Manual Bacteriologia Octubre 2013

MANUAL Bacteriología Médica M. C. Norma Herrera Díaz M. A. Ma. Olga González Rangel M. C. Rosalba Villalba Luna

Índice - Práctica No. 1 - Práctica No. 2

“ÁNALISIS DE CEPAS DE REFERENCIA RELACIONADAS A INFECCIONES DEL TRACTO GASTROINTESTINAL” “COPROCULTIVO”

- Práctica No. 3

“ÁNALISIS DE CEPAS DE REFERENCIA RELACIONADAS A INFECCIONES DEL TRACTO URINARIO”

- Práctica No. 4

“UROCULTIVO”

- Práctica No. 5

“ÁNALISIS DE CEPAS DE REFERENCIA REALCIONADAS A INFECCIONES DEL TRACTO GENITAL Y DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES DE TRANSMISIÓN SEXUAL”

- Práctica No. 6

“ÁNALISIS DE CEPAS DE REFERENCIA RELACIONADAS A INFECCIONES DEL TRACTO RESPIRATORIO”

- Práctica No. 7

“DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO DE INFECCIONES DE VÍAS RESPIRATORIAS ALTAS: FARINGE, NASOFARINGE, CONJUNTIVA Y OÍDOS”

- Práctica No. 8

“DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO DE INFECCIONES DE VÍAS RESPIRATORIAS BAJAS: DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSIS

- Práctica No. 9

“ÁNALISIS DE CEPAS DE REFERENCIA RELACIONADAS A INFECCIONES DE LA PIEL Y DE CEPA DE REFERENCIA RELACIONADA A SEPTICEMIA”

- Práctica No. 10 - Práctica No. 11 - Anexos

“DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO DE INFECCIONES EN HERIDAS” “HEMOCULTIVO”

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NORMATIVIDAD INTERNA DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA 1. El tiempo máximo para entrar al laboratorio es de 10 minutos, una vez transcurridos, no se permitirá al alumno la entrada. 2. Todos los objetos personales deberán ser guardados en las áreas laterales a las mesas de trabajo. 3. Debido a la naturaleza del trabajo que se desarrolla en el Laboratorio de Microbiología es obligatorio el uso de bata de manga larga, de preferencia de tela de algodón y con cierre de velcro, de guantes de látex desechables, de lentes de seguridad, de mascarilla o cubrebocas y de zapato cerrado. 4. Para prevenir accidentes, los usuarios del laboratorio deben recogerse perfectamente su cabello de tal forma que no se encuentre expuesto. 5. Lávese meticulosamente las manos con detergente antes del inicio de cada práctica y al salir del laboratorio. Repita este mismo procedimiento cuando salga a un breve periodo de descanso. 6. Al inicio y al término de cada práctica debe limpiarse la mesa de trabajo con el desinfectante preparado para dicho fin. 7. Por seguridad de los alumnos queda estrictamente prohibido comer, beber, fumar y en general llevarse objetos a la boca dentro del laboratorio. 8. Es obligatorio que los alumnos cuenten con la muestra clínica necesaria para el desarrollo de la práctica, en caso de no cumplir con este requisito, no se les permitirá permanecer en el laboratorio. 9. Para evitar los riesgos de contaminación durante el trabajo de laboratorio debe evitarse entablar conversaciones así como comunicarse a voces con los vecinos de otras mesas de trabajo. 10. Al finalizar cada práctica, el material empleado en ésta debe entregarse debidamente separado; el materialcontaminado para esterilizar, el material sucio para lavar y el material limpio. Los Residuos Peligrosos Biológico – Infecciosos deberán eliminarse de acuerdo a la NOM-087-SEMAR NAT-SSA1-2002, las especificaciones de eliminación se encuentran por escrito en el cuarto de material contaminado. 11. Todo material no contaminado tal como: algodón, papel estraza, cerillos, etc., debe ser depositado en los botes destinados para este uso. No tire basura al suelo, en cajas de reactivos ni en las tarjas. 12. Limpiar el equipo utilizado en el desarrollo de la práctica, colocarlo en su lugar correspondiente y llenar on tinta negra los datos de la bitácora de uso de equipo. 13. Dejar los frascos de reactivos para tinción bien cerrados y ordenados en la caja de reactivos. 14. Las tarjas del área de tinción deben ser talladas con fibra y detergente para eliminar los residuos de colorante, los bancos utilizados durante el trabajo de laboratorio deben dejarse en su sitio. 15. Para evitar el riesgo de contaminación el material deberá ser incubado sólo el tiempo indicado, en caso contrario será enviado al cuarto de material contaminado. 16. El material que no se encuentre en condiciones óptimas para ser utilizado en prácticas posteriores deberá ser eliminado del refrigerador y enviado al cuarto de material contaminado. 17. En caso de romper o derramar material contaminado, vierta algún desinfectante y deje actuar por lo menos 10 minutos antes de limpiar. Avise al profesor. 18. En caso de producirse un incendio o una herida personal como un corte o una quemadura, informe de inmediato al instructor de esta situación de emergencia. 19. Con el objeto de mantener bajo control los inventarios de los equipos, reactivos y medios de cultivo así como evitar riesgos de contaminación con cultivos microbianos, no se deberá sacar éstos del laboratorio sin autorización. 20. Se prohibe el uso de teléfono móvil; se recomienda apagarlo. 21. Queda estrictamente prohibido abrir la puerta de emergencia, ésta debe ser abierta sólo en caso necesario. 22. Los informes de las actividades de laboratorio deberán ser entregados al instructor semanalmente.

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIHUAHUA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Práctica No. 1 ANÁLISIS DE CEPAS DE REFERENCIA RELACIONADAS A INFECCIONES DEL TRACTO GASTROINTESTINAL

Laboratorio de Bacteriología Médica

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RESULTADO DE APRENDIZAJE Describe las características macroscópicas, microscópicas y metabólicas de las cepas de referencia: Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Yersinia enterocolítica, Shigella boydii y Vibrio cholerae, relacionadas a infecciones del tracto gastrointestinal.

INTRODUCCIÓN FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE O ENTEROBACTERIAS Se trata del grupo más importante de bacilos gram negativos de interés médico. Incluye géneros patógenos estrictos y otros que son oportunistas. Especies patógenas estrictas E. coli spp.: invasor, agregante y toxigénico Salmonella spp., Shigella spp. y Yersinia spp. Especies comensales Escherichia coli, Citrobacter freundii, Citrobacter diversus, Hafnia koseri, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Pantoea agglomerans, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia spp. Morganella morganii La familia de Enterobacteriaceae es una gran familia de bacilos Gram negativos que se localizan principalmente en el colon de los seres humanos y ciertos animales, muchos forman parte de la flora normal. Las Enterobacterias son el grupo más común de bacilos Gram negativos cultivados en el laboratorio clínico y se encuentran entre las bacterias patógenas más comunes. Estos microorganismos son los principales anaerobios facultativos del intestino grueso pero están presentes en menor número comparados con los anaerobios, como el género Bacteroides. La taxonomía de las Enterobacterias es compleja y ha cambiado con rapidez, se han definido más de 25 géneros y 110 especies o grupos, sin embargo, las Enterobacterias clínicamente significativas comprenden de 20 a 25 especies. Las características comunes de todos los miembros de esta familia heterogénea son su localización anatómica y los siguientes procesos metabólicos: son anaerobios facultativos, todos fermentan la glucosa y con frecuencia producen gas, ninguno posee la citocromo oxidasa, reducen los nitratos a nitritos como parte de sus procesos de generación de energía, son catalasa positivos. Estos bacilos pueden tener movilidad gracias a flagelos periticos o pueden carecer de ella. Estas características pueden usarse para distinguir las Enterobacterias de otros grupos de microorganismos de importancia médica, los bacilos no fermentadores Gram negativos, el más importante de ello es Pseudomonas aeruginosa. Todos los miembros contienen la endotoxina en sus paredes celulares, algunos producen exotoxinas denominadas enterotoxinas, como E.coli y V. cholerae, estas activan la adenilato ciclasa en el interior de las células del intestino delgado. Los antígenos de algunos de los miembros de las Enterobacterias, especialmente de los géneros Shigella y Salmonella, son importantes; se usan para su identificación en el laboratorio clínico y para investigaciones epidemiológicas. Los tres antígenos de superficie son los siguientes:


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• El antígeno de la pared celular (antígeno somático o antígeno O) es la porción polisacárido externa del lipopolisácarido. Está compuesto por repeticiones de oligosacaridos compuestos de 3 ó 4 azúcares repetidos de 15 a 20 veces, es la base del serotipado de muchos bacilos entéricos. Son resistentes al calor y al alcohol. Casi todas las especies de Shigella comparten uno o más antígenos O con E coli. • El antígeno H está en la proteína flagelar. Sólo los microorganismos flagelados como E coli y Salmonella spp., presenta antígenos H, los no móviles como Klebsiella spp. y Shigella spp. no los presentan. Los antígenos H de algunas especies de Salmonella son inusuales porque el microorganismo puede alternar reversiblemente entre dos tipos de antígenos H denominados fase 1 (designada con letras minúsculas) y fase 2 (designada con números arábigos). Los microorganismos deben usar este cambio en su antigenicidad para evadir la respuesta inmune. • El antígeno capsular polisacárido K es particularmente importante en los microorganismos encapsulados, como el género Klebsiella. El antígeno K se identifica por la reacción de Quellung (hinchazón de la capsula) en presencia de un antisuero especifico y se utiliza para serotipos de E coli y Salmonella typhi por motivos epidemiológicos. En S. typhi el agente causal de la fiebre tifoidea, se denomina antígeno Vi y es de gran relevancia. Las muestras sospechosas de contener miembros de la familia Enterobacteriaceae y microorganismos relacionados normalmente se inoculan en dos medios: en una placa de agar sangre y en un medio selectivo diferencial, como el agar MacConkey o el agar azul de metileno eosina (EMB). En estos medios las bacterias no fermentadoras de lactosa (Salmonella spp., Shigella spp. y Yersinia spp.) forman colonias sin color, mientras que las fermentadoras de lactosa forman colonias coloreadas. El efecto selectivo de estos medios consiste en la supresión del crecimiento de microorganismos Gram positivos no deseados, ya que hay sales biliares y tintes bacteriostáticos en el agar. Existen pruebas de selección adicionales que consisten en el agar triple azúcar hierro TSI y el caldo de urea. Estos resultados de proceso de selección normalmente son suficientes para identificar el género de un microorganismo, para identificar la especie es necesario realizar un conjunto de 20 ó más reacciones bioquímicas. Otra información importante para identificar algunos de estos microorganismos es su movilidad, que depende de la presencia de flagelos. FAMILIA VIBRIONACEAE: GÉNERO VIBRIO, AEROMONAS, PLESIOMONAS Bacilos Gram negativos, con flagelo polar, anaerobios facultativos y fermentadores de glucosa. Género Vibrio Bacilo gramnegativo pequeño, curvo o recto. Incluye las especies: V. cholerae: serogrupo O1- biotipos Clásico / Tor; serotipos Ogawa, Inaba, Hikojima O2 a O138 y O139 Vibrios no aglutinables: V. parahaemolyticus V. vulnificus Otras especies Se le llama enfermedad gastrointestinal, a todas aquellas enfermedades que dañan el sistema digestivo. Son ocasionadas por varios motivos que pueden ser desde orgánicos y psicológicos, pero principalmente son causadas por bacterias, virus o parásitos que penetran al organismo por medio de alimentos y agua contaminada principalmente con materia fecal, que también se disemina por el ambiente, sobre todo en temporada de calor. Las principales manifestaciones son: Laboratorio de Bacteriología Médica

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• Fiebre. • Dolor estomacal o abdominal (cólicos). • Constipación o estreñimiento.

• Vómito. • Diarrea. • Náuseas.

Una de las consecuencias y complicaciones más graves cuando hay diarrea y vómito, es la deshidratación. Los órganos que son afectados con mayor frecuencia son: el esófago, el estómago, el duodeno, el ano, el recto, el páncreas y los intestinos, el delgado y el grueso. Entre los principales microorganismos que las ocasionan están: la Salmonella spp., la Escherichia coli, la Shigella spp., las Giardias y las temibles amibas. DESCRIPCIÓN DE LAS CEPAS DE REFERENCIA Salmonella typhi es un bacilo Gram negativo, clasificada en el esquema de Kauffman-White, anaerobio facultativo, algunos móviles y no fermentan la lactosa. S. typhi es la única serovariedad que no produce gas en la fermentación de los azúcares. S. typhi posee además un antígeno de virulencia (Vi). Su cultivo puede ser en medios diferenciales o selectivos a 37°C, produce H2S y es móvil. Salmonella enteritidis es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae. Se cultiva en medios diferenciales o selectivos. Producen grandes cantidades de gas durante la fermentación de azúcares, y llevan a cabo una fermentación ácido mixta, lactosa negativa. La producción de H2S y movilidad son características específicas. Shigella spp. es un bacilo gran negativo, bacilo Gram negativo, es anaerobio facultativo, no móvil, no formadores de esporas, es fermentador, oxidasa negativo, lactosa negativo. Se reconocen como especies a: Shigella dysenteriae, S. sonnei, S. boydii y S. flexneri. Se cultiva en medios como McK, SS, XLD. Se pueden diferenciar por la prueba de manitol y ornitina o por el sero grupo correspondiente. Yersinia enterocolítica miembro de la familia Enterobacteriaceae. Gram negativo, anaerobio facultativo, oxidasa- negativo. Crece en medios como McK, Agar HE, XLD, Agar columbia. Con un crecimiento óptimo en torno a 29ºC (rango de 22 a 37°C) y posee varias características fenotípicas dependientes de la temperatura. Es inmóvil a 37ºC pero móvil por medio de flagelos perítricos a temperaturas inferiores a 30ºC. Se recomienda utilizar las pruebas bioquímicas de TSI urea, movilidad a 25°C y 37°C, reducción de nitratos y citratos para clasificar los biotipos. Vibrio cholerae bacilo Gram negativo con forma de bacilos curvados (coma). El medio de cultivo más utilizado es TCBS (tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa), temperatura óptima 35°C, pH 7.2 a 8.6. Bioquímicamente se caracterizan por dar positivo la prueba de oxidasa y sacarosa positiva. Es una bacteria anaerobia facultativa. Poseen flagelación polar, que les otorga una movilidad máxima. Pese a que nutricionalmente son poco exigentes, se emplean medios específicos para aislarlos de muestras clínicas. Junto con otra especie de género Vibrio pertenece a la subdivisión gamma de las Proteobacterias. Hay dos cepas principales de V. cholerae, Clásico y El Tor, y numerosos serogrupos. Otra especie aislada es Vibrio parahaemolyticus, el cual se diferencia por la prueba de sacarosa. Identificar con pruebas bioquímicas y serológicas para la identificación de Vibrio cholerae O1.


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MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIAL • Portaobjetos • Mecheros de Bunsen • Asas de nicromio recta y circular • Hisopos estériles • Papel filtro 1x1 cm • Aplicador de madera

MATERIAL BIOLÓGICO • Cepas de referencia: Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Shigella spp., Yersinia enterocolítica y Vibrio cholerae, proporcionadas en caldo nutritivo. EQUIPO • Microscopio óptico de campo claro • Incubadora a 37°C REACTIVOS • Solución salina fisiológica 0.85% • Aceite de inmersión • Cristal violeta • Safranina • Yodo lugol • Alcohol acetona • H2O2 3% • Reactivo de oxidasa (Clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina) • Rojo de metilo • α- Naftol • KOH 40% • FeCl3 • Reactivo de Kovac’s • α-naftilamina • Ácido sulfanílico MEDIOS DE CULTIVO • Agar MacConkey (MCK) • Agar Salmonella - Shigella (SS) • Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) • Agar Sulfito de Bismuto (SB) • Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa (TCBS)


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PRUEBAS BIOQUÍMICAS • Rojo de Metilo (RM) • Voges Proskauer (VP) • Fenilalanina deaminasa (FEA) • Medio Citrato de Simmons • Lisina Hierro Agar (LIA, por sus siglas en inglés) • Medio Movilidad, producción de Indol, descarboxilación de Ornitina (MIO) • Caldo de Urea • Medio de Malonato • Medio Reducción de Azufre, producción de Indol, Movilidad (SIM, por sus siglas en inglés) • Medio Triple Azúcar Hierro (TSI, por sus siglas en inglés) • Caldo de Nitratos EQUIPO DE SEGURIDAD PERSONAL • Bata para uso en el laboratorio • Guantes de látex • Cubreboca METODOLOGÍA 1. Utilizar las técnicas asépticas correspondientes. 2. Descargar cada cepa de referencia con hisopo estéril en un extremo de la caja Petri que contiene el agar indicado por el instructor. 3. Con el asa de nicromio circular estéril realizar estriado para cultivo puro. 4. Incubar los medios de cultivo inoculados en posición invertida a 37°C, durante 24 a 48 horas, en condiciones de aerobiosis. 5. A partir de las colonias aisladas de cada cepa de referencia, anotar las características macroscópicas. 6. De cada cepa de referencia, describir morfología microscópica mediante la realización de la tinción de Gram. 7. Realizar las pruebas metabólicas para la identificación de bacilos Gram negativos utilizando carbohidratos complejos, metabolismo de proteínas y exoenzimas.

NOTA: La siembra de Yersinia enterocolitica, se realiza por duplicado en el medio SIM ya que se incuba a dos temperaturas diferentes: 25ºC y 37ºC. 8. Incubar las pruebas bioquímicas a 37°C durante 24 a 48 horas. 9. Interpretar los resultados de las pruebas metabólicas agregando los reactivos que sean necesarios. 10. Realizar las anotaciones correspondientes y comparar los resultados con los de la bibliografía correspondiente. Laboratorio de Bacteriología Médica

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RESULTADOS Cepa de referencia Medio de cultivo Forma

MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA

Tamaño Color Elevación Borde Luz Reflejada Luz transmitida Consistencia Sustrato

Cepa de referencia Forma Arreglo Afinidad Tintorial

MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA

PRUEBAS BIOQUÍMICAS: BACILOS GRAM NEGATIVOS Cepa de referencia Prueba bioquímica RESULTADO REFERENCIA TSI LIA Agar citrato FeA Caldo RM Caldo VP Caldo malonato Caldo Urea Caldo Nitratos MIO SIM Oxidasa Catalasa Laboratorio de Bacteriología Médica

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BIBLIOGRAFÍA

• Brooks, G.F., Carroll, K.C., Butel, J.S., Morse, S.A. (2008). Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Alderberg. 19a edición. Editorial Manual Moderno. México D.F. • Ingraham, I.J., Ingraham, A.C.; (1998) Introducción a la microbiología, editorial Reverté, S.A.; Barcelona España. • Madigan T.M., Martinko, M.J., Parker, J.; BROCK Biología de los Microorganismos; PEARSON Prentice Hall, Madrid España. • Murray, P.R., Rosenthal, K.S., Kobayashi, G.S., Pfaller, M.A. (2009). Microbiología Médica. 6ta. edición. Editorial Elsevier Mosby. Madrid, España.


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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIHUAHUA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

Práctica No. 2 Coprocultivo


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RESULTADO DE APRENDIZAJE Describe los aspectos clínicos relacionados a infecciones del tracto gastrointestinal e identifica macroscópica, microscópica y metabólicamente al agente etiológico causal del proceso infeccioso.

INTRODUCCIÓN El tracto gastrointestinal humano, el lugar de la digestión de los alimentos, se compone de estómago, intestino delgado e intestino grueso. El pH de los fluidos del estómago es bajo, pH 2. El estómago puede considerarse por lo tanto, como una barrera microbiológica contra la entrada de bacterias extrañas en el tracto intestinal. El recuento de bacterias del contenido gástrico es generalmente bajo y en el estómago no hay apenas biota normal. El intestino delgado está dividido en dos partes: el duodeno y el íleon. Desde el duodeno al íleon, el pH se hace progresivamente menos ácido y aumenta el número de bacterias. En el colon, las bacterias están presentes en grandes cantidades y esta región puede considerarse como un recipiente de fermentación especializado. Muchas bacterias viven en el interior de su luz utilizando como nutrientes algunos productos de la digestión de los alimentos. Los aerobios facultativos como Escherichia coli se encuentran en cantidades mucho más pequeñas que otras bacterias. Los 7 recuentos totales de aerobios facultativos son por lo general inferior a 10 por gramo del contenido intestinal. Las actividades de los aerobios facultativos consumen todo el oxígeno presente, convirtiendo el ambiente del intestino grueso en estrictamente anaerobio y favorable para el crecimiento intenso de anaerobios obligados. Muchos de estos anaerobios son bacilos largos, delgados, Gram negativos con extremos en forma de huso y están fijados por su extremo a las pequeñas deformaciones de la pared intestinal. Otros anaerobios obligados incluyen especies de Clostridium spp. y Bacteroides spp. El número total de anaerobios obligados es enorme, al igual que Enterococcus faecalis. La microbiota intestinal en el hombre puede variar cualitativamente dependiendo de la dieta. La biota intestinal ejerce una marcada influencia sobre las funciones del hospedador, llevando a cabo una amplia variedad de reacciones metabólicas. Las partículas generadas por la acción fermentadora y los microorganismos metanogénicos incluyen la producción de gas y la producción de olor. Durante el paso de los alimentos por el tracto gastrointestinal, se absorbe agua del material digerido que progresivamente llega a hacerse más concentrado y se transforma en heces. Las bacterias constituyen cerca de un tercio del peso de la materia fecal. Los organismos que viven en luz del intestino grueso son continuamente arrastrados corriente abajo por el trasiego del material y, si el inóculo bacteriano se conserva, estas bacterias que se pierden deben ser constituidas por un nuevo crecimiento. La velocidad de crecimiento de bacterias en la luz del intestino hace que la población bacteriana se duplique una o dos veces por día. COPROCULTIVO Una gran variedad de bacterias puede producir infecciones gastrointestinales. Para que estas bacterias se puedan recuperar en el cultivo, se debe recoger una muestra de heces adecuada, transportarse al laboratorio de forma que se asegure su viabilidad de los microorganismos Laboratorio de Bacteriología Médica

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infeciosos e inocularse en los medios de cultivo selectivo apropiados. Los hisopos rectales no se deben enviar, puesto que se tienen que inocular diferentes medios selectivos para poder recuperar así los posibles patógenos. La cantidad de heces que se recoge en un hisopo no sería la adecuada. En ciertos casos es necesario emplear dicha toma de muestra. Las muestras de heces se deben recoger en una cuña limpia y pasarse después a un frasco muy bien cerrado que sea resistente al agua. Las muestras se deben transportar rápidamente al laboratorio para evitar los cambios ácidos en las heces (producidos por el metabolismo bacteriano), que son tóxicos para microorganismos como Shigella spp. Si se piensa que va haber un retraso, las heces se deben mezclar con un conservante como el tampón de fosfato mezclado con glicerol o el medio de transporte Cary-Blair (si se sospecha infección por Campylobacter spp). Es importante notificar al laboratorio si se sospecha un patógeno entérico en particular, debido a que esto ayudará a seleccionar el medio de cultivo más adecuado. Por ejemplo aunque las especies de Vibrio pueden crecer en los medios comunes que se utilizan para los coprocultivos, el uso de un medio selectivo para Vibrio spp. facilita el aislamiento rápido y la identificación para este microorganismo. Además, algunos microorganismos no se aíslan de forma habitual con los procedimientos de laboratorio. Por ejemplo, Escherichia coli enterotoxigénica puede crecer en los medios de cultivo habituales pero no se puede distinguir fácilmente de una E. coli no patógeno. De la misma forma no se espera que otros microorganismos se encuentren en las muestras de heces porque su enfermedad está causada por una toxina que se produce en alimentos y no por el crecimiento del microorganismo en el aparato digestivo. Algunas cepas de E. coli se han determinado con un nivel de virulencia distinto y asociadas a Sindromes clinicos especificos como son: enterotoxigenixas (ECET), enteroinvasoras (ECEI), enteropatógenas (ECEP), enterohemorrágicas (ECEH), y enteroagregativa (ECEAgg), las cuales tienen padtrones epidemiológicos diferente y se han relacionado a serotipos diferentes. Debido a que múltiples bacterias tanto patógenas, como no patógenas, están presentes en las muestras de heces, es frecuente que se tarde al menos 3 días en aislar e identificar a un patógeno entérico. Por ese motico, los coprocultivos se utilizan para confirmar el diagnostico clínico, y el tratamiento, si está indicado, no se debe retrasar a la espera de los resultados de cultivo. De hecho, las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos no se realizan con la mayor parte de los patógenos entéricos. Existen alternativas en el diagnóstico para precisar la cepa que se encuentra originando la etioligía diarreica y entre ellas podemos mencionar: métodos de alutinación, ELISA, PCR, entre otros. Cuando se andminitran antibióticos por vía oral, se puede inhibir el crecimiento de la biota normal así como el de los patógenos, después, el movimiento continuado del contenido intestinal conduce a la pérdida de las bacterias preexistentes y a la esterilización virtual del tracto intestinal. Las enfermedades gastrointestinales ocupan una de las primeas causas de consulta médica y son también una de las primeras causas de muerte en México y en el mundo.


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MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES • Portaobjetos • Mecheros de Bunsen • Asas de nicromio recta y circular • Hisopos estériles • Papel filtro 1x1 cm • Aplicador de madera MATERIAL BIOLÓGICO • Muestra de materia fecal. EQUIPO • Microscopio óptico de campo claro • Incubadora a 37°C REACTIVOS • Solución salina fisiológica 0.85% • Aceite de inmersión • Cristal violeta • Safranina • Yodo lugol • Alcohol acetona • H2O2 3% • Reactivo de oxidasa (Clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina) • Rojo de metilo • α- Naftol • KOH 40% • FeCl3 • Reactivo de Kovac s • α-naftilamina • Ácido sulfanílico MEDIOS DE CULTIVO • Agar MacConkey (McK) • Agar Salmonella-Shigella (SS) • Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) • Agar Sulfito de Bismuto (SB) • Caldo de tetrationato PRUEBAS BIOQUÍMICAS • Rojo de Metilo (RM) • Voges Proskauer (VP) • Fenilalanina deaminasa (FEA) • Medio Citrato de Simmons • Lisina Hierro Agar (LIA, por sus siglas en inglés) • Medio Movilidad, producción de Indol, descarboxilación de Ornitina (MIO) • Caldo de Urea Laboratorio de Bacteriología Médica

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• • • •

Medio de Malonato Medio Reducción de Azufre, producción de Indol, Movilidad (SIM, por sus siglas en inglés) Medio Triple Azúcar Hierro (TSI, por sus siglas en inglés) Caldo de Nitratos

EQUIPO DE SEGURIDAD PERSONAL • Bata para uso en el laboratorio • Guantes de látex • Cubreboca METODOLOGÍA 1. Utilizar las técnicas asépticas correspondientes. 2. Colectar la muestra de heces diarreicas: a) La muestra se colecta cuando el paciente presenta diarrea, lo antes posible luego del comienzo de la enfermedad (preferiblemente dentro de los cuatro primeros días) y antes de comenzar el tratamiento con antimicrobianos. b) Las muestras de heces se deben recoger en una cuña limpia y pasarse después a un frasco muy bien cerrado que sea resistente al agua. c) Un hisopo rectal o aplicador de muestra fresca en un medio de transporte, es cantidad de muestra suficiente para realizar el diagnóstico. d) Utilizar medio de transporte Cary-Blair u otro medio de transporte conveniente (NO debe usarse glicerol salino de tampón para el transporte de muestras de V. cholerae). e) Refrigerar a 4°C si los especímenes se recibirán en el laboratorio antes de las 48 horas o congelar a -70°C. Las muestras fecales de pacientes con sospecha de tener cólera pueden ser transportadas a temperatura ambiente y mantenidas por largo tiempo si es necesario; sin embargo, se prefiere la refrigeración. f) Transportar los tubos sellados o recipientes a prueba de pérdidas; colocar en un recipiente hermético para proteger del hielo o hielo seco. 3. Examinar macroscópicamente las heces. El aspecto de las heces: líquidas, acuosas, mucosas, mucoso – sangrientas, hemorrágicas, blandas, orientan sobre patógenos responsables como: enteroi invasivo (Salmonella spp., Shigella spp.) o enterotoxigénico (Vibrio cholerae, E coli enterotoxigénico) 4. Observar la muestra en fresco: si las heces son líquidas, un examen directo entre porta y cubre permitirá poner de manifiesto la presencia de leucocitos, hematíes o la movilidad de bacterias como Campylobacter spp. o Vibrio spp. 5. Elaborar frotis fijo a partir de la muestra y realizar tinción simple utilizando azul de metileno. La presencia de leucocitos se relaciona a una infección por gérmenes invasivos (Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp) o por no invasivos productores de toxinas que inducen a lesiones mucosas cólicas (C. difficile toxigénico). 6. Descargar la muestra de heces con hisopo estéril en los medios de cultivo selectivos y diferenciales. 7. Esterilizar el asa de nicromio circular en la flama del mechero y estriar los medios de cultivo, utilizando la técnica para cultivo puro. Con la finalidad de disminuir la carga microbiana, esterilizar el asa cada vez que se haya terminado de estriar un cuadrante del medio de cultivo. 8. Inocular una pequeña cantidad de muestra de heces en caldo de tetrationato. 9. Incubar los medios de cultivo a 35°C durante 24 a 48 horas en condiciones de aerobiosis. 10. Resembrar a partir del caldo de enriquecimiento, en medio de cultivo Sulfito de Bismuto, incubar a 35°C durante 24-48 horas en condiciones de aerobiosis. Laboratorio de Bacteriología Médica

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11. A partir de las colonias aisladas, realizar morfologías macroscópica y microscópica, para esta última utilizar tinción de Gram. 12. Realizar las pruebas metabólicas para la identificación de bacilos Gram negativos utilizando carbohidratos complejos, metabolismo de proteínas y exoenzimas.

NOTA: La siembra de Yersinia enterocolitica, se realiza por duplicado en el medio SIM ya que se incuba a dos temperaturas diferentes: 25ºC y 37ºC. 13. Incubar las pruebas bioquímicas a 37°C durante 24 a 48 horas. 14. Interpretar los resultados de las pruebas metabólicas agregando los reactivos que sean necesarios. 15. Realizar las anotaciones correspondientes y comparar los resultados con los de la bibliografía correspondiente.

RESULTADOS

Examen macroscópico Observación microscópica directa

Cepa de referencia Medio de cultivo Forma


Tamaño Color Elevación Borde Luz Reflejada Luz transmitida Consistencia Sustrato Laboratorio de Bacteriología Médica

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PRUEBAS BIOQUÍMICAS: BACILOS GRAM NEGATIVOS Cepa de referencia Prueba bioquímica RESULTADO REFERENCIA TSI LIA Agar citrato FeA Caldo RM Caldo VP Caldo malonato Caldo Urea Caldo Nitratos MIO SIM Oxidasa Catalasa

BIBLIOGRAFÍA



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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIHUAHUA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Práctica No. 3 ANÁLISIS DE CEPAS DE REFERENCIA RELACIONADAS A INFECCIONES DEL TRACTO URINARIO


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RESULTADO DE APRENDIZAJE Describe las características macroscópicas, microscópicas y metabólicas de las cepas de referencia: Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter clocae, Pseudomonas aeruginosa y Enterococcus faecalis, relacionadas a infecciones del tracto urinario.

INTRODUCCIÓN Las infecciones en el tracto urinario son muy comunes, por ello en el laboratorio se trabajan muestras diariamente y es necesario conocer las bacterias que más comúnmente afectan este sistema, para ello cada bacteria presenta alguna característica en particular que nos haga identificarla y poder ayudar al médico en el diagnostico y tratamiento. DESCRIPCIÓN DE LAS CEPAS DE REFERENCIA Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas y otros bacilos no fermentadores constituyen un complejo conjunto de patógenos oportunistas de plantas, animales y el ser humano. Para complicar la comprensión de estos microorganismos, la clasificación taxonómica ha sufrido numerosos cambios en los últimos años. A pesar de los muchos géneros existentes, sólo unos pocos se aislan con frecuencia. En concreto, más del 75% de las bacterias no fermentativas aisladas a partir de muestras clínicas corresponden a las especies Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophüia, Acinetobacter baumannii y Acinetobacter iwoffli y Moraxella catarrhalis. Las sencillas necesidades de crecimiento y la versatilidad nutricional de Pseudomonas hacen posible su amplia distribución ambiental. Son capaces de utilizar un gran número de compuestos orgánicos como fuentes de carbono y de nitrógeno, y algunas cepas crecen incluso en agua destilada al degradar los restos de los nutrientes. Las especies de Pseudomonas poseen muchos factores estructurales, enzimas y toxinas que aumentan su virulencia, a la vez que las hacen resistentes a los antibióticos que se usan con una frecuencia mayor. Las Pseudomonas son bacilos gramnegativos móviles rectos o ligeramente curvados que suelen disponerse en parejas. Estos microorganismos no son fermentadores y utilizan los hidratos de carbono a través del metabolismo respiratorio en el que el oxígeno actúa como aceptor terminal de electrones. Aunque se definen como aerobios estrictos, pueden crecer de forma anaerobia utilizando nitrato o arginina como aceptor terminal de electrones. La presencia de citocromo oxidasa en las especies de Pseudomonas se utiliza para distinguirlas de las enterobacterias. Algunas Pseudomonas adquieren un aspecto mucoide como consecuencia de la abundancia de polisacáridos capsulares; estas cepas son especialmente frecuentes en los pacientes con fibrosis quística. Algunas producen pigmentos difusibles (p. ej., piocianina [azul], fluoresceína [amarillo], piorrubina [marrón]. Algunas de las especies como Ps. fluorescens, Ps. putida, Ps. syringae, Ps. alcaligenes y Ps. aeruginosa se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza. La morfología de las colonias (p. ej., tamaño de la colonia, actividad hemolítica, pigmentación, olor) y los resultados de una selección de pruebas bioquímicas rápidas (p. ej., reacción positiva de la oxidasa) bastan para la identificación preliminar de las cepas. Por ejemplo, Ps. aeruginosa crece Laboratorio de Bacteriología Médica

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rápidamente y forma colonias planas con bordes que se van extendiendo, una pigmentación verde relacionada con la síntesis de piocianina azul y fluoresceína amarilla, y un olor dulce característico semejante al de las uvas. Proteus mirabilis La infección del aparato urinario por P. mirabilis es la enfermedad más frecuente causada por este género. P. mirabilis produce grandes cantidades de ureasa, que escinde la urea en dióxido de carbono y amonio. Este proceso eleva el pH urinario y facilita la formación de cálculos renales. El aumento de la alcalinidad de la orina también resulta tóxica para el uroepitelio. A pesar de la diversidad serológica de estos microorganismos, la infección no se ha asociado a ningún serogrupo específico. En contraposición a lo que ocurre con E. coli, los pili de P. mirabilis pueden disminuir su virulencia al favorecer la fagocitosis de las bacterias. Forma parte de la familia Enterobacteriaceae bacilos gram negativos, móviles, con flagelos perítricos, aerobios y anaerobios facultativos, tradicionalmente a este género se le ha encuadrado en los géneros Providencia y Morganella. Todos ellos se caracterizan por su capacidad para desaminar la fenilalanina y ureasa presente, en el medio de agar sangre presenta crecimiento en ondas, y colonias lactosa negativa planas con bordes irregulares en medio de McConkey, tiene un olor característico y es capaz de producir indol a partir del triptófano. Forma parte de la microbiota intestinal. Se ha aislado en muestras ambientales, incluyendo tierras, abonos y aguas contaminadas, y en una gran variedad de muestras de animales. Escherichia coli El género Escherichia se compone de cinco especies, de las que E. coli es la más frecuente y la más relevante desde el punto de vista clínico. Este microorganismo se asocia a una gran variedad de enfermedades, como septicemia, infecciones de vías urinarias, meningitis y gastroenteritis. Como era de esperar, la multitud de cepas capaces de producir enfermedad se encuentra reflejada en la diversidad antigénica de esta especie. Un gran número de células de E. coli están presentes en el aparato digestivo, y estas bacterias son una causa frecuente de septicemia, meningitis neonatal, infecciones del aparato urinario y gastroenteritis. Por ejemplo, E. coli son: 1) los bacilos gramnegativos que se aíslan con una frecuencia mayor en los pacientes con septicemia; 2) responsables de producir más del 80% de las IAU adquiridas en la comunidad, así como la mayoría de las infecciones nosocomiales. Infección del aparato urinario (IAU). La mayoría de los bacilos gramnegativos que producen IAU se originan en el colon, contaminan la uretra, ascienden hasta la vejiga y pueden migrar hasta el riñón o la próstata. Aunque la mayoría de las cepas de E. coli puede producir IAU, la enfermedad se relaciona con mayor frecuencia a ciertos serogrupos específicos. Estas bacterias son especialmente virulentas por su capacidad para producir adhesinas (principalmente pili P, AAF/I, AAF/H y Dr), las cuales se unen a las células que recubren la vejiga y el aparato urinario superior (evitando la eliminación de las bacterias durante la micción), y hemolisina HlyA, que lisa los hematíes y otros tipos celulares (llevando a la liberación de citocinas y a la estimulación de la respuesta inflamatoria). Enterobacter clocae Perteneciente a la familia de las Enterobacteriaceae, tiene un comportamiento (Indol, rojo de Metilo, Vogues-Proskauer, Citrato) opuesto a E. coli. En la actualidad incluye 14 especies. Desde el punto de vista de la medicina humana, los representantes más importantes son E. cloacae y E. aerogenes. Las bacterias se encuentran en el tubo digestivo humano, aunque también Laboratorio de Bacteriología Médica

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libremente en el suelo y en el agua. Su cultivo a partir de material de estudio puede realizarse fácilmente en medios de cultivo sencillos. Las colonias son grandes y mucosas; algunas cepas forman cápsulas. Como fuente de carbonos pueden utilizar glucosa y lactosa, e incluso citratos. Enterococcus feacalis Los enterococos («cocos entéricos») se clasificaron previamente como estreptococos del grupo D debido a que poseen el antígeno de la pared celular del grupo D, un ácido teicoico con glicerol que se asocia a la membrana citoplásmica. A pesar de este dato, se observó que estos microorganismos diferían de los restantes estreptococos del grupo D (conocidos como estreptococos del grupo D no enterocócicos [p. ej., Streptococcus bovis]). Los grupos enterocócicos y no enterocócicos se diferenciaron inicialmente por sus propiedades fisiológicas y a través del análisis de ácidos nucleicos. En el año 1984, los enterococos se clasificaron en el nuevo género Enterococcus, el cual consta actualmente de 29 especies. Las especies que se aíslan con una mayor frecuencia y que son clínicamente las más importantes son Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium. Enterococcus gallinarum y Enterococcus casseliflavus también constituyen frecuentes colonizadores del aparato digestivo del ser humano y revisten importancia debido a su posible confusión con E. faecium resistente a vancomicina, aunque rara vez se asocian a enfermedad en el ser humano. Los enterococos son cocos grampositivos que típicamente se disponen en parejas o en cadenas cortas. Los cocos son anaerobios facultativos y su temperatura óptima de crecimiento es de 35 °C, aunque la mayor parte de las cepas pueden crecer en un intervalo de temperatura comprendido entre 10 °C y 45 °C. Los enterococos son exigentes desde el punto de vista nutricional, ya que requieren vitaminas B, bases de ácidos nucleicos y una fuente de carbono como la glucosa. El agar enriquecido con sangre de carnero es adecuado para el desarrollo de estas bacterias, y se pueden observar colonias blanquecinas de gran tamaño tras un período de incubación de 24 horas; las colonias pueden tener un aspecto no hemolítico, α-hemolítico o, rara vez, β-hemolítico. Los enterococos toleran la exposición a condiciones ambientales adversas (como la presencia de NaCl al 6,5% y sales biliares al 40%). Estas propiedades básicas se pueden usar para distinguir los enterococos de otros cocos grampositivos catalasa-negativos. La diferenciación de las distintas especies enterocócicas exige la utilización de diversas pruebas fenotípicas seleccionadas (p. ej., reacciones de fermentación, motilidad, producción de pigmento).

MATERIALES Y MÉTODOS MEDIOS DE CULTIVO • Agar MCK • Agar Sangre • Agar Sangre de Cordero • Agar ENDO • Agar EMB • Agar Cetrimide PRUEBAS BIOQUÍMICAS • TSI • RM/VP • Citrato • Caldo de malonato Laboratorio de Bacteriología Médica

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• • • • • • • •

LIA MIO Bilis Esculina Nitratos Caldo de urea FEA SIM Caldo 6.5% NaCl

REACTIVOS • Cristal violeta • Yodo Lugol • Alcohol cetona • Aceite de inmersión • Safranina • Naftol • KOH 40% • Cloruro Férrico • KOH 10% • Solución salina fisiológica 0.85% • Reactivos para Oxidasa • H2O2 3% MATERIAL DE SEGURIDAD • Bata de laboratorio • Guantes de látex • Cubre bocas MATERIAL • Portaobjetos • Mecheros de Bunsen • Asas de nicromio recta y circular • Hisopos estériles • Papel filtro 1x1 cm • Aplicador de madera MATERIAL BIOLÓGICO • Cepas de referencia: Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Proteus spp, Enterococcus faecalis y Pseudomonas aeruginosa proporcionadas en caldo nutritivo. EQUIPO • Microscopio óptico de campo claro • Incubadora a 37°C


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METODOLOGÍA Inocular las diferentes cepas en los medios de cultivo descritos para obtener su crecimiento y realizar a partir de las colonias la morfología macroscópica, morfología microscópica e inocular las diversas pruebas bioquímicas. 1 Pseudomonas aeruginosa 2 Proteus mirabilis 3 E. coli 4 Enterobacter clocae 5 Enterococcus faecalis

1. Utilizar las técnicas asépticas correspondientes. 2. Descargar cada cepa de referencia con hisopo estéril en un extremo de la caja Petri que contiene elagar indicado por el instructor. 3. Con el asa de nicromio circular estéril realizar estriado para cultivo puro. 4. Incubar los medios de cultivo inoculados en posición invertida a 37°C, durante 24 a 48 horas, en condiciones de aerobiosis. 5. A partir de las colonias aisladas de cada cepa de referencia, anotar las características macroscópicas. 6. De cada cepa de referencia, describir morfología microscópica mediante la realización de la tinción de Gram. 7. Realizar las pruebas metabólicas para la identificación de bacilos Gram negativos utilizando carbohidratos complejos, metabolismo de proteínas y exoenzimas.

8. Incubar las pruebas bioquímicas a 37°C durante 24 a 48 horas. 9. Interpretar los resultados de las pruebas metabólicas agregando los reactivos que sean necesa rios. 10. Realizar las anotaciones correspondientes y comparar los resultados con los datos de la bibliografía. Laboratorio de Bacteriología Médica

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RESULTADOS






PRUEBAS BIOQUÍMICAS: BACILOS GRAM NEGATIVOS Cepa de referencia Prueba bioquímica RESULTADO REFERENCIA TSI LIA Agar citrato FeA Caldo RM Caldo VP Caldo malonato Caldo Urea Caldo Nitratos MIO SIM Oxidasa Catalasa Laboratorio de Bacteriología Médica

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PRUEBAS BIOQUÍMICAS: COCO GRAM POSITIVO Cepa de referencia Prueba bioquímica RESULTADO REFERENCIA Catalasa Hemólisis Prueba Bilis Esculina Crecimiento Caldo 6.5 % NaCl

BIBLIOGRAFÍA



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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIHUAHUA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Práctica No. 4 Urocultivo


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RESULTADO DE APRENDIZAJE Describe los aspectos clínicos relacionados a infecciones del tracto urinario e identifica macroscópica, microscópica y metabólicamente al agente etiológico causal del proceso infeccioso e identifica a través de el Método de Kirby – Bauer las pruebas de susceptibilidad.

INTRODUCCIÓN Las infecciones del tracto urinario son unas de las infecciones más comunes en humanos. En general un limitado número de especies bacterianas son responsables de la mayoría de estas infecciones. La presencia de microorganismos en orina se denomina bacteriuria, sean o no, causantes de infección. Las enfermedades del tracto urinario son causadas en la mayoría de los casos por bacterias provenientes de la propia flora intestinal del paciente, que penetran el tracto urinario vía la uretra, llamada ruta ascendente de la infección. La orina normal no contiene bacterias, pero estas se encuentran normalmente cubriendo toda la piel y además se encuentran en gran número en las materias fecales y en el ano. Si las bacterias suben hasta los riñones por los uréteres puede producirse una infección de los mismos llamada pielonefritis. La infección de los riñones es mucho menos frecuente pero más severa que la cistitis, cuando llegan a la vejiga y producen una infección e inflamación en ésta. Cuando ocurre una cistitis, el interior de la vejiga se vuelve rojo e irritado, que puede causar dolor en el vientre y una necesidad urgente de ir a orinar, aunque solo se pueden hacer unas pocas gotas que al salir producen quemazón. La orina puede tener un olor desagradable y en ocasiones notará que tiene sangre (hematuria). También puede tener escape de orina. La infección de los riñones (pielonefritis) produce dolor en la espalda y fiebre y si la infección no se trata rápidamente las bacterias pueden pasar a la sangre y causar una infección muy severa que puede ser mortal y que se llama sepsis. La orina vesical normalmente no contiene microorganismo. Sin embargo, los primeros 10 a 15ml de orina emitidos por personas normales de cualquier edad o sexo, siempre presentan bacterias, las que proceden de la flora corriente de la uretra anterior, prepucio, región vulvo-vaginal o de contaminación fecal. La flora de estas es variada y esta constituida por Estafilococos coagulasa positivo y negativo; Estreptococos diversos, Enterobacterias, Lactobacilos, Micoplasmas, bacterias anaerobias, levaduras y muchos otros microorganismos. En la presencia de esta flora, incluyen localización anatómica, sexo, edad, hábitos e higiene y factores patológicos propios del huésped. El examen microbiológico de una muestra de orina se denomina urocultivo, el cual permite la identificación del número y los tipos de bacterias presentes en la orina y se recomienda cuando los síntomas indican una posible infección urinaria como: dolor y sensación de calor al orinar, así como urgencia frecuente de orinar. Este examen se ha de hacer desde un punto cuantitativo y cualitativo. • Examen cuantitativo: Método de asa calibrada: Esta estimación cuantitativa consiste en sembrar una placa con medio de agar-sangre o agar con CLED en una muestra de orina, sin centrifugar, empleando asa de platino calibrada (4 mm. de diámetro). Después de incubar las siembras a 37° durante 24 a 48 horas, se cuenta el número de colonias desarrolladas y el resultado se multiplica por 100, ya que la asa de Laboratorio de Bacteriología Médica

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platino contiene 0.01 ml. de orina. • Examen cualitativo: El estudio cualitativo, que conduce a la identificación del agente, se realiza mediante la siembra de la muestra homogeneizada, en placas con agar-sangre, agar-CLED, agar de Levine o MacConkey. Es recomendable el medio CLED, porque favorece el desarrollo de bacterias patógenas urinarias y permite la identificación de los microorganismos contaminados. Su contenido en cisteína y lactosa y su deficiencia en electrolitos facilitan, por una parte, el reconocimiento de colonias de bacterias y, por otra, inhiben el carácter invasor de las colonias de Proteus. Así se facilita la identificación de estafilococos, y otros agentes que pueden contaminar la orina. La identificación final de los agentes se hace mediante el estudio de sus propiedades bioquímicas y características serológicas. Esto permite establecer relaciones de identidad entre microorganismos aislados en cultivos sucesivos o de control, y definir el estado de revivida o de reinfección. La orina es una de las muestras que con más frecuencia se remite para cultivo. Debido a que la uretra se encuentra colonizada por bacterias potencialmente patógenas, se debe desechar la primera porción de la orina recogida de la micción o mediante cateterización. Los patógenos del aparato genitourinario pueden crecer también en la orina, por lo que no se debe retrasar el traslado de las muestras al laboratorio. Si la muestra no se puede cultivar inmediatamente, se debe refrigerar. Una vez que la muestra se encuentra en el laboratorio, se inoculan de 1 a 10 μl en cada medio de cultivo (generalmente un medio de agar no selectivo y un medio selectivo). Esto se hace así para que el número de microorganismos en la orina se pueda cuantificar, lo que es útil para valorar el significado de un aislamiento, aunque en un paciente con piuría se debe considerar clínicamente significativo un número escaso de microorganismos. Las bacterias que con mayor frecuencia se aíslan en la orina de pacientes con infección urinaria son: Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticcus, Proteus spp., Klebsiella spp., Enterococcus faecalis, entre otros. La presencia de microorganismos en orina se denomina bacteriuria, sean o no, causantes de infección. Toma de muestra. -Se toma la primera muestra de orina de la mañana. -Se hace asepsia en la zona genital con jabón neutro y agua. -El recipiente de la muestra debe estar esterilizado, y ser de boca ancha. -Se recoge en el recipiente solo la muestra del chorro medio de la micción. -Transportarse de inmediato al laboratorio.

MATERIALES Y MÉTODOS MATERIAL • Asa de nicromio calibrada • Portaobjetos • Cubreobjetos • Puente para tinciones • Hisopos estériles • Regla Laboratorio de Bacteriología Médica

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MATERIAL BIOLÓGICO • Muestra de orina REACTIVOS • Cristal violeta • Yodo Lugol • Alcohol cetona • Aceite de inmersión • Safranina • Naftol • KOH 40% • Cloruro Férrico • KOH 3% • Solución salina fisiológica 0.85% • Tubo 0.5 Nefelómetro de Mcfarland • Tubo con 5 ml de solución salina al 0.85% estéril • Sensidiscos a seleccionar de acuerdo a la bacteria aislada e identificada. • H2O2 al 3%. • Reactivo de oxidasa (Clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina) MEDIOS DE CULTIVO • Agar Sangre • Agar McK • Agar CLED o Chromoagar • Agar Mueller Hilton • Agar sal manitol PRUEBAS BIOQUÍMICAS • TSI • LIA • Citrato • FEA • RM • VP • MALONATO • MIO • SIM • Caldo con 6.5% NaCl • Agar Bilis Esculina EQUIPO • Microscopio • Mecheros • Incubadora • Cuenta colonias


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EQUIPO DE PROTECCIÓN • Bata • Guantes • Cubreboca METODOLOGÍA Primer día 1. Utilizar las técnicas asépticas correspondientes. 2. Utilizando un asa calibrada en 0.01 ml., tomar muestra de orina e inocular el agar CLED o Chromoagar, primero una línea recta en medio de la caja y posteiormente estriarla de arriba hacia abajo en movimientos de “Z”

3. Con el asa de nicromio o con la misma asa calibrada tomar muestra de orina y realizar una descarga sobre cada uno de los siguientes medios: Agar Mac Conkey, Agar Sangre y sal manitol. 4. Realizar el estriado en los cuatro cuadrantes, sin esterilizar el asa al cambiar a cada cuadrante. 5. Incubar las cajas a 35°C en condiciones de aerobiosis por 24 horas. 6. Hacer un frotis para teñirlo con la tinción de Gram, sin solución salina utilizando una gotita de orina, teñir y observar, y así leer cuantas bacterias hay en un campo (1 bacteria por campo 10 5 UFC/ml) 7. Observar las características físicas de la muestra: color, olor, aspecto y pH. Segundo día 8. Realizar la morfología colonial macroscópica de las diferentes colonias aisladas en los diversos medios de cultivo. 9. Realizar un frotis de las colonias aisladas y teñirlo con la Tinción de Gram. 10. Hacer el recuento de colonias en el agar CLED o Chromoagar con el apoyo de un cuenta colonias y reportar las UFC/ml 11. De acuerdo a el resultado de morfología macroscópica y microscópica seleccione las pruebas bioquímicas que debe inocular, para identificar el microorganismo aislado. 12. Incubar las pruebas bioquímicas a 35°C por 24 horas. 13. Se selecciona una caja donde haya colonias aisladas del microorganismo a observar y realizar el antibiograma a través del Método Kirby-Bauer • Se suspenden colonias en un tubo de solución salina fisiológica estéril hasta llegar a una concentración igual al tubo 0.5 del Nefelómetro de Mac Farland. • Para esto se iguala la turbidez de los dos tubos observando un fondo elaborado con líneas blancas y negras. • Se inocula en un agar Mueller Hinton recién preparado con estría cerrada en toda la caja. Utilizando un hisopo estéril. • Se colocan máximo 4 sensidiscos de antibióticos seleccionados de acuerdo al microorganismo aislado. • Invertir la caja y dejar incubar por 24 hrs. a 37°C. • Seguir el protocolo del Método de Kirby-Bauer descrito en anexos. Laboratorio de Bacteriología Médica

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Tercer día 14. Después de incubar las pruebas bioquímicas hacer la lectura correspondiente e IDENIFICAR la bacteria presente en la muestra de orina utilizando tablas de referencia. 15. Medir el halo de inhibición presentado en el Agar de Mueller Hinton e interpretar de acuerdo a las tablas la Sensibilidad, Sensibilidad Intermedio o Resistencia presentada y reportarla en la sección de resultados.

Revisar la siguiente referencia electrónica: Becton, Dickinson and Company. 2007. BBL Sensi-Disc Antimicrobial Susceptibility Test Discs (Discos BBL Sensi-Disc para el análisis de sensibilidad antimicro- biana). Disponible [online]. http://www.bd.com/ds/technicalCenter/inserts/8840621(1107).pdf

RESULTADOS Recuento de UFC/ml ________________________________________________ Características físicas


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PRUEBAS BIOQUÍMICAS: BACILOS GRAM NEGATIVOS Cepa de referencia Prueba bioquímica RESULTADO REFERENCIA TSI LIA Agar citrato FeA Caldo RM

Caldo VP Caldo malonato Caldo Urea Caldo Nitratos MIO SIM Oxidasa Catalasa


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PRUEBAS BIOQUÍMICAS: COCOS GRAM POSITIVOS RESULTADO

REFERENCIA

Coagulasa Manitolasa Bilis Esculina Cloruro de Sodio 6.5% Catalasa

ANTIBIOGRAMA Antibiótico

Halo de inhibición

Rango de inhibición

Resultado

BIBLIOGRAFÍA



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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIHUAHUA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Práctica No. 5 ANÁLISIS DE CEPAS DE REFERENCIA RELACIONADAS A INFECCIONES DEL TRACTO GENITAL Y DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO DE INFECCIONES DE TRANSMISIÓN SEXUAL


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RESULTADO DE APRENDIZAJE Describe las características macroscópicas, microscópicas y metabólicas de las cepas de referencia C. albicans y S. agalactiae. Describe los aspectos clínicos relacionados a infecciones del tracto genital tanto femenino como masculino, e identifica macroscópica, microscópica y metabólicamente al agente etiológico causal del proceso infeccioso.

INTRODUCCIÓN DESCRIPCIÓN DE CEPAS DE CEPAS DE REFERENCIA Streptococcus agalactiae Es un coco Gram positivo cuyo arreglo es en cadenas (Estreptococos), es anaerobio y aerobio facultativo y algunos presentan cápsula. Forman parte de la flora normal vaginal y son típicamente β-hemolíticos, hidrolizan el hipurato de sodio y dan positivo a la prueba de CAMP. Es causante de varias patologías como por ejemplo: neumonía, meningitis y septicemias como enfermedades neonatales de comienzo precoz, bacteriemia con meningitis en enfermedades neonatales de comienzo tardío, infecciones en mujeres gestantes. Candida albicans Es el hongo más patógeno de éste género. Se encuentra en la microbiota normal de la boca y tubo digestivo, y en las mujeres se localiza, además, en la vagina. Este hongo se reproduce por clami- dosporas y dan positivo a la prueba de pseudomicelio y presentan un crecimiento a los 37°C. En agar Biggy aparece como colonias lisas, circulares marrón-negro con flecos del micelio leve. INFECCIONES DE TRANSMISIÓN SEXUAL Las infecciones de trasmisión sexual (ITS) son un conjunto de afecciones clínicas infectocontagiosas que se transmiten de persona a persona por medio de contacto sexual que se produce, casi exclusivamente, durante las relaciones sexuales, incluido el sexo vaginal, sexo anal y el sexo oral; también por el uso de jeringuillas contaminadas o por contacto con la sangre, y algunas de ellas pueden transmitirse durante el embarazo, es decir, de la madre al hijo. Las consecuencias a largo plazo de ITS afectan sobre todo a las mujeres y a la infancia; entre las complicaciones de estas infecciones figuran las obstrucciones de las trompas de Falopio que provocan esterilidad y los peligrosos embarazos extrauterinos, el cáncer de útero, los abortos, las anormalidades congénitas y la ceguera del recién nacido. La vulnerabilidad de la mujer es mayor ya que la transmisión sexual de este tipo de infecciones es más eficaz si se contagia del hombre a la mujer, además el diagnóstico precoz de la mayoría de la ITS es más difícil de establecer en las mujeres que en los hombres. Los patrones epidemiológicos actualmente indican que las mujeres y los niños que tienen mayor probabilidad de morir o de padecer incapacidades permanentes a consecuencia de una ITS pertenecen a la clase más pobre o a grupos étnicos minoritarios. La Vaginosis Bacteriana es la causa más frecuente de consulta de la mujer por síntomas vaginales (40 a 50 %) seguida por Candidiasis (20 a 25 %) y Trichomoniasis (15 a 20 %). Laboratorio de Bacteriología Médica

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Las causas de Vaginitis / Vaginosis no puede determinarse solo sobre la base de los síntomas clínicos o el exa,men físico. Para realizar el diagnóstico correcto se requiere la evaluación microscópica del exudado vaginal. Los métodos de cultivo son menos útiles para el diagnóstico de algunas entidades vaginales. La evaluación microscópica requiere evaluar 3 características: *Aspecto de las células epiteliales, aspecto del germen dominante y morfotipos presentes, presencia o ausencia de leucocitos. Tradicionalmente, cinco enfermedades han sido clasificadas como de transmisión sexual: la sífilis, la gonorrea, el cancroide, el linfogranuloma venéreo y el granuloma inguinal. Sin embargo, muchas otras se trasmiten sexualmente, incluyendo el herpes genital, la hepatitis, el Molluscum contagiosum, el piojo púbico, las sarna y la infección por el VIH que produce el SIDA. Las enfermedades venéreas generalmente se agrupan según los síntomas y signos que producen. La sífilis, el herpes genital y el chancroide producen úlceras sobre la piel o las membranas que cubren la vagina o la boca. La gonorrea y las infecciones clamidiales causan uretritis (infamación y secreción de la uretra) en los hombres; cervicitis (infamación y secreción del cérvix) e infecciones pélvicas en las mujeres e infecciones oculares en los recién nacidos. Muchas de las infecciones de transmisión sexual mas comunes y mejor conocidas, como la gonorrea y la sífilis, son producidas por bacterias como Neisseria gonorrhoeae y Treponema pallidum respectivamente. Sífilis La sífilis es una enfermedad de transmisión sexual causada por la bacteria Treponema pallidum. Esta bacteria penetra en el organismo a través de las membranas mucosas, como las de la vagina o la boca, o bien a través de la piel. Horas después, llega cerca de los ganglios linfáticos y luego se propaga por todo el organismo a través de la sangre. La sífilis también puede infectar a un feto durante el embarazo, causando defectos congénitos u otros problemas. Una persona que ha sido curada de sífilis no se vuelve inmune y puede volver a infectarse. Gonorrea La gonorrea es una enfermedad de transmisión sexual causada por la bacteria Neisseria gonorrhoeae que infecta el revestimiento mucoso de la uretra, el cérvix, el recto y la garganta o la membrana blanca (la conjuntiva) de los ojos. La bacteria puede propagarse a través del flujo sanguíneo hacia otras partes del cuerpo, especialmente la piel y las extremidades. En las mujeres, puede ascender por el tracto genital para infectar las membranas que se encuentran dentro de la pelvis, causando dolor pélvico y problemas reproductivos. Chancroide El chancroide es una enfermedad de transmisión sexual causada por la bacteria Haemophilus ducreyi que produce úlceras genitales dolorosas y persistentes. A pesar de que fue una enfermedad rara, el número de casos de chancroide se ha incrementado en los últimos tiempos. Una persona con una úlcera de chancroide tiene más probabilidades de infectarse con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) si resulta expuesta a él. Linfogranuloma venéreo El linfogranuloma venéreo es una enfermedad de transmisión sexual causada por Chlamydia trachomatis, una bacteria de crecimiento intracelular.


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El linfogranuloma venéreo es causado por variedades de Chlamydia trachomatis diferentes de las que provocan inflamación de la uretra (uretritis) y el cérvix (cervicitis). Éste se produce generalmente en las zonas tropicales y subtropicales.

MATERIALES Y MÉTODOS MATERIAL • Asas de nicromio circular y recta • Portaobjetos • Cubreobjetos • Frasco de vidrio grande con tapa • Vela blanca pequeña • Mecheros de Bunsen MATERIAL BIOLÓGICO • Muestra de exudado genital en medio de tranporte y en solución salina fisiológica estéril. • Cepas de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae y Candida albicans, los cocos proporcionados en agar sangre y la levadura en agar Biggy EQUIPO • Microscopio compuesto de campo claro • Incubadora REACTIVOS • Solución salina fisiológica estéril 0.85% • Aceite de inmersión • Cristal violeta • Safranina • Yodo lugol • Alcohol acetona • Reactivo de oxidasa (Clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina) • H2O2 3% • Rojo de metilo • α- Naftol • KOH 40% • FeCl3 • Reactivo de Kovac’s • α-naftilamina • Ácido sulfanílico • Plasma • KOH 10% • KOH 3% MEDIOS DE CULTIVO • Agar MacConkey (McK) • Agar sangre • Agar Bismuto, glicina, glucosa, levadura (Biggy, por sus siglas en inglés) • Agar Thayer Martin Laboratorio de Bacteriología Médica

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PRUEBAS BIOQUÍMICAS • Rojo de metilo (RM) • Voges Proskauer (VP) • Fenilalanina deaminasa (FEA) • Medio Citrato de Simmons • Lisina Hierro Agar (LIA, por sus siglas en inglés) • Medio Movilidad, producción de Indol, descarboxilación de Ornitina (MIO) • Caldo de Urea • Medio de Malonato • Medio Reducción de Azufre, producción de Indol, Movilidad (SIM por sus siglas en inglés) • Medio Triple Azúcar Hierro (TSI, por sus siglas en inglés) • Caldo de nitratos EQUIPO DE SEGURIDAD PERSONAL • Bata para laboratorio • Guantes de látex • Cubreboca METODOLOGÍA 1. Describir características macroscópicas y microscópicas, esta última mediante la tinción de Gram, de las cepas de referencia. Streptococcus agalactiae y Candida albicans. 2. Realizar la prueba de la catalasa para la cepa de Streptococcus agalactiae, además realizar para esta misma cepa, la prueba de CAMP: a) Esterilizar el asa de nicromio circular en la flama del mechero, inocular en agar sangre preparado con eritrocitos ovinos o bovinos, una cepa β hemolítica de S. aureus en línea horizontal y líneas verticales del Streptococcus β hemolítico a identificar que queden a una distancia de 2mm. b) Incubar el medio a 35°C durante 24 horas en aerobiosis. No se recomienda la incubación en atmósfera de CO2 ya que la prueba puede inhibirse. c) La prueba se interpreta como positiva cuando se presenta un efecto en forma de flecha debido al sinergismo del factor CAMP del Streptococcus agalactiae con la hemolisina β (esfingomielasa C) del S.aureus.


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1. Realizar la prueba de tubo geminativo para la cepa de C. albicans: a) Esterilizar el asa de nicromio circular en la flama del mechero. b) Inocular 2 ó 3 colonias en el tubo que contiene plasma. c) Incubar a 37°C, durante 24 horas, en condiciones de aerobiosis. d) Realizar preparación húmeda y observar en el microscopio utilizando los objetivos 10X y 40X. e) Identificar las pseudohifas y los pseudomicelios característicos de Candida albicans. Exudado vaginal 2. Colectar la muestra de exudado: a) Con la paciente en posición ginecológica sobre la camilla, se introduce un espéculo estéril sin lubricante a la vagina (si es necesario, utilizar agua para lubricación). b) Se recoge la muestra, bajo visión directa con un hisopo estéril de la zona de mayor exudado o del fondo del saco vaginal posterior. c) Repetir la operación por segunda vez, esto para tener una muestra para el estudio microscópico y la otra para el cultivo y la identificación bacteriana. Exudado uretral a) Limpiar cuidadosamente la mucosa circundante del pene con gasas estériles. b) Introducir suavemente la torunda uretral fina con un movimiento de rotación hasta penetrar por la uretra unos 2 cm. Introducir de 3 a 5 cm para la identificación de Chlamydia trachomatis. c) Repetir la operación con una segunda torunda. d) Cuando no haya suficiente exudado, puede estimularse mediante un masaje suave. Transporte y conservación El envío de la muestra debe ser de inmediato. Cuando la muestra pueda procesarse antes de 15 minutos deberán emplearse torundas con medio de transporte tipo Stuart – Amies, que se mantendrán a temperatura ambiente, o preferentemente, en estufa a 35 a 37 º C hasta su procesamiento, con un máximo de 6 a 12 horas. 2. Descagar la muestra con hisopo iniciando en los medios de cultivo enriquecidos y posteriormente en los selectivos y diferenciales. 3. Esterilizar sólo una vez el asa de nicromio circular en la flama del mechero y estriar los medios en orden inverso a la descarga, utilizando la técnica para cultivo puro. 4. Incubar los medios a 35°C durante 24 a 48 horas, los selectivos y diferenciales en condiciones de aerobiosis y los enriquecidos en microerofilia (carboxifilia), utilizando el frasco de vidrio con tapa y la vela blanca pequeña. 5. Realizar tinción de Gram a partir de la muestra proporcionada en medio de transporte Stuart y leer 20 campos para determinar los morfotipos de acuerdo a los criterios de Nugent. 6. A partir de la muestra colectada en solución salina fisiológica realizar la prueba de aminas, utilizando KOH al 10% y elaborar preparación húmeda para la identificación del protozoo flagelado Trichomonas vaginalis. 7. A partir de las colonias aisladas, realizar morfologías macroscópica y microscópica, para esta última utilizar tinción de Gram. 8. Realizar las pruebas metabólicas necesarias para la identificación de género y especie del agente etiológico causal del proceso infeccioso. 9. Incubar las pruebas metabólicas a 35°C, durante 24 horas en condiciones de aerobiosis. 10. Interpretar las pruebas bioquímicas. 11. Realizar las anotaciones correspondientes y comparar los resultados con los de la bibliografía correspondiente. Laboratorio de Bacteriología Médica

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RESULTADOS




Cepa de referencia Forma Arreglo


Afinidad Tintorial

Tubo germinativo

MUESTRA PROBLEMA Criterios de Nugent


40







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PRUEBAS BIOQUÍMICAS: BACILOS GRAM NEGATIVOS Prueba bioquímica

RESULTADO

REFERENCIA

TSI LIA Agar citrato FeA Caldo RM Caldo VP Caldo malonato Caldo Urea Caldo Nitratos MIO SIM Oxidasa Catalasa

BIBLIOGRAFÍA

• Brooks, G.F., Carroll, K.C., Butel, J.S., Morse, S.A. (2008). Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Alderberg. 19a edición. Editorial Manual Moderno. México D.F. • Ingraham, I.J., Ingraham, A.C.; (1998) Introducción a la microbiología, editorial Reverté, S.A.; Barcelona España. • Madigan T.M., Martinko, M.J., Parker, J.; BROCK Biología de los Microorganismos; PEARSON Prentice Hall, Madrid España. • Murray, P.R., Rosenthal, K.S., Kobayashi, G.S., Pfaller, M.A. (2009). Microbiología Médica. 6ta. edición. Editorial Elsevier Mosby. Madrid, España. • Nugent P.R.,'* Krohn A.M.,2 and Hillier L.S.,3Reliability of Diagnosing Bacterial Vaginosis Is Improved by a Standardized Method of Gram Stain Interpretation, Pediatric, Adolescent, and Maternal AIDS Branch, National Institute of Child Health and Human Development, Executive Plaza North, Bethesda, Maryland 20892,1 and Department of Epidemiology2 and Department of Obstetrics and Gynecology,3 University of Washington, Seattle, Washington 98195.


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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIHUAHUA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Práctica No. 6 ENFERMEDADES DE VÍAS RESPIRATORIAS:

“ANÁLISIS DE CEPAS”


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RESULTADO DE APRENDIZAJE Cultiva e Identifica cepas bacterianas del tracto respiratorio.

INTRODUCCIÓN Dentro de las vías respiratorias existe, envuelto por tejido epitelial, un ambiente cálido y húmedo, al que llega el aire inspirado cargado de agentes patógenos. Los microorganismos que allí llegan son virus, bacterias, hongos y parásitos. Las infecciones más comunes de las vías respiratorias son causadas por virus y bacterias. Algunas son relativamente inocuas, mientras que otras pueden poner la vida en compromiso. La facilidad con que se producen las infecciones en el aparato respiratorio varía según el estado de salud del individuo. Cabe señalar que algunos gérmenes invaden únicamente algunas partes del aparato respiratorio. La cavidad orofaríngea es susceptible de infecciones por bacterias, virus y hongos; las infecciones virales suelen ser autolimitadas, pero hacen que los tejidos afectados se vuelvan más propensos a infecciones secundarias por bacterias. En la tráquea y los bronquios las infecciones virales hacen que las vías respiratorias se vuelvan propensas a las sobreinfecciones bacterianas. Los cocos Gram positivos son un grupo heterogéneo de bacterias. Las características que contienen en común son su forma esférica, su reacción a la tinción de Gram y la ausencia de endoesporas. La presencia o ausencia de actividad catalasa es una prueba sencilla que se utiliza para subdividirlas en varios géneros. GENERO STAPHYLOCOCCUS Familia Micrococcaceae. El nombre del género Staphylococcus procede del griego staphylé, (racimo de uvas). La mayor parte de los estafilococos tiene un diámetro de entre 0.5 y 1 µm y son anaerobios facultativos (es decir, crecen aerobia y anaerobiamente) inmóviles, capaces de crecer en un medio con una elevada concentración de sal y a temperaturas desde 18 hasta 40° C. Estas bacterias están presentes en la piel y en las mucosas del ser humano. Especies de interés clínico: S. aureus. Existen otras especies cuya significación clínica está condicionada por su número (cantidad abundante o cultivo puro), tipo de paciente y muestra (en líquidos estériles su valor en grande), ya que son comensales y oportunistas, fundamentalmente son S. epidermidis y S. saprophyticus. Cocos grampositivos, catalasa (+) y anaerobios facultativos. GÉNERO STREPTOCOCCUS Familia Streptococcaceae. Cocos gram positivos, catalasa (-)1, anaerobios facultativos. Clasificación: Se realiza según varios criterios: - Tipo de hemólisis. - Antígenos somáticos: - Polisacárido C2: Permite clasificar en los serogrupos de Lancefield A-H y K-V. - Antígeno capsular: Presente en algunas especies y actúan como marcador de tipo. Laboratorio de Bacteriología Médica

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-

Otros antígenos de tipo: Actúan como marcadores epidemiológicos. Proteína M. En la superficie de la fimbria. Proteínas T (resistente a la tripsina) y R. Propiedades Bioquímicas: Sensibilidad a la Bacitracina y a la Optoquina. Tolerancia a NaCl 6.5% (S. bovis no lo tolera; Enterococcus spp. si). Crecimiento en medio con bilis e hidrólisis de la esculina (S. bovis, Enterococcus spp.). Factor CAMP (fosfolipasa inducida por la presencia de S. aureus).

El género Streptococcus es un grupo formado por diversos cocos Gram positivos que normalmente se disponen en parejas o en cadenas. La mayoría de las especies son anaerobios facultativos, y algunos carecen únicamente en una atmósfera enriquecida con dióxido de carbono.

Grupos bioquímicos

Serogrupos

Hemólisis

S. pyogenes

A

β

S. agalactiae

B

β

S. anginosus

C, F, G

β

S. bovis

D

S. grupo viridans

No está presente

S. pneumoniae

No está presente

Enterococcus spp.

Descripción de cepas a estudiar en el presente objeto de estudio Streptococcus pyogenes: Origina diversas enfermedades supurativas y no supurativas. Aunque este microorganismo constituye la causa mas frecuente de faringitis bacteriana. Son cocos esféricos de diámetro comprendido entre 1 y 2 µm que forman cadenas cortas en las muestras clínicas y cadenas de mayor longitud cuando crecen en medios de cultivo. Su crecimiento es optimo en el medio agar sangre enriquecido con sangre de carnero, pero se inhibe cuando tiene una concentración elevada de glucosa. Después de 24 horas de incubación se observan colonias blancas de 1 a 2 mm con grandes zonas de β-hemolisis. Este presenta sensibilidad a la Bacitracina, produce ácido hialurónico capsular que se presenta en la placa como una gota de agua, es catalasa (–), tiene metabolismo fermentativo con producción de acido láctico y no produce gas. Streptococcus pneumoniae: El neumococo es un coco Gram positivo encapsulado. Las células tienen un diámetro de de 0.5 a 1.2 µm, con forma ovalada o de lanceta, y se disponen en parejas (diplococos) o en cadenas cortas. La morfología de las colonias es variable. Las colonias de las cepas encapsuladas suelen ser grandes (1 a 3 mm de diámetro en agar sangre; más pequeñas en medios como chocolate) redondas y mucoides; las colonias de las cepas no encapsuladas son más pequeñas y aplanadas. Las colonias aparecen como α-hemolíticas en agar sangre cuando se incuban en una atmosfera aerobia, y pueden ser β-hemolíticas cuando crecen en condiciones Laboratorio de Bacteriología Médica

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anaerobias. Es un microorganismo exigente, solo puede crecer en medios enriquecidos con productos sanguíneos. S. pneumoniae se puede identificar también por su sensibilidad a la optoquina (etilhidrocupreína dihidrocloruro), carece de la actividad catalasa. ban en una atmosfera aerobia, y pueden ser β-hemolíticas cuando crecen en condiciones anaerobias. Es un microorganismo exigente, solo puede crecer en medios enriquecidos con productos sanguíneos. S. pneumoniae se puede identificar también por su sensibilidad a la optoquina (etilhidrocupreína dihidrocloruro), carece de la actividad catalasa. Staphylococcus aureus: La mayor parte de los estafilococos tiene un diámetro de entre 0,5 y 1 mm y son anaerobios facultativos (es decir, crecen aerobia y anaerobiamente) inmóviles capaces de crecer en un medio con una elevada concentración de sal (p. ej., cloruro sódico al 10%) y a temperaturas desde 18 hasta 40 °C. Cocos gram positivos, catalasa positivos organizados en forma de racimos, capsulados, y dan positivo a la prueba de coagulasa, son halofílicos, por lo que se pueden aislar en el Agar Sal-Manitol y presentan una β-hemólisis en el Agar Sangre, en cuanto a su morfología colonial se caracterizan por presentar colonias color dorado, cremosas y brillantes. Está presente como biota normal de la piel y de las superficies mucosas y está involucrado en las enfermedades cutáneas como carbuncos, foliculitis e infección de heridas; en enfermedades mediadas por toxinas como en la intoxicación alimentaria, el síndrome de la piel escaldada y el síndrome del shock tóxico; en artritis séptica, bacteriemia, endocarditis y neumonía. Staphylococcus epidermidis: Son cocos gram positivos que se caracterizan por no producir la enzima coagulasa, no fermenta el manitol, presentan una γ-hemólisis, forman colonias de color blanco. En medio no selectivos, como agar sangre, agar tripticasa soya y otros, producen colonias de 1-3 mm de diámetro en las primeras 18 a 24 horas de incubación, gracias a estos factores se pueden diferenciar de S. aureus en el laboratorio. Se encuentra constantemente en la piel, en especial en los lugares húmedos y zonas de transición del epitelio cutáneo-mucoso. Por lo general no es patógeno, pero puede comportarse como una bacteria oportunista y producir ocasionalmente infecciones urinarias, infecciones de las heridas postoperatorias, endocarditis, meningitis e incluso sepsis. Corynebacterium spp: C. diphtheriae: son bacilos rectos ó ligeramente curvos gram positivos aerobios y anaerobios facultativos, contienen gránulos metacromáticos (acúmulos de polifosfatos como una fuente de energía) que se observan con la tinción de Albert, presentan una γ-hemólisis, tienen la capacidad de hidrolizar el telurito, que se le adiciona en el agar sangre para su diagnóstico. Las corinebacterias son aerobias o anaerobias facultativas, inmóviles y catalasa-positivas. La mayoría, pero no todas, las especies fermentan los hidratos de carbono y generan moléculas de ácido láctico. Otras bacterias corineformes se relacionan. Klebsiella pneumoniae: En la tinción de Gram son negativos, la asimilación y la fermentación de la lactosa se puede observar en el Agar Mac Conkey donde las colonias son de color rosado y en el medio Kliger o TSI donde son Ácido/Ácido, es decir fermentador de la lactosa mas producción de gas; y en la fermentación butanodiólica o prueba de Voges Proskauer son positivos. Por último, sus condiciones óptimas de cultivo son en agar nutritivo a 37 °C, pH de 7.0 – 7.6. Su formación de cápsula y la falta de movilidad son características específicas. Otras especies de Klebsiella son: K. oxytoca, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis. Son lactosa, glucosa, sacarosa y ureasa positivas, tienen producción de gas y dan positivo al Vogues-Proskauer.


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MATERIALES Y MÉTODOS MATERIAL • Asas de nicromio circular y recta • Portaobjetos • Puente para tinciones • Mecheros de Bunsen • Frasco de vidrio grande con tapa • Vela blanca pequeña MATERIAL BIOLÓGICO • Cepas de referencia: 1. S. pyogenes, 2. S. pneumoniae, 3. S. aureus, 4. S. epidermidis, 5. Corynebacterium spp, y 6. Klebsiella pneumoniae proporcionadas en caldo nutritivo EQUIPO • Microscopio • Incubadora • Mecheros REACTIVOS • Cristal violeta • Yodo Lugol • Alcohol cetona • Aceite de inmersión • Safranina • Naftol • KOH 40% • Cloruro Férrico • KOH 3% • Solución salina fisiológica 0.85% • Reactivos para Oxidasa • H2O2 • KOH 40% • Reactivo de Kovac’s • α – Naftol • Reactivos N1 y N2 MEDIOS DE CULTIVO • • • •

Agar Sangre Agar Sangre + Telurito de potasio 2% Agar McK Agar Sal Manitol

PRUEBAS BIOQUIMICAS • •

API 20E Catalasa


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• • •

Coagulasa Oxidasa Disco A

EQUIPO DE SEGURIDAD PERSONAL • Bata para uso de laboratorio • Guantes de látex • Cubreboca METODOLOGIA DÍA 1 1.- Proceder a sembrar; utilizando las técnicas de asepsia, quemando el asa, como se muestra a continuación: 1

3

2

4

Agar Sangre.

3

4

Agar Sal Manitol

5

Agar Sangre + Telurito de Potasio 2%

6

MCK

2.- Proceder a incubar los agares con las cepas 1, 2 en el frasco de vidrio a condiciones de carboxifilia por 24 hrs. a 37°C. Las demás cajas en condiciones de aerobiosis a 37°C. DÍA 2 1. Realizar la lectura macroscópica de los agares. 2. Realizar la tinción de Gram, para observar la morfología microscópica. 3. Realizar las pruebas bioquímicas que se describen a continuación:


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• • • •

S. pyoneges: Catalasa, Hemólisis Factor Camp Sensibilidad Bacitracina

• • •

S. pneumoniae: Catalasa Hemólisis Sensibilidad Optoquina.

S. aureus

• • • •

• • • • • •

S. aureus: Catalasa Coagulasa Manitol Hemólisis

Staphylococcus epidermidis: • Catalasa • Coagulasa • Manitol • Hemólisis

Klebsiella pneumoniae: • API • Oxidasa

Corynebacterium spp: Catalasa O/F Glucosa O/F Maltosa O/F Sacarosa O/F Lactosa Caldo de Nitratos

Con relación a la prueba de sensibilidad de la optoquina de S. pneumoniae, el microorganismo se siembra en una placa de agar sangre y se coloca un disco saturado con optoquina en el centro del inóculo. Después de incubar las placas durante una noche, alrededor del disco se observa una zona de inhibición del crecimiento bacteriano. Se pueden llevar a cabo pruebas diagnósticas bioquímicas, serológicas y moleculares adicionales con el fin de lograr la identificación definitiva.


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En cuanto a la Prueba API para Klebsiella pneumoniae se siguen los siguientes pasos: Se coloca la tira en su propia cámara húmeda de incubación. Previamente se pone agua en los alvéolos de la cámara para proporcionar una atmósfera húmeda durante la incubación 1. A partir de una colonia aislada del microorganismo, realizar una suspensión en 5 ml de solución salina (0.85% de NaCl) o 5 ml de agua estéril. 2. Para las pruebas |CIT|, |VP| Y |GEL|, llenar el tubo y la cúpula.

3. Para las pruebas restantes, llenar únicamente los tubos y no las cúpulas

4. Para las pruebas: ADH, LDC, ODC, H2S, Y URE, Se crea una atmósfera anaerobia llenando la cúpula con aceite estéril.

5. Incubar a 36 °C durante 18 a 24 h. DÍA 3 1. Proceder a la lectura del API, basándose en la bibliografía correspondiente, y apoyándose en las imágenes que a continuación se presentan.


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RESULTADOS

Cepa de referencia Medio de cultivo


Klebsiella pneumoniae

Agar Mac Conckey

Forma Tamaño

Color Elevación Borde Luz Reflejada Luz transmitida Consistencia Sustrato

Forma Arreglo Afinidad Tintorial


Sistema Api 20 E -( !


Prueba de Oxidasa !

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5

Resultado que se debe interpretar en el SOFTWARE API 20 E '31*67*"*89:;*

!


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Streptococcus pyogenes

Agar sangre

Forma Tamaño

Color Elevación Borde Luz Reflejada Luz transmitida Consistencia Sustrato



PRUEBAS BIOQUÍMICAS HEMOLISIS Tipo de hemólisis presente CAMP Prueba de CAMP CATALASA Presencia de catalasa PRUEBA DE BACITRACINA


RESULTADO

REFERENCIA

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Streptococcus pneumoniae Agar sangre

Forma Tamaño Color Elevación Borde Luz Reflejada Luz transmitida Consistencia Hemólisis



PRUEBAS BIOQUIMICAS HEMOLISIS Tipo de hemólisis presente CATALASA Presencia de catalasa PRUEBA DE OPTOQUINA


RESULTADO

REFERENCIA

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MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA Sthaphylococcus aureus


Forma Tamaño Color Elevación Borde Luz Reflejada Luz transmitida Consistencia Sustrato

Agar Sangre

Hemólisis


Agar Sal Manitol

Manitol


PRUEBAS BIOQUIMICAS HEMOLISIS Tipo de hemólisis presente COAGULASA Presencia de coagulasa CATALASA Presencia de catalasa MANITOL


RESULTADO

REFERENCIA

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Cepa de referencia

MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA Corynebacterium spp.

Medio de cultivo

Agar Sangre + Telurito de Potasio

Forma

Tamaño Color Elevación Borde Luz Reflejada Luz transmitida Consistencia Reducción del telurito de potasio



PRUEBAS BIOQUIMICAS

Catalasa O/F glucosa O/F lactosa O/F sacarosa O/F maltosa Caldo de nitratos

RESULTADO

REFERENCIA

Especie identificada:


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MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA Sthaphylococcus epidermidis


Forma Tamaño Color Elevación Borde Luz Reflejada Luz transmitida Consistencia Sustrato

Agar Sangre

Hemólisis


Agar Sal Manitol

Manitol


PRUEBAS BIOQUIMICAS HEMOLISIS Tipo de hemólisis presente COAGULASA Presencia de coagulasa CATALASA Presencia de catalasa MANITOL

RESULTADO

REFERENCIA

BIBLIOGRAFÍA

• Brooks, F.G., Butel, J.S., Morse, S.A., (2005). Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg, 18va edición, Editorial el Manual Moderno. • Brooks, G.F., Carroll, K.C., Butel, J.S., Morse, S.A. (2008). Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Alderberg. 19a edición. Editorial Manual Moderno. México D.F. • Ingraham, I.J., Ingraham, A.C.; (1998) Introducción a la microbiología, editorial Reverté, S.A.; Barcelona España. • Madigan T.M., Martinko, M.J., Parker, J.; BROCK Biología de los Microorganismos; PEARSON Prentice Hall, Madrid España. • Murray, P.R., Rosenthal, K.S., Kobayashi, G.S., Pfaller, M.A. (2009). Microbiología Médica. 6ta. edición. Editorial Elsevier Mosby. Madrid, España. Laboratorio de Bacteriología Médica

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIHUAHUA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Práctica No. 7 DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO DE INFECCIONES DE VÍAS RESPIRATORIAS ALTAS: FARINGE, NASOFARINGE, CONJUNTIVA Y OIDOS


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RESULTADO DE APRENDIZAJE Realiza el diagnóstico bacteriológico de los microorganismos patógenos del tracto respiratorio superior a través de una muestra de faringe, nasofaringe, ojos u oído, aislando e identificando el agente etiológico.

INTRODUCCIÓN Las bacterias y los virus son los agentes etiológicos más frecuentes de las infecciones de las vías respiratorias superiores. Algunas de estas infecciones son benignas, pero otras pueden causar súbitamente la muerte del individuo debido a la particular anatomía del tracto respiratorio. Puesto que el aire debe penetrar a través de un único y estrecho conducto respiratorio, especialmente en la región situada anteriormente al lugar donde la tráquea se bifurca para comunicarse con los bronquios, las infecciones que provocan una inflamación de las paredes de este conducto pueden ocasionar el bloqueo de la entrada del aire y causar la muerte súbita por asfixia, como ocurre en la epiglotis y en la difteria. La mayoría de las infecciones bacterianas de la faringe se deben a Streptococcus del grupo A. Otras bacterias que pueden producir faringitis son Corynebacterium diphteriae, B. pertussis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydophila pneumoniae y Micoplasma pneumoniae. Sin embargo, el aislamiento de estas especies bacterianas exige la utilización de técnicas especiales. Otras bacterias potencialmente patógenas, como Staphylococcus aureus, S. pneumoniae, Haemophilus influenzae, enterobacterias y Pseudomonas aeruginosa, pueden estar presentes en la bucofaringe, si bien rara vez producen faringitis. BRONQUITIS AGUDA: Es una inflamación de los bronquios debida, generalmente, a una infección. Es una de las enfermedades más frecuentes, que aparecen como secuela de una infección de las vías respiratorias superiores. La causa de la mayoría de los casos de bronquitis aguda es vírica; sin embargo las bacterias también son causa frecuente en fumadores (p. ej. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae) y en no fumadores (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae). En la bronquitis aguda la tos persistente que sigue a la infección de las vías aéreas superiores (p. ej. rinitis y faringitis) es el síntoma más común, la tos se acompaña a menudo con la presencia de expectoración mucosa y clara, aunque algunos pacientes presentan esputo purulento. Síntomas asociados pueden ser fiebre, cefaleas, malestar general y disnea al esfuerzo. La radiografía de tórax puede diferenciar la bronquitis aguda de la neumonía porque en la bronquitis no hay evidencia de condensación o infiltrados. FARINGITIS: Es una inflamación de las paredes de la faringe, incluye amígdalas, paladar y úvula. Puede ser causada por infección vírica, bacteriana o fúngica. La faringitis vírica supone aproximadamente el 70% de los casos. La faringitis aguda folicular es el resultado de la invasión por Estreptococo β-hemolítico y representa un 15-20% de los episodios restantes. La faringitis fúngica especialmente la candidiasis, aparece con el uso prolongado de antibióticos o corticoides inhalados o en pacientes inmunosuprimidos, especialmente los que sufren infección por VIH. Laboratorio de Bacteriología Médica

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Se debe utilizar un hisopo de Dacron o de alginato de calcio para obtener las muestras faríngeas. Se deben tomar muestras de la zona de las amígdalas, la faringe posterior y de cualquier exudado o zona ulcerada. SINUSITIS AGUDA: Es una infección de uno o más de los senos paranasales y suelen producirse como una complicación de un resfriado común u otra infección vírica. Está presente en el 90% de los resfriados comunes, pero solo es de origen bacteriano en muy pocos casos. La tos y los estornudos crean diferencias de presión entre los espacios aerobios y las zonas contiguas, haciendo que las bacterias que colonizan la nasofaringe penetren en los senos, donde se multiplican rápidamente. El malestar en la zona de los senos frontales o maxilares es un síntoma frecuente en el resfriado común, pero es la aparición de dolor facial, fiebre y rinorrea purulenta lo que sugiere presencia de sinusitis aguda. Los agentes etiológicos son análogos a los de la otitis aguda: S. pneumoniae, H. influenzae y M. catarrhalis. El diagnóstico clínico se confirma con una radiografía de senos paranasales observando su o cupación y nivel hidroaéreo. El diagnostico etiológico exacto no es fácil, por la dificultad de tomar muestras adecuadas para el cultivo sin que se contamine la muestra a su paso por la nariz. OTITIS MEDIA AGUDA: Es una infección de oído medio que se produce por la llegada de microorganismos a través de la trompa de Eustaquio. Es una de las infecciones más frecuentes en niños entre los 6 meses y los 3 años. Puede ser causada por bacterias y virus en solitario o en combinación. Entre las bacterias, las más frecuentes son S. pneumoniae, H. influenzae y Moraxella catarrhalis. La otitis media aguda se define como la presencia de secreciones en el oído medio, cuyo síntoma predominante es la otalgia. El tímpano está edematoso y puede abombarse hasta romperse, por lo que se producirán la salida por el oído externo del material purulento y la mejoría o desaparición del dolor. En las otitis medias crónicas supuradas la flora es polimicrobiana, aumentando la frecuencia de enterobacilos, Pseudomonas spp., S. aureus y anaerobios. Algunas de las complicaciones que se dan son mastoiditis, laberintitis, meningitis aguda, absceso de cerebro, epidural o subdural y trombosis del seno lateral. Las muestras se deben aspirar con una aguja y una jeringa; el cultivo del oído externo no tiene valor predictivo para la otitis media. Las infecciones del oído externo se producen típicamente por Ps. aeruginosa («el oído del nadador») o por S. aureus. La muestra adecuada para el cultivo se obtiene mediante el raspado con hisopo de la zona del oído afectada.


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INFECCIONES DE OJOS: Aunque los patógenos oculares más frecuentes crecen rápidamente (p. ej., S. aureus, S. pneumoniae, H. influenzae, Ps. aeruginosa, Bacillus cereus), algunos pueden necesitar tiempos de incubación prolongados (p. ej., estafilococos coagulasa-negativos) o el uso de medios de cultivo especializados (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis). Para las infecciones de la superficie del ojo, las muestras se recogen con un hisopo antes de aplicar anestésicos tópicos o un legrado corneal; para las infecciones profundas, se realiza la aspiración del humor vítreo o acuoso; todas las muestras se deben introducir en un medio adecuado al ser recogidas; el retraso provocará la pérdida significativa de microorganismos. La recogida de muestras para el diagnóstico de las infecciones oculares es difícil debido a que las muestras obtenidas son generalmente muy escasas y a que están presentes relativamente pocos microorganismos.

MATERIALES Y MÉTODOS MATERIAL • Asas de nicromio • Portaobjetos • Gradilla • Hisopo • Puente para tinciones • Mecheros de Bunsen • Frasco de vidrio grande con tapa • Vela blanca pequeña MATERIAL BIOLÓGICO • Muestra faríngea Aunque también puede ser: • Muestra de conjuntiva • Muestra de oído • Muestra nasofaríngea EQUIPO • Microscopio • Incubadora • Mecheros REACTIVOS • Reactivos para tinción de Gram • Aceite de inmersión. • KOH 40%


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• • • •

Reactivo de Kovac’s α – Naftol Solucion salina fisiológica 0.85% KOH 3%

MEDIOS DE CULTIVO • • • •

Agar Sangre humana Agar Sal Manitol Agar Mac Conkey Medio de Stuart

PRUEBAS BIOQUIMICAS • H2O2 al 3% • Plasma • Caldo de manitol • Disco A • Disco P • Medio Basal O/F: glucosa 1%, lactosa 1%, maltosa 1%, sacarosa1%. • Caldo nitratos • Rojo de metilo (RM) • Voges Proskauer (VP) • Fenilalanina deaminasa (FeA) • Citrato • Lisina Hierro Agar (LIA) • MIO (Movilidad, producción de Indol y descarboxilación de Ornitina) • Caldo de Urea • Malonato • SIM (Reducción de Azufre, producción de Indol y Movilidad) • Medio Triple Azúcar Hierro (TSI) EQUIPO DE SEGURIDAD PERSONAL • Bata para uso de laboratorio • Guantes de látex • Cubreboca METODOLOGÍA TOMA DE MUESTRA: Exudado faríngeo: Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrás. Con ayuda de un abatelenguas se empuja la lengua hacia abajo para facilitar el acceso a la parte posterior de la faringe, con un hisopo de algodón previamente estéril se realiza un raspado de las áreas hipéremicas, purulentas o de membranas, en el área de inflamación; se recoge el exudado si existe; se debe evitar el contacto con la saliva porque puede inhibir la recuperación de los estreptococos del grupo A.


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DÍA 1 1. Proceder a la toma de muestra de exudado Faríngeo, utilizando un hisopo estéril. 2. Proceder a la inoculación de los agares: Sangre, Mac Conkey y Sal manitol; primero realizar un estriado en el primer cuadrante con el hisopo en cada uno de los medios, seguir con el estriado en los siguientes cuadrantes con el asa de nicromio circular previamente estéril. 3. Incubar a 37°C durante 24 horas a excepción del agar sangre que se incuba en condiciones de carboxifília. 4. Realizar frotis de la muestra en portaobjetos proceder a la tinción de Gram y observar al microscopio. DÍA 2 1. Realizar la morfología macroscópica observando características del crecimiento bacteriano evaluando color, borde, elevación, consistencia, luz reflejada, luz transmitida y la hemólisis en el caso del Agar Sangre. 2. Realizar tinción de Gram para observar la morfología microscópica. 3. Si se presenta crecimiento en agar Mac Conkey se tendrán que realizar las pruebas bioquímicas correspondientes a microorganismos Gram (-), a estos también se les realizan la prueba de oxidasa. 4. Para el agar sangre se revisa si presentaba hemólisis; para α hemólisis se debe realizar prueba de catalasa, si es negativa se realiza la prueba de la Optoquina (S. pneumoniae). Si se presenta una β-hemólisis y prueba de catalasa negativa se realiza prueba de Bacitracina (S. pyogenes). 5. En cuanto al agar sal manitol se emplea para observar crecimiento y la utilización de manitol, se realiza las pruebas de coagulasa y catalasa, para confirmar la especie de Estafilocococo. Laboratorio de Bacteriología Médica

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RESULTADOS FROTIS DEL EXUDADO FARÍNGEO Respuesta inflamatoria: Microorganismos observados:

MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA Muestra Medio de Cultivo Forma Tamaño Color Elevación Borde Luz reflejada Luz trasmitida Consistencia Sustrato

MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA Cepa aislada Forma Arreglo Afinidad Tintorial


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Cepa aislada

Hemólisis Catalasa Coagulasa Optoquina Bacitracina Manitol TSI LIA Citrato FeA RM VP Malonato MIO: Movilidad Indol Descarboxilacion de ornitina SIM: Movilidad Indol H2S

PRUEBAS BIOQUIMICAS Resultado

Refererencia

Microorganismo identificado:

BIBILOGRAFÍA

• Brooks, F.G., Butel, J.S., Morse, S.A., (2005). Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg, 18va edición, Editorial el Manual Moderno. • Brooks, G.F., Carroll, K.C., Butel, J.S., Morse, S.A. (2008). Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Alderberg. 19a edición. Editorial Manual Moderno. México D.F. • De la Rosa, M., Prieto J. Microbiología para Ciencias de la Salud. (2003).2da Edición. Editorial Elsevier. España. • Ingraham, I.J., Ingraham, A.C.; (1998) Introducción a la microbiología, editorial Reverté, S.A.; Barcelona España. • Madigan T.M., Martinko, M.J., Parker, J.; BROCK Biología de los Microorganismos; PEARSON Prentice Hall, Madrid España. • Murray, P.R., Rosenthal, K.S., Kobayashi, G.S., Pfaller, M.A. (2009). Microbiología Médica. 6ta. edición. Editorial Elsevier Mosby. Madrid, España. Laboratorio de Bacteriología Médica

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIHUAHUA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Práctica No. 8 DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO DE INFECCIONES DE VÍAS RESPIRATORIAS BAJAS: DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSIS


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RESULTADO DE APRENDIZAJE Realiza el diagnóstico bacteriológico de los microorganismos patógenos del tracto respiratorio inferior a través de una muestra de esputo, identificando microscópicamente y en cultivo a Mycobacterium tuberculosis.

INTRODUCCIÓN La tuberculosis es una enfermedad transmisible de declaración obligatoria, a menudo de larga duración producida por M. tuberculosis, la cual fue descubierta por Koch en 1882. Mycobacterium bovis, responsable de la tuberculosis bovina, también puede producir tuberculosis en el huésped humano. GÉNERO MYCOBACTERIUM Clasificación Clínica de las especies: Micobacterias que producen la tuberculosis: M. tuberculosis, M. bovis y M. africanum. Micobacteria que produce la lepra: M. leprae. Micobacterias atípicas o ambientales, productoras de las micobacteriosis: sólo algunas especies son patógenas estrictas (como M. kansasii) y la mayoría son oportunistas (como M. chelonae). M. tuberculosis es un parasito intracelular obligado y el hombre es su único reservorio. La tuberculosis puede afectar a todos los órganos, produciendo características alteraciones anatomo patológicas. Los pacientes con enfermedad latente por M. tuberculosis desarrollan habitualmente un test de tuberculina positivo, pero son asintomáticos y no infecciosos. Estas personas presentan un riesgo de un 10% de desarrollar enfermedad tuberculosa o tuberculosis activa durante su vida. En 2002 la Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que 2000 millones de personas, una tercera parte de la población mundial, presentaba una infección por M. tuberculosis. Las personas con riesgo elevado de enfermedad por M. tuberculosis son, los alcohólicos, los drogadictos, los reclusos y los individuos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Puesto que es difícil erradicar la enfermedad en estos pacientes, la diseminación de la infección a otros grupos de población, como los profesionales sanitarios, constituye un importante problema de salud. Esta circunstancia es especialmente cierta en los casos de M. tuberculosis multirresistente, ya que los pacientes que reciben un tratamiento inadecuado pueden constituir un foco de infección durante periodos de tiempo prolongados. En cuanto al diagnostico, la toma de muestra se realizara según la localización de la enfermedad; se obtendrá esputo, orina, jugo gástrico, biopsia, LCR, etc. La cantidad será la mayor posible y se realizara en un mínimo de tres muestras en días consecutivos ya que la eliminación de bacilos no es constante. Se pueden utilizar varias técnicas para obtener muestras de las vías respiratorias inferiores, entre las que se incluyen la expectoración, la inducción con solución salina, la broncoscopia y la aspiración directa a través de la pared torácica. Dado que las bacterias de las vías respiratorias superiores pueden contaminar los esputos expectorados e inducidos, se deben examinar las muestras al microscopio con el fin de valorar la magnitud de la contaminación bucal y la utilidad del Laboratorio de Bacteriología Médica

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procesamiento de la muestra. Las muestras que contienen un gran número de células epiteliales escamosas sin predominio de bacterias en asociación con leucocitos no se deben procesar para su cultivo. La presencia de estas células indica que la muestra se ha contaminado con saliva. En cuanto a la microscopia se realiza tinción de acido-alcohol resistencia. Las micobacterias poseen la característica de poseer un alto porcentaje de lípidos en su pared celular, lo que le permite ser acido alcohol resistentes, esta propiedad permite la coloración de la bacteria y su observación en el microscopio, observándose la bacteria de color rojo y al agregarse el colorante de contraste (colorante de azul de metileno), las micobacterias (color rojo) quedan distinguibles de todo lo demás (color azul). TIPOS DE TINCIONES PARA MICOBACTERIAS Básicamente hasta hoy en día existen tres procedimientos distintos para la coloración de bacterias ácido alcohol resistentes: • • •

Tinción de Ziehl-Neelsen Tinción de Kinyoun Tinción con fluorocromo auramina.

CULTIVO • Lowenstein-Jensen: Es el más utilizado en los laboratorios clínicos, este es menos inhibitorio a bacterias contaminantes que el medio de petragnani; posee gran ventaja, ya que los estudios cromogénicos y pruebas bioquímicas son más exactas cuando son realizados a partir de subcultivos provenientes del medio de Lowenstein-Jensen. • Petragnani: Posee gran cantidad de agente inhibidor, es muy utilizado en cultivos a partir de muestras muy contaminadas. • American Thoracic Society (ATS): No es recomendable para muestras de esputo, este medio es muy utilizado para muestras de LCR, líquido pleural y biopsias de tejidos (muestras regularmente estériles). • Middlebrook 7H10 y 7H11: Están preparados en placas transparentes, permitiendo la observación precoz de microcolonias de micobacterias en un tiempo de 10 a 12 días de incubación en lugar de los 18 a 24 días en promedio requeridos por otros medios. La rapidez de estos medios de cultivo, es la adición de biotina y catalasa. IDENTIFICACIÓN (PRUEBAS BIOQUÍMICAS) • La identificación de Mycobacterium tuberculosis mediante pruebas bioquímicas es hasta ahora la prueba diagnóstica más confiable y utilizada, sin embargo, la desventaja de las pruebas bioquímicas es el tiempo que tarda en obtener los resultados finales. Esta situación ha dado lugar al perfeccionamiento de técnicas moleculares o cromatográficas.

MATERIALES Y MÉTODOS MATERIAL • Mechero de Bunsen • Portaobjetos Laboratorio de Bacteriología Médica

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• • •

Cerillos Aplicadores Algodón

MATERIAL BIOLÓGICO • Muestra de expectoración CEPA DE REFERENCIA • Frotis • Cultivo de M. tuberculosis EQUIPO • Microscopio • Mecheros • Campana biológica REACTIVOS • Aceite de inmersión • Tinción de Kinyoun • Fenol 5% EQUIPO DE SEGURIDAD PERSONAL • Bata para uso de laboratorio • Guantes de látex • Cubreboca METODOLOGÍA DÍA 1 Preparación del extendido: Antes de comenzar a trabajar debe lavarse las manos y colocarse el cubreboca. Tenga en cuenta las medidas de bioseguridad recomendadas. La mejor medida para evitar riesgos y errores es la sistematización de las actividades que se han de realizar, téngalo en cuenta: Antes de comenzar a trabajar, disponga en la mesa todo lo necesario para realizar el extendido en el espacio despejado de la misma o en la bandeja: mechero, aplicadores o asas, frasco con arena y fenol o alcohol, soporte para los extendidos, lápiz para marcar los portaobjetos, portaobjetos marcados con la numeración de las muestras a procesar. Es conveniente extender una hoja de papel absorbente en el área de trabajo donde realizará los extendidos, la que descartará con el material a esterilizar, al finalizar el trabajo Si marca los portaobjetos con lápiz graso hágalo en la parte posterior de los mismos para evitar que se pierda la identificación durante la coloración. Disponga a su izquierda o derecha (siempre en la misma posición) las muestras de acuerdo a Laboratorio de Bacteriología Médica

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numeración creciente y los portaobjetos marcados delante de cada una de ellas. El portaobjetos se divide virtualmente en tres tercios, uno de ellos se utiliza para marcar el número correlativo de identificación y los dos restantes se dejan para realizar el extendido. Se recomienda no procesar más de doce muestras por vez para evitar accidentes y errores por cambio de muestra. Fijación del extendido: Espere a que las láminas se hayan secado al aire y luego páselas rápidamente sobre la llama dos o tres veces para fijar el extendido; no lo queme ni lo sobrecaliente. Los extendidos deben ser coloreados lo antes posible, no deben quedar sin colorear hasta el día siguiente, ya que los bacilos permanecen vivos cuando son fijados sólo con calor suave. Conserve las muestras hasta que haya realizado las coloraciones y lecturas y esté seguro de que no necesitará realizar nuevos extendidos o enviarlas para cultivo. Cuando haya terminado, puede descartar las muestras colocándolas, junto con los palillos, en un recipiente para incineración o bien colocándoles fenol al 5% o hipoclorito de sodio al 10% y dejándolas hasta el día siguiente, momento en que puede eliminarlas con los desechos habituales del laboratorio. Limpie la superficie de trabajo descartando los papeles con que pudiera haberla cubierto y pase fenol al 5% o hipoclorito de sodio al 10% sobre la superficie para desinfectarla. Descarte los guantes, del mismo modo que las muestras. Después de haber preparado su extendido proceder a realizar la Tinción de Ziehl-Neelsen oTinción de Kinyoun y desarrollar los siguientes puntos de trabajo: 1. Observar las características macroscópicas del tubo de medio Lowenstein – Jensen. Se proporciona al alumno un cultivo positivo de M. tuberculosis, por el tiempo de crecimiento y las condiciones del área de trabajo. 2. Del frotis teñido de la muestra problema, proceder a observar en el microscopio realizando el conteo de bacilos por campo. 3. De un frotis teñido previamente, proceder a observar en el microscopio, realizando el conteo de bacilos por campo. 4. Realizar el registro de los bacilos encontrados en cada campo para de esa manera determinar el grado de patogenicidad que presenta el paciente. 5. Realizar la limpieza del área de trabajo. Forma de reportar baciloscopía: Los resultados de la observación microscópica, son reportados por número de cruces. Este dato puede indicarle al médico el tamaño de la lesión, la capacidad infectiva del paciente; además proporciona una importante información epidemiológica y la evolución del tratamiento. Cada campo microscópico debe observarse en superficie y profundidad. Los bacilos aparecen como bastoncillos delgados de color rojo y con gránulos en su interior, aislados, en pares o agrupados sobre un fondo azul claro de la tinción de contraste. Laboratorio de Bacteriología Médica

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La contabilidad debe seguir una pauta uniforme de observación leyendo de izquierda a derecha o viceversa del extendido. Revisar un mínimo de 100 campos útiles distribuidos en el total del extendido. El número de campos varía según la cantidad de bacilos encontrados. Para el informe de resultados considere:

Resultado Negativo De 1 a 9 BAAR

Característica No se observan bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) en 100 campos microscópicos observados. Reportar el número de bacilos en 100 campos.

Positivo (+)

Menos de un bacilo por campo en promedio (de 10 a 99 bacilos), en 100 campos observados.

Positivo (++)

De uno a diez bacilos por campo en promedio en 50 campos observados.

Positivo (+++)

Más de 10 bacilos por campo en 20 campos microscópicos observados.

BAAR = Bacilos ácido resistentes

RESULTADOS Paciente: Número de muestra: Tipo de muestra:

Característica

MORFOLOGIA MICROSCÓPICA

Forma

Muestra positiva

Muestra analizada

Arreglo Afinidad Tintorial


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Cepa de referencia Medio de cultivo Forma Tamaño Color Elevación Borde Luz Reflejada Luz Transmitida Lectura de los 100 campos

Resultado de BAAR:


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BIBILOGRAFÍA

• Brooks, F.G., Butel, J.S., Morse, S.A., (2005). Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg, 18va edición, Editorial el Manual Moderno. • Brooks, G.F., Carroll, K.C., Butel, J.S., Morse, S.A. (2008). Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Alderberg. 19a edición. Editorial Manual Moderno. México D.F. • De la Rosa, M., Prieto J. Microbiología para Ciencias de la Salud. (2003).2da Edición. Editorial Elsevier. España. • Ingraham, I.J., Ingraham, A.C.; (1998) Introducción a la microbiología, editorial Reverté, S.A.; Barcelona España. • Madigan T.M., Martinko, M.J., Parker, J.; BROCK Biología de los Microorganismos; PEARSON Prentice Hall, Madrid España. • Murray, P.R., Rosenthal, K.S., Kobayashi, G.S., Pfaller, M.A. (2009). Microbiología Médica. 6ta. edición. Editorial Elsevier Mosby. Madrid, España.


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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIHUAHUA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Práctica No. 9 ANÁLISIS DE CEPAS DE REFERENCIA ASOCIADAS A INFECCIONES DE LA PIEL Y DE CEPA DE REFERENCIA RELACIONADA A SEPTICEMIA Práctica No. 10 DIAGNÓSTICO DE HERIDAS INFECTADAS


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RESULTADO DE APRENDIZAJE Describe los aspectos clínicos relacionados a infecciones de heridas infectadas, y realiza un cultivo para microorganismos aerobios y anaerobios e identifica macroscópica y microscópicamente al agente etiológico causal del proceso infeccioso. Describe las características macroscópicas, microscópicas y metabólicas de las cepas de referencia Bacillus spp. relacionada a infecciones en heridas y Listeria monocytogenes relacionadas a septicemias.

INTRODUCCION Uno de los indicadores fundamentales de la sepsis local es la acumulación de pus dentro de un absceso o que exuda desde una fístula o de una superficie mucocutánea. También pueden encontrarse diferentes grados de enrojecimiento, dolor y tumefacción. Las infecciones de las heridas externas incluyen las asociadas con una lesión traumática o con úlceras por decúbito (escaras), picaduras o mordeduras de animales o de personas, quemaduras o cuerpos extraños en la piel o las mucosas. Las heridas internas y los abscesos pueden asociarse con apendicitis, colecistitis, celulitis, infecciones dentales, osteomielitis, empiema, artritis séptica, sinusitis u otras infecciones internas. Muchos de estos procesos son intrahospitalarios, contraídos luego de procedimientos invasivos, manipulaciones quirúrgicas o colocación de prótesis. Otros derivan de la diseminación sanguínea a partir de sitios primarios de infección. Por último, puede existir la diseminación directa de bacterias desde sitios adyacentes de infección o por la rotura de una víscera, en especial, el intestino grueso. Las bacterias anaerobias suelen ser un problema cuando el sitio de infección se encuentra adyacente al intestino o cuando la herida esta contaminada por microbiota fecal. Ciertas bacterias se asocian con situaciones clínicas particulares. Pasteurella multocida se encuentra en heridas causadas por mordeduras de animales. Pseudomonas aeruginosa es un patógeno común cuando se produce una herida penetrante en el pie en personas que usan zapatillas. Pseudomonas aeruginosa, las especies de Candida y diversos hongos filamentosos representan un problema particular en las heridas por quemaduras; además, el virus del herpes simple también puede causar infecciones serias en estos pacientes. Las bacterias Gram positivas aerobias (incluidos Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes), las bacterias anaerobias estrictas y los bacilos Gram negativos aerobios suelen causar infecciones en los pacientes diabéticos. RECOLECCIÓN DE MUESTRAS Las heridas superficiales suelen estar colonizadas por bacterias ambientales; a menudo la muestra obtenida con un hisopo no refleja la verdadera causa del proceso de infección. Los métodos de elección para la recolección del material por examinar son la biopsia de tejido, el raspado de una herida que supura o el aspirado del líquido o pus de la parte profunda de la herida. El sitio del cual se tomará la muestra debe descontaminarse primero con jabón para cirugía y etanol al 70% o isopropanol, luego de lo cual la herida se lava bien con solución fisiológica estéril y se seca. Si por algún motivo se prevé una demora superior a los 30 minutos para el procesamiento de la muestra, ésta deberá transferirse a un recipiente de transporte. Laboratorio de Bacteriología Médica

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Si no se puede obtener el material con una aguja y una jeringa, se puede tomar una muestra de la superficie. Si bien se utilizan comúnmente hisopos también se han utilizado paños y papeles filtro. Se debe realizar una limpieza cuidadosa del sitio, como ya se describió. Puede ser necesario separar los bordes de la herida con el pulgar y el índice de una mano o realizar un pequeño corte con una hoja de bisturí en un absceso cerrado antes de introducir la punta del hisopo en el interior de la lesión con la otra mano. Se coloca entonces de inmediato el hisopo en un recipiente apropiado de transporte. Es posible, pero poco probable que en un cultivo de material obtenido de la superficie no se aísle una bacteria patógena que se halle en lo profundo de una herida; es mucho más probable que se aíslen microbios colonizantes además de los patógenos verdaderos. EXAMEN MICROSCÓPICO DE LAS MUESTRAS Se debe realizar la Tinción de Gram a todas las muestras. Las claves morfológicas de la etiología pueden sugerir otros procedimientos diagnósticos más allá de los requeridos por el médico (p.ej., cultivos para bacterias anaerobias u hongos). Si se recibe una biopsia de tejido, el examen histológico debe incluir las tinciones para bacterias y hongos y el examen de una tinción de hematoxilina-eosina para la búsqueda de inclusiones virales. CULTIVOS Se deben utilizar medios selectivos y no selectivos enriquecidos para aislar las especies bacterianas eugónicas y con requerimientos nutricionales especiales. Si se obtuvo material de aspirado o tejido es adecuado utilizar cultivo para bacterias anaerobias. El cultivo microbiológico cuantitativo se recomienda para los cultivos de heridas con el objetivo de determinar el significado de los aislamientos, predecir la probabilidad de una sepsis en una herida por quemadura y determinar la probabilidad de que una herida cicatrice fácilmente. Hay datos que avalan el uso de cultivos de superficie en lugar de biopsias. De manera similar, los cultivos semicuantitativos (que se realizan de rutina mediante la siembra seriada en estrías en cuadrantes de placas de agar) han proporcionado información de que ésta es equivalente a las estrategias cuantitativas más dificultosas. Sin duda, si no se aísla ningún microorganismo, un cultivo cualitativo brinda la misma información que un cultivo cuantitativo. Staphylococcus aureus Cocos Gram positivos que presentan un arreglo en forma de racimo (estafilococos), algunas cepas presentan capsula, son inmóviles, anaerobios facultativos y halófilos. Tienen una gran capacidad para crecer en un rango muy amplio de temperatura que va desde los 18°C a los 40°C, y son microbiota normal de la piel, presentan la particularidad de dar positivo a la prueba de coagulasa y presentan una hemólisis del tipo β. Bacillus spp. Bacilos Gram positivos que se agrupan en cadenas largas, y se caracterizan por poseer endoesporas en la parte central del bacilo en forma ovalada, es aerobio y anaerobio facultativo, presentan terminaciones cuadradas o redondeadas. Se distinguen tres especies importantes para este género, que son de importancia clínica: Bacillus cereus, Bacillus anthracis y Bacillus subtilis. Laboratorio de Bacteriología Médica

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• Bacillus cereus: Ureasa positivo, no utiliza el manitol, es halófilo, da positivo a la prueba de nitratos y presenta movilidad, hemólisis, no contiene cápsula y no es sensible a la penicilina. • Bacillus anthracis: Es inmóvi, ureasa negativo, utiliza el manitol, da positivo a la prueba de nitratos y es catalasa positivo, no hemolíticos, contiene cápsula y es sensible a la penicilina. • Bacillus subtilis: Presentan movilidad, catalasa y oxidasa positivas, da positivo a la prueba de nitratos, es hemolítico, no presenta cápsula. Listeria monocytogenes Es una bacteria ampliamente difundida en la naturaleza. Su presencia en los alimentos está determinada por su extensa distribución en el ambiente - tierra, aguas servidas, materia fecal, vegetación, ensilados y entorno de la producción de alimentos, lo que confiere una importante oportunidad para contaminarlos. A pesar de la amplia presencia de la bacteria en el ambiente la enfermedad no es frecuente. La listeriosis es considerada una infección oportunista; es decir, se presenta en individuos vulnerables. Presenta dos tipos de cuadros: • Invasivo • Gastroentérico El cuadro más severo, presenta severas manifestaciones invasivas que dan lugar a meningitis con o sin septicemia, ó sólo septicemia. Las manifestaciones usuales son: septicemia, meningitis, conjuntivitis, encefalitis, endocarditis, partos prematuros, abortos, nacidos muertos. La enfermedad tiene un 20% de letalidad. El período de incubación es de 7 a 30 días y el 85 a 90% requiere hospitalización. Por otro lado, el cuadro gastroentérico puede presentar desde portadores sin síntomas hasta individuos con signos gastrointestinales. Los grupos vulnerables son individuos inmunocomprometidos, embarazadas, neonatos y fetos, enfermos crónicos y ancianos. El 99% de los casos es de origen alimentario; el resto obedece a la infección de los neonatos por una madre infectada o por contagio en salas de neonatología. Hoy se sabe que no todas las cepas de L. monocytogenes son patógenas. Se ha observado variabilidad en la virulencia (grado de patogenicidad de la bacteria) dentro de la especie L. monocytogenes y éste concepto va ganando reconocimiento. Se ha demostrado que hay Listeria monocytogenes avirulentas, hipovirulentas y virulentas. La variabilidad en la virulencia de L. monocytogenes permite comprender el numero bajo de casos a pesar de las frecuente exposición a alimentos con éste microorganismo. La patogenicidad ó capacidad de un microorganismo para producir enfermedad obedece a varios factores de virulencia. En L. monocytogenes está influenciada por varios genes que dan lugar a factores entre ellos la hemolisina (listeriolisina O), internalinas, fosfolipasas y otros.


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Listeria es un bacilo corto Gram positivo, recto o ligeramente curvo, de bordes redondeados, aparece aislado, en pequeños grupos o en cadenas cortas, posee cuatro flagelos en posición perítrica, presenta una motilidad a temperatura ambiente y una motilidad mínima o nula a 37°C. No es esporulado y tampoco capsulado, β-hemolítico, ureasa negativa, VP y RM positivos.

MATERIALES Y MÉTODOS MATERIAL • Asa de nicromio • Portaobjetos • Cerillos • Gradilla • Puente de tinción • Tripié • Tela de asbesto • Vaso de precipitado MATERIAL BIOLÓGICO • Muestra de herida CEPAS DE REFERENCIA • Bacillus spp. • Listeria monocytogenes • S. aureus EQUIPO • Microscopio • Incubadora • Mecheros REACTIVOS • Solución salina fisiologica 0.85% • Cristal violeta • Yodo lugol • Alcohol acetona • Safranina • Verde de malaquita • Aceite de inmersión • Rojo de metilo • Reactivo de Kovac’s • α−naftol • KOH al 40% Listeria • CAMP • Nitratos • SIM • Bilis Esculina Laboratorio de Bacteriología Médica

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Bacillus • SIM • Nitratos • Medio de OF + glucosa 1% • Medio de OF + maltosa 1% • Medio de OF + lactosa 1% EQUIPO DE SEGURIDAD PERSONAL • Bata para uso de laboratorio • Guantes de látex • Cubreboca Listeria • CAMP • Nitratos • SIM • Bilis Esculina Bacillus • SIM • Nitratos • Medio de OF + glucosa 1% • Medio de OF + maltosa 1% • Medio de OF + lactosa 1% EQUIPO DE SEGURIDAD PERSONAL • Bata para uso de laboratorio • Guantes de látex • Cubreboca METODOLOGÍA DÍA 1: • Proceder a sembrar las cepas de Bacillus spp. y Listeria monocytogenes, y la muestra contenida en el medio de transporte; utilizando las técnicas asépticas en los siguientes agares:


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Bacillus spp.

INCUBAR A 37°C

AGAR SANGRE

MUESTRA AGAR MCK

AEROBIOSIS

MUESTRA AGAR SANGRE CARNERO

CARBOXIFILIA

MUESTRA AGAR LIVER VEAL

ANAEROBIOSIS

Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes

S. aureus

DÍA 2 • Observar la morfología macroscópica. • Realizar Tinción de Gram para observar la morfología microscópica. • Realizar la prueba de catalasa a la muestra y las pruebas bioquímicas correspondientes, de acuerdo a los datos hasta el momento identificados. • Inocular las cepas en las pruebas bioquímicas para identificarlas: Bacillus spp.: SIM, Nitratos, OF + glucosa 1%, O/F + maltosa 1% O/F + lactosa 1%. Listeria: Prueba de CAMP, Nitratos, SIM (25°C y 37°C), Bilis esculina. • La cepa de Bacillus se deja en la incubadora por mayor tiempo para realizar la tinción de esporas. DÍA 3 • Realizar a la cepa de Bacillus spp. la tinción de Shaeffer y Fulton (para observar endoesporas) • Proceder con la lectura de las pruebas realizadas a las cepas para su identificación y para determinar la especie. • Identificar el microorganismo aislado en la muestra. Laboratorio de Bacteriología Médica

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RESULTADOS MUESTRA: Muestra


Medio de Cultivo Forma Tamaño Color Elevación Borde Luz reflejada Luz trasmitida Consistencia Sustrato



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Cepa aislada

Hemólisis Catalasa Coagulasa Oxidasa TSI LIA Citrato FeA RM VP Malonato MIO: Movilidad Indol Descarboxiación de ornitina SIM: Movilidad Indol H 2S Otras Pruebas:


Refererencia

Microorganismo(s) identificado(s):


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CEPAS:


Cepa de referencia Medio de Cultivo Forma Tamaño Color Elevación Borde Luz reflejada Luz trasmitida Consistencia Sustrato



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Cepa de referencia Listeria monocytogenes


Refererencia

SIM: Movilidad Indol H 2S Movilidad a 25°C (SIM) Movilidad a 37°C (SIM) Nitratos Bilis esculina CAMP

Bacillus

SIM: Movilidad Indol H 2S Nitratos O/F glucosa O/F lactosa O/F maltosa

BIBILOGRAFÍA

• Brooks, F.G., Butel, J.S., Morse, S.A., (2005). Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg, 18va edición, Editorial el Manual Moderno. • Brooks, G.F., Carroll, K.C., Butel, J.S., Morse, S.A. (2008). Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Alderberg. 19a edición. Editorial Manual Moderno. México D.F. • De la Rosa, M., Prieto J. Microbiología para Ciencias de la Salud. (2003).2da Edición. Editorial Elsevier. España. • Ingraham, I.J., Ingraham, A.C.; (1998) Introducción a la microbiología, editorial Reverté, S.A.; Barcelona España. • Madigan T.M., Martinko, M.J., Parker, J.; BROCK Biología de los Microorganismos; PEARSON Prentice Hall, Madrid España. • Murray, P.R., Rosenthal, K.S., Kobayashi, G.S., Pfaller, M.A. (2009). Microbiología Médica. 6ta. edición. Editorial Elsevier Mosby. Madrid, España.


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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIHUAHUA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Práctica No. 11 HEMOCULTIVO


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RESULTADO DE APRENDIZAJE Describe los aspectos clínicos relacionados a problemas septicémicos en el humano e identifica macroscópica, microscópica y metabólicamente el microorganismo presente en un hemocultivo indicando género y especie a la que pertenece.

INTRODUCCIÓN El hemocultivo constituye uno de los procedimientos más importantes que se realizan en el laboratorio de microbiología clínica. El éxito de esta prueba esta directamente relacionado con los métodos que se utilizan para recoger muestra de sangre. El factor más importante que determina el éxito de un hemocultivo es el volumen de sangre procesada. Por ejemplo, se produce un incremento del 40% en la tasa de cultivos positivos para microorganismos cuando se cultivan 20 ml de sangre en lugar de 10 ml debido a que más de la mitad de los pacientes septicémicos portan menos de un microorganismo por mililitro de sangre. Por eso se deben de recolectar aproximadamente 20 ml de sangre para cada hemocultivo en un adulto, y volúmenes proporcionalmente menores en los niños y en los neonatos. La desinfección cuidadosa de la piel es un aspecto de gran importancia, ya que muchos pacientes hospitalizados son susceptibles a infecciones con microorganismos que colonizan su piel. Las bacteriemias se definen como la presencia de bacterias en la sangre que se pone de manifiesto por el aislamiento de éstas en los hemocultivos. Gracias a la implementación de los hemocultivos, es posible identificar una bacteriemia o una septicemia en los pacientes infectados con alguna bacteria, para poder dar al médico una herramienta elemental y crucial para la elección del tratamiento para el paciente. Las bacteriemias pueden ser de tres tipos: transitorias, continuas o intermitentes, según la forma en que aparecen los microorganismos en la sangre, pero ésta distinción es difícil de establecer y poco práctica desde el punto de vista microbiológico. Existe un cuarto tipo de bacteriemia llamada de “brecha” la cual se emplea cuando ésta se presenta en un paciente que está recibiendo una terapia sistémica con antimicrobianos a los cuales es sensible el microorganismo aislado. Su presencia puede ser debida a una concentración inadecuada del antimicrobiano en la sangre, a un incorrecto drenaje del foco de infección, a la presencia de endocarditis (infección endovascular), al deterioro de las defensas del huésped, al desarrollo de resistencia al tratamiento antimicrobiano, etc. La mayoría de los microorganismos son capaces de invadir el torrente circulatorio. En la actualidad los Gram positivos, especialmente estafilococos y enterococos, igualan o superan en frecuencia a los Gram negativos. Esto es debido a múltiples causas, entre las que destacan la utilización de antibióticos de amplio espectro, el uso generalizado de catéteres intravasculares y el empleo de métodos de diagnóstico invasores. Por otra parte, el aumento de pacientes inmunodeprimidos con tratamientos antineoplásicos o con infección por el VIH ha propiciado la aparición de bacteriemias por agentes que en el pasado eran causa muy rara de infección. Estudios clínicos han demostrado que la septicemia puede ser continuada o intermitente: La septicemia continuada se produce fundamentalmente en pacientes con infecciones intravasculares (p. ej., endocarditis, tromboflebitis séptica, infecciones de catéteres intravasculares) o en septicemias devastadoras (p. ej., shock séptico). La septicemia intermitente se da en pacientes con infecciones en una localización distal (p. ej., Laboratorio de Bacteriología Médica

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pulmones, aparato genitourinario, tejidos blandos). El momento de la extracción de la sangre no es importante en los pacientes con septicemias continuas, pero sí lo es en aquellos con septicemias intermitentes. Por otra parte, debido a que los signos clínicos de septicemia (p. ej., fiebre, escalofríos, hipotensión) aparecen como respuesta a la liberación de endotoxinas o exotoxinas por parte de los microorganismos, estos signos se manifiestan hasta 1 hora después de que los microorganismos hayan pasado a sangre. Por tanto, es posible que existan pocos o ningún microorganismo en sangre cuando el paciente se torna febril. En consecuencia se recomienda recoger dos o tres muestras de sangre de forma aleatoria durante un periodo de 24 horas. La mayor parte de las muestras de sangre se inoculan en frascos que contienen caldo de cultivo enriquecido. Se deben inocular dos frascos de medio para cultivo (10 ml de sangre por frasco) con el fin de garantizar una recuperación máxima de microorganismos. Cuando estos frascos de caldo noculados llegan al laboratorio, se incuban a 37°C y se inspeccionan a intervalos regulares para observar el crecimiento bacteriano. Cuando se detecta crecimiento, los caldos son subcultivados con el propósito de aislar el microorganismo para su identificación y realizarle las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos. La mayor parte de los aislamientos con significación clínica se detectan en los dos primeros días de incubación; sin embargo, todos los cultivos se deben incubar a lo largo de un periodo mínimo comprendido entre 5 y 7 días. Las incubaciones más prolongadas suelen resultar innecesarias. Debido a la pequeña cantidad de microorganismos que están presentes en la sangre de un paciente séptico, no merece la pena teñir las extensiones con tinción de Gram para su observación al microscopio. OBTENCION DE LA MUESTRA El procedimiento de extracción de sangre para la realización de hemocultivos se debe realizar cumpliendo las máximas precauciones de asepsia. 1. Lavarse las manos. 2. Colocar ligadura 3. Palpar la vena a puncionar. 4. Realizar antisepsia con alcohol 70% en una zona de piel de unos 10 cm de diámetro alrededor del sitio de punción con movimientos de abajo hacia arriba. 5. Repetir el procedimiento utilizando Yodo povidona al 10%. 6. Dejar actuar 1-2 minutos, esto es, hasta que se seque el antiséptico sobre la piel. 7. Mientras actúa el iodóforo, desinfectar el tapón de goma del frasco de hemocultivo con alcohol 70%. 8. Colocarse los guantes estériles. 9. Extraer la sangre sin tocar en ningún momento el campo desinfectado. Si fuera necesario palpar nuevamente la vena se cambiaran los guantes estériles y se realizará nueva antisepsia de piel. 10. Inyectar directamente la sangre en el frasco. No es necesario cambiar de aguja. 11. Mover los frascos para que la sangre y el medio de cultivo se mezclen. 12. Para frascos de sistemas automatizados, retirar las tirillas de las botellas y pegarlas en la hoja de pedido correspondiente al paciente. En ningún caso se rotulará o pegará ningún tipo de etiqueta adhesiva sobre los códigos de barras de las botellas.


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VOLUMEN DE LA MUESTRA La cantidad de sangre a introducir en cada botella es de 10 ml en el caso de pacientes adultos. En caso de neonatos y niños pequeños en que no se pueden obtener volúmenes grandes de sangre, es suficiente una cantidad 1-5 ml por frasco. En estos casos se utilizan botellas de hemocultivo pediátrico. NÚMERO DE MUESTRAS Dos hemocultivos por paciente, previos al tratamiento antimicrobiano. El intervalo de tiempo entre las extracciones es suficiente con una hora, pero cuando exista una gran urgencia en iniciar el tratamiento, este intervalo puede acortarse hasta 15 minutos o se pueden extraer dos muestras simultáneas de diferentes sitios de punción. En caso de endocarditis subaguda se recomienda aumentar a tres frascos de hemocultivo repartidos en 24 horas y en caso de que la primera serie sea negativa, obtener tres muestras más al día siguiente. Si el paciente está recibiendo antibióticos puede ser necesario obtener otra serie de hemocultivos al tercer día. TRANSPORTE Deben enviarse en forma inmediata al laboratorio una vez finalizada la serie. Mientras, mantener a temperatura ambiente. Nunca debe refrigerarse ni congelarse. OBSERVACIONES Cuando no haya venas accesibles puede realizarse la extracción de sangre arterial. No son adecuadas las muestras extraídas a través de catéteres. En caso que el paciente esté recibiendo antibióticos realizar la toma de muestra previo a la administración de la dosis de antimicrobiano. Si se evita conversar durante la toma de la muestra no es necesario colocarse cubrebocas. En sala de inmunodeprimidos sí es aconsejable el uso de gorro y cubrebocas.

MATERIALES Y MÉTODOS MATERIAL • Asa de nicromio • Portaobjetos • Cerillos • Gradilla • Puente de tinción • Frasco de vidrio grande con tapa • Vela blanca pequeña • Algodón • Equipo para venopunción CEPA DE REFERENCIA • Cepa a identificar EQUIPO • Microscopio óptico • Incubadora • Mecheros Laboratorio de Bacteriología Médica

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PRUEBAS BIOQUÍMICAS: • TSI • LIA • Citrato de Simmons • FeA • VP • Malonato • Urea • Nitratos

• • • • • • • •

Mio SIM Prueba de oxidasa Prueba de catalasa Cuagulasa Bilis esculina Disco P Disco A

EQUIPO DE PROTECCIÓN PERSONAL • Bata de laboratorio • Guantes de látex • Cubreboca METODOLOGÍA Pasos para la toma de la muestra sanguínea:

Lavarse las manos.!

Se colocaron los guantes estériles. !

Desinfectar el tapón de goma del frasco de hemocultivo con alcohol yodado. Inyectar directamente sangre en el frasco. !

Puncionar y extraer la sangre sin tocar la zona desinfectada.!

la

Elegir la vena adecuada en el espacio antecubital y colocar el torniquete entre el antebrazo y el hombro, lo suficientemente apretado.

Realizar asepsia con alcohol yodado con movimientos de arriba hacia abajo en la zona del sitio de punción. Repetir el procedimiento utilizando alcohol al 70%.

!

Colocar torunda con alcohol, presionando la zona de punción para evitar hematoma.

!


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En el caso de utilizar recipiente comercial de hemocultivo, seguir cuidadosamente las instrucciones del equipo de venopunción que usualmente se incluye. 1. Colocar la sangre obtenida directamente en el frasco de hemocultivo junto al mechero lo más rápido posible. 2. Mezclar suavemente el recipiente de hemocultivo, no agitando bruscamente, procurar que la sangre se impregne en toda la superficie del medio de cultivo del frasco. 3. Incubar el frasco del hemocultivo a 37º y revisarlo diariamente. 4. Resembrar el hemocultivo en los medios que crean necesarios 5. Incubar los medios a 37º C durante 24 horas, si se sembró en agar sangre incubar en condiciones parciales de CO2. 6. Realizar tinción de Gram. 7. Realizar las pruebas bioquímicas de las colonias sospechosas, obtenidas en los medios de cultivos utilizados. DÍA 1 • Proceder a observar si se presenta crecimiento en el medio, turbidez, hemólisis o presencia de gas. • Realizar tinción de Gram en fresco para identificar donde se cultivara dicha muestra. • Elegir los agares que considere convenientes DÍA 2 • Realizar las pruebas bioquímicas correspondientes. DÍA 3 Observar resultados de pruebas bioquímicas del hemocultivo e identificar la bacteria presente en el hemocultivo.

Chocolate

Sangre

MCK

SM

RESULTADOS

CARACTERÍSTICAS DEL HEMOCULTIVO

Turbidez Hemólisis Gas

MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA DEL HEMOCULTIVO



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Muestra


Medio de Cultivo Forma Tamaño Color Elevación Borde Luz reflejada Luz trasmitida Consistencia Sustrato

Forma Arreglo Afinidad tintorial



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Cepa aislada

TSI LIA Citrato FeA RM VP Malonato MIO: Movilidad Indol Descarboxilacion de ornitina SIM: Movilidad Indol H2S Otras pruebas:


Refererencia

Microorganismo identificado:

BIBILOGRAFÍA

• Brooks, F.G., Butel, J.S., Morse, S.A., (2005). Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg, 18va edición, Editorial el Manual Moderno. • Brooks, G.F., Carroll, K.C., Butel, J.S., Morse, S.A. (2008). Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Alderberg. 19a edición. Editorial Manual Moderno. México D.F. • De la Rosa, M., Prieto J. Microbiología para Ciencias de la Salud. (2003).2da Edición. Editorial Elsevier. España. • Ingraham, I.J., Ingraham, A.C.; (1998) Introducción a la microbiología, editorial Reverté, S.A.; Barcelona España. • Murray, P.R., Rosenthal, K.S., Kobayashi, G.S., Pfaller, M.A. (2009). Microbiología Médica. 6ta. edición. Editorial Elsevier Mosby. Madrid, España.


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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIHUAHUA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS ANEXOS TINCION DE GRAM Es la tinción más comúnmente utilizada en los laboratorios de microbiología. Costituye el criterio básico para separar los grandes grupos de bacterias (es decir, grampositivo y gramnegativo) Para la realización de esta tinción se toma una colonia de la bacteria a analizar, se le agraga una gota de solución salina se fija en un portaobjetos mediante calentamiento; esta se expone a cristal violeta (1 min) y después se le agrega yodo (1 min), esto para formar el cokmplejo del pigmento principal. Durante la decoloración de le agrega alcohol o acetona (30 seg), las bacterias positivas retienen el complejo mientras que las negativas lo pierden. Al final se les agrega por un minuto safranina que es retenido por los microorganismos gramnegativo (De ahí se coloración rosada o rojiza). El grado en que cada microorganismo retiene la tinción depende del organismo, las condicionesdel cultivo y la habilidad para la tinción del microscopista. Reactivos utilizados: - Solución salina fisiológica - Agua, destilada o potable - Cristal violeta - Yodo lugol - Alcohol-acetona - Safrina - Aceite de inmersión Metodología 1. Realizar un frotis a partir de una colonia aislada, mezclándola con una gota de solución salina en un portaobjetos. 2. Una vez seco, cubrirlo con cristal violeta por un minuto. 3. Enjuagar con agua. 4. Cubrir con la solución de yodo lugol durante un minuto. 5. Enjuagar con agua. 6. Decolorar con alcohol-acetona por un tiempo de 10 segundos. 7. Enjuagar. 8. Cubrir con safranina por un minuto. 9. Enjuagar nuevamente con agua. 10. Observar la tinción al microscopio con objetivo de 100X utilizando aceite de inmersión.


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Prueba de hidróxido de potasio al 3% para diferenciar cepas Gram (+) y Gram (-) 1. Tomar una colonia de la bacteria a probar y ponerla sobre un portaobjetos. 2. Adicionarle una gota de hidróxido de potasio al 3% y mezclarla con un palillo de madera. 3. Levantar el palillo y observar un hilo viscoso que no se debe romper con facilidad, lo cual indica la presencia de una bacteria Gram negativa. 4. Ausencia de viscosidad indica presencia de una bacteria Gram positiva. COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN Esta es la técnica más empleada en el mundo y ha sido recomendada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Unión Internacional Contra la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias (UICTER) por ser la que asegura resultados reproducibles con un entrenamiento sencillo. Es también la más económica y alcanza la misma sensibilidad que la técnica de fluorescencia si se le dedica tiempo suficiente a la lectura de cada frotis. Consta de tres tiempos: 1) Coloración. Disponga dos varillas de vidrio sobre la pileta de lavado a una distancia de aproximadamente 5 cm entre una y otra; si por cualquier causa no desea colorear en la pileta puede utilizar alguna bandeja metálica o de vidrio. Coloque las láminas fijadas conservando el orden numérico con el extendido hacia arriba y sin que se toquen entre ellas. Vierta los reactivos y el agua suavemente evitando salpicaduras que pueden transferir material de un portaobjetos a otro y pueden generar aerosoles. Cubra la superficie del extendido con fucsina básica fenicada recientemente filtrada. También se puede cubrir previamente el extendido con un trozo de papel de filtro que no sobresalga del portaobjeto y luego cubrir con la fucsina. Este papel evita que los posibles cristales de fucsina se asienten sobre el extendido. Con la llama de un hisopo embebido en alcohol caliente suavemente por debajo de los extendidos con movimientos de vaivén hasta que observe que se desprenden los primeros vapores. El calentamiento nunca debe ser tal que hierva la fuschina El calentamiento nunca debe ser tal que hierva la fucsina ya que a esta temperatura la pared de los bacilos se destruye y no se colorean. El calentamiento nunca debe ser tal que hierva la fucsina ya que a esta temperatura la pared de los bacilos se destruye y no se colorean. En el término de aproximadamente cinco minutos debe calentar tres veces hasta emisión de vapores; este tiempo y estas temperaturas son suficientes para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se fije a sus lípidos. Levante cuidadosamente el portaobjetos desde el extremo más cercano a usted y con el frasco de agua o un chorro fino proveniente de una manguera conectada a la canilla, lave cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solución de fucsina. Girando el extendido lave con cuidado también la parte posterior. Incline el portaobjetos tomándolo con una pinza para eliminar el exceso de agua y evitar diluir los reactivos que se utilizarán a continuación. 2) Decoloración. Cubra la totalidad del extendido con solución decolorante de alcohol-ácido y deje aproximadamente 3 minutos para que el decolorante actúe. Pasado ese tiempo enjuague con abundante agua a baja presión. Vuelva a cubrir con solución decolorante, déjelo actuar un minuto y enjuague nuevamente. Se considera decolorado cuando sus partes más gruesas conservan sólo un leve tinte rosado. Si aún observa coloración rosada intensa, repita el procedimiento. Laboratorio de Bacteriología Médica

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Lectura de Morfología Macroscópica 1. Forma: puede ser descrita como circular, irregular o puntiforme (pequeña). 2. Tamaño: puede ser una característica útil para la identificación. El diámetro de una colonia representativa puede ser medido. Las colonias muy pequeñas se refieren como “puntiformes”. 3. Consistencia: pueden utilizarse varios términos, como seca, húmeda, mucoide y viscosa. 4. Color: es importante describir el color o pigmento de la colonia. Debe considerarse que el pigmento puede estar influenciado por factores ambientales tales como temperatura y fuente de nutrientes. Aquí también pueden incluirse algunas características ópticas relevantes como opaca, translúcida, iridiscente, nublada. En el caso de medios de cultivo con un sustrato especifico e indicador y de acuerdo a la cepa probada se observa un color por la actividad bioquímica del mismo. 5. Elevación: describe la vista lateral de una colonia; incluye plana, levantada, convexa y umbonada (levantada en el centro). 6. Margen: puede ser entero (liso, sin irregularidades), lobulado, filamentoso o rizoide (con ramificaciones). Interpretación de Pruebas Bioquímicas Reactivos: Agar en pico de flauta Citrato de Simmons Fenilalanina desaminasa: FEA Hierro-triple azúcar: TSI, por sus siglas en inglés Descarboxilación y desaminación de Lisina: LIA Medios semisólidos Producción de ácido Sulfhídrico, Indol y movilidad: SIM Movilidad, Indol y descarboxilación de la Ortnitina: MIO Caldos de cultivo Malonato Rojo de Metilo (RM) Voges-Proskauer (VP) Urea Para reducción de Nitratos Complementarios Cloruro férrico. Rojo de metilo Alfa-naftol Hidróxido de potasio al 40%. Reactivo de Kovac’s Reactivo para nitratos A: α-naftilamina Reactivo para nitratos B: Ácido sulfanílico Metodología: 1. Tener aislados bacilos Gram negativos en una placa de agar 2. Realizar una morfología microscópica, con tinción de Gram, para confirmar 3. Utilizando el asa recta, montar el juego de pruebas bioquímicas de la siguiente manera: - Agares pico de flauta Citrato y FEA: sembrar por estría en la superficie Laboratorio de Bacteriología Médica

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- Agares pico de flauta TSI y LIA: sembrar por picadura hasta el fondo y estría en la superficie - Medios semisólidos MIO y SIM: sembrar por picadura hasta el fondo, teniendo precaución de no mover mucho el asa dentro del medio. - Caldos de Malonato, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer, Urea y para reducción de Nitratos: tomar un poco de la sepa y sembrarla por agitación del asa en el caldo. 4. Incubar a 37°C por 24 horas. 5. Pasado el tiempo de incubación, tomar las lecturas correspondientes. En los medios MIO y SIM adicionar 4 gotas de reactivo de Kovac’s al terminar con las observaciones. 7. Para el agar FEA añadir unas gotas de cloruro férrico y observar si existe o no cambio de color. 8. En el caldo rojo de metilo, añadir 4 ó 5 gotas del indicador del mismo nombre. 9. Para el caldo VP, añadir 4 gotas de alfa-naftol y 4 gotas de KOH al 40%. Dejar destapado y agitar cada 5 minutos hasta completar 15 minutos. 10. En el caldo de nitratos añadir dos gotas de reactivo de nitratos A y dos gotas de reactivo B. 11. Tomar las lecturas y hacer las interpretaciones correspondientes de acuerdo a los siguientes datos: Citrato de Simmons: Es un medio para determinar la capacidad de usar el citrato como única fuente de carbono. Se determina con la enzima citrasa, utilizando azul de bromotimol como indicador de pH. Si se observa crecimiento en el área de la estría, cambio de coloración, de color verde a azul, se considera como citrato positivo. Fenilalanina desaminasa (FEA): Contiene entre sus ingredientes DL-Fenilalanina, donde los organismos que poseen la enzima fenilalanina desaminasa para desaminar este aminoácido al ácido fenilpirúvico. Se detecta este cetoácido tras la adición de cloruro férrico. Si existe un cambio de coloración de amarillo a verde, se considera fenilalanina desaminasa positiva. Hierro-triple azúcar, TSI, por sus siglas en inglés: Se basa en la capacidad de utilizar aeróbica y anaeróbicamente la glucosa, lactosa y/o sacarosa, así como reducir el azufre a ácido sulfhídrico. Tras la incubación se puede observar un cambio de coloración a amarillo, en el fondo únicamente, o en todo el tubo. El fondo indica fermentación y el pico indica oxidación. Si permanece un color rojizo, no existe utilización de los carbohidratos. Una coloración negra indica la presencia de ácido sulfhídrico, además puede notarse la presencia de gas. La forma de reportar se expresa K/K cuando el pico y el fondo son rojos, K/A si solo el fondo es amarillo y A/A cuando todo el medio es amarillo. De igual manera, se reporta la formación de gas y la presencia de ácido sulfhídrico. Descarboxilación y desaminación de Lisina (LIA): Se utiliza para determinar la capacidad de las bacterias para descaboxilar y/o desaminar la lisina, así como producir ácido sulfhídrico. Posee un indicador de cambios de pH, púrpura de bromocresol. La descarboxilación ocurre en el fondo, anaeróbicamente, mientras que la desaminación se da en condiciones de aerobiosis, en el pico del agar. Se reporta como descarboxilacion positiva si el fondo se observa de color morado, y como desaminación positiva si el pico se torna rojo. La presencia de ácido sulfhídrico se aprecia con un precipitado negro. Producción de ácido Sulfhídrico, Indol y movilidad, SIM: Este medio contiene triptófano, que mediante la enzima triptofanasa, el microorganismo puede producir indol. El cual se corrobora con la adición del reactivo de Kovac’s, formado por ácido clorhídrico, alcohol amílico y dimetilaminobenzaldehido (DMABA), produciéndose un halo rojo en la parte superior del medio. Laboratorio de Bacteriología Médica

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Este medio contiene también tiosulfato de sodio, que puede reducirse a ácido sulfhídrico; apareciendo un precipitado negro en caso de ser positivo. La movilidad se aprecia cuando hay crecimiento del microorganismo de manera muy extendida a partir del inóculo. Movilidad, Indol y descarboxilación de la Ornitina (MIO): Comparte las metodologías para detectar indol y movilidad con respecto al medio SIM. Este medio se utiliza además para detectar la descarboxilacion de ornitina. Si no hay un cambio de coloración se reporta como positivo. Malonato: Tiene similitud con el ácido succínico, que es un componente del ciclo de Krebs. La enzima succinato deshidrogenasa transforma este ácido a ácido fumárico. Los microorganismos que sean capaces de presentar esta enzima podrán desarrollarse en este caldo, el cual contiene además azul de bromotimol como indicador de pH. Si el organismo utiliza el malonato, el medio se alcaliniza y el indicador hará que el caldo vire a un color azul. Rojo de Metilo: Es caldo utilizado para identificar a las bacterias que producen ácidos por medio de fermentación ácido mixta de la glucosa. El medio contiene además un buffer de fosfatos. Si el microorganismo produce una cantidad muy alta de ácidos, supera al buffer y el pH desciende. Esto se confirma mediante la adición de unas gotas del indicador rojo de metilo. Una coloración amarilla es un resultado negativo, en tanto que una coloración roja indica resultado positivo. Voges-Proskauer (VP): Es un caldo similar al de rojo de metilo, donde las bacterias producen ácidos mixtos; sin embargo, muchas veces no es suficiente cantidad estable para superar el buffer de fosfatos y bajar el pH. Entonces el producto final en este tipo de bacterias será acetoína y 2,3 butanediol. Para identificar estos microorganismos se añade alfa-naftol e hidróxido de sodio al 40%, el tubo se mezcla para airear el medio y oxidar la acetoina a diacetilo, que posteriormente reacciona con los componentes de las peptonas formando un color rojo. Esta coloración se reporta como positiva, en tanto que sin cambio de color se reporta de manera negativa. Urea: Este caldo contiene urea, factores de crecimiento y un indicador de pH, rojo de fenol. Si el microorganismo presenta la enzima ureasa, convierte la urea en amonio y dióxido de carbono, entonces el medio adquiere una coloración rosada. El resultado es negativo si el caldo no cambia de color o se torna amarillo. Para reducción de Nitratos: La reducción de nitratos es un tipo de respiración anaeróbica; muchas bacterias poseen la enzima nitrato reductasa, que convierte el nitrato en nitrito. Este caldo contiene nutrientes y nitrato potásico. Tras la incubación se añaden ácido sulfanílico y a-naftilamina, y si los nitratos fueron reducidos a nitritos se producirá un cambio de coloración a rojo, que se reporta como positivo.


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Prueba bioquímica Citrato FEA TSI

LIA

SIM

Resultados positivos Color azul y/o crecimiento en el área de estriado Coloración verde A/A Pico y fondo amarillo K/A Pico rojo, fondo amarillo Gas: Fisuras en agar H2 S: Precipitado negro Desaminación: pico rojo Descarboxilación: fondo morado H2S: Precipitado negro

Malonato Rojo de Metilo Voges-Proskauer Urea

H2 S: Precipitado negro Indol: halo rojo Movilidad: crecimiento muy extendido a partir del inóculo. Movilidad: crecimiento muy extendido a partir del inóculo. Indol: halo rojo descarboxilación de Ornitina: fondo color morado Coloración azul Coloración rojo Coloración salmón Coloración rosa

Reducción de Nitratos

Coloración roja

MIO

Resultados negativos Sin cambio de color, ni crecimiento Sin cambio de color K/K Pico y fondo rojo Gas: sin fisuras H2 S: Sin precipitado Desaminación: sin cambio en el pico Descarboxilación: sin cambio en el fondo H2 S: Sin precipitado H2 S: Carencia de precipitado Indol: sin halos rojizos Movilidad: crecimiento solo en el área de la picadura. Movilidad: crecimiento solo en el área de la picadura. Indol: sin halos rojizos descarboxilación de Ornitina: fondo amarillo Sin cambio de color Coloración amarillo Sin cambio de color Coloración amarilla, sin cambio de color Sin cambio de color

Oxidasa. En esta prueba, las bacterias vivas se colocan en un papel filtro y se adiciona una gota del reactivo de oxidasa (tetrametil p fenildiamina). En menos de un minuto, el reactivo, cambiará de color si la citocromo oxidasa está presente.

Resultado Azul oscuro o morado Sin cambio de color

Interpretación La citocromo oxidasa está presente La citocromo oxidasa está ausente

Hemolisinas. La actividad de las hemolisinas se observa en una caja de agar sangre de carnero al 5% después de 24 h de incubación. Resultado Zona transparente alrededor del crecimiento Zona verdosa alrededor del crecimiento Sin cambio en el medio


Interpretación Destrucción total de los glóbulos rojos: -hemólisis Destrucción parcial de los glóbulos rojos: -hemólisis El organismo no ataca los glóbulos rojos ( -hemólisis)

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Manual Bacteriologia Octubre 2013

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