TÉCNICAS DE SIEMBRA, TINCIÓN Y RECUENTO DE HONGOS Y BACTERIAS Angie Benavides a, Nicolás Gómez a, Juan Camilo Montaño a a
Departamento de Ingeniería Bioquímica, Universidad Icesi, Cali, Colombia
RESUMEN En todo lo que nos rodea podemos encontrar microorganismos, estos pueden ser tan pequeños que simplemente no son visibles a ojo humano, pero aportan a que organismos de mayor tamaño continúen con su existencia, ya que hacen posible que se cumplen diversas funciones esenciales permitiendo que se desarrolle la vida. Gracias a esto, es importante que podamos interpretar los resultados de las diferentes morfologías, agrupaciones y métodos más comunes para diferenciar entre bacterias y hongos. Las diferentes morfologías y agrupaciones que posee cada microorganismo es una de las rutas utilizadas para este fin, además uno de los métodos que más se utilizan es la tinción de Gram, es empleada para entender la estructura de los microorganismos, con eso se puede dar una idea del tipo de microorganismo que es, un ejemplo de esto E. coli el el cual presenta una tinción Gram negativa mientras que Bacillus sp presenta una Gram positiva. PALABRAS CLAVES: Recuento, microorganismos, aislamientos, medio de cultivo INTRODUCCIÓN Conocer la estructura y composición de un determinado microorganismo es de vital importancia dado que al estar presente en nuestro ecosistema deberemos saber cómo se relaciona con el hombre o como pueda tener un uso a nivel industrial. Muchos de estos microorganismos han podido ser utilizados por el ser humanos en diferentes industrias para lograr generar productos de interés. Estos pueden ser para la fermentación en la industria cervecera, vacunas que pueden significar el avance en medicina, elaboración de alimentos, industria textil, entre otras (Cifuentes & Espinosa, 2008). Aunque existan diferentes medios de cultivo, podemos agruparlos según su estado físico, en sólidos, líquidos y semisólidos, pero también según su utilización. En práctica para hacer un aislamiento ai slamiento de un cultivo de hongos es posible utilizar el agar Rosa Bengala o el Sabouraud, esto es posible ya que estos solo permiten el crecimiento de hongos y esporas debido a que poseen cloranfenicol, un pH neutro y altas concentraciones de glucosa glucosa (INSTRUCCIONES DE USO - Medios Medios en placa listos para usar, 2013). Mientras que, para realizar cultivos de bacterias es posible utilizar agares como lo son: MRS, MacConkey, Casoy, XLD, Almidón, Cetrimide y Leche. El agar MRS, el agar Casoy es un medio enriquecido debido a que además de tener sustancias indispensables para el crecimiento del microorganismo, el agar MacConkey es por su parte, un inhibidor, ya que inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas pero no el inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas, el medio XLD, el Cetrimide y el XLD son medios selectivos porque permiten el crecimiento crecimiento de colonias de una población polimicrobiana. Por último el agar de leche es un medio de cultivo enriquecido. Las bacterias pueden clasificarse en Gram positivas o en Gram negativas dependiendo de la composición de su pared celular. Las Gram negativas poseen una capa delgada de péptido glucano
y una membrana externa, mientras que las Gram positivas poseen una capa gruesa de péptido glucano y carecen de membrana externa. La tinción de Gram es una técnica diferencial que permite hacer la clasificación descrita anteriormente, para ello, la muestra es puesta en contacto con cristal violeta, el cual tiene afinidad con el péptido glucano y tiñe la pared de color morado, después se adiciona lugol para formar un complejo cristal violeta-yodo y así evitar la salida del cristal violeta. Posteriormente se añade una mezcla alcohol-acetona la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra sus poros. Las bacterias Gram positivas retienen el complejo cristal violeta-yodo debido a que presentan en mayor proporción péptido glucano, mientras que las bacterias Gram negativas se decoloran al no poseer gran cantidad de esta estructura. Finalmente, se añade safranina, el cual es un colorante secundario, que tiñe de rosado las bacterias que se decoloraron previamente (Gram negativas). Por medio de esta práctica se busca reconocer las diferencias macroscópicas y microscópicas de las bacterias y hongos. Para lo anterior es necesario conocer las diferentes técnicas de siembra y aislamiento de estos microorganismos, utilizando cultivos enriquecidos, selectivos y diferenciales para dicho fin. MATERIALES Y MÉTODOS 1.1)
Materiales: Para llevar cabo la siembra de las bacterias Staphylococcus aureus , E. coli, Klebsiella pneumoniae, Bacillus subtilis se utilizaron los agares Casoy, XLD, MacConkey, MRS, Leche, Almidón, Cetrimide. Para la siembra por estrías se utilizó 90ml de caldo Casoy esteril y una muestra de agua. Para realizar las fijaciones se utilizaron diferentes láminas, mechero y para su tinción su utilizó el kit de tinción de Gram, Para las diluciones se utilizó una micro pipeta de 1000μL y tubos de ensayo de 16x150. Finalmente, para realizar la
caracterización y observar los detalles es preciso contar con un microscopio. 1.1.1) Técnica de sedimentación: Se marcaron las cajas de los agares Casoy, MacConkey y MRS con los nombres de los diferentes lugares en los cuales se dejarían abiertos durante 30 min, transcurrido este tiempo, se incubo a una temperatura de 35°C ± 2°C durante 48 horas. 1.1.2) Recuento: Al pasar las 48 horas realizar el conteo de colonias obtenidas en los diferentes medios, realizando además una observación macroscópica de estas, reportando el número de colonias en UFC/30 min 1.1.3) Siembra por estrías en superficie: adicionar la muestra de agua en 90mL caldo de Casoy estéril, incubar durante 30 min. Transcurrido este tiempo, sembrar por agotamiento en los diferentes medios. Posteriormente, volver a incubar a 35°C ± 2°C durante 48 horas y realizar la descripción de las colonias obtenidas. 1.1.4) Métodos de tinción: Tinción de Gram Se deben marcar las diferentes láminas con los nombres de los microorganismos, adicionar una gota de agua destilada a la lámina portaobjetos y con un asa desechable tomar una pequeña porción de la muestra del cultivo y homogenizarla con el agua destilada de la lámina. Seguido a esto, dejar secar empleando un mechero, adicionar 10 gotas de cristal violeta sobre la homogenización y dejar
actuar durante 1 min, retirar el exceso de colorante con agua destilada y agregar 10 gotas de Lugol sobre la homogenización, dejar actuar esperando por 1 min, después retirar el exceso nuevamente con agua destilada, a continuación, adicionar 10 gotas de Alcohol acetona y dejar actuar durante 30seg retirando el exceso posteriormente con agua destilada. Finalmente, adicionar 10 gotas de Fucsina sobre la lámina y dejar actuar durante 1 min, retirando con agua destilada, fijar la muestra a la lámina para obsérvala con un microscopio y detallar sus características. 1.2)
Materiales: Para llevar cabo la siembra de hongos en las muestras de cascara de naranja, agua residual, hojas y manos se utilizaron los agares de Sabouraud con cloranfenicol y Rosa de Bengala. 1.2.1) Técnica de sedimentación: Se marcaron las cajas de los agares Sabouraud con Cloranfenicol y Agar Rosa de Bengala con los nombres de los diferentes lugares en los cuales se dejarían abiertos durante 30 min, transcurrido este tiempo, se incubo a una temperatura de 35°C ± 2°C desde 48 horas a 5 días. 1.2.2) Recuento: Al pasar las 48 horas realizar el conteo de colonias obtenidas en los diferentes medios, realizando además una observación macroscópica de estas, reportando el número de colonias en UFC/30 min 1.2.3) Técnica de dilución: adicionar la muestra de agua en 90mL de agua peptonada 0,1%(p/v) estéril, agitar y realiza diluciones 1/10 hasta tener una dilución de 10 -5. 1.2.4) Siembra en superficie: Marcar las cajas Petri, tomar 0,1 ml de cada dilución y realizar la siembra en cada agar, después de esto incubar a 28°C ± 2°C desde 48 horas a 5 días. 1.2.5) Recuento: Pasado este tiempo, observar las diferentes siembras y seleccionar las que tengan un rango de colonias entre 25-250, reportar el número de colonias en UFC/gmL. 1.2.6) Recuento en cámara de Nuebauer: Con la ayuda de un capilar rellenar la cámara y hacer el conteo de las células que se encuentren en los cinco cuadrantes principales, después calcular el número de células. 1.2.7) Siembra por estrías en superficie: Realizar siembra masiva en ¼ de la caja agar de Sabouraud y Rosa de Bengala, relizar siembra por agotamiento. Posteriormente, volver a incubar a 35°C ± 2°C durante 48 horas y realizar la descripción de las colonias obtenidas. 1.2.8) Caracterización Microscópica de Mohos: Con ayudad de una cinta, tomar una muestra ejerciendo presión sobre el cultivo, luego presionarla contra una lámina previamente con azul de lactofenol en su superficie, realizar la descripción microscópica de los cultivos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Para la técnica de sedimentación se emplearon tres medios de cultivo y se dejaron expuestos al medio ambiente durante 30 minutos dentro de un carro. Los resultados obtenidos en cada agar, es decir, las características macroscópicas de las colonias, se describen a continuación en la Tabla 1 . Tabla 1. Descripción de las colonias de bacterias formadas en la técnica de sedimentación. Sitio de exposición Carro Agar Casoy Agar MacConkey Agar MRS Se observa crecimiento de 4 No se observa crecimiento Se observa crecimiento de cinco colonias. Una de ellas es de de microorganismos en colonias, tres de ellas con forma forma filamentosa y de gran este medio de cultivo circular, de color blancotamaño, mientras que las otras amarillento y con bordes tres tienen forma circular con completos. Las otras dos colonias bordes bien definidos presentan un color amarillo en el (completos). De estas últimas, centro y un color más claro en los dos presentan un color blanco bordes. y la otra un color amarillo. En el agar casoy se obtuvieron 4 colonias/30 min de exposición en el interior del carro, en el MacConkey no se observó formación de colonias y por último, en el agar MRS se obtuvieron 5 colonias/30 min de exposición en el interior del carro. El análisis de estos resultados se presenta más adelante, junto con los resultados de la técnica 2. Para la segunda técnica de siembra y aislamiento, se extrajo una muestra de agua de un lago cerca de la universidad y se realizó posteriormente un sembrado por estrías en superficie en siete medios de cultivo distintos. Las características macroscópicas de las colonias de bacterias que crecieron en dichos medios se presentan en la Tabla 2. Tabla 2. Descripción de las colonias de bacterias formadas en la técnica de aislamiento en medios selectivos. Nombre de la muestra Agua de lago Agar MRS Agar MacConkey Agar Casoy Agar XLD Se observan muy Se observan tres En este agar se observan No se observa pocas colonias, tres en colonias pequeñas de más colonias, alrededor crecimiento total. Todas son de un color rosado en el de 8, sin embargo la de ninguna forma circular, con centro y sus bordes un mayoría tiene forma colonia bordes completos y de poco blancos. Todas irregular, las otras son color blanco cremoso. son de forma circular y circulares. Algunas tienen Dos de ellas son más con bordes completos. bordes completos y otras, grandes. ondulados. Agar Almidón Agar Cetrimide Agar Leche Se observa gran cantidad de Se observan unas cuantas En este agar se observaron colonias colonias, principalmente de colonias de color amarillo, grandes de forma irregular y de forma irregular, de color de forma circular y con color blanco, con bordes lobulados. blanco, algunas con bordes bordes completos. No También se evidenció una colonia ondulados y otros presentan fluorescencia al de color amarillo y de forma lobulados. Se ven unas exponerlas a luz UV. rizoide, con bordes filamentosos.
cuantas de forma circular con bordes enteros. En lo reportado por Benavides (2007), el agar MacConkey posee sales biliares y cristal violeta, los cuales inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas en el medio, y al tener lactosa en su composición, está diseñado para distinguir entre las enterobacterias (bacterias Gram negativas) capaces de fermentar la lactosa de las que no tienen esta capacidad, bacterias Lac+ y bacterias Lac-, respectivamente. Las bacterias Lac+ se caracterizan por formar colonias rosadas en este medio, debido a que producen ácidos y disminuyen el pH de este, identificándolas con el rojo neutro (componente del agar). Mientras que las bacterias Lac-, usaran la peptona del medio para convertirla en amoniaco, incrementando su pH y produciendo colonias de color blanco. En la técnica de siembra por sedimentación, no se evidenció crecimiento de colonias en este medio, lo cual era lo esperado por ser una muestra del interior de un carro, puesto que este agar es selectivo para bacterias que están presentes en los intestinos de seres vivos, en heces, en suelo, plantas, y en algunos medios acuáticos. Por otro lado, en la técnica de siembra por estrías en superficie, se encontraron tres colonias pequeñas de color rosa, lo que indica la presencia de bacterias Lac +, posiblemente de los géneros Escherichia, Klebsiella, Citrobacter y Enterobacter (coliformes), que están presentes, como ya se mencionó, en ambientes húmedos y heces. El agar XLD (xilosa, lisina, desoxicolato) es un medio de cultivo empleado para el aislamiento de los géneros Salmonella y Shigella, las cuales forman colonias de color negro y de color rojo, respectivamente, y si hay presencia de coliformes, estos formaran colonias de color amarillo (ZajcSatler & Gragas, 1977). Nye et al (2002) reportaron en su estudio que el agar XLD fue uno de los menos eficientes para aislar Salmonella sp, frente a otros medios de cultivo, como el agar DCA y el agar MLCB. En este estudio
no se encontró ningún tipo de colonia en el agar XLD, lo que quiere decir que posiblemente no estaba presente este microorganismo en la muestra o que se encontraba en muy pequeñas cantidades. Tampoco se evidenciaron coliformes, puesto que este medio es más selectivo para las dos especies ya mencionadas, y además, como se observó en el agar MacConkey (selectivo para coliformes) había muy poca presencia de estos microorganismos. El agar almidón permite el aislamiento de microorganismos amilolíticos, es decir, productores de amilasas, las cuales degradan el almidón en sus componentes simples. Después de que se produzca el crecimiento de las colonias se agregan unas gotas de lugol al medio para identificar la presencia de dichos microorganismos. Este reactivo interacciona con el almidón, tiñendo sus moléculas de azul-café. Las colonias amilolíticas presentarán un halo alrededor de ellas, indicando en que sitios se consumió el almidón. En este estudio, se identificaron varias colonias de estas bacterias amilolíticas, que según Buitrago et al (2014), puede tratarse de géneros como Bacillus, Pseudomonas, Aeromonas, Acinetobacter y Streptomyces, encontrados en sus aislamientos realizados hace algunos años en humedales de Bogotá.
El agar de cetrimide se emplea para el aislamiento de Pseudomonas aeruginosa , puesto que es un medio de cultivo selectivo para esta especie. Esto se da porque los compuestos de amonio cuaternario presentes en el medio, poseen propiedades antimicrobianas, inhibiendo el crecimiento de bacterias, e incluso el de otras especies de Pseudomonas. Sin embargo, P. aeruginosa es resistente a estos compuestos. Además, esta especie produce fluorosceína, lo que la hace fácil de identificar bajo luz ultravioleta, y es la única conocida que produce un pigmento llamado piocianina, de color verdoso (Brown & Lowbury, 1965). En el estudio de Brown & Lowbury (1965) se emplearon dos variaciones del agar cetrimide para realizar aislamientos de esta especie y determinar cuál de los dos era más productivo. En ambos agares se encontró un buen crecimiento, y solo varió en la cantidad producida de cada pigmento. Por el contrario, en el presente estudio, se encontraron colonias amarillas en el agar de cetrimide, las cuales no mostraban fluorescencia bajo luz UV, indicándonos, estas dos características, que no se trataba de colonias de P. aeruginosa. Claramente, la muestra contenía otros microorganismos diferentes a esta especie y posiblemente el medio de cultivo no tenía la suficiente concentración de compuestos de amonio cuaternario que inhibieran estos otros géneros de bacterias. El agar leche permite aislar microorganismos con capacidad de hidrolizar proteínas, es decir que son productores de proteasas. Este agar, al estar compuesto de leche, posee la proteína principal de dicha sustancia, la Caseína, la cual le da su color blanco característico. Cuando esta proteína es hidrolizada y consumida por las bacterias que producen tales enzimas, el agar leche pierde su color y se evidencia un halo alrededor de las colonias de estas bacterias (Benavides, 2007). En la presente práctica no se evidenció tal halo alrededor de las colonias formadas en el medio de cultivo, indicando que estos microorganismos posiblemente no son productores de proteasas, sin embargo, al ser un medio enriquecido, se da el crecimiento de otro tipo de microorganismos. El agar MRS es un medio de cultivo selectivo para bacterias acido lácticas, especialmente del género Lactobacillus. Esta selectividad se da por la acción de uno de sus componentes, el citrato de amonio, el cual fomenta el crecimiento de especies del género Lactobacillus, mientras que inhibe el crecimiento de otros microorganismos (de Man, Rogosa, & Sharpe, 1960). En la técnica de siembra por sedimentación se evidenciaron unas cuantas colonias de color blanco, lo que indica que posiblemente hay presencia de Lactobacillus sp en el interior del carro. Estos microorganismos están presentes en el tracto gastrointestinal de animales, en suelos, agua, productos lácteos, plantas y heces. La presencia de estos microorganismos en este ambiente puede ser debida a contaminación del mismo, por medio de las diferentes personas que utilizan el carro. En la segunda técnica de siembra, por estrías en superficie, se evidenciaron tres colonias pequeñas en el medio de cultivo, lo que nos indica que en la muestra de agua hay presencia de este género de bacterias ácido lácticas, que como ya se mencionó, están presentes en suelos y ambientes acuáticos. En otro procedimiento, se evaluaron algunas características, macroscópicas y microscópicas, de los microorganismos proporcionados por el profesor. En la Tabla 3, se registra la morfología de las colonias y la clasificación de las diferentes bacterias de acuerdo a la composición de su pared celular, realizando para ello, la tinción de Gram; Las bacterias que presentaron una tinción rosada fueron E.
coli y Klebsiella, evidenciando así, que son bacterias Gram negativas. Por el contrario, Bacillus y S. aureus presentaron una tinción morada, por lo tanto, son bacterias Gram positivas
Tabla 3. Características macroscópicas y microscópicas de aislamientos de microorganismos provistos por el profesor. Microorganismo Morfología de las colonias Tinción de gram Agar XLD: colonias amarillas, circulares y planas Agar casoy: colonias blancas Bacilos gram negativos Escherichia coli Agar MacConkey: colonias anaranjadas En los tres agares, casoy, almidón y leche, las colonias Bacilos gram positivos Bacillus presentaron forma circular y color blanco No se puede diferenciar las Bacilos gram negativos Klebsiella colonias No se puede diferenciar las Cocos gram positivos Staphylococcus aureus colonias agrupados en racimos Estos microorganismos evaluados son patógenos, por lo que es de gran interés conocer la composición de su pared celular y otras estructuras externas, las cuales les dan soporte e integridad a la bacteria. Es decir, si conocemos el tipo de pared celular podemos buscar un antibiótico específico que ataque los componentes de ella, ingrese a la célula y provoque finalmente la muerte del microorganismo. Así antibióticos como eritromicina, lincomicina y vancomicina atacan la pared de bacterias Gram positivas, mientras que estreptomicina, gentamicina y norfloxacina atacan la pared de bacterias Gram negativas (Hernández, 2002). Por otra parte, el análisis de la morfología de colonias depende mucho de una buena técnica de aislamiento por estrías en superficie. Sin embargo, las muestras de S. aureus y klebsiella tuvieron una mala técnica de aislamiento y por ende no se pudieron diferenciar las colonias ni hacer una descripción morfológica de ellas; por el contrario, en las muestras de E. coli y Bacillus se pudo evidenciar claramente la morfología de las colonias. Esta morfología depende mucho del medio de cultivo, ya que en cada uno de ellos se presentan nutrientes específicos que hacen que las bacterias crezcan y modifiquen el agar de manera específica. Pasando ahora a la práctica de cultivos de hongos, se realizó una técnica similar, en donde se expusieron dos medios de cultivo (agar Sabouraud y agar Rosa-Bengala) durante 30 minutos en un ambiente interior, específicamente, la sala de una casa y cerca de plantas. En la Tabla 4 se registra la descripción macroscópica y microscópica de esta muestra. Este ambiente generó que crecieran diferentes hongos que forman parte de nuestro hogar y conviven con nosotros. Según la literatura, algunos de estos hongos son inofensivos, tales como Saccharomyces cerevisiae y los del género Penicillium, que a su vez tienen gran importancia industrial. S. cerevisiae es un levadura y se utiliza para la fabricación de pan, cerveza, vino, biocombustible, y productos farmacéuticos a base de glicerol (Tortora, Funke, & Case, 2007); Los
hongos del género Penicillium son usados en la industria farmacéutica para la producción de penicilina. Por otro lado, hay hongos que pueden causar alergias cuando están expuestos a ambientes húmedos como Alternaria, Cladosporium, Aspergillus, Helmin thosporium, Epicoccum, Fusarium y Mucor . Estos microrganismos son causantes de rinitis, secreción y congestión nasal, resecación de la piel y picazón en ojos, nariz y garganta (Centers for Disease Control and Prevention, 2003). Tabla 4. Descripción de las colonias de hongos formadas en la técnica de sedimentación Sitio de exposición Sala de la casa Agar Rosa de Bengala
Agar Sabouraud con Cloranfenicol
MICROSCOPIA
Se observa crecimiento de 2 colonias: una es pequeña, de forma circular y color anaranjado. La otra es de mayor tamaño, con forma y bordes filamentosos y es de color blanco.
Se observa crecimiento de ocho colonias, tres de ellas de color negro, forma circular y gran tamaño. Otras tres colonias presentan forma irregular, tamaño variado, de color amarillento y una pequeña porción de color rosado. Otra colonia presenta forma circular, color anaranjado y el centro negro. La última colonia tiene forma filamentosa, es de tamaño mediano y de color blanco.
- Mucorales: Hifas gruesas y aseptadas, esporangios - Alternaria: Hifas septadas dematiáceas, conidióforos septados de color café.
Al comparar la literatura de los hongos comunes en el hogar con los recogidos en el cultivo o agar, hubo similitud ya que, al realizar la prueba microscópica de estos, se obtuvieron microrganismos del género Alternaria, y Geotrichum la presencia de este hongo se puedo dar por la cercanía a tierra y material vegetal (plantas) (Tangarife, 2016). Además se observaron hongos de orden mucoral, y se podría decir que son del género Mucor ya que estos presentan Hifas gruesas, septadas y esporangios con esporangiosporas redondas, (Tangarife, 2016) estas características morfológicas fueron similares a las observadas al realizar la prueba microscópica; los microrganismos pertenecientes a este orden pueden causar enfermedades como mucormicosis a pacientes diabéticos e inmunocomprometidos y se puede encontrar en ambientes como el suelo, en materiales en descomposición, en el aire y pan, (Cabello, 2007) es por esto que es posible encontrarlos en ambientes interiores que poseen los recursos adecuados para su crecimiento. Tabla 5. Recuento de células en la suspensión de esporas y en la suspensión de levaduras de los grupos de laboratorio. Suspensión de Suspensión expresada Suspensión de Suspensión expresada esporas (células/ml) en log levaduras (células/ml) en log 7 3,9x10 7,59106 2,3x107 7,36172 4 5 1,4x10 4,14613 1,7x10 5,23044 6 6 1,8x10 6,25527 5,6x10 6,74818 6 6 5x10 6,69897 7,5x10 6,87506 8 7 7,3x10 8,86332 2,3x10 7,36172 1,3x108 8,11394 7,4x107 7,86923
3,6x106
6,55630
1x109
9
Promedio:
∑
(1)
X: Promedio x: conjunto de observaciones n: Número de observaciones -
Suspensión de Esporas = 6,8892 Suspensión de levaduras = 7,2
Desviación estándar:
√ − ∑=()2
(2)
S: desviación estándar X: Promedio x: conjunto de observaciones n: Número de observaciones -
Suspensión de Esporas = 1,5255 Suspensión de levaduras = 1,1495
Coeficiente de variación
∗100
(3)
CV: Coeficiente de variación S: desviación estándar X: Promedio -
Suspensión de Esporas = 22,14% Suspensión de levaduras = 15,96% Gracias a estos coeficientes de variación se puede concluir que los datos obtenidos del recuento en cámara de Nuebauer están dispersos en todo el grupo dado que el crecimiento se realizó en una forma masiva con lo cual se pudo interpretar utilizando el log en base 10. Estos datos no son aceptables dado que al tener un 22,14% en suspensión de esporas y un 15.96% en suspensión de levaduras, se puede decir que no es precisa.
Tabla 6. Descripción macroscópica y microscópica de las colonias muestras empleadas. Origen de la muestra Descripción macroscópica Agar SAB RB Estructura fibrosa Número variado sobre el agra de de colonias de color blanco, la color blanco que Hoja de árbol cual presente en parecen algodón el centro unas coloraciones oscuras Base como un Base como un algodón, algodón, pigmentación crecieron en Cascara de naranja amarilla con menor cantidad, colonias de un presentan color negro colonias de un color negro Estructura Estructura semejante al semejante al sarro, de color sarro, de color Manos blando con zonas blando pero con un poco más zonas más oscuras aglomeradas Dos colonias Una colonia de separas, de color color blanco, de blanco, se observa menor tamaño una estructura que las Agua residual como de un encontradas en el algodón agar SAB
de hongos formadas en las Descripción microscópica SAB RB Se observan filamentos tubulares, entrelazados y de color azul
conidios de color café, con hifas que presentan una división
NO SE REALIZÓ
Hifas las cuales no presentan división y además se observan esporas de un color gris oscuro.
Los posibles géneros asociados a la hoja de árbol detectados en la muestra son Alternaría y Mucoral, debido a que en gran parte se pueden encontrar en el ambiente y por ende en plantas. Alternaria tiene la capacidad de producir micotoxinas las cuales son capaces de contaminar alimentos o materias primas originando así enfermedades o transtornos denominados micotoxicosis, también son mohos causantes de gripas y están presentes en la aparición de infecciones en personas inmunodeficientes (Pavón, González, Martín, & García, 2012). Por otro lado, los hongos extraídos de la cascara de naranja crecieron abundantemente en los medio de cultivo y presentaron diferentes morfologías (tabla 6), en la muestra de cascara de naranja se observa un hongo de color verde (figura 1), al consultar en la literatura los hongos más comunes presentes en cíclicos son Penicillium digitatum y penicillium italicum , y causan moho verde y moho azul respectivamente (Zimmermann, 2018), por lo tanto se podría afirmar que el hongo presente en
la naranja es del género Penicillium; sin embargo al hacer la caracterización microscópica se evidencia que el hongo presente es Aspergillus, este microorganismo provoca podredumbre en cítricos post cosecha, y las cepas utilizadas en industrias pueden causar alergias por inhalación produciendo aspergilosis; a pesar de esto el hongo A. niger tiene gran importancia industrial, este utilizado para producción de ácido cítrico, ácido glucónico y enzimas como celulasa, invertasa, amiloglucosidasa, amilasa, lactasa, proteasa ácida y pectinasa. (Devaney, 2018). Otros hongos que se pueden encontrar en la cascara son Alternaria citri , Botrytis cinérea, Geotrichum candidum, Phytophthora citrophthora, Phomopsis, Diplodia, Rhizopus nigricans , Trichotecium roseum, Colletotrichum gloeosporioides , Fusarium oxysporum, Cladosporium herbarum y Trichoderma, (www.tecnicoagricola.es, 2012) sin embargo estos hongos no se presentaron en la muestra.
Figura 2. Crecimiento de hongo en mandarina En la muestra de agua estancada, crecieron diferentes colonias de hongos, la morfología se registra en la tabla 6, sin embargo, al realizar la microscopia no se pudo identificar géneros de hongos específicos. Según la literatura los hongos en sistemas acuícolas están presenten de forma natural (Rocha, Lozano, & Ygnasio, 2006), entre los más comunes se encuentran géneros como Escherichia, Salmonella, Pseudomonas, Aeromonas, Serratia, Nocardia y Spirochaeta, estos microorganismos son de origen fecal o están implicados en procesos de biodegradación. (Galvin, 2003) Al analizar los cultivos de hongos en las hojas se observaron diferentes colonias, las cuales se describen en la (tabla 6); Los posibles géneros asociados a la hoja de árbol que podrían estar en la muestra son Alternaría y Mucoral, debido a que en gran parte de estos microorganismos se pueden encontrar en el medio ambiente y por ende en plantas. Alternaria tiene la capacidad de producir micotoxinas las cuales son capaces de contaminar alimentos o materias primas originando así enfermedades o trastornos denominados micotoxicosis, también son mohos causantes de gripas y están presentes en la aparición de infecciones en personas inmunodeficientes (Pavón, González, Martín, & García, 2012). CONCLUSIONES A partir de los resultados obtenidos en la tinción de Gram se puede comparar las diferentes estructuras que componen la pared celular de las bacterias, E. coli y Klebsiella son bacterias Gram positivas por lo que presentan una pared celular con gran porcentaje de péptido glucano, mientras que, Bacillus y S. aureus son bacterias Gram negativas es decir presentan una pared celular compuesta de membrana externa y en menor cantidad por peptidoglicano.
Las técnicas macroscópicas y microscópicas hicieron posible la diferenciación de bacterias y hongos, en el caso de las bacterias la técnica de aislamiento permitió describir morfológicamente las colonias y con esto se puede concluir que el medio de cultivo influye en la morfología colonial de las bacterias, esto debido a que cada medio tiene componentes nutricionales diferentes. Por otro lado, se evidencio la presencia de hongos y levaduras en ambientes comunes, algunos de estos microorganismos son patógenos o pueden producir infecciones como Alternaría y Mucor , mientras que otros conviven con nosotros sin generar ningún daño, y por el contrario son microorganismos de gran importancia biotecnología, como A. niger, S. cerevisiae, Penicillium sp y E. coli . A partir de los resultados obtenidos al realizar el recuento de células en hongos se puede evidenciar que la levadura crece más rápido que la suspensión de esporas.
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