Detección alimentos
Grupo: 04 Equipo: 1 Integrantes
de
Staphylococcus
aureus
en
Objetivos
Realizar adecuadamente la cuantificación de Staphylococcus aureus en alimentos, mediante la técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana. Explicar el fundamento de todas las etapas del método de detección de Staphylococcus aureus en alimentos.
Etiqueta de la Muestra:
Muestra: Fresas con Crema.
Estado físico de la muestra: Solido. Fecha: 28/ 02/ 2013 Hora: 07:00 am Nombre de la persona que tomo la muestra: Gachuz López Gabriela. Temperatura: aproximadamente 20°C Apariencia general de la muestra: Buen color, buen olor, producto fresco, recién elaborado. Apariencia general del lugar: Limpio
Técnica Analítica (son los diagramas de cada una de las integrantes del equipo, que se integran al reporte). Resultados
1.- Aislamiento selectivo.
No hubo desarrollo de Staphylococcus aureus en las cajas Petri con Agar Baird Parker, para nuestra muestra (Fresas con Crema). Por lo que ya no se prosiguió a la realización del punto 2 y 3. 2. Recuperación de la cepa. 3. Pruebas bioquímicas. Al no encontrar en las cajas Petri colonias típicas de Staphylococcus aureus, reportamos la sensibilidad de la metodología empleada (extensión en superficie), que para este caso es de 100 UFC/g valor estimado para fresas con crema (muestra sólida). Al no existir la presencia de S. aureus en el alimento recurrimos a tomar colonias de las cajas de Agar Baird Parker, dónde se sembró el control de este microorganismo, para la realización de los otros 2 pasos que consisten en la recuperación de la cepa y las pruebas bioquímicas que nos ayudarán a confirmar la presencia y cuantificación de esta especie en un alimento. Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
1. Aislamiento selectivo del control. Se sembró en el agar Baird Parker por agotamiento para obtener colonias aisladas.
Características macroscópicas de Staphylococcus aureus. (Control)
Colonias negras circulares, brillantes, convexas, lisas, con diámetro de 1 a 2mm, muestran zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia.
2.-Recuperación de la cepa (control) VISTA MICROSCOPICA FECHA DE INOCULACIÓN: 28/ 02/ 2013 MUESTRA: tomada de un tubo que contenía la cepa ya pura de Staphylococcus aureus para ser el control.
TINCIÓN: Tinción de Gram. AUMENTO TOTAL: 1000 DESCRIPCIÓN: Gram positivo MORFOLOGÍA: cocos AGRUPACIÓN: Estafilococos, tétradas, diplococos.
VISTA MACROSCOPICA Fecha de inoculación: 28/ 02/ 2013 Fecha de observación del crecimiento: 30/ 02/ 2013 Microorganismo: Staphylococcus aureus Medio de cultivo: Agar Baird Parker Técnica de inoculación: Estriado en cuadrante radial. Incubación: 37°C / 24 hrs
Observaciones: Características coloniales AGAR BAIRD PARKER. Forma Circular, conexa Color Negro, brillosas Elevación Convexa Textura butirosas Aspecto/ Caract. Zona circular opaca, halo blanco alrededor de la
colonia.
CUADRO 1. Número de colonias a evaluar de S. aureus
Cuenta total de colonias sospechosas en una caja representativa 51 a 100 UFC
Colonias sospechosas a caracterizar bioquímicamente 5
Inoculación de colonias aisladas y seleccionadas características de este microorganismo, según el cuadro anterior BHI
3.- Pruebas bioquímicas del control 3.1.- Prueba de la presencia de la enzima coagulasa
Cuadro 2. Interpretación de las reacciones en la prueba de la coagulasa Valor Características Formación de coágulo 2+ (positiva) pequeño organizado Aparición del coagulo: después de 3 horas. Sólo en los tubos que corresponden a las colonias 1, 3, 4, y 5
3.2.- Prueba de la enzima termonucleasa (control)
Al adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0.1M si existe una coloración rosa brillante
# de Colonia EnzimaTermonucleasa 1 Negativa 2 Negativa 3 Positiva 4 Positiva 5 Positiva
3.3.-Prueba de fermentación de manitol en anaerobiosis control
Manitol + por el vire del indicador rojo de fenol a color amarillo #de Colonia 1 2 3
Prueba de Manitol Positiva Positiva Positiva
4 5
Positiva Positiva
3.4.- Prueba de la Catalasa (control) # de Colonia Enzima Catalasa 1 Negativa 2 Negativa 3 Positiva 4 Positiva 5 Positiva Cálculos y expresión de resultados del control S. aureus toxigénico Cómo este es un análisis del control, el cual no provenía de alguna dilución conocida, se hará un ejemplo de los cálculos considerando las UFC encontradas en la caja Petri con Agar Baird Parker del control y las colonias caracterizadas que resultaron positivas para todas las pruebas bioquímicas (del control).
Al analizar un sope de la Facultad de Química se encontró que la caja Petri representativa estadísticamente contenía 58 UFC sospechosas de contener a S. aureus . Éstas se localizaban en la caja Petri con agar Baird Parker que corresponde a una dilución diez a la menos tres (0.001g/mL) y de esta dilución se inoculó 0.1 mL ( =0.0001g de muestra inoculada), extendiendo el inóculo con una varilla de vidrio en forma de “L”, posteriormente se
incubó a 35 2 °C durante 48 hrs, obteniendo los resultados antes mencionados (58 UFC). De las colonias características y tomando en cuenta el cuadro número 1, se tomaron 5 colonias para caracterizarlas bioquímicamente. De estas 5 colonias analizadas, solamente 3 resultaron positivas para todas las pruebas bioquímicas realizadas. Se pregunta: 1) ¿Cuántas UFC/g de S. aureus toxigénico, se encuentran en este alimento? 2) ¿Se puede consumir el alimento? El razonamiento de los cálculos es el siguiente: a) Determinar el porcentaje de colonias de S. aureus toxigénico. Cinco colonias representan el 100 % de UFC muestreadas, tres colonias positivas, a ¿qué porcentaje corresponden? 5UFC--------------------------------------- 100% 3UFC--------------------------------------- x X= 60% Enseguida, de las 58 UFC encontradas en esta dilución (que contiene 0.0001 g de alimento), se dice que 58 UFC están en 0.0001 g de muestra, ¿cuántas UFC habrá en 1.0 g de alimento? 58UFC----------------------------------------- 0.0001 g X ----------------------------------------- 1 g X= 580,000 UFC/g de alimento. De las 580,000 UFC/g de alimento, solamente el 60% de ellas son toxigénicas, entonces ¿cuántas UFC toxigénicas/g de alimento, se encuentran en este alimento?
580,000 UFC/g------------------------------------- 100% X ------------------------------------ 60% X= 348,000 UFC/g El resultado debe expresarse en forma exponencial, tomando en cuenta solamente los 2 primeros dígitos: X= 35x UFC/g Estas 350,000 UFC/g de alimento (35x UFC/g), de acuerdo a Jablonski et. al presentan riesgo para la salud pública, ya que cada 20 min se va duplicando la población de S. aureus toxigénico llegando así en un tiempo corto a representando números de UFC potencialmente riesgosas que pueden causar intoxicación alimentaria. Por lo que el alimento no se debe de consumir.
Análisis de Resultados En las cajas Petri con Agar Baird Parker, dónde se inoculo por extensión en superficpie 0.1 mL de cada dilución, NO se encontró desarrollo de Staphylococcus aureus, esto lo vemos en la imagen reportada en resultados, donde podemos ver que no hay desarrollo, ni características que demuestren la presencia del microorganismo, los puntos que se ven en la imagen corresponde a otra especie de estafilococos, se propone que son porque está especie de Staphylococcus epidermidis estafilococos también se desarrolla en este medio, las características de crecimiento corresponden a estas colonias, ya que eran colonias negras, tamaño irregular, con zona opaca alrededor de la colonia sin la zona clara alrededor, que es la que caracteriza a S. aureus y no podría ser algún otro género de microorganismo debido a que el medio Baird Parker es un medio de alta especificidad diagnóstica, selectivo y diferencial para el aislamiento y recuento de estafilococos coagulasa positiva en alimentos, el cloruro de litio y el telurito potásico suprimen el crecimiento de microorganismos no deseados inhibiendo el desarrollo de ellos.
Con esto podemos decir que la única contaminación que encontramos presente en nuestro alimento analizado (fresas con crema) son S. epidermidis los cuales se encuentran en la piel humana, llegando a nuestra muestra por un mal lavado de manos previo a la preparación de estas o a una contaminación cruzada durante la elaboración del producto. Análisis de resultados del control Mediante una colonia característica del Agar Baird Parker del control pudimos realizar una tinción en la que confirmamos que se tenía la presencia de un microorganismo gram (+), al ser vistas de manera macroscópica pudimos observar las características similares que corresponden a Sthaphylococcus aureus como color negro, brillosas, halo blanco alrededor de la colonia. Se hizo el conteo de las colonias y detectamos 58 UFC en la caja Petri por lo que se prosiguió a caracterizar 5 colonias sospechosas con pruebas bioquímicas, en las cuales sólo 3 de las 5 colonias dieron positivo en todas las pruebas. La prueba de la coagulasa nos es de gran utilidad para detectar a S.aureus, el resultado positivo indica que la muestra contiene al microorganismo, la coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre formando un complejo llamado estafilotrombina, permitiendo que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina esto permite que la sangre coagule. La coagulasa se relaciona con la superficie de S. aureus porque puede cubrir su superficie con fibrina al tener contacto con sangre, está cubierta de fibrina es capaz de resistir la fagocitosis, haciendo de S. aureus un microorganismo de mayor virulencia. La prueba de DNasa se utiliza principalmente para determinar a los estafilococos denominados patógenos potenciales. La desoxirribonucleasa de S. aureus difiere de otras DNasas en que requiere calcio como un catión activador (cofactor), tiene un pH óptimo más alto casi de 9 degradando el DNA ampliamente, presenta termoestabilidad alta resistiendo la ebullición (100°C) durante 15 min, obteniendo nucleasa termoestable, siendo así un indicador de S. aureus en la literatura se presenta como una propiedad constante en este microorganismo, ya que ninguna otra especie de estafilococos la presenta. La prueba del Manitol en anaerobiosis es para detectar a S. aureus ya que fermentan lentamente a los carbohidratos, como el manitol. La prueba resulto positiva en el medio que contenía el indicador rojo de fenol, virando a color amarillo, indicándonos la capacidad de S.
aureus de fermentar el manitol degradándolo hasta ácido sin
producción de gas; la prueba se lleva bajo condiciones de anaerobiosos debido a que S. aureus tiene un metabolismo anaerobio facultativo. La prueba de la catalasa nos dio positiva en algunas de las colonias caracterizadas indicándonos así que si contienen la enzima catalasa, la cual le es de gran utilidad a S. aureus para evitar la formación de radicales tóxicos que se forman por el sistema de la mieloperoxidasa en las células fagocíticas, evadiendo así los mecanismos de defensa en el huésped, subsistiendo y multiplicándose dentro del mismo.
Conclusiones Las Fresas con crema que analizamos para detectar Staphylococcus aureus, muestran ser casi seguras al consumo humano, de acuerdo a la NORMA Oficial Mexicana NOM-243SSA1-2010, Productos y servicios. Leche, fórmula láctea, producto lácteo combinado y derivados lácteos. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Donde se nos reporta lo siguiente para Staphylococcus aureus en cremas, un ingrediente principal para la elaboración de nuestro alimento. <100 UFC/g o mL
Mantequilla, cremas, leche condensada azucarada, leche fermentada o acidificada, dulces a base de leche. Quesos madurados y quesos procesados
Lo cual cumplió nuestro alimento ya que no encontramos colonias características de S. aureus durante el aislamiento selectivo. Para las fresas que se usan no encontramos reportado la cantidad permitida en UFC/g o mL de Staphylococcus aureus en la NMX-F131-1982. ALIMENTOS PARA HUMANOS. FRUTAS Y DERIVADOS. MERMELADA DE FRESA.
Al no tener desarrollo de este microorganismo desde la primera etapa del método que consiste en un aislamiento selectivo; podemos decir que este producto al ser elaborado cumple con las buenas prácticas de Higiene, reportándolo sólo con la sensibilidad mínima del método de 100UFC/g valor estimado de fresas con
crema, cumple con las normas antes mencionadas lo que lo hace un alimento seguro para ser consumido.
Bibliografía
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-115-SSA1-1994, Bienes y servicios. Métodos para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos. NMX-F-131-1982.
ALIMENTOS
PARA
HUMANOS.
FRUTAS
Y
DERIVADOS. MERMELADA DE FRESA.
NORMA Oficial Mexicana NOM-243-SSA1-2010, Productos y servicios. Leche, fórmula láctea, producto lácteo combinado y derivados lácteos. Disposiciones y especificaciones sanitarias.
