UNIVERSIDAD EL CAUCA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA1 VI SEMESTRE GUÍA No 5 BIOPROSPECCIÓN DE MICROORGANISMOS: AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN Y CONSERVACIÓN 1. INTRODUCCIÓN A nivel mundial las empresas de carácter agroindustrial evidencian un crecimiento productivo que impacta positivamente la economía de los países, sin embargo durante la ejecución de sus procesos, generan a diario una cantidad importante de residuos. Muchos de estos residuos son aprovechados por diversas especies de microorganismos, quienes haciendo uso de sus procesos metabólicos obtienen los recursos necesarios para su crecimiento poblacional. Teniendo en cuenta lo anterior, es importante la caracterización microbiológica de estos residuos, ya que muchos de los microorganismos presentes en ellos exhiben características de interés industrial como por ejemplo, actividad proteolítica, lignolítica, antimicrobiana, insecticida, entre otras; que pueden ser aprovechadas en diversas aplicaciones agrícolas, industriales, sanitarias, farmacéuticas etc. Esta búsqueda sistemática de organismos completos (o componentes naturales) de la biodiversidad para darles un valor comercial en el desarrollo de productos, es lo que se conoce como bioprospección. Estos productos tienen aplicación en diferentes industrias como farmacéutica, biotecnológica, medicina botánica, agro-insumos, etc. (Duarte y Vehlo, 2009) En este sentido, el desarrollo de la microbiología ha generado un impacto importante en campos como los que se describen a continuación:
Microbiología de alimentos: que estudia los microorganismos como productores de alimentos y como agentes de deterioro de los mismos. En el primer caso selecciona, mantiene, y mejora microorganismos útiles en la generación de productos alimenticios con nuevas características sensoriales; es decir, modificación de texturas, generación de aromas y sabores. Mientras que el segundo aspecto, se encarga de desarrollar mecanismos para prevenir y controlar el contacto de microorganismos con los alimentos. Microbiología industrial: encargada de estudiar y manipular los microorganismos a gran escala para la producción de compuestos como materia prima o para la obtención de fármacos, vacunas, disolventes orgánicos e insumos alimentarios. Por ejemplo la proteína unicelular utilizada en la alimentación animal, la producción de alcohol, la generación de ácidos orgánicos, entre otros. Microbiología médica: estudia e identifica los agentes causantes de enfermedades, sus posibles mecanismos mec anismos de acción acc ión y métodos de control.
1Elaborada por: Ing. José Luis Hoyos Concha. Con cha. Esp. Biotecnología. M.Sc. Est. Doc. Ingeniería de Alimentos. Docente.
Actualizada por: Ing. Remigio Yamid Pismag P ismag Portilla. M.Sc. Ingeniería de Alimentos. Docente. Biólogo Iván Otero Ramírez. Est. Maestría Microbiología Agroindustrial. Agroindustrial. Docente Ing. Rocío Bonilla Méndez. M.Sc. Diseño y gestión de d e procesos. Docente
Microbiología agrícola: estudia los procesos microbianos útiles para el crecimiento de las plantas, así como las enfermedades causadas por microorganismos fitopatógenos (hongos, bacterias, virus, viroides, entre otros) y sus posibles mecanismos de control. Microbiología sanitaria y ambiental: desarrolla procesos de ingeniería y microbiología a gran escala para el tratamiento de residuos y descontaminación de los ecosistemas. Microbiología del agua potable: investiga y aplica métodos para eliminar microorganismos patógenos en redes de agua.
1.1 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Con el fin de obtener los microorganismos que son de interés para el investigador, inicialmente es necesario suministrar la muestra problema, la cual posee una carga de células microbianas viables (cultivables) y aquellos que no se pueden reproducir en un medio de cultivo; de igual modo es necesario tener claro los factores ambientales como temperatura, pH, contenido de humedad, requerimientos nutricionales específicos (sustrato) para el crecimiento de estos microorganismos. Con respecto al sustrato, se puede establecer la existencia de una gran variedad de medios de cultivo, disponibles para el desarrollo selectivo o no de los microorganismos. Pero como el objetivo es iniciar con un proceso de aislamiento de los microorganismos de interés, es indispensable que dichos sustratos, aporten nutrientes para la obtención de energía y desarrollo selectivo de los mismos. Todos estos componentes, deben proporcionar las condiciones óptimas para que los microorganismos sean capaces de conformar estructuras que les permitan multiplicarse. Una vez definidas las condiciones de sustrato y “ambientales” requeridas por el grupo de
microorganismos a aislar, se procede a realizar la siembra. En términos microbiológicos, se entiende por SIEMBRA al proceso mediante el cual se lleva una porción de una población de microorganismos (inóculo), desde un cultivo bacteriano (muestra problema) a un medio nutritivo para su crecimiento. Entre los métodos utilizados para el aislamiento de microorganismos se encuentra las diluciones seriadas y siembra en placa. El método de las diluciones seriadas consiste en tomar una alícuota conocida de la muestra problema y diluirla en proporciones fijas, hasta obtener varias diluciones en serie, donde se asume que en cada muestra existe una proporción conocida de microorganismos cuantificables por mililitro. Es importante aclarar que cada muestra debe ser inoculada en medios adecuados para favorecer su desarrollo y posterior aislamiento. Siembra en placa: técnica utilizada para hacer el aislamiento y recuento a partir de diluciones seriadas. En este método se usa principalmente cajas petri con agar sólido previamente preparado, en el cual se vierte una pequeña cantidad de dilución problema y se esparce con la ayuda de perlas de cristal. En ocasiones se emplea agar en doble capa, donde el medio de cultivo debe estar fundido y a 45ºC, se agrega 1ml de la dilución a sembrar, realizando una breve agitación. Una variación de estos métodos, es que dicha dilución se coloca en el centro de la caja de Petri estéril, se adiciona el medio de cultivo en la caja y se homogeniza con movimientos giratorios horizontales y verticales, teniendo cuidado de no formar burbujas, finalmente se deja solidificar y se procede a incubar.
1.2 CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LAS COLONIAS BACTERIANAS Una vez realizado el proceso de aislamiento en medios sólidos, las bacterias forman estructuras visibles denominadas colonias. Como regla general cada especie forma siempre en el mismo medio colonias semejantes. Por tanto, los rasgos de las colonias son importantes para su identificación primaria; algunas de las características que permiten diferenciar una colonia se muestran a continuación: Tamaño: Puntiformes si son extremadamente pequeñas. En adelante se miden y reporta el tamaño en milímetros (Pequeña < 1 mm, mediana entre 1 y 4 mm, grande 4 mm >). Elevación: plana, elevada, convexa, umbilicada, cóncava, etc. Borde o margen: entero, irregular, dentado, lobulado, ondulado, filamentoso, etc. Superficie: lisa o rugosa. Consistencia: filamentosa, cremosa, seca o pulverulenta. Propiedad óptica: brillante, opaco, translucida. Color: amarillo, verde, rojo, blanca, etc. 1.3 PURIFICACIÓN En biotecnología, se recurre a una técnica esencial de microbiología para la obtención de cultivos puros, a partir de los cuales es posible analizar el comportamiento microbiano de una forma precisa y selectiva. El cultivo puro es aquel que contiene una sola especie o tipo de microorganismo y que presumiblemente se ha obtenido a partir de una misma célula; cada uno de los cultivos puros que componen una especie se denomina cepas. Para la obtención de cultivos puros se pueden utilizar varios métodos que van desde el aislamiento de una sola bacteria utilizando micro pipetas, diluciones seriadas, aislamiento por agotamiento o utilización de medios de cultivo selectivos entre otros. La técnica más empleada en microbiología para procesos de purificación es el agotamiento. La siembra por agotamiento consiste en tomar una nueva caja de petri con medio sólido, en la palma de una mano, ligeramente inclinada muy cerca de un mechero. Con la mano contraria, se maneja el asa previamente esterilizada y con ella se recoge el material de cultivo de la primera siembra en placa. Se trazan estrías paralelas hasta la mitad o tercera parte de la caja; luego se flamea el asa, se gira la caja y se hacen estrías en la misma forma hasta la mitad de la superficie libre; se flamea nuevamente el asa y se hace girar la caja; se trazan estrías perpendiculares a las anteriormente trazadas en el cuadrante libre. Se esteriliza el asa antes de descartarla. El procedimiento descrito se observa en la Figura 1. 2 1
Figura 1. Siembra por agotamiento
3
Observe que en el punto 3, la formación de colonias es mucho más clara y completamente definida, este es el resultado deseado en el método por agotamiento, el cual permite hacer la purificación del microorganismo objeto de estudio. 1.4 DESCRIPCION MICROSCÓPICA Una vez se obtiene el cultivo puro se pueden realizar una serie de tinciones que permiten diferenciar aún mejor los aislamientos obtenidos así como también, verificar la pureza de cultivo obtenido para proceder a otras actividades de interés para el investigador o el empresario. Entre las tinciones más utilizadas se puede mencionar: tinción de Gram, tinción de cápsulas y esporas (para bacterias), tinción con azul de lactofenol (para hongos) y tinción con azul de metileno (para levaduras). 1.5 CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS En condiciones naturales cuando se agotan las fuentes nutritivas o bajo condiciones adversas, los microorganismos paralizan o atenúan su metabolismo, entrando en un periodo de dormancia. A este fenómeno descrito se le ha denominado microbiostasis o hipobiosis. Cuando las condiciones vuelven a ser favorables o existe una nueva fuente nutritiva el microorganismo inicia nuevamente su desarrollo. Bajo este concepto la conservación de microorganismos in-vitro ha intentado copiar este procedimiento, sin embargo, no existe un método de conservación perfecto (Hernández y Loaiza 2014). La conservación de la biodiversidad microbiana autóctona se debe dirigir a mantener viables y estables fenotípica y genotípicamente especímenes representativos con aplicabilidades concretas, para lo cual es necesario desarrollar técnicas de conservación específicas para cada una de ellas previendo la reducción de efectos adversos en el proceso. En este sentido, el éxito de la conservación de los cultivos microbianos es esencial para las actividades de investigación o industriales (Sánchez y Corrales 2005). Algunas características de los métodos de conservación se describen a continuación: Conservación en refrigeración a 5 -8°C: incrementa la vida útil de los cultivos, se deben hacer resiembras periódicas, es un proceso laborioso y consume mucho tiempo (Zamora, 2003). No obstante, el mayor problema de las resiembras es la posibilidad de cambio en el comportamiento genotípico y fenotípico (Sánchez y Corrales 2005). Conservación por congelación: tras la congelación ocurre la mayor tasa de destrucción bacteriana, sin embargo, se llega a estabilizar y las células se mantienen viables durante largos periodos de tiempo. Cuanto menor sea la temperatura de almacenamiento, mayor será la supervivencia de las bacterias, sin embargo, se requieren agentes crioprotectores como glicerol o clara de huevo. Los agentes crioprotectores son compuestos químicos no tóxicos, con facilidad para atravesar la membrana celular y acumularse intracelularmente. Se mantienen de forma amorfa durante el proceso de congelación y son capaces de unir electrolitos o moléculas de agua para retrasar la congelación. Entre otros efectos protectores sirven para compensar la diferencia de presión osmótica que se genera cuando empieza a congelarse la superficie de la célula. De esta manera se evita una perdida excesiva de agua que podría provocar la deshidratación y destrucción de las células. Este método de congelación ofrece facilidad para procesar los microorganismos, confiabilidad de los resultados, estabilidad de las cepas y el costo es favorable (Sanchez y Corrales 2005; Zamora, 2003).
Conservación por suspensión con agua destilada: es un método simple, económico, seguro y capaz de asegurar la supervivencia de los cultivos por períodos prolongados. Permite mantener altos porcentajes de viabilidad, caracteres morfológicos y f isiológicos en periodos a veces superiores a 5 años, en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. No obstante, no se ha comprobado la estabilidad de caracteres específicos como la virulencia, el poder fermentativo y la preservación de transformantes genéticos (Hernández y Loaiza 2014).
Entre otros métodos de conservación se pueden mencionar: conservación en nitrógeno líquido, conservación por deshidratación, liofilización, desecación en papel filtro, desecación en suelo, arcilla o silica gel, desecación en bolas de alginato (Hernández y Loaiza 2014; Zamora, 2003).
2. OBJETIVOS Objetivo general Desarrollar habilidades en procesos de bioprospección de microorganismos de interés a partir de muestras ambientales e industriales. Objetivos específicos Reconocer diferentes técnicas de aislamiento de bacterías, hongos y levaduras a partir de muestras ambientales. Conocer y aplicar una metodología para la purificación y conservación de microorganismos de interés Comprobar la selectividad de los medios utilizados.
3. MATERIALES Material Erlenmeyer de 90 mL Gradilla Mechero Asas Pipetas de 10 mL Propipetas Micropipeta 1000 µL – 100 µL Perlas para inoculación Puntas para Micropipeta 1000 µL – 100 µL Papel aluminio Papel Kraft Toallas absorbentes Vinipel Cinta de enmascarar
Cantidad por grupo 1 1 1 1 1 1 1
Uso general
4. REACTIVOS Reactivo
Cantidad por grupo
Medio de cultivo asignado para aislamiento Medio de cultivo asignado purificación Agua destilada Reactivos tinción de gram Azul de lactofenol
1 1 2L
5. EQUIPOS Equipo Cámara de flujo laminar Nevera Incubadora a 30°C y 35°C Microscopio
Cantidad por grupo Uso general Uso general Uso general Uso general
6. MATERIALES QUE DEBE TRAER EL GRUPO De uso individual: tapabocas, guantes de latex, gorro. Por grupo: papel aluminio, papel kraft, vinipel y toallas absorbentes. GRUPO 1. Suero de leche GRUPO 2. Agua de rallandería de yuca (proveniente de los tanques de fermentación) GRUPO 3. Jugo de caña o jugo de fique GRUPO 4. Suero de leche GRUPO 5. Agua de rallandería de yuca (proveniente de los tanques de fermentación) GRUPO 6. Agua de río
7. PROCEDIMIENTO 7.1 PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO 7.1.1
7.1.2
Realizar la preparación de los medios de cultivo de acuerdo a las indicaciones del proveedor (Ver instrucciones en el recipiente). A continuación se indica el medio de cultivo correspondiente según el microorganismo a aislar: Levaduras: Agar cloranfenicol (YGC) Bacterias ácido lácticas: Agar Man, Rogosa y Sharpe (MRS) Bacterias amilolíticas: Agar almidón Bacterias acumuladoras de PHA: Plate Count Agar (PCA) + Glucosa 15 g L -1 + Azul de nilo 1 µL/mL Llevar los medios de cultivo esterilizados a la cabina de flujo laminar y servir en las cajas de petri. Dejar solidificar. Rotular las cajas con las respectivas diluciones que serán inoculadas.
7.2 PREPARACIÓN DE DILUCIONES SERIADAS 7.2.1
Realizar la preparación de una solución madre de la muestra (dilución 10 -1), de la siguiente manera:
Para muestras líquidas: Diluir 10 mL de muestra problema en 90 mL de agua destilada estéril. Para muestras sólidas: Disolver 10 g de muestra en 90 mL de agua destilada estéril, agitar durante 5 minutos y dejar reposar por otros cinco minutos.
Nota: Mantener la boca de los recipientes cerca del mechero y en lo posible mantener todo cubierto y tapado para evitar contaminación. 7.2.2
Tomar 1 mL de la solución madre y llevar a tubo con 9 mL de agua destilada (dilución 10-2). Preparar diluciones sucesivas 10 -3, 10-4, 10-5 realizando este mismo procedimiento (Ver Figura 2).
Figura 2. Preparación de diluciones seriadas de la muestra 7.3 SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO
Nota: Realizar el procedimiento en cámara de flujo laminar. 7.3.1 7.3.2 7.3.3 7.3.4 7.3.5 7.3.6
Inocular en las cajas de Petri (con el medio estéril previamente servido y solidificado), 100 microlitros de cada dilución con la ayuda de una micropipeta y puntas previamente esterilizadas. Esparcir la muestra por toda la superficie del medio con la ayuda de perlas de vidrio y realizando movimientos circulares. Retirar las perlas cerca del mechero y sellar las cajas con con papel vinipel. Incubar a 30°C o 35 °C según el grupo de microorganismos que se desea aislar. Colocar las cajas de forma invertida para evitar exudaciones que dificulten el desarrollo microbiano. Realizar observaciones y registros de crecimiento periódicamente.
7.4 DESCRIPCIÓN MACROSCÓPICA Y PURIFICACIÓN
Nota: Realizar todo el procedimiento descrito a continuación en cámara de flujo laminar. 7.4.1 7.4.2 7.4.3
Realice la descripción macroscópica de las colonias obtenidas de acuerdo a lo descrito en el ítem 1.2 Cerca de un mechero, tomar una de colonias de interés claramente identificada. Con una asa flameada, sembrar por agotamiento (Ver Figura 1) en caja de petri con el medio correspondiente.
7.4.4 7.4.5
Rotular y tapar cada caja con su muestra y sellar con vinipel. Incubar a 30°C o 35 °C según sea el caso.
7.5 DESCRIPCIÓN MICROSCÓPICA Para la descripción microscópica de los aislados obtenidos se empleará la tinción de gram para bacterias, la tinción con azul de metileno para levaduras y tinción con azul de lactofenol para hongos. 7.5.1
TINCIÓN DE GRAM
7.5.1.1 Deposite una gota de agua en un portaobjetos. 7.5.1.2 Tome una colonia y disuélvala sobre la gota de agua haciendo una extensión sobre el portaobjetos. 7.5.1.3 Fije la placa al calor 7.5.1.4 Una vez seco, cubra el extendido con cristal violeta y déjelo por un minuto. 7.5.1.5 Lave con abundante agua. 7.5.1.6 Cubra nuevamente el extendido con lugol y déjelo por un minuto. 7.5.1.7 Lave con agua. 7.5.1.8 Agregue alcohol-acetona dejando por 30 segundos. 7.5.1.9 Lave con agua. 7.5.1.10Finalmente, cubra la placa con safranina dejando por un minuto, lave, deje secar y observe al microscopio en el objetivo de 100 x (Recuerde agregar aceite de inmersión). 7.5.2
TINCIÓN CON AZUL DE METILENO
7.5.2.1 7.5.2.2 7.5.2.3 7.5.2.4
Deposite una gota de azul de metileno en un portaobjetos. Tome una colonia con el asa y disuélvala sobre la gota de tinte. Cubra con un cubre objetos Observe en el microscopio a 40x o 100x (en caso de usar 100x recuerde usar aceite de inmersión).
7.5.3
TINCIÓN CON AZUL DE LACTOFENOL
7.5.3.1 7.5.3.2 7.5.3.3 7.5.3.4 7.5.3.5
Deposite una gota de azul de lactofenol en un portaobjetos. Con un pedazo de cinta tome una muestra de micelio de la colonia objeto de estudio Ubique el micelio sobre la gota de azul de lactofenol Ponga un cubreobjetos sobre la zona donde depositó el micelio Observe al microscopio en objetivo de 40x.
7.6 CONSERVACIÓN Para la conservación en tubos con agar inclinado se toma una colonia del cultivo puro y se hace una estría sobre la superficie del agar inclinado. Llevar a incubar y conservar a 4°C.
8. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
8.1 ¿Cuáles son los posibles usos en el campo agroindustrial de los microorganismos objeto de estudio? 8.2 ¿Por qué son empleados cada uno de los medios de cultivo para los microorganismos aislados en la práctica?
9. BIBLIOGRAFÍA
DUARTE, Oscar. VEHLO, Lea. 2009. La bioprospección como un mecanismo de cooperación internacional para el fortalecimiento de capacidades en ciencia y tecnología en Colombia. Ci. Inf. Brasilia. 38, 3, p. 96-110. GOMEZ, J. y ACEVEDO, D. Manual de microbiología. Curso de microbiología ambiental. Universidad del Valle. 2001 HERNÁNDEZ, D. y LOAIZA, A. 2014. Selección de un método para la conservación y preservación de actinomicetos aislados del suelo del Jardin botánico de la Universidad Tecnológica de Pereira. Tesis de grado para optar el título de Tecnologo Químico. Universidad Tecnológica de Pereira. P.p.14-22. MADIGAN, J., MARTINKO, M. y PARKER, J. Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall. España. 2010. PIRAGUATA, M., MOJICA, M. y BAQUERO, E. Aislamiento, purificación y selección de bacterias como candidatos para ser utilizadas en procesos de biorremediación de Mancozeb ( Ethylenebiscliothio carbamate) utilizado en cultivos de papa. Revista científica. 2006. N°8. Pag. 157 – 171. SÁNCHEZ, L. y CORRALES, L. 2005. Evaluación de la congelación para conservación de especies autóctonas bacterianas. Nova-publicación científica Vol. 3 (4). P.p. 21 – 29. VOLCY, CHARLES y PARDO, VÍCTOR. Principios de Micología. Centro de publicaciones, Universidad Nacional de Colombia. 1994. WARD, O. P. Biotecnología de la Fermentación. Acribia. España. 1990 ZAMORA, L. 2003. Aislamiento, identificación y conservación de cultivos de bacterias lácticas antagonistas de microbiota contaminante de sangre de matadero. Tesis doctoral Universitat de Girona. P.p. 25 – 35.
