Práctica 1. Enzimas: Catalasa y alfa-amilasa Enzimas: Catalasa y alfa-amilasa Objetivo General. General. Que el alumno conozca, comprenda y pueda observa y valorar la acción de las enzimas en los alimentos y pueda comprender cada uno de los conceptos relacionados con las enzimas como son la catalasa y alfa amilas amilasa a en las práctica prácticas s a realiz realizar ar en diferen diferentes tes aliment alimentos os y le permita permita al alumno alumno compre comprende nderr el proce proceso so para para poder poder aplic aplicarl arlo o en la aduis aduisici ición ón de conocimientos básicos básicos y en los procesos industriales e investi!ación investi!ación Objetivos particulares. 1. "bse "bserv rvar ar la prese presenc ncia ia de la enzima enzima cata catala lasa sa en te#id te#idos os anim animal ales es y ve!etales. $. Comp Compro roba barr la acci acción ón de la temp temper erat atur ura a sobr sobre e la acti activi vida dad d de las las enzimas. %. Comprobar Comprobar la acción acción &idrol'tica &idrol'tica de de la amilasa amilasa en los los alimentos alimentos.
(as enzima enzimas s son prote' prote'nas nas ue ue sirve sirven n como como catal cataliza izador dores. es. Ellas Ellas son son las encar!adas de re!ular la catálisis, incrementando o disminuyendo la velocidad de las reacciones u'micas. )na enzima act*a sobre un sustrato espec'fico, son sustancias ue participan sin consumirse durante la reacción, son vitales para el funcionamie funcionamiento nto del cuerpo cuerpo en la di!estión, di!estión, ellas son son las ue &acen &acen posible los los procesos procesos ue ue normalmente normalmente podr'an no no ocurrir solo a temperaturas altas. (as enzimas son prote'nas ue traba#an a!rupadas con otros componentes noprote'nicos llamados coenzimas. (os cofactores pueden ser: +rupo +rupos s or!áni or!ánicos cos ue están están perman permanent enteme emente nte unido unidos s a la enzima enzima !rupo !rupo prosttico, Cationes, iones metálicos car!ados positivamente activadores, los cuales se unen temporalmente al sitio activo de la enzima dando una intensa car!a positiva a la prote'na de la enzima, una molcula or!ánica, !eneralmente vitaminas o proveniente de vitaminas coenzimas, los cuales no permanecen unidos a la molcula de de la enzima, enzima, pero se se combina con el comple#o enzimaenzimasustrato temporalmente. En las reacciones u'micas las sustancias conocidas como reactivos act*an con otros para formar nuevas sustancias, llamadas productos. (a ener!'a es un componente muy importante en la reacción u'mica, por ue sirven como un almacn de ener!'a, y reuieren de una ener!'a de activación para llevarse a cabo. /uc&os de los procesos ue se llevan a cabo en el cuerpo &umano normal normalmen mente te reuie reuieren ren temper temperatu aturas ras muy altas, altas, temper temperatu aturas ras ue no son sostenibles para la vida &umana. (as prote'nas enzimáticas son !eneralmente !lobulares. (os enlaces intra e intermoleculares ue mantienen a las estructuras secundarias y terciarias son modificadas o desnaturalizadas por la temperatura y cambios por el p0. Este
efecto cambia la forma y la actividad del sitio catal'tico de una enzima, los cuales son muy sensibles al p0 y la temperatura. La catalasa es una enzima com*n encontrada en los or!anismos vivos, donde funcionan como catalizadores en las reacciones de descomposición del peróido de &idró!eno 0$"$ en a!ua y o'!eno. (a catalasa tiene uno de los recambios más altos de todas las enzimas. )na molcula de catalasa podr'a convertir millones de molculas de peroido de &idró!eno a a!ua y oi!eno por se!undos. (a catalasa es un tetramero de cuatro cadenas polipeptidicas, cada una lar!a cadena con 233 aminoácidos, contiene cuatro !rupos &emo porfirinicos &ierro ue llevan a la enzima a reaccionar con el peroido de &idró!eno. El p0 óptimo para la catalasa es aproimadamente de 4, la temperatura varia por especie.
(a reacción de descomposición del peroido de &idró!eno $ 0$"$ 5 $ 0$" 6 "$ 0$"$ 6 7e888-E 5 0$" 6 "97e8-E.6 0$"$ 6 "97e8-E.6 5 0$" 6 7e888-E 6 "$ /aterial +radilla
Pipetas
>oluciones de 7e&lin! =y ? ?istur'
;
/ec&ero
>olución de lu!ol
?a@o /ar'a
=!ua oi!enada
=lmidón
Material biológico: los alumnos e caa e!uipo los proporcionan 0'!ado de pollo, cerdo ó res 7rutas y verduras, tomate, manzanas, peras, etc. (a catalasa es una enzima ue se encuentra en las clulas de los te#idos animales y ve!etales.
(a función de esta enzima en los te#idos es necesaria porue durante el metabolismo celular, se forma una molcula tóica ue es el peró"io e #irógeno$ %&O& a!ua oi!enada. Esta enzima, la catalasa, lo descompone en a!ua y o'!eno, por lo ue se soluciona problema.
(a reacción de la catalasa sobre el %&O&, es la si!uiente:
Aeacción =
(a eistencia de catalasa en los te#idos animales, se aprovec&a para utilizar el a!ua oi!enada como desinfectante cuando se ec&a sobre una &erida. Como muc&as de las bacterias pató!enas son anaerobias no pueden vivir con o'!eno, mueren con el desprendimiento de o'!eno ue se produce cuando la catalasa de los te#idos act*a sobre el a!ua oi!enada
CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES La catalasa (peróxido de hidrógeno: peróxido de hidrógeno oxidorreductasa, EC 1111!" es una de las en#i$as $%s a&undantes en la naturale#a ' se encuentra a$plia$ente distri&uida en el organis$o hu$ano, aunue su acti)idad )ar*a en dependencia del te+ido -sta resulta $%s ele)ada en el h*gado ' los ri.ones, $%s &a+a en el te+ido conecti)o ' los epitelios, ' pr%ctica$ente nula en el te+ido ner)ioso A ni)el celular se locali#a en las $itocondrias ' los peroxiso$as, excepto en los eritrocitos, donde se encuentra en el citosol/ Esta en#i$a es una $etaloprote*na tetra$-rica, cu'o peso $olecular se encuentra en el rango de /10/20 34 Consta de 5 su&unidades id-nticas ue se $antienen unidas por interacciones no co)alentes Cada su&unidad contiene un grupo prost-tico de protopor6irina I7 ' el contenido protoh-$ico ' el de hierro representan un 1,1 8 ' 0,09 8 respecti)a$ente del peso $olecular total de la en#i$a En algunas especies la CAT contiene $ol-culas de nicotina$*n aden*n dinucleótido 6os6atado en su 6or$a reducida (;A4<=" ligadas estrecha$ente a la en#i$a as* se ha de$ostrado ue la CAT hu$ana ' la de res est%n ligadas a 5 $ol-culas de ;A4<=, 1 en cada su&unidad ' ue no existe interacción directa entre el grupo he$o ' el ;A4<= 5 En la 6igura aparece la representación de una su&unidad de la en#i$a El ;A4<= unido a la en#i$a no est% in)olucrado en su acti)idad catal*tica o peroxidati)a Esta $ol-cula puede inter)enir en la pre)ención ' re)ersión parcial de la inacti)ación de la CAT por su propio sustrato tóxico ' esta&ili#a a la en#i$a por tener un e6ecto alost-rico so&re su con6or$ación Ade$%s, la CAT constitu'e un reser)orio de ;A4<=, lo cual +uega un i$portante papel durante el estr-s oxidati)o >U;CI?; E;@IATICA La CAT co$o parte del siste$a antioxidante est% in)olucrada en la destrucción del = /?/ generado durante el $eta&olis$o celular Esta en#i$a se caracteri#a por su alta capacidad de reacción pero relati)a$ente poca a6inidad por el sustrato
5
sustrato donador CAT
/=/? B R
La reacción general entra.a la reducción del sustrato to$ando los %to$os de hidrógeno aportados por el donador, ' los productos 6inales ser*an el sustrato reducido ' el donador oxidado En la 6unción catal*tica, el donador es otra $ol-cula de = /?/ Esta 6unción sólo puede ser reali#ada por la en#i$a en su 6or$a tetra$-rica! =/?/ B =/?/
5 /=/? B B?/
En la reacción peroxidati)a la en#i$a puede utili#ar co$o donadores de hidrógeno al $etanol, etanol, %cido 6ór$ico, 6enol ' 6or$aldeh*do Esta 6unción se puede reali#ar con $onó$eros, d*$eros ' tetr%$eros ! La acti)idad de la CAT puede ser inhi&ida por el cianuro, la a#ida, el sul6uro, la hidroxila$ina, el paraceta$ol, la &leo$icina, la adria$icina, la &en#idina ' el parauat
/ateriales y /todos En esta práctica vamos a demostrar la eistencia de la catalasa en cada una de las muestras. 1. Colocar en un tubo de ensayo unos trocitos de &'!ado. $. =@adir 2 mililitros de a!ua oi!enada. >e observará un intenso burbu#eo debido al desprendimiento de o'!eno. 7i!ura 1 "bserva la reacción ' >igura 1
Besnaturalización de la catalasa /ediante esta eperiencia, vamos a ver una propiedad fundamental de prote'nas, ue es la desnaturalización. a ue la catalasa u'micamente es una prote'na, podemos desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Puedes recordarlo en la práctica de prote'nas. =l perder la estructura terciaria, perderá tambin la función y como consecuencia su función catal'tica, por lo ue no podrá descomponer el a!ua oi!enada y no se observará nin!*n tipo de reacción cuando &a!amos la eperiencia anterior con muestras de te#idos &ervidos.
1. Colocar en un tubo de ensayo varios trocitos de &'!ado. $. =@adir a!ua para &ervir la muestra. 0ervir durante unos minutos. %. Bespus de este tiempo, retirar el a!ua sobrante. D. =@adir el a!ua oi!enada. D "bservar el resultado. 7i!ura $
>igura /
Cuestionario
1. En u alimentos se encuentra la enzima catalasaF $. En u forma se encuentra la catalasa en cada unos de los alimentos en los ue se encuentra en mayor cantidadF % En ue unidades se reportanF D. Cual es la temperatura optima de la catalasaF ;. Cual es el p0 optimo de la catalasaF 4. = u temperatura se desnaturaliza la catalasaF G. En ue alimentos se encuentran en mayor cantidad y como se encuentranF
'milasa (a amilasa, denominada tambin ptialina o tialina, es un enzima &idrolasa ue tiene la función de di!erir el !lucó!eno y el almidón para formar az*cares simples, se produce principalmente en las !lándulas salivares sobre todo en las !lándulas parótidas y en el páncreas.
alternativos:
1,D-I-B-!lucano-!lucano&idrolasaJ
(as I-amilasas son enzimas dependientes de cloruro, completamente afuncionales en ausencia de iones de cloruro. =ct*an a lo lar!o de cualuier punto de la cadena de los carbo&idratos, descomponindolos en maltotriosa y maltosa desde la amilosa o maltosa, !lucosa y detrina desde la amilopectina. Bado ue puede actuar en cualuier punto de la cadena es más rápida ue la
K-amylasa. En los animales es una enzima di!estiva mayor y su p0 óptimo está entre ;.4 y 4.3. En fisiolo!'a &umana tanto la procedente de la saliva como la pancreática son I-=milasas. Puede encontrarse en al!unas plantas, &on!os y bacterias. %irólisis el almión er la actividad de la enzima, la amilasa o ptialina, presente en la saliva. Esta enzima act*a sobre el polisacárido almidón, &idrolizando el enlace "!licos'dico, por lo ue el almidón se terminará por transformar en unidades de !lucosa. Es importante ue recuerdes las reacciones caracter'sticas de !l*cidos para comprender la práctica. (as reacciones ue nos sirven para identificar polisacáridos almidón y las ue nos permiten identificar monosacáridos !lucosa. /todo
1
igura
>igura
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En el tu&o 1, ha# la Reacción de >ehling >igura 5 En el tu&o /, reali#a la Reacción de Lugol >igura D
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Los resultados
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>igura D
son los esperados para un polisac%rido co$o el al$idón •
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>igura 5
(os tubos % y D ue contienen el almidón, al ue le &emos ec&ado la saliva, ponerlos en un vaso de precipitados al ba@o /ar'a, controlando la temperatura del a!ua para ue no &ierva, ya ue lo ue intentamos, es ue la enzima de la saliva traba#e a unos %4: C. Be#arlo unos 12 minutos 7i!ura ; . = continuación realizar las si!uientes reacciones: En el tubo n*mero %, realizar la Aeacción de 7e&lin!. 7i!ura 4. En el tubo n*mero D, realizar la Prueba del (u!ol. 7i!ura G El resultado positivo obtenido en el tubo de ensayo %, nos dice ue no &ay ya almidón, porue la amilasa de la saliva &a &idrolizado el almidón transformándolo en !lucosa, por eso la reacción de 7e&lin! es a&ora positiva. Be una manera similar, podemos interpretar el resultado del tubo de ensayo D, a&ora nos da la reacción de polisacáridos ne!ativa, ya ue el almidón polisacárido se &a &idrolizado.
>igura
>igura 2
>igura !
Cuestionario Be ue manera act*a la catalasaF y por u libera o'!enoF (a catalasa de las muestras están en las mismas concentracionesF Cual es la diferencia entre las catalasas animales y ve!etales de las muestras ue traba#aronF
Cuales es la reacción de la alfa amilasa sobre los componentes de los materiales empleadosF Es una enzima espec'fica para almidonesF Que tipo de polimeros contienen las muestras ue traba#aronF
Que tipo de azucares tienen estas muestrasF =r!umente sus conclusiones de las prácticas
?iblio!raf'a
Estructura y mecanismos de las enzimas •
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>ersht, A Structure and echanis$ in olding F = >ree$an, 1992 ISG; 01!/!22 Falsh, C, En#'$atic Reaction echanis$s F = >ree$an and Co$pan' 199 ISG; 01!0000
Cinética e inhibición •
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Athel CornishGoMden, Fundamentals of Enzyme Kinetics (rd edition",
Función y control de las enzimas en las células •
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unda$entals o6 En#'$olog': Cell and olecular Giolog' o6 Catal'tic
Convenciones para asignar nombres a enzimas •
En#'$e ;o$enclature, Reco$$endations 6or en#'$e na$es 6ro$ the ;o$enclature Co$$ittee o6 the International Union o6 Gioche$istr' and olecular Giolog'
Aplicaciones industriales •
=istor' o6 industrial en#'$es, art*culo en ingl-s so&re la historia de las en#i$as industriales, entre 6inales del siglo 77 ' el presente
