Laporan Praktikum
Hari/Tanggal : Rabu, 3 September 2014
Mikrobiologi
Waktu
: 11:00 WIB
PJP
: M. Arif Mulya, SPi.
Asisten
: Ade Setiawan, AMd. Embun Novita A., AMd.
KUANTITAS MIKROBE, HITUNGAN MIKROSKOPIS LANGSUNG
Kelompok 2 Aang Febrizal J3L113020 J 3L113020
PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA PROGRAM DIPLOMA IPB 2014
A. Pendahuluan 1. Latar Belakang Mikroba ialah jasad renik yang mempunyai kemampuan sangat baik untuk bertahan hidup. Jasad renik tersebut dapat hidup hampir di semua tempat di permukaan bumi. Mikroba mampu beradaptasi dengan lingkungan yang sangat dingin hingga lingkungan yang relatif panas, dari lingkungan yang asam hingga lingkungan yang relatif panas, serta dari lingkungan yang asam hingga basa. Mikroba ini tidak dapat dilihat secara kasat mata. Oleh karena itu, untuk melihat miroorganisme diperlukan alat bantu berupa mikroskop (Afriyanto 2005). Kuantitasi mikroba menunjukkan jumlah koloni yang mampu dibentuk oleh mikroba tertentu. Beberapa koloni bakteri ini, bagi tubuh manusia akan menyebabkan penyakit. Steril dari bakteri untuk makanan terutama minuman, sangat perlu diketahui demi menjaga kesehatan. Air minum dari berbagai tempatmempunyai jenis-jenis bakteri yang tidak sama. Untuk air minum hasil penyulingan diharapkan sudah terbebas dari bakteri (Fardiaz, 1996). Penentuan jumlah angka mikroorganisme sangat penting dilakukan untuk menetapkan keamanan suatu sediaan farmasi dan makanan. Berbagai metode telah dikembangkan untuk menghitung jumlah mikroorganisme. Metode tersebut berupa menghitung jumlah sel, massa sel, atau isi sel yang sesuai dengan jumlah sel. Terdapat empat macam cara umum untuk memperkirakan besar populasi mikroorganisme, yaitu perhitungan langsung, pengukuran langsung, perhitungan tidak langsung, dan perkiraan tidak langsung (Harmita 2006). Perhitungan langsung (direct count ) digunakan untuk menghitung jumlah sel atau biomassa mikroorganisme dengan cara sel dihitung langsung di bawah mikroskop atau dengan perhitungan partikel elektronik (electronic particle counter ). Pengukuran langsung (direct measurement ) digunakan untuk menghitung biomassa mikroorganisme dengan cara massa sel dapat ditentukan dengan menimbang atau mengukur berat seluruh sel serta biomassa dapat dikorelasikan dengan jumlah sel dan membandingkannya pada kurva standar. Perhitungan tidak langsung (indirect count ) digunakan untuk menghitung jumlah sel yang ada pada sampel dengan cara memperkirakan jumlah mikroorganisme dalam sampel yang telah dikonsentrasikan dan ditanam pada media yang sesuai, contohnya pembentukan koloni dalam pelat agar. Perkiraan tidak langsung (indirect estimate) digunakan untuk biomassa mikroorganisme. Biomassa mikroorganisme diperkirakan dengan cara mengukur komponen biokimia sel mikroorganisme yang relatif konstan, seperti protein, adenosin trifosfat (ATP), lipopolisakarida (LPS), murein, dan klorofil. Biomassa juga dapat diperkirakan secara tidak langsung dengan mengukur kekeruhan. Perkiraan tidak langsung biomassa mikroorganisme dapat dikorelasikan
dengan jumlah sel dengan membandingkannya pada kurva standar (Harmita 2006).
2. Tujuan Praktikum bertujuan menentukan jumlah sel yeast/Khamir pada sampel menggunakan teknik hitungan mikroskopis langsung. B. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan pada praktikum yaitu mikroskop, pipet tetes, cover glass, Counter dan Haemacytometer. Bahan-bahan yang digunakan yaitu suspensi yeast/khamir dan alkohol 70%. C. Prosedur/Cara Kerja Penentuan kuantitas mikroba, hitungan mikroskopis langsung dilakukan terlebih dahulu persiapan alat yang akan digunakan. Salah satu alat yang digunakan yaitu mikroskop cahaya. Sebelum mikroskop cahaya disambungkan ke aliran listrik atau dinyalakan, terlebih dahulu dipastikan bahwa lensa objektif yang digunakan adalah lensa yang memiliki perbesaran paling kecil. Selain perbesaran lensa objektif yang diperhatikan, perbesaran pencahayaan yang digunakan juga dalam keadaan minimum. Selanjutnya, meja peparat dipastikan sudah berada pada bagian atas. Setelah itu mikroskop siap untuk dinyalakan. Setelah mikroskop nyala dan siap untuk digunakan, Haemocytometer dan cover glass disiapkan sbagai media sampel dalam perhitungan mikroba. Haemocytometer dan cover glass dibersihkan dengan secarik kertas lensa atau tissue. Setelah itu, Haemocytometer diletakkan pada meja preparat dan dijepit. Kemudian dicari ruang hitung pada Haemocytometer dengan perbesaran yang paling kecil yaitu 40 kali. Setelah ditemukan kamar hitungnya, lensa diubah dengan perbesaran 100 kali. Lalu cover glass diletakan diatas Haemocytometer. Suspensi Khamir yang telah disiapkan, dikocok dan diambil dengan menggunakan pipet tetes sebanyak 0,1 sampai 0,5 ml. Kemudian, suspensi tersebut dialirkan secara cermat ke ruang hitung melalui celah yang terdapat pada sisi Haemocytometer. Perhitunga jumlah sel dapat dilakukan dengan menghitung sel pada lima bidang pandang yang tela h ditentukan. D. Data dan Hasil Pengamatan Berrikut ini adalah data hasil perhitungan jumlah sel yeast pada lima bidang pandang yang telah ditentukan:
Tabel 1 Hasil kuantitasi yeast Bidang Pandang 1 2 3 4 5
Σ sel
54 65 53 37 39
Kepadatan (sel/ml)
1,24.10
Contoh perhitungan jumlah sel/mL: 248/5 = 49,6 sel/kotak Σ
3
. 10 3
Σ 49,6 . 25 . 7
Σ ,4 sel/mL
E. Pembahasan Metode hitungan langsung dapat juga digunakan untuk untuk menghitung jumlah spora kapang atau jumlah sel khamir dlam suatu suspensi dengan menggunakan Haemocytometer/hemasitometer atau gelas objek Thoma, Petroff-Hausser, dan neubeur. Hemositometer adalah suatu alat yang dapat digunakan untuk melakukan perhitungan mikroba secara depat dan dapat digunakan untuk jumlah sel mikroba yang sedikit. Alat ini terdiri dari cover glass, dua counting chamber yang terdapat garis-garis mikroskopis, serta cover glass mounting support. Pada permukaan gelas objek ini terdapat garis-garis melintang dan membujur sehingga terbentuk kotak. Adapun kotak terbesar berukuran 1 mm2. Kotak seluas 1 mm2 di bagian tengah dibagi menjadi menjadi 25 kotak (0,2 mm x 0,2 mm) masing-masing berisi 16 kotak terkecil (0,05 mm x 0,05 mm). Masing-masing kotak 0,2 mm x 0,2 mm dibatasi dengan 3 garis. Garis yang tengah merupakan batas. Jika gelas objek ini ditutup dengan gelas penutup, kedalaman di bawah gelas penutup adalah 0,1 mm, sehingga volume masing-masing kotak adalah 0,05 x 0,05 x 0,1=0,00025 mm 3. Penghitungan spora kapang atau sel kamir dilakukan pada kotak-kotak tersebut secara acak misalnya dipilih 5 kotak dari 25 kotak pada luasan 1 mm2 (Winiati dan Nurwitri 2012).
Gambar 1 Haemocytometer Pada percobaan dilakukan sterilisasi sebelum dan sesudah pekerjaan di laboratorium. Alkohol 70% disemprotkan pada tangan untuk membunuh mikroorganime yang tidak diinginkan. Haemocytometer dan cover glass juga dibersihkan dengan alkohol 70% untuk membunuh mikroorganisme yang tidak diinginkan dan membersihkan kotoran yang menempel pada alat,
karena pada saat diamati di bawah mikroskop alat harus bersih dan steril sehingga pengamatan terlihat jelas oleh mata dan mempermudah untuk melakukan perhitungan mikroba. Ketika menggunakan mikroskop untuk mencari ruang-ruang kamar pada Haemocytometer , intensitas cahaya jangan terlalu terang, karena garis-garis pada Haemocytometer yang tipis sekali tidak akan terlihat dikalahkan oleh sinar yang lebih besar dari cahaya mikroskop. Selain cahaya, faktor perbesaran mikroskop juga berpengaruh. Ruang-ruang kamar Haemocytometer baik di bagian bawah maupun atas akan terlihat dalam perbesaran 4x10. Pada pebesaran tersebut, akan terlihat kotak-kotak berukuran besar sebanyak 25 kotak. Setiap satu kotak besar berukuran 1 mm 2. Pada perbesaran 40x10 akan terlihat dengan jelas satu kotak besar yang menyusun ruang kamar memiliki 16 kotak.
Gambar 2 Ruang Hitung Sel-sel yeast yang berhamburan pada ruang-ruang kamar Haemocytometer tidak perlu dihitung semua. Hanya 5 kotak besar dari 25 kotak besar yang dipilih, tetapi harus bersifat representatif. Pemilihan 5 kotak dapat secara diagonal atau pada keempat kotak yang berada di setiap sudut dengan satu kotak berada di tengah. Dalam percobaan ini 5 bidang pandang yang digunakan adalah berbentuk diagonal.
Gambar 3 Lima Bidang Pandang Diagonal Pada percobaan, ketika suspensi yeast diteteskan pada ruang-ruang kamar, maka sel-sel yeast baik yang hidup dan yang mati tidak dapat dibedakan. Untuk membedakan sel yang mati dengan sel yang hidup maka digunakan larutan pewarna yaitu methylene blue. Ketika methylene blue ini ditambahkan, maka sel yang hidup akan tetap tidak berwarna atau transparan sedangkan sel yang mati akan berwarna biru, karena sel mati memiliki lapisan dinding sel yang rusak sehingga pewarna dapat masuk. Konsentrasi methylene blue ini tidak boleh terlalu tinggi, karena dapat menyebabkan zat pewarna dapat masuk menembus lapisan dinding sel yang hidup sehingga sel
hidup akan membentuk warna biru. Namun, pada saat percobaan tidak digunakan metilen blue, sehingga sel yang terhitung terdiri dari sel hidup dan sel mati. Setelah diketahui jumlah spora kapang atau sel kamir dalam kotak tersebut, jumlah spora kapang atau sel kamir dalam suatu volume bahan dapat dihitung sebagai berikut ini: Jumlah spora per mm3 = jumlah spora per mm 2 x faktor pengenceran (FP) x 10 Di mana angka 10 diperoleh dari 1/0,1 mm Jumlah spora atau sel kamir per ml (cm3)=jumlah sel per mm2 x FP x 10000 (Winiati dan Nurwitri 2012). Dari hasil percobaan diperoleh kepadatan sel yeast yaitu sebesar 1,24.107 sel/mL.
Gambar 4 Sel Yeast Pada Perbesaran 100 kali
F.
Simpulan
Dari hasil percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa sel yeast/khamir yang terdapat dalam sampel memiliki kepadatan sebesar 1,24.107 sel/mL.
G. Daftar Pustaka
Afriyanto E. 2005. Pakan Ikan dan Perkembangannya. Jakarta: Kanisius Fardiaz, S., 1996, Analisis Mikrobiologi Pangan, PT. Radja Grafindo Persada, Jakarta. Harmita. 2006. Buku Ajar Analisis Hayat . Jakarta: Kedokteran EGC. Ed. ke-3 Winiawati P. Rahayu, C. C. Nurwitri. 2012. Mikrobiologi Pangan. Bogor: IPB Press
