 0,2 mL de solución Hidróxido de Potasio al 40% agitar.
Dejar reposar durante 2 a 4 h sin agitar el tubo; se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.
d. Utilización del citrato (C)
Inocular un tubo con agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se inocula en línea recta en el centro del bisel (pico de flauta).
Incubar a 35° C de 24 a 48 h.
El desarrollo del cultivo en la superficie y la presencia de una coloración azul, debido al viraje del indicador que contiene el medio, indica prueba positiva.
CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Calcular la densidad microbiana con base en el número más probable conforme al procedimiento señalado en la Tabla 1, (que se muestra a continuación y es utilizado para el análisis de agua), para estimar la población de bacterias coliformes totales, bacterias coliformes fecales y Escherichia coli de acuerdo con el número de tubos positivos. Expresar en NMP/100 mL. Utilizando volúmenes 10 mL de muestras de agua en 10 tubos, aplicar la Tabla 1:
TABLA 1. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 mL de muestra de agua. No. de Tubos Positivos 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
NMP/100 mL
95% de Límite de Confianza (aproximado) Inferior Superior 0 3 0,03 5,9 0,26 8,1 0,69 10,6 1,3 13,4 2,1 16,8 3,1 21,1 0,4 27,1 5,9 36,8 8,1 59,5 13.5 Infinito
<1,1 1,1 2,2 3,6 5,1 6,9 9,2 12 16,1 23 <23
Tabla 2. Requisitos Microbiológicos para el agua potable según la Norma COVENIN 1431:1982 para NMP Producto
Análisis
Agua Potable
Coliformes
Método de n Referencia DTM 10
c 1
Límite por 100 mL m M 0 4
n: Número de muestras del lote, c: Número de muestras defectuosas, DTM: Método de Dilución en Tubos Múltiples (NMP), m: Límite Mínimo, M: Límite Máximo.
Tabla 3. Perfil bioquímico de pruebas IMViC para Escherichia coli Microorganismo E. coli
Indol +
Rojo de Metilo +
Voges-Proskauer -
EQUIPOS Y MATERIAL
Autoclave.
Horno de aire caliente o estufa para esterilización.
Destilador de agua.
Potenciómetro o cinta de pH universal.
Frasco de vidrio estéril y de boca ancha para el muestreo.
Equipo de baño María con una temperatura estable a 44,5 ± 0,2° C
Incubadora a 35 ± 0,5° C.
Citrato -
Mechero Bunsen.
Tubos de 16 x 150 milímetros (o de mayor medida) con tapones de vaquelita.
Tubos Durham.
Pipetas serológicas de 10 mililitros.
Asa de inoculación con aro de níquel, cromo o platino.
Material para la preparación de medios de cultivo: espátulas, matraces, probetas,
SOLUCIONES Y MEDIOS DE CULTIVO
Caldo lauril sulfato (caldo lauril triptosa) a doble concentración (para la prueba presuntiva del grupo coliformes).
Caldo verde brillante lactosa bilis 2% a concentración simple para la prueba confirmativa de coliformes totales (en función de que todos los tubos presuntivos den resultados positivos).
Caldo EC para la prueba confirmativa de coliformes termotolerantes (en función de que todos los tubos presuntivos den resultados positivos).
Agua destilada para la preparación de los medios.
PREPARACIÓN DE MATERIAL
Preparar el caldo lauril triptosa (lauril sulfato) doble concentración y dispensar según el volumen de muestra que se va a sembrar (en este caso 10 mL), de tal manera que las porciones de muestra inoculadas al medio no reduzcan la concentración de ingredientes del medio, la cual debe mantenerse constante.
En cada tubo colocar un tubo Durham invertido y esterilizar en autoclave. Tener la precaución de que en el momento de iniciar la prueba no estén a la temperatura de refrigeración y cuidar de que ninguno de los tubos presente burbujas producidas en el momento del autoclavado.
Proceder al marcado de los tubos, anotando el número designado por el laboratorio, el volumen seleccionado de muestra que va a ser inoculado y la fecha del análisis. Esta marcación podrá hacerse solamente en el primer tubo de la derecha en la primera fila.
Si se van a emplear diluciones, identificar los frascos de agua de dilución con el número de muestra y las diluciones seleccionadas.
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS COVENIN 1126-89. Alimentos. Identificación y Preparación de Muestras para el Análisis Microbiológico (1ra Revisión).
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES Covenin 1104:1996. Determinación del Número Más Probable de Coliformes, Coliformes Fecales y de Escherichia coli (2da Revisión).
BIBLIOGRAFÍA
Madigan, M T y Martinko, J M., Brock, Biology of Microorganisms, 11a ed.
Brooks, Geo F., Batel, Janet S. y Morse, Stephen A.,
Microbiología Médica de Jawetz.
Pelczar
COVENIN 1431:1982. Agua Potable Envasada. Requisitos.
COVENIN 3047:1993. Agua Potable. Método de Determinación del Número Más Probable de Bacterias Coliformes.
COVENIN 1104:1996. Determinación del Número Más Probable de Coliformes, Coliformes Fecales y de Escherichia coli (2da Revisión).
COVENIN 1126-89. Alimentos. Identificación y Preparación de Muestras para el Análisis Microbiológico (1ra Revisión).
DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA POTABLE
Incubación a 37° C durante 24 - 48 h
Incubación a 37° C durante 24 - 48 h
Incubación a 37° C durante 24 - 48 h
Tubos con 10 mL doble concentración de caldo lauril sulfato de sodio (CLSS)
CLSS + 10 mL de muestra
2 ó 3 asadas/Tubo
Tubos con 10 mL de caldo lactosa verde brillante bilis 2%
Siembra con asa bacteriológica de los tubos positivos (producción de gas) de caldo lactosa a caldos verde brillante bilis 2% y EC
2 ó 3 asadas/Tubo
Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes totales /100 ml de muestra
Tubos con 10 mL de caldo EC o EC- Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes MUG fecales /100 ml de muestra.
Siembra de tubos positivos en placas de Agar EMB para la búsqueda de Escherichia coli
