BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Latar Belakang Belakang
Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari mengenai makhluk hidup yang mikroskopis dan tidak dapat dilihat mata biasa. Untuk itu, dalam melakukan analisis mikrobiologi dikenal sebutan analisis mikroskopis, yaitu analisis yang dilakukan terhadap jasad renik yang tidak terlihat oleh mata biasa. Oleh karena itu, butuh alat bantu yang digunakan agar kita dapat melihat jasad renik tersebut. Mikroskop adalah salah satu alat bantu yang digunakan untuk melakukan analisis mikroskopis. Dalam penggunaannya, sebelumnya harus dipersiapkan preparat untuk analisis mikroskopis. Jika kita ingin mempelajari mikroorganisme individual, kita harus dapat memeriksa sel-sel tunggal. Untuk dapat melakukannya, kita harus mengoleskan sel-sel tunggal tersebut dan melihatnya melalui mikroskop. Sel bakteri dan mikroorganisme lainnya diamati dengan b antuan mikroskop. Terutama sel bakteri selain selnya sangat kecil, juga transparan dan tidak berwarna. Setelah metode pewarnaan diketahui dan dikembangkan. Pengamatan bakteri menjadi lebih muda. Bahkan hasil pewarnaan itu dapat digunakan untuk pewarnaan lebih lanjut dan mendalam. Diantaranya digunakan dalam penentuan jenis atau identifikasi. Banyak metode pewarnaan yang dapat dilakukan dan setiap metode mempunyai tujuan-tujuan tertentu. Untuk itu, analisis mikroskopis akan dibahas lebih lanjut di makalah ini. 1.2 Rumusan Rumusan Masalah Masalah
Adapun rumusan masalah dari makalah ini adalah sebagai berikut. -
Bagaima Bagaimanaka nakah h penggu penggunaan naan mikros mikroskop kop untu untuk k melak melakukan ukan analis analisis is mikroskopis ?
-
Bagaima Bagaimanaka nakah h persiap persiapan an smear, smear, pewar pewarnaan naan seder sederhana hana,, dan penemp penempela elan n zat basah ?
-
Bagaima Bagaimanaka nakah h pewarn pewarnaan aan difere diferensi nsial al dilakuk dilakukan an ?
-
Bagaima Bagaimanaka nakah h pewar pewarnaa naan n difer diferens ensial ial tambaha tambahan n dilak dilakukan ukan ?
1.3 Tu Tujua juan n
Adapun tujuan dari pembuatan makalah ini adalah sebagai berikut. -
Mengetahui prosedur penggnaan mikroskop
-
Mengetahui proses-proses persiapan smear, pewarnaan sederhana, dan penempelan zat basah
-
Mengetahui proses pewarnaan diferensial
-
Mengetahui proses pewarnaan diferensial tambahan
1.4 Prinsip 1.5 Manfaat
Adapun manfaat pembuatan makalah ini adalah menambah ilmu dan wawasan mengenai analisis mikroskopis bagi penyusun pada khususnnya dan bagi pembaca pada umumnya.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Mikroskop
Bagian-bagian dari mikroskop cahaya: 1. lensa okuler, 2. lensa objektif, 3. lensa objektif yang lain, 4. pengatur fokus, 5. pengatur fokus secara halus, 6. papan letak objek/sampel/preparat yang dilihat, 7. sumber cahaya, 8. kondensor cahaya, 9. penjepit sampel Mikroskop cahaya atau dikenal juga dengan nama "Compound light microscope" adalah sebuah mikroskop yang menggunakan cahaya lampu sebagai pengganti cahaya matahari sebagaimana yang digunakan pada mikroskop konvensional. Pada mikroskop konvensional, sumber cahaya masih berasal dari sinar matahari yang dipantulkan dengan suatu cermin datar ataupun cekung yang terdapat dibawah kondensor. Cermin ini akan mengarahkan cahaya dari luar kedalam kondensor.
Jenis lensa
Mikroskop cahaya menggunakan tiga jenis lensa, yaitu lensa obyektif , lensa okuler , dan kondensor . Lensa obyektif dan lensa okuler terletak pada kedua ujung tabung mikroskop sedangkan penggunaan lensa okuler terletak pada mikroskop bisa berbentuk lensa tunggal (monokuler ) atau ganda ( binokuler ). Pada ujung bawah mikroskop terdapat tempat dudukan lensa obyektif yang bisa dipasangi tiga lensa atau lebih. Di bawah tabung mikroskop terdapat meja mikroskop yang merupakan tempat preparat. Sistem lensa yang ketiga adalah kondensor. Kondensor berperan untuk menerangi obyek dan lensa-lensa mikroskop yang lain.
Cara kerja
•
Lensa obyektif berfungsi guna pembentukan bayangan pertama dan menentukan
struktur serta bagian renik yang akan terlihat pada bayangan akhir serta berkemampuan untuk memperbesar bayangan obyek sehingga dapat memiliki nilai "apertura" yaitu suatu ukuran daya pisah suatu lensa obyektif yang akan menentukan daya pisah spesimen, sehingga mampu menunjukkan struktur renik yang berdekatan sebagai dua benda yang terpisah. •
Lensa okuler, adalah lensa mikroskop yang terdapat di bagian ujung atas tabung
berdekatan dengan mata pengamat, dan berfungsi untuk memperbesar bayangan yang dihasilkan oleh lensa obyektif berkisar antara 4 hingga 25 kali. •
Lensa kondensor, adalah lensa yang berfungsi guna mendukung terciptanya
pencahayaan pada obyek yang akan dilihat sehingga dengan pengaturan yang tepat maka akan diperoleh daya pisah maksimal.
Jika daya pisah kurang maksimal maka dua benda akan terlihat menjadi satu dan pembesarannyapun akan kurang optimal.
Preparasi sediaan Persiapan preparat di dalam mikroskop cahaya terbagi menjadi dua jenis, yaitu : •
Preparat Non-permanen , yang dapat diperoleh dengan menambahkan air pada
sel hidup di atas kaca objek, kemudian diamati di bawah mikroskop. •
Preparat permanen , yang dapat diperoleh dengan melakukan fiksasi yang
bertujuan untuk membuat sel dapat menyerap warna, membuat sel tidak bergerak, mematikan sel, dan mengawetkannya. •
Tahap selanjutnya , yaitu pembuatan sayatan, yang bertujuan untuk memotong
sayatan hingga setipis mungkin agar mudah diamati di bawah mikroskop. preparat dilapisi dengan monomer resin melalui proses pemanasan karena pada umumnya jaringan memiliki tekstur yang lunak dan mudah pecah setelah mengalami fiksasi, kemudian dilanjutkan dengan pemotongan menggunakan mikrotom. Umumnya mata pisau mikrotom terbuat dari berlian karena b erlian tersusun dari atom karbon yang padat. Oleh karena itu, sayatan yang terbentuk lebih rapi. Setelah dilakukan penyayatan, dilanjutkan dengan pewarnaan, yang bertujuan untuk memperbesar kontras antara preparat yang akan diamati dengan lingkungan sekitarnya. Setiap pewarna mengikat molekul yang memiliki kespesifikan tertentu, contohnya : Hematoksilin, yang mampu mengikat asam amino b asa (lisin dan arginin) pada berbagai protein, dan eosin, yang mampu mengikat molekul asam (DNA dan rantai samping pada aspartat dan glutamat). 2.2 Persiapan Smear, Penempelan zat basah, dan Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dan
basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin. 2.3 Pewarnaan
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari p ewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut p ewrna negatif. Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain. Pewarnaan basa bisa terjadi biasenyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya metilin biru, kristal violet, safranin dan lain-lain. Teknik pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan satu jenis senyawa pewarna, teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini diperlukan untuk mengamati morfologi, baik bentukmaupun susunan sel. Teknik pewarnaan yang lain adalah pewarnaan diferensial, yang menggunakan senyawa pewarna yang
lebih dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri gram positif dan bakteri gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam. Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula, spora dan nukleus. Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang b elkau yakni sebagai berikut: mempersiapkan kaca obyek. Kaca obyek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk membuat apusan dari bakteri yang diwarnai. mempersiapkan apusan. Apusan yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis. Apusan ini dapat berasal dari biakan cair atau padat. Biakan Cair. Suspensi sel sebanyak satu atau dua mata jarum inokulasi diletakkan pada kaca obyek. Lalu diapuskan pada kaca obyek selebar ... cm. Biarkan mengering diudaraata diatas api kecil dengan jarak 25 cm. Biakan Padat. Bakteri yang dikultur pada medium padat tidak dapat langsung dibuat apusan seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dulu. Letakkan setetes air pada kaca obyek, lalu denganjarum inokulasi ambil bakteri dari biakan padat, letakkan pada tetesan air dan apusan. Biarkan mengering diudara. Fiksasi dengan pemanasan. Apusan bakteri pada akaca obyek bila tidak diletakkan secara kuat, dapat terhapus pada waktu proses pewarnaan lebih lanjut. Proses peletakan apusan pada kaca obyek dapat dilakukan diantaranyadengan cara memanaskan diatas api.
2.4 Macam-Macam Pewarnaan
1. Pewarnaan sedehana - Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) - Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005)). 2. Pewarnaan diferensial - menggunakan lebih dari satu macam zat warna - Tujuan untuk membedakan antar bakteri - Contoh: Pw. Gram, Pw. Bakteri Tahan Asam Pewarnaan Diferensial terdiri dari : 1. Pewarnaan Gram Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat
dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998). Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang ha mpir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna (Hadioetomo, 1990). Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998). Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008). Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) : - Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar. - Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme. - Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa.
Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk pemeriksaan mikroskopik adalah (Pelczar, 1986) : - Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek. - Fiksasi olesan pada kaca objek. - Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial. Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) : - Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi. - Memperjelas ukuran dan bentuk jasad - Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad. - Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui. Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negative. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarnaan yang bermuatan positif ataupun negatif (Suriawiria, 1985). 2. Pewarnaan Acid-Fast 3. Pewarnaan Granula Metakromatik Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatikyang terdiri atas volutin,granula glikogen serta granula lemak. Granula metakhromatik sering ditemukan pada jenis-jenis kuman patogen tertentu dan berbentuk khas untuk kuman tersebut. Di dalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatik yang tersebut di dalam sediaan mikroskopik. Misalnya kuman difteri mempunyai granula metakhromatik karena bila diwarnai dalam sediaan, granula tersebut akan berwarna lain dari pada zat warna yang digunakan. Misalnya bila diwarnai sediaan kuman difteri dengan zat warna biru metilen,granula Babes-Ernst akan berwarna coklat tua.
Pada spesies kuman tertentu, granula metakhromatik terletak pada tempat-tempat khas di dalam sel kuman. Disamping material nukleus, sitoplasma bakteri mungkin mengandung inklusi selkepingan-kepingan kecil material yang tidak menjadi bagian utuh struktur sel. Butiran khusus ini yang rupanya bertindak sebagai sumber fosfat dan energi disebut butiran metakromat karena akan menyerap warna merah apabila diwarnai dengan biru metilen. Butiran metakromat disebut juga kolektif volutin. Pewarnaan Granula dapat dilakukan dengan metode selain Neisser yaitu : 1. Metode Albert’s 2. Metode Much Weis (Mycobacterium tuberculose).
3. Pewarnaan khusus - Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri→ kapsul, spora, flagel dll Pewarnaan Khusus terdiri dari : 1. Pewarnaan Negatif Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam (Campbell dan Reece, 2005). Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri. 2. Pewarnaan Kapsul Beberapa jenis bakteri dan amoeba hijau-biru mengeluarkan bahan-bahan yang amat berlendir dan lengket pada permukaan selnya, melengkungi dinding sel. Bila bahan berlendir tersebut kompak dan tampak sebagai suatu bentuk yang pasti ( bundar/lonjong) maka disebut kapsul, tetapi bila tidak teratur bentuknya dan menempelnya pada sel kurang erat maka disebut selaput lendir.
Kapsul dan lendir tidaklah esensial bagi kehidupan sel, tapi dapat berfungsi sebagai makanan cadangan, perlindungan terhadap fagositosis ( baik dalam tubuh inang maupun dialam bebas ) atau perlindungan terhadap dehidrasi. Kemampuan menghasilkan kapsul merupakan sifat genetis, tetapi produksinya sangat dipengaruhi oleh komposisi medium tempat ditumbuhkannya sel-sel yang bersangkutan. Komposisi medium juga dapat mempengaruhi ukuran kapsul. Ukuran kapsul berbeda-beda menurut jenis bakterinya dan juga dapat berbeda diantara jalur-jalur yang berlainan dalam satu spesies. Pada beberapa jenis bakteri adanya kapsul sebagai petunjuk virulensi. Semua kapsul bakteri tampaknya dapat larut dalam air. Komposisi kimiawi kapsul ada yang berupa glukosa ( misalnya dektrosa pada leokonostok mesendteroides), polimer gula amino (misalnya asam hialuronat pada Staphylococcus piogenik), polipeptida (misalnya polimer asam D-glutamat pada Bacillus antraksis) atau kompleks polisakarida protein ( misalnya B disentri). Simpai biasanya diperlihatkan dengan cara pewarnaan negatif atau modifikasi dari cara itu. Salah satu pewarnaan simpai (kapsul) ini ( metode Welch) meliputi pemberian larutan kristal ungu panas disusul kemudian dengan pencucian dengan larutan tembaga sulfat. Tembaga sulfat ini digunakan untuk menghilangkan zat warna berlebihan karena pencucian biasa dengan air akan melarutkan simpai. Garam tembaga memberi pula warna pada latar belakang, sehingga sel dan latar belakang akan tampak biru tua dan simpai berwarna biru yang lebih muda. 3. Pewarnaan Spora Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Segera setelah keadaan luar baik lagi bagi mereka, maka pecahlah bungkus spora dan tumbuhlah bakteri. Spora lazim disebut endospora ialah karena spora itu dibentuk di dalam sel. Endospora jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk dari pada bakteri biasa yaitu bakteri dalam bentuk vegetatif. Sporulasi dapat dicegah,
jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium yang baru. Endospora dibuat irisan dapat terlihat terdiri atas pembungkus luar, korteks dan inti yang mengandung struktur nukleus. Apabila sel vegetatif membentuk endospora, sel ini membuat enzim baru, memproduksi dinding sel yang sama sekali baru dan berubah bentuk. Dengan kata lain sporulasi adalah bentuk sederhana diferensiasi sel, karena itu, proses ini diteliti secara mendalam untuk mempelajari peristiwa apa yang memicu perubahan enzim dan morfologi. Spora biasanya terlihat sebagai badan-badan refraktil intrasel dalam sediaan suspensi sel yang tidak diwarnai atau sebagai daerah tidak berwarna pada sel yang diwarnai secara biasa. Dinding spora relatif tidak dapat ditembus, ini pula yang mencegah hilangnya zat warna spora setelah melalui pencucian dengan alkohol yang cukup lama untuk menghilangkan zat warna sel vegetatif. Sel vegetatif akhirnya dapat diberi zat warna kontras. Spora biasanya diwarnai dengan hijau malachit atau carbol fuchsin. Spora kuman dapat berbentuk bulat, lonjong atau silindris. Berdasarkan letaknya spora di dalam sel kuman, dikenal letak sentral,subterminal dan terminal. Ada spora yang garis tengahnya lebih besar dari garis tengah sel kuman, sehingga menyebabkan pembengkakan sel kuman. 4. Pewarnaan Flagella Tujuan Mempelajari dasar dasar kimiawi dan kinerja prosedur pewarnaan flagella BAB III METODE BAB IV KESIMPULAN DAN SARAN
