MICROORGANISMOS INDICADORES DE LA CONTANINACION FECAL (Coliformes) I.
INTRODUCCIÓN
En el análisis de alimentos se toman en cuenta algunos microorganismos que son indicadores de unas Buenas Practicas de Elaboración y de unas buenas practicas de Higiene, Hig iene, considerándole ciertas especies como microorganismos indicadores de contaminación Fecal. En esta esta prac practi tica ca se podr podrá á dete determ rmin inar ar medi median ante te la iden identi tifi fica caci ción ón de cier cierto tos s microorganismos si el alimento presenta o no contaminación fecal, lo que significa que si el alimento a tenido contacto en el trayecto de su elaboración con material fecal. Muchos microorganismos diferentes causantes de enfermedad, o patógenos, pueden contaminar los alimentos Las ETAs constituyen, según la Organización Mundial de la Salud (OMS) uno de los problemas de salud más extendido en el mundo contemporáneo y una causa importante de reducción de la productividad económica. Hay muchas infecciones diferentes transmitidas por los alimentos Se han descrito más de 250 enfermedades diferentes transmitidas por los alimentos. La mayorí mayoría a de estas estas enferm enfermeda edades des son infeccio infecciones nes,, ocasion ocasionada adas s por distint distintas as bacterias, virus y parásitos que pueden ser transmitidos por los alimentos.
II.
OBJETIVOS a. Identificar Identificar los principales principales microor microorganis ganismos mos indicadore indicadores s de contaminació contaminación n fecal en alimentos (Coliformes) b. Determinar Determinar los los principales principales alimentos alimentos con con riesgos de contam contaminació inación n fecal.
III.
REVISION BIBLIOGRAFICA
Los microorganismos indicadores de la contaminación fecal, principalmente son: Coliformes, Colifecales, Escherichia coli, Enterobacteriaceas totales y Streptococcus del Grupo D de Lancefield, por cuanto normalmente se les encuentra en el tracto digestivo del hombre y de animales de sangre caliente.
COLIFORMES El término Coliformes comprende los géneros Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter las cuales se caracterizan por utilizar la Lactosa como fuente de Carbono. Los Coliformes distintos a la E. coli persisten en el suelo o sobre las superficies, tales como los granos, frutas y otros productos del campo.
IV. MATERIALES Muestra : Alimentos varios 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20.
Baño Maria a 45.5 ºC Incubador, 35 ± 1.0°C Balanza Matraces Pipetas esteriles Utensilios esteriles Tubos de dilucion Campanas de Durhan Caldo Bilis Verde Brillante (BGLB) 2% Caldo Lauryl Sulfato (LST) Caldo Azida de Sodio Glucosado Agar Mac Conkey Caldo Peptona Caldo MR-VP Agar citrate se simons Agar plate count en viales Reactivo de Kovacs Reactivo de Voges-Proskauer (VP) Colorantes para timcion Gram Indicador Rojo de metilo V. METODO
1.
PRUEBA PRESUNTIVA PARA COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y E COLI NMP
a. Realizar las diluciones necesarias según el alimento como se muestra en el grafico. 1mL
Alimento 10g
1mL
1mL
1mL
+ 9mL SSF
90m mL SSF
9mL SSF
9mL SSF
b. De cada uno de los tubos de dilución se inocularan en 3 tubos con caldo lauril sulfato 1mL campanas1mL 1mL 1mL24 horas a 35 ºC que contienen de Durhan, se incubaran por c. Observar la formación de gas y turbidez, si los tubos no tuvieran formación de gas pero si hay turbidez, incubar otras 24 horas para su evaluación. d. Se continua a la prueba confirmativa de Coliformes con los tubos que sean positivos (presencia de gas y turbidez) 10-1
10-2
10-3
10-4
2.
NMP – Prueba confirmativa para coliformes
a.
Para cada tubo positivo se transfiere un inoculo usando el asa de cole a un tubo con caldo bilis verde brillante que contiene campana de Durhan, incubar a 35ºC por 48 horas. Pasado el tiempo confirmar la presencia de gas y turbidez, posteriormente calcular el NMP a partir de la prueba confirmativa.
b.
3.
NMP – Test de confirmación para Coliformes fecales y E coli
De cada tubo positivo de la prueba presuntiva colocar un inoculo con el asa de cole a un tubo con caldo lauryl, incubar a 45.5ºC y examinar la formación de gas, en caso de ser negativo incubar unas 48 horas extras. b. Calcular el NMP usando los resultados positivos de este test. a.
Ejemplo: Prueba de coliformes fecales dieron positivos: -1= 3 -2=1 -3=0 Se inoculan en total 4 tubos con caldo peptona, los resultados positivos -1= 1 -2= 1 Se van a la tabla de coliformes fecales con este código: 1, 1 , 0 4.
NMP – Test completo para E. coli a. b. c.
d.
Para confirmar E. coli, se agita el tubo con caldo peptona y se toma un inoculo al agar Mac conkey y sembrar por estria. Incubar a 35ºC por 24 h. Examinar las placas sospechosas E. coli. Transferir 5 colonias sospechosas a viales con agar plate count, incubar a35ºC/24 h, realizar las pruebas bioquímicas para confirmar e coli. La identificación de una sola colonia es suficiente para confirmar la presencia de E. coli. Realizar una tincion Gram (gram negativo)
5. PRUEBAS BIOQUMICAS De las cepas aisladas sembrar según: Produccion de Indol Inocular en un tubo con caldo peptona e incubar por 24 h a 35ºC. realizar la prueba de indol añadiendo reactivo de Kovacs y observando la formación de un anil lo grosella para una prueba positiva. Reacción de Voges-Proskauer (VP) Inocular un tubo con caldo MR-VP e incubar por 48 h a 35ºC. separar en dos tubos Añadir 0.6 mL de solución α-naphthol y 0.2 mL 40% KOH, agitar. Añadir cristales de creatina. Agitar y observar la formación de un anillo rojo. Reaction de Rojo de Metilo
Incubar el tubo con el sobrante de caldo MR-VP 48 ± 2 h a 35°C. Añadir 5 gotas de rojo de metilo al tubo. Si el color rojo permanece es positivo, si cambia a amarillo es negativo Reacción de Citrato Inocular con asa de cole a un tubo con agar citrato de Simmons, incubar por 48 horas. Detectar el cambio de color a azul para que sea positivo Formación de gas a partir de lactosa. Inocular a un tubo con caldo lactosa y campaña de Durhan, incubar 48 ± 2 h at 35°C. Observar la producción de Gas Prueba de Kliger Se utilizara en agar Kligler para la prueba de descarte de E. coli. El cual se lleva a pH 7,4 y se reparten a razón de 7 ml en tubos de ensayo y esterilizar a 121°C x 20 minutos.
INTERPRETACION PRUEBAS BIOQUÍMICAS IMVIC, PARA DETERMINAR E. coli Consiste en las siguientes pruebas:
I M Vi C
: Producción de Indol : Prueba del Rojo de metilo : Producción de Acetil Metil Carbinol o Prueba de Voges Proskauer : Asimilación de Citrato
(I): CALDO PEPTONADO Se investiga el indol formado después de la incubación, agregando gotitas del reactivo de Kovacs, formado por la mezcla de alcohol isoamílico y de ácido nítriconitroso (10 ml y 5 ml respectivamente), y agitarlo. La reacción es positiva si la fase alcohólica está coloreada de rojo claro y oscuro y constante.
(M): CALDO ROJO DE METILO Después de haber incubado la siembra a 37°C por 24 horas, agregar 5 gotitas de una solución al 0.04% de rojo de metilo. La reacción se considera positiva si la coloración es roja y negativa si es amarilla.
(Vi): CALDO VOGES PROSKAUER Caracteriza a gérmenes que producen acetil metil carbinol a partir dc la glucosa que lleva el medio de cultivo. El acetil metil carbinol AMC se reconoce oxidandolo a diacetil (color rosado) Al tubo con el medio respectivo inoculado e incubado a 37 ºC por 24 horas, se le agrega unos mg de creatina p.a y 0.5 ml de una solución de soda al 40% y agitar fuertemente por 3 minutos. La reacción es positiva, si una coloración rojo carmín aparece al cabo de 10 minutos.
(C): AGAR CITRATO DE SIMMONS Una vez sembrado el inóculo por estría superficial en el agar Citrato de Simmons inclinado, e incubado a 37°C x 24 hr, la reacción es positiva si el medio presenta una coloración azul.Luego de obtener número de tres cifras (confirmados según resultados del IMViC, Tabla N° 1) , se logra el valor de la tabla del NMP, para después calcular la
población de Escherichia coli en la muestra problema de manera similar que los anteriores.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL DEL NMP PARA COLIFORMES 1mL
Prueba Presuntiva
Alimento 10g
1mL
1mL
+ 9mL SSF
90m mL SSF
9mL SSF
10-1
9mL SSF 10-3
10-2
10-4
Prueba Confirmativa Test de Eijkman 1mL c/u
CLVBB y CLVBB 2cc
de las pruebas positivas del CLVBB 2 cc + +
+ +
+
+
+
-
+
+ -
+
+
+
-
+
-
+
+
-
+
-
Incubar a 37 °C / 24
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PARA E. COLI CLVB
+
+
+
-
+
CP
+
Incubar a 44 °C/24 h
Prueba de Kligler para E. coli
+
Incubar a 37°C/24 h
Galeria IMVIC
CP
CRM CVO ACS
REPORTE DE DATOS Para reportar la cantidad de coliformes totales del recuento estándar en placa, emplear las reglas correspondientes.
Para reportar los resultados con respecto a la determinación del Número Más Probable de coliformes totales, colifecales y E. coli se debe de seguir los pasos correspondientes a la regla del NMP
Elegir la dilución más alta (la más diluida), en la que sean positivos de formación de gas los tres tubos, y las dos diluciones superiores (más diluidas) más próximas. Sí
esto no es posible, ya que ninguna de las diluciones trabajadas presentan tres tubos positivos, o porque no se hicieron diluciones más altas de aquella que presenta tres tubos positivos, seleccionar las tres últimas diluciones y anotar el número de tubos positivos en cada una. Por ejemplo:
a. Si las tres últimas diluciones positivas fueron: 1:100, 1:1000 Y 1:10000 y el número de tubos positivos en cada dilución fuera 3, 1, 0, el resultado se anotaría del siguiente modo: Diluciones:
1:100 = 1:1000
=
1:10000=
0
3 1
Este valor 3, 1, 0, se busca en la tabla del N M P, de tres alícuotas, y nos dará de la población de Coliformes totales. Ejemplo: FILA ESCOGIDA
CLAVE 3-0-2
NMP 6,5
3-1-0
4,5
3-1-1
7,5
A este número obtenido de la tabla debe multiplicárselo por la inversa de la menor dilución en la que se han hallado 3 (+), es decir que corresponde a la dilución de la primer cifra de la CLAVE característica. La población se calcula de la siguiente manera: Lectura: 3, 1, 0 (1:100, 1:1000, 1:10000) Valor Tabla N M P: 4,5 La dilución escogida es 1:100 Por lo tanto seria: 4.5 x 102 UFC/ g de muestra Nota: Estos cálculos han sido realizados considerando que se analizaron 10 g de muestra problema.
VI. RESULTADOS VII.DISCUSIONES VIII. CONCLUSIONES IX. CUESTIONARIO 1. Indique cuáles son los microorganismos indicadores de la contaminación fecal, y cuál es su importancia en los alimentos. 2. Describa la función que desempeñan cada uno de los componentes de los medios de cultivo descritos en la presente práctica. 3. ¿Qué finalidad tienen las diluciones? ¿Dónde se requieren más diluciones en una muestra fresca o en una muestra procesada, y por qué? 4. Exponga todo acerca de la influencia de los Coliformes, Colifecales y la E. coli en la salud del hombre.
X. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS FRAZIER. W. 1992. Microbiología de los Alimentos. 4ta edición. Editorial Acribia. Zaragoza HARRIGAN, W. 1992. Métodos de Laboratorio en Microbiología de los alimentos y productos. Lácteos. 3ra Edición. Editorial Acribia. Zaragoza. JAY. J.1994. Microbiología Moderna de los Alimentos. 2da Edición. Editorial Acribia. Zaragoza.
TABLA N° 1 Escherichia coli Enterobacter aerogena (o Aerobacter aerogenes
I
M
Vi
C
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
