UNIVERSIDAD NACIONAL DE SANTA FACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE AGROINDUSTRIA
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
Estudio Fitoquímico de las flores de
“
Laccopetalum Giganteum
(Pacra-Pacra)
”
ASESOR
:
Símpalo
NUEVO CHIMBOTE
2016
Agradecemos en primer lugar, al ser Supremo, Supremo, único dueño de todo saber y verdad, por iluminarnos durante este trabajo y por permitirnos finalizarlo finalizarlo con éxito; y en segundo lugar, pero no menos importante, a nuestros queridos padres, por su apoyo incondicional y el esfuerzo diario que realizan por brindarnos una buena educación. Los esfuerzos mayores, por más individuales que parezcan, siempre están acompañados de apoyos imprescindibles para lograr concretarlos. En ésta oportunidad, nuestro reconocimiento y agradecimiento a nuestro profesor por su oportuna, precisa e instruida orientación para el logro del presente trabajo.
2
ÍNDICE: I.
AGRADECIMIENTOS……………………………………...2
II.
ÍNDICE……………………………………………………….3
III.
DATOS GENERALES………………………………….……4
IV.
RESUMEN……………………………………………………5
V.
INTRODUCCIÓN 5.1
Realidad Problemática………………………………..……...7
5.2
Trabajos Previos………………………………………......….8
5.3
Formulación del problema………………………..…………11
5.4
Importancia y justificación……………………………….....12
5.5
Definición de términos básicos.…………………………….12
VI.
OBJETIVOS-HIPÓTESIS…………………………………..13
VII.
METODOLÓGÍA DE ESTUDIO
7.1
Método de investigación…………………………………….14
7.2
Estrategia de estudio…………………………………….…...14
7.3
Universo o población………………………………………...14
7.4
Diseño y características de la muestra………………………14
7.5
Descripción
y
acondicionamiento
de
las
unidades
experimentales……………………………………………….14 7.6
Técnicas de recolección, procesamiento y análisis de los datos…………………………………………………………..15
7.7
Técnicas de procesamiento y análisis de datos…..…………15
VIII.
PRESUPUESTO……………………………………………....21
IX.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………..……..………23
X.
ANEXOS………………………………………………………26
3
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN I. DATOS GENERALES 1.1
TÍTULO
: “ESTUDIO
FITOQUÍMICO
DE
LAS
FLORES
DE
LACCOPETALUM GI GANTEUM (PACRA-PACRA)”
1.2
EQUIPO INVESTIGADOR: Asesor
:
Símpalo
Responsables :
1.3
Carrasco Huayanay Jeyner Guillermo
Cueva Granados Leydi Patricia
Lopez Herrera Ciro Nalter
Matta Canova Yuleisy
Rina Valera Vásquez
FACULTAD Y DEPARTAMENTO ACADÉMICO A LA QUE PERTENECE EL PROYECTO: Facultad
:
Departamento :
1.4
1.5
1.6
Ingeniería Dep. Académico de Ingeniería Agroindustrial
ÁREA Y LÍNEA DE DESARROLLO DE LA INVESTIGACIÓN: Área
:
Recursos naturales y medio ambiente
Línea
:
Conservación y uso de la biodiversidad
TIPO DE INVESTIGACIÓN: Según su aplicabilidad
:
Básica
Según su Naturaleza
:
Descriptiva
LUGAR DONDE SE DESARROLLARÁ EL PROYECTO: Región
:
Ancash
Provincia
:
santa
Distrito
:
Nuevo Chimbote
Lugar
:
Laboratorio de bioquímica Universidad Nacional del Santa 4
II. RESUMEN La Pacra Pacra , científicamente conocida como Laccopetalum, es un género con una especie de planta de flores perteneciente a la familia Ranunculaceae. Su nombre deriva del griego lakkos= agujero, cavidad y petalon= pétalo, en alusión a los numerosos nectarios que se distribuyen en cada pétalo (Soukup, 1970). (1) Laccopetalum,
es un género monoespecífico y endémico de la flora peruana (Tamura,
1993, 1995), el cual como única especie Laccopetalum giganteum, se encuentra restringida a unas pocas localidades en el norte andino de nuestro país. Presenta unas hojas espinosas, suculentas, grandes, glaucas, con unas flores muy grandes y verdosas. (Lehnebach et al., 2007). (2)(3) Actualmente esta planta ha recibido diversos nombres vulgares como: “Pacra” (Macbride, 1937); “Pacra – Pacra” (Sagástegui et al , 1999); “Pagra – Pagra” o “H uamanripa” (Soukup, 1970); “H uamanrripa” (Sagástegui et al , 1999) y también “Rima – Rima” (Cano et al , 2006). (1) (4) (7) (8) Esta planta endémica, crece en las regiones ecológicas del páramo, de la puna húmeda y de la zona alto andina; entre los 3900 y 5300 m de altura (Brako & Zarucchi, 1993; León, 2006). (5). Hasta mediados del siglo XX la mayoría de los especímenes conocidos provenían de localidades en el norte del Departamento
de Ancash, Provincia de Pallasca y
Departamento de Cajamarca, Provincia de Hualgayoc (Macbride, 1937; Weberbauer, 1945). Sin embargo, excursiones botánicas demuestran que algunas de estas poblaciones de plantas persisten en algunas localidades como “Pelagatos y Conchucos” en la zona de Pallasca, como también en otras localidades del Departamento de La Libertad y una zona contigua en el Departamento de San Martín con protección estatal. (León 5165-USM, 2006). (6) (7) (9). Laccopetalum giganteum habita zonas pedregosas y rocosas (Weberbauer, 1945);
también se conoce que ocupa sitios de arenisca en Conchucos en Ancash y zonas aledañas, donde está asociada con especies diversas mayormente arbustivas y herbáceas altas típicas de la jalca. Por su hábitat en alturas muy elevadas se supone un crecimiento y una regeneración muy lentos, y dada su depredación continua; actualmente se encuentra 5
catalogada como una especie en Peligro Crítico y considerada en “El Libro Rojo de las plantas endémicas del Perú”. (D.S. 043-2006-AG). (6) (9) Varias partes de la flor de Laccopetalum giganteum son empleadas en medicina folclórica para usos tanto en seres humanos, como para empleo veterinario. (11) El uso de las flores en medicina folclórica humana, tiene mucha fama, en forma de infusión especialmente como remedio contra la tos (antitusígeno), y se venden en los pueblos para combatir afecciones de la garganta y pulmones (Soukup, 1970; Brack Egg, 1999; Sagástegui et al., 1999; Cano et al., 2006). Inclusive autores afirman que fue empleada de esta forma por los antiguos peruanos del incanato (Fernández & Rodríguez, 2007). (1) (4) (8) Las flores, en la medicina folclórica veterinaria, son mezcladas con sal y se dan al ganado, porque se considera como un remedio eficaz para aumentar la fecundidad. (Soukup, 1970; Sagástegui et al, 1999). (1) (8). En la comunidad de Conchucos, Dpto. Ancash, las flores son cortadas en pedazos o trozos pequeños y se combinan con las hojas de “chocho silvestre” Lupinus sp. Denominado “copcho”, la mezcla es guardada 24 horas, tiempo en el cual emite un calo r (elevadas temperaturas), luego se extiende en mantas y se les da de comer al ganado vacuno, especialmente al que no entra en celo y a los machos para ser más fecundos, añadiendo sal. En esta misma comunidad se ha comprobado que sirve también como purgante eficaz (diarreico) en el ganado ovino y caprino. (Fernandez & Rodríguez, 2007) (10). Igualmente se tiene la creencia popular de que la “Pacra – Pacra” actúa como un afrodisiaco y que aumenta la potencia sexual masculina; así mismo para poder tener progenie las mujeres. Para tal efecto, los “chamanes” o “falsos curanderos” mesclan la flor en depósitos mezclándola con aguardiente (alcohol de caña de azúcar ), “algarrobina” (miel de algarrobo), “chuchuhuasi” (licor de Maytenus spp. ) entre otras, para lograr la fertilidad deseada. (Fernández & Rodríguez, 2007) (10). Sin embargo, Pera et al. (2004) reportaron toxicidad para cierto uso de flores entre usuarios en la zona de Conchucos, la que se produce cuando los lugareños (pastores), prueban el néctar emitido por los nectarios de los pétalos, presentando fuertes dolores de 6
cabeza y alucinaciones. También se conoce que la planta tiene acción vesicante, produciendo ampollas y quemaduras al poner en contacto con la piel humana hasta de tercer grado; tal es así que se han reportado casos de quemaduras de tercer grado con daños irreversibles al colocar los pétalos de la planta, previo vendaje, para tratar supuestas enfermedades de artritis y reumatismo. (11) En el 2007, J. Arroyo y Colab. Facultad de medicina y bioquímica – UMSM. Realizaron un estudio experimental para determinar si la administración por vía oral del extracto etanólico de flores de Laccopetalum giganteum (Pacra-pacra) en ratas normales aumenta la fertilidad. El cual se realizó en una muestra de 48 animales, divididos aleatoriamente en 2 grandes grupos (experimental y control con SSF) de 24 machos y 24 hembras. Al término fueron sacrificados, para observar la presencia de fetos en el útero; y a los animales que estuvieron separados, se les extrajo muestra de sangre, para conocer el nivel de testosterona en machos y LH, FSH, estrógenos y progesterona en hembras. Como resultado obtuvieron que los flavonoides, compuestos fenólicos y taninos estuvieron en mayor cantidad en el extracto etanólico y el 100% de ratas que recibió el extracto etanólico de la planta y estuvo junto a los machos resultó grávida; y, las separadas que recibieron el mismo extracto, presentaron incremento de FSH en las hembras y testosterona en los machos, comparativamente a los controles respectivos.
Por lo que en condiciones
experimentales, el extracto etanólico de las flores de Laccopetalum giganteum (pacra pacra) incrementó la fertilidad en ratas normales. (12)
III. INTRODUCCIÓN 3.1
REALIDAD PROBLEMÁTICA El Perú es depositario de una extraordinaria y variada flora cuyas aplicaciones terapéuticas y nutritivas en la medicina tradicional cobran importancia hoy en día con la ideología ecológica en la cual se trata de rescatar todo lo útil que la sabia naturaleza nos brinda. Los componentes de una planta se subdividen en dos grandes grupos: Los Metabolitos Primarios y los Metabolitos Secundarios o Productos Naturales. Los primeros conformados por carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, están universalmente distribuidos y participan en la actividad celular de todo ser viviente; mientras que los últimos comprenden principios activos, compuestos químicos de estructura compleja
y de distribución más restringida, cuyo 7
conocimiento estructural permite diseñar reacciones para producir derivados semisintéticos con utilidad bioquímica
y terapéutica. Es entonces de gran
importancia, aislarlos y localizarlos en los ensayos biológicos adecuados. Solo se puede conocer el valor nutritivo de una planta o producto, y por ende recomendar o no su consumo, sino se sabe su composición química.
3.2
TRABAJOS PREVIOS En el 2007, J. Arroyo y Colab. Facultad de medicina y bioquímica – UMSM. Realizaron un estudio experimental para determinar si la administración por vía oral del extracto etanólico de flores de Laccopetalum giganteum (Pacra-pacra) en ratas normales aumenta la fertilidad. El cual se realizó en una muestra de 48 animales, divididos aleatoriamente en 2 grandes grupos (experimental y control con SSF) de 24 machos y 24 hembras. Al término fueron sacrificados, para observar la presencia de fetos en el útero; y a los animales que estuvieron separados, se les extrajo muestra de sangre, para conocer el nivel de testosterona en machos y LH, FSH, estrógenos y progesterona en hembras. Como resultado obtuvieron que los flavonoides, compuestos fenólicos y taninos estuvieron en mayor cantidad en el extracto etanólico y el 100% de ratas que recibió el extracto etanólico de la planta y estuvo junto a los machos resultó grávida; y, las separadas que recibieron el mismo extracto, presentaron incremento de FSH en las hembras y testosterona en los machos, comparativamente a los controles respectivos. Por lo que en condiciones experimentales, el extracto etanólico de las flores de Laccopetalum giganteum (pacra-pacra) incrementó la fertilidad en ratas normales. El procedimiento experimental fue el siguiente: -
Las flores de la planta Laccopetalum giganteum (pacra-pacra) fueron recolectadas en Huaraz, departamento de Ancash. La identificación taxonómica de la planta fue realizada en el Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
-
Para la preparación del extracto alcohólico, las flores frescas fueron lavadas y sometidas a deshidratación, a 40 ºC, por 48 horas; luego, fueron trituradas en un molino eléctrico, hasta obtener un polvo fino, macerándose con alcohol a 60 ºC. Luego de los 15 días, se filtró y se llevó a estufa, a 40 ºC, en placas grandes, para la desecación respectiva, por 4 días, para llevarlo a 8
extracto seco. Y al extracto seco se le realizó reacciones de identificación o coloración para determinar la presencia o ausencia de metabolitos secundarios haciendo uso de reactivos específicos, en los resultados se indicó presencia o ausencia del metabolito: 5 mg de extracto problema con 5 gotas de reactivos. -
El estudio farmacológico in vivo se realizó a las ratas hembras y machos que recibieron SSF y extracto etanólico de las flores de la planta Laccopetalum giganteum (pacra-pacra) y estuvieron en jaulas separadas; se les extrajo muestra de sangre, para dosaje de hormonas: testosterona en machos y en las hembras LH, FSH, estrógenos y progesterona, expresándose en µg/dL. El dosaje hormonal se hizo mediante el método electro quimioluminiscencia, que es una forma química seca, con una sensibilidad y especificidad de 99%. Las ratas hembras que recibieron el extracto, así como las ratas hembras que recibieron suero fisiológico y estuvieron en jaulas junto a los machos, fueron sacrificados para retirarles el útero y evaluar la fecundidad o gravidez, por medio de la observación de los fetos presentes.
-
Se determinó los niveles de urea, creatinina y transaminasas, como indicadores de la función renal y hepática, mediante los métodos convencionales realizados en el Instituto de Investigaciones Clínicas de la Facultad de Medicina de la UNMSM.
-
Los datos obtenidos al evaluar el aumento de la actividad fertilizante fueron sometidos al análisis de varianza, y comparación de medias; para los diferentes análisis se consideró la p<0,05.
El ex sistema neuroendocrino y a las gónadas, que presentan dos funciones bien diferenciadas, espermatogénesis y esteroidogénesis. Ambas funciones son controladas por vía endocrina, desde la hipó- fisis anterior, que secreta dos gonadotropinas, la hormona folículo estimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH). Sus funciones son: FSH actúa sobre las células de Sértoli, localizadas en el interior de los tubos seminíferos, estimulando la espermatogénesis o producción de espermatozoides; LH actúa sobre las células de Leydig, en el tejido intersticial, provocando el proceso de esteroidogé-nesis o producción de hormonas masculinas (andró- genos), cuyo principal producto es la testosterona. La testosterona regula la 9
secreción de LH, actuando sobre el hipotálamo y la hipófisis anterior, en un proceso de homeostasis negativa. Con los hallazgos descritos, se postula que el extracto etanólico de las flores de Laccopetalum giganteum (pacra-pacra) podría actuar directamente sobre el hipotálamo y la hipófisis, favoreciendo la liberación de los factores de la FSH, y sobre la hipófisis, permitiendo la producción de gonadotropina hipofisiaria FSH. Por otro lado, al administrar el extracto alcohólico de las flores de Laccopetalum giganteum (pacra-pacra), en ratas normales machos estimula la producción de testosterona (Figura 3), posiblemente por metabolitos secundarios presentes en la planta (Tabla 1), que actuarían a nivel del hipotálamo liberando la neuregulina (Nrg). Este, a su vez, actuaría a nivel hipofisario, liberando inicialmente LH y activando las células de Leydig (12). Posteriormente, la LH caería por retroalimentación negativa, debido al incremento de la testosterona. Este incremento de los niveles de testosterona pudo tracto etanólico de las flores de Laccopetalum giganteum (pacra-pacra).
10
3.3
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA: El Perú es depositario de una extraordinaria y variada flora cuyas aplicaciones terapéuticas y nutritivas en la medicina tradicional cobran importancia hoy en día con la ideología ecológica en la cual se trata de rescatar todo lo útil que la sabia naturaleza nos brinda. (13)
11
Los componentes de una planta se subdividen en dos grandes grupos: Los Metabolitos Primarios y los Metabolitos Secundarios o Productos Naturales. Los primeros conformados por carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, están universalmente distribuidos y participan en la actividad celular de todo ser viviente; mientras que los últimos comprenden principios activos, compuestos químicos de estructura compleja
y de distribución más restringida, cuyo
conocimiento estructural permite diseñar reacciones para producir derivados semisintéticos con utilidad bioquímica
y terapéutica. Es entonces de gran
importancia, aislarlos y localizarlos en los ensayos biológicos adecuados. (14). Solo se puede conocer el valor nutritivo de una planta o producto, y por ende recomendar o no su consumo, sino se sabe su composición química. Por lo descrito anteriormente sobre la planta Laccopetalum Giganteum, es necesario plantear la siguiente pregunta:
¿Cuáles son los efectos de las propiedades fitoquímicas de las flores de Laccopetalum Giganteum (Pacra-Pacra), procedente de la zona de Conchucos – Ancash, en la fertilidad del ser humano?
3.4
IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO Nuestra región Ancash presenta un alto porcentaje de los trabajos etnobotánicos del País, en los pisos de vegetación entre 3.000 y 3.500 m, siendo los estudios en el Callejón de Huaylas y Conchucos los que abarcan mayor rango. (18) Y siendo Laccopetalum Giganteum “Pacra – Pacra” es una especie endémica y en peligro de extinción, pero con grandes propiedades con fines reproductivos, que se encuentra en nuestra región y a nuestro acceso; el presente estudio pretenderá determinar las características fitoquímicas para responder a los efectos que se le atribuyen desde el punto de vista de la bioquímica, y con ello también aprovechar en un futuro sus componentes para la elaboración y/o producción de nuevos productos alimentarios.
3.5
DEFINICIÓN DE TÉRMINOS BÁSICOS: A. LACCOPETALUM GIGANTEUM: Planta perenne erguida, 1 m de alto, hojas crasas y glaucas de las Jalcas (3.900 m – 4.500 m). Es un género con una
12
especie de planta de flores perteneciente a la familia Ranunculaceae, endémico de la flora peruana. (15) B. PACRA – PACRA: nombre vulgar que se asigna a la planta Laccopetalum Giganteum en la zona andina (jalca) del Perú. C. FLOR: Es el conjunto de antófilos periánticos más o menos vistoso; tienen la función de contener y proteger los órganos de reproducción de la planta. Una flor completa consta de pedúnculo, cáliz, corola, androceo y gineceo. (16) D. ESTUDIO FITOQUÍMICO: Tiene como objetivo determinar los metabolitos secundarios presentes en la especie vegetal a estudiar, aplicando una serie de técnicas de extracción, de separación y purificación y de determinación estructural. (17)
3.6
OBJETIVOS 2.4.1
OBJETIVO GENERAL: Determinar la influencia de las propiedades fitoquímicas de las flores de Laccopetalum Giganteum “Pacra – Pacra” , procedente
de la zona de
Conchucos – Ancash, en el ser humano.
2.4.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Determinar las características macroscópicas de las flores de Laccopetalum Giganteum “Pacra – Pacra” procedente
de la zona
de Conchucos – Ancash.
Determinar las características microscópicas de las flores de Laccopetalum Giganteum “Pacra – Pacra” procedente
de la zona
de Conchucos – Ancash.
Determinar las características fisicoquímicas de las flores de Laccopetalum Giganteum “Pacra – Pacra” procedente
de la zona
de Conchucos – Ancash.
Elaborar un extracto a base las flores de la planta Laccopetalum Giganteum “Pacra – Pacra” procedente
de la zona de Conchucos
– Ancash.
3.7
HIPÓTESIS a. HIPÓTESIS POSITIVA:
13
El
extracto
etanólico
de
las
Flores
de Laccopetalum
giganteum (pacra-pacra) aumenta la fertilidad en Seres vivos, por su alto contenido en ácido fólico.
b. HIPÓTESIS NEGATIVA: El extracto etanólico de las Flores de Laccopetalum giganteum (pacra-pacra) no aumenta la fertilidad en Seres vivos, por su alto contenido en ácido fólico.
IV. METODOLOGÍA DE ESTUDIO A. MÉTODO DE INVESTIGACIÓN Investigación descriptiva.
B. ESTRATEGIA DE ESTUDIO Se empleará el estudio comparativo entre unidades de muestreo de Laccopetalum Giganteum “Pacra – Pacra” tanto en su estado seco como fresco.
C. UNIVERSO O POBLACIÓN Flores de Laccopetalum Giganteum “Pacra – Pacra” comercializados en el Callejón de Conchucos.
D. DISEÑO Y CARACTERÍSTICAS DE LA MUESTRA Diseño
:
Se empleará el diseño descriptivo simple.
Características de la muestra: Se empleará Flores de Laccopetalum Giganteum “Pacra – Pacra” tanto en su estado seco como fresco.
E. DESCRIPCIÓN Y ACONDICIONAMIENTO DE LAS UNIDADES EXPERIMENTALES Las unidades experimentales son las Flores de Laccopetalum Giganteum “Pacra – Pacra”
del callejón de Conchucos, las cuales serán previamente seleccionadas y
tratadas antes de su uso en los análisis bioquímicos propuestos con las medidas de bioseguridad adecuadas para su manipulación.
14
F. TÉCNICAS DE RECOLECCIÓN, PROCESAMIENTO Y ANÁLISIS DE LOS DATOS Se realizará un muestreo simple, con una sola muestra, debido a la escasez de este producto y a su situación de peligro crítico.
Recolección: Se recogerá una muestra de 10 Kg. de las Flores de Laccopetalum Giganteum “Pacra – Pacra”
del callejón de Conchucos en su estado fresco y seco,
en depósitos de almacenamiento previamente preparados y adecuados.
Procesamiento: Se realizarán los registros de las características fitoquímicas encontradas en las flores de Laccopetalum Giganteum “Pacra – Pacra” tanto macroscópicas, microscópicas, fisicoquímica y fitoquímicas.
Análisis de Datos: Los datos tanto de muestreos parciales como finales se procesarán matemáticamente y estadísticamente, mediante el diseño descriptivo clásico, mostrándose en tablas comparativas.
G. TÉCNICAS DE PROCESAMIENTO Y ANÁLISIS DE DATOS A. DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS:
El estudio macro-morfológico se realizará a simple vista, determinando las características macroscópicas como: Forma, textura, superficie, color, olor, dimensiones y condición de las flores de Laccopetalum Giganteum “Pacra – Pacra”. (19)
B. DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS:
Se realizará mediante el método de la observación al microscopio de los tejidos de la flor fresca para determinar su estructura y elementos celulares que permitirán la identificación de la planta. Para lo cual se realizarán cortes histológicos superficiales y transversales, de la manera más fina posible con un bisturí, sobre láminas portaobjetos. Luego para la clarificación y reblandecimiento de la muestra se procederá a colocar safranina al 1% o azul de metileno al 1%. Una vez coloreada la muestra, se fijará la muestra a la laminilla para ser observada al microscopio binocular de menor a mayor aumento. (19) E nsayos H istoquímicos: a) Reconocimiento de materias albuminoideas: 15
o
Reacción Xantoproteica: Se tratará un corte histológico con HNO3 y aplicando calor para observar el color amarillo característico, luego se aplicará una gota de solución de NaOH, para observar el color característico que indique la presencia de proteínas.
o
Reacción de Biuret: Someteremos los cortes histológicos durante 10´ en solución acuosa de sulfato de cobre al 1%, lavaremos y agregaremos solución de KCH al 10% para observar células de color violeta que indicará la presencia de proteínas.
o
Reacción de Millón: se agregará este reactivo a los cortes histológicos, y después de calentar suavemente se observará la coloración rojo característica, en el caso de ser positivo. (20)
b) Reconocimiento de Alcaloides: Se observarán en los cortes histológicos al
ser tratados con los reactivos de Dragendorff, Mayer y Bouchardat, si son positivos evidenciarán presencia de alcaloides. c) Reconocimiento de Resinas y musílagos: Se agregarán solución
alcohólica de violeta de anilino y de fuccina en partes iguales sobre los cortes histológicos para observar cambios de color, que indiquen la presencia de resinas y musílagos. d) Reconocimiento de grasas: Se agregará reactivo de Sudan III a los cortes
histológicos, para que luego se observe si la coloración cambia a más o menos rojo, lo que indicará presencia de grasas. e) Reconocimiento de Almidón: Se agregará una gota de Lugol diluida a un
corte histológico, en el caso de teñirse de azul, comprobará la presencia de almidón. (20)
C. DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS FISICOQUÍMICAS:
Determinación de las materias E xtrañas:
Para ello se empleará 100 g de muestra los cuales se esparcirán sobre el papel y se separarán manualmente las materias extrañas con una lupa. El material separado se pesará y se determinará su porcentaje en relación a la muestra de ensayo aplicando la siguiente fórmula: =
M
100 (%)
Donde: 16
Me = Porcentaje materia extraña M = masa inicial de la muestra de ensayo (g) m = Masa de materia extraña (g)
100 = Factor matemático para los cálculos Luego de la separación de sustancias extrañas, se procederá a lavar las flores con agua potable a chorro y después con agua destilada. (21)
Secado a temperatura a estufa:
Para este tipo se secado se tomará 100 gramos de las flores, previamente determinando la cantidad de materia extraña, luego de ser lavadas y colocadas dentro de bolsas de papel kraft y se llevan a la estufa a 40°C. Se medirá el tiempo de secado y se cuantificará la perdida de agua. Esto se realizará por 3 veces hasta valores constantes. (20) Pulverización y Tamizaje:
Se pulverizará lo pétalos de las flores de Laccopetalum Giganteum “Pacra – Pacra”,
con la ayuda de un molino mecánico y luego se tamizará con la
ayuda de un set de tamices hasta obtener partículas homogéneas de tamaño 5mm. (21) D. DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS FITOQUÍMICAS:
Las características fitoquímicas de determinarán empleando el extracto etanólico de la flor de Laccopetalum Giganteum “Pacra – Pacra”.
Extracto etanólico: es un extracto con olor característico, obtenido a partir de materia prima desecada de origen vegetal, por maceración o percolación en contacto con etanol, seguida de la eliminación de dicho solvente por un procedimiento físico. Para el presente estudio se obtendrá este extracto por percolación con el fin de preservar los compuestos termolábiles que pudiera contener la muestra. Consiste en colocar el material fragmentado en un embudo o recipiente cónico y hacer pasar un disolvente adecuado a través del mismo. (22) Las técnicas de procesamiento bioquímico que se utilizarán son las siguientes:
E nsayo de Catequinas: Tomaremos una gota de extracto etanólico con la
ayuda de una pipeta calibrada y se aplicará sobre papel filtro. Luego sobre
17
la mancha se aplicará una solución de carbonato de calcio. La aparición de una mancha verde carmelita a la luz UV, indicará un ensayo positivo. (21)
E nsayo de Resinas: Se añadirá 2 ml de extracto etanólico a 10 ml de agua
destilada. La aparición de un precipitado indicará positivo. (23)
E nsayo de F ehing: permite conocer la presencia de azúcares reductores;
para ello en una alícuota se evaporará el extracto etanólico en baño maría y al residuo se agregará 2 ml de agua, luego 2 ml del reactivo y se calentará a baño maría durante 5 minutos. El resultado será positivo si aparece un precipitado rojo. (24)
E nsayo de Baljet: Permite reconocer en un extracto la presencia de
compuestos con agrupamiento lactónico, en particular coumarinas, aunque otros compuestos lactónicos pueden positivo al ensayo. Para ello en una alícuota del extracto etanólico
se adicionará 1 ml de reactivo,
considerándose positivo la aparición de una coloración o precipitado rojo.
E nsayo de Liebermann – Burchard: Permite conocer en un extracto
etanólico la presencia de triterpenos y/o esteroides; para lo cual en una alícuota se evaporará el extracto etanólico en baño maría y el residuo se disuelve con 1 ml de cloroformo. Luego se agrega de anhídrido acético y se mezcla bien. Por la pared del tubo de ensayo de agrega III gotas de ácido sulfúrico concentrado sin agitar. el ensayo es positivo cuando:
o
Rosado – azul : muy rápido
o
Verde intenso: visible aunque rápido.
o
Verde oscuro – negro: final de la reacción.
E nsayo de Espuma: permite conocer la presencia de saponinas, tanto del
tipo esteroidal como triterpénica. Para ello en una alícuota con extracto etanólico, se diluirá con cinco veces su volumen en agua y se agitará la mezcla fuertemente durante 10 minutos. Se considera positivo cuando aparece espuma en la superficie de la mezcla de más de 2mm y persiste por más de 2 minutos.
E nsayo del Cloruro F érrico: Permite reconocer la presencia de
compuestos fenólicos y/o tanino en un extracto vegetal. En una alícuota de extracto etanólico se agregará III gotas de solución tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica. El ensayo es positivo cuando: o
Coloración rojo-vino: compuestos fenólicos en general. 18
o
Coloración verde intensa: taninos del tipo pirocatecólicos.
o
Coloración azul: taninos pirogalotánicos.
E nsayo de ninhidrina: permite conocer en los extractos vegetales, la
presencia de aminoácidos libres o de aminas en general. Para ello, en una alícuota de extracto etanólico se agrega 2 ml de solución al 2% de ninhidrina, luego la mezcla se calienta aprox. 10 minutos en baño maría. El ensayo es positivo cuando se desarrolla un color azul violáceo.
E nsayo de Barntráger: permite reconocer la presencia de quinonas. Para
ello en una alícuota con extracto etanólico se agregará 1 ml de hidróxido de sodio. Se agita mezclando las fases y se deja en reposo hasta su ulterior separación. Se considera positivo cuando la fase acuosa alcalina superior se colorea: Coloración rosada = (++); Coloración roja = (+++).
E nsayo de Shinoda: permite conocer la presencia de flavonoides. Para
ello, en una alícuota con extracto etanólico se diluye con 1 ml de ácido clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico. Después de la reacción se espera 5 minutos y se añade alcohol amílico, se mezclan las fases y se deja reposar hasta que se separen. El ensayo es positivo cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo intenso en todos los casos.
E nsayo de Kedde: Permite reconocer la presencia de glucósidos
cardiotónicos. Para lograrlo, en una alícuota de extracto etanólico se mezcla con 1 ml del reactivo y se deja reposar durante 10 minutos. El ensayo es positivo cuando desarrolla una coloración violácea persistente durante 1 a 2 h.
E nsayo de antocianidinas: Permite reconocer flavonoides de estructura de
secuencia C6-C3-C6. Para ello se calienta 2ml del extracto etanólico con 1 ml de HCl durante 10 minutos y se deja enfriar. Luego se añade 1ml de agua y 2 ml de alcohol amílico. Se agita y deja separar las dos fases. La aparición de color rojo a marrón en la fase amilica indica positivo.
E nsayo de Dragendorff: Permite reconocer en el extracto etanólico la
presencia de alcaloides. Para ello, en una alícuota con el extracto etanólico se añade I gota de ácido clorhídrico concentrado, cuya mezcla se calienta suavemente y se deja enfriar. Luego con esta solución, se añade III gotas
19
del reactivo de Dragendorff. Se considera positivo de la siguiente manera: Opalescencia (+), Turbidez definida (++) y Precipitado (+++).
E nsayo de Mayer: En una alícuota con el extracto etanólico se añade I
gota de ácido clorhídrico concentrado, cuya mezcla se calienta suavemente y se deja enfriar. Se añade luego una pizca de cloruro de sodio en polvo, se agita y filtra. Se añade III gotas de la solución reactiva de Mayer y se comprueba positivo: Opalescencia (+), Turbidez definida (++) y Precipitado coposo (+++).
E nsayo de Wagner: En una alícuota con el extracto etanólico se añade I
gota de ácido clorhídrico concentrado, cuya mezcla se calienta suavemente y se deja enfriar. Se añaden III gotas del reactivo de Wagner y los resultados se clasifican: Opalescencia (+), Turbidez definida (++) y Precipitado (+++).
E nsayo de H ager: En una alícuota con el extracto etanólico se añade I
gota de ácido clorhídrico concentrado, cuya mezcla se calienta suavemente y se deja enfriar. Se añaden III gotas del reactivo de Hager y los resultados también se clasifican: Opalescencia (+), Turbidez definida (++) y Precipitado (+++). (25)
20
V. PRESUPUESTO 5.1
RECURSOS A. Asignación Económica a Investigadores: La realización del presente estudio estará a cargo del docente asesor y los estudiantes de 3er ciclo de Ingeniería Agroindustrial con el 100% de participación.
B. Bienes y Servicios: DESCRIPCIÓN
Unitario
MONTO (S/.) Parcial
BIENES Materiales de Ambientación Materiales de Oficina 12 marcadores indeleble S/. 36.00 03 plumones marcadores S/. 18.00 01 millar de papel bond S/. 30.00 01 docena de lapiceros S/. 15.00 06 cuadernos de apuntes S/. 24.00 02 cintas maskyntape S/. 6.00 06 Sobres manila S/. 3.00 01 docena de papel kraft S/. 10.00 06 resaltadores S/. 18.00 Materiales de Laboratorio 02 Baldes PVC de 40 litros S/. 50.00 10 Kg de Flor de Laccopetalum S/. 200.00 Giganteum “Pacra – Pacra” Solventes S/. 300.00 Set de reactivos S/. 1,500.00 04 Cajas de Guantes de S/. 120.00 examinación 06 Lentes de protección S/. 60.00 03 docenas de Bistuí S/. 10.00 Materiales de impresión Material Fotográfico Material de Cómputo Insumos para la preparación SERVICIOS Viáticos y asignaciones Pago de refrigerios para salida de S/. 500.00 campo Impresión y digitación Revelado de fotografías S/. 150.00
Total S/. 3,600.00
S/. 500.00 S/. 160.00
S/. 2,240.00
S/. 150.00 S/. 100.00 S/. 50.00 S/. 400.00
S/. 5,450.00 S/. 4,500.00 S/. 300.00
21
C. Costos del Proyecto: MONTO (S/.) Total S/. 3,600.00
DESCRIPCIÓN BIENES Materiales de Ambientación Materiales de Oficina Materiales de Laboratorio Materiales de impresión Material Fotográfico Material de Cómputo Insumos SERVICIOS Viáticos y asignaciones Impresión y digitación TOTAL
S/. 500.00 S/. 160.00 S/. 2,240.00 S/. 150.00 S/. 100.00 S/. 50.00 S/. 400.00 S/. 5,450.00 S/. 5,500.00 S/. 450.00
S/. 9,050.00
D. Financiamiento: Universidad Nacional del Santa
5.2
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES MESES
ACTIVIDADES 1. Revisión Bibliográfica 2. Preparación, técnicas, instrumentos. 3. Recolección de muestra. 4. Procesamiento muestra.
de
la
5. Análisis e interpretación de resultados 6. Elaboración de Informe final
Julio
Agosto
X
X
X
Setiembre
Octubre
Noviembre
Diciembre
X
X
X
X
X
X
X
X
22
VI.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1) SOUKUP, J. (1970). Vocabulario de los Nombre Vulgares de la Flora Peruana. Edit. Salesiana S.A. Lima – Perú. 2) TAMURA, M. (1993). Ranunculaceae. Pp. 563-583. En K. Kubitzki, J.G. Rohwer & V. Bittrich (Eds). Flowering Plants. Dicotyledons: Magnoliid, Hamamelid and Caryophyllid Famies. The Families and Genera of Vascular Plants. SpringerVerlag. Berlin. 3) LENEBACH, C.; A. Cano; C. Monsalve; P. McLenachan; E. Hórandl, and
P. Lockhart. (2007). Phylogenetic relationships of the monotopyc Pruvian genus Laccopetalum (Ranunculaceae). Plant Syst. Evol 264 (1-2) : 109 -116. En línea disponible en: http://link.springer.com/article/10.1007/s00606-006-0488-8#/page-1 4) CANO, A; M. La Torre; S. Castillo; H. Aponte; M. Morales; W. Mendoza; B.
León; J. Roque, I. Salinas; C. Monsalve & H. Beltrán. (2006). Las plantas comunes del Callejón de Conchucos (Ancash, Perú). Guía de Campo. Museo de Historia Natural (UNMSM). Serie de Divulgación 13:1-303. Lima - Perú. 5) BRAKO, L. & J. Zarucci. (1993). Catálogo de las Angiospermas y Gimnospermas del Perú. Monogr. Syst. Bot Missouri Bot. Garden. Vol. 45. 6) LEÓN, B. (2006). Ranunculáceas endémicas del Perú. Libro rojo de las plantas endémicas
del
Perú.
Rev.
Perú
Biol.
Perú.
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13
Part
2(2):
660
-661.
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http://www.sacha.org/macbr/intro_sp.htm 8) SAGÁSTGUI, A.; M. O. Dillon; I. Sánchez Vega; S. Leiva & P. Lezama.
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–
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en:
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23
046e7a025df/1434050783296/ETNOBOTANICA+DEL+PERU+PREHISPANO_Fern%C3%A1ndez+y+Rodriguez.pdf 11) R. RODRÍGUEZ; M. Wigend.; B. León; E. Altivez; J. Pera & S. Arroyo.
(2007). Laccopetalum giganteum (Ranunculaceae) una especie endémica en peligro del Norte del Perú, que necesita plan de conservación urgente. Universidad Nacional de Trujillo.
Part 14(1): 123-130. Trujillo – Perú.
Disponible en:
https://www.academia.edu/2922480/Laccopetalum_giganteum_Ranunculaceae_una _especie_end%C3%A9mica_En_Peligro_del_norte_del_Per%C3%BA.
Sitio web: http://ericrodriguezr.blogspot.pe/2008/02/laccopetalum-giganteumwedd-ulbr.html 12) J. ARROYO; A. Barreda; E. Ráez; B. Jurado; G. Moral; J. Matínez & C.
Palomino. (2007). El Extracto etanólico de las flores de Laccopetalum giganteum (pacra – pacra) aumenta la fertilidad en ratas. Faculta de Medicina y F. Bioquímica. UMSM.
Pág.
238
–
234.
Lima
–
Perú.
Disponible
en:
http://revistasinvestigacion.unmsm.edu.pe/index.php/anales/article/view/1209 13) VILLAR M. Vargas O. (2001). Manual de fitoterapia. Perú. OPS/OMS. Pág. 7-9, 25,27. Lima – Perú. 14) LOCK O. (1998) Investigación Fitoquímica. 1° Edic. Pontificia Universidad Católica del Perú. Pág. 1-3. Lima – Perú. 15) S. VEGA. y O. Dillon (2006). Jalcas. Pág. 77:90. Universidad Nacional de Cajamarca. Cajamarca – Perú. Pdf. 16) R. FERREIRA y E. Cerrate. ( 2002). BOTANICA. Capitulo III. Museo de Historia Natural de la UNMS. Lima – Perú. Disponible en Pdf. 17) LOCK de Ugaz O. (2000). Análisis Fitoquímico y Metabolitos Secundarios. Capitulo IV. Pontificia Universidad Católica del Perú. Lima – Perú. Pdf. 18) LA TORRE C. y Albán C. (2006). Etnobotánica del Perú. Botánica Económica de los Andes Centrales. Pág. 239-243. UMSM. Lima – Perú. Pdf. 19) RONCAL R. y Saldaña C. (2014). Características farmacognósticas de las hojas y tallos de la Paperomia dolabriformis Kunth “congona de zorro” procedentes del Cerro Campana del distrito de Huanchaco – La Libertad. UNT. Trujillo – Perú. 20) SILVA E. (1995). Estudio Fitoquímico y Bromatológico del fruto Solanum Topiro (cocona). UNT. Trujillo – Perú.
24
21) RAMOS C. y Solórzano R. (2016). Características farmacognósticas de las hojas de Alternanthera lanceolata Shinz “lancetilla” proveniente del distrito de Urpay provincia de Sánchez Carrión región la Libertad. UNT. Trujillo – Perú 22) GONZALEZ V. (2004). Obtención de aceites y extractos etanólicos de Plantas del Amazonas. Universidad de Colombia. Colombia. Pdf. 23) RAMOS C. y Solórzano R. (2016). Características farmacognósticas de las hojas de Alternanthera lanceolata Shinz “lancetilla” proveniente del distrito de Urpay provincia de Sánchez Carrión región la Libertad. UNT. Trujillo – Perú. 24) IBAÑEZ D. (1964). Contribución al estudio Fitoquímico de las Semillas de Hylocereus sp – Extracción del aceite y su
estudio . UNT. Trujillo – Perú.
25) MENDOZA V. y Minaya P. (2014). Estudio Fitoquímico e Histoquímico de la raíz, tallo y hoja de Krameria lappaceae “ratania” procedente de la provincia de Huaraz – Ancash. 2013. UNT. Trujillo – Perú.
25
VII.ANEXOS 6.1. Imagen de la planta Laccopetalum giganteum vista por planos:
26
6.2.Tabla de Tamizaje Fitoquímico del extracto etanólico de las flores de Laccopetalum giganteum (pacra – pacra):
METABOLITOS Catequinas
EXTRACTO
ENSAYO
ETANÓLICO
Ensayo de Catequinas:
Resinas
Ensayo de Resinas:
Azúcares reductores
Ensayo de Fehling:
Cumarinas
Ensayo de Baljet:
Triterpenos y esteroides Saponinas
Ensayo de Liebermann – Burchard: Ensayo de Espuma:
Compuestos fenólicos y
Ensayo
taninos
férrico:
del
Cloruro
Aminoácidos
Ensayo de Ninhidrina:
Quinonas
Ensayo de Borntrager:
Flavonoides Glucósidos Cardiotónicos Antocianidinas
Ensayo de Shinoda: Ensayo de Kedde: Ensayo de antocianidinas: Ensayo de Dragendorff:
Alcaloides
Ensayo de Mayer: Ensayo de Wagner: Ensayo de Hager
Intensidad:
Identificación:
+
Baja
+
Positivo
++
Mediana
-
Negativo
+++
Alta
27
