Manual de Bacteriologia Veterinaria-Version Para Saeti

INDICE

Página

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.

INTRODUCCIÓN REGLAMENTO INTERNO DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIA PRACTICAS DE LABORATORIO MEDIDAS DE SEGURIDAD Y REGLAMENTOS DE LABORATORIO MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA Y TINCIONES SIMPLES

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MORFOLOGÍA COLONIAL Y AISLAMIENTO POR ESTRÍA CRUZADA TINCIÓN DE GRAM TINCIÓN DE ZIEHL-NIELSEN TINCIONES SELECTIVAS AISLAMIENTO DE HONGOS Y MORFOLOGÍA COLONIAL CULTIVO DE ANAEROBIOS USO DE MEDIOS SELECTIVOS USO DE PRUEBAS BIOQUIMICAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS COLECCIÓN Y ENVIO DE MUESTRAS AL LABORATORIO ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE PROCESOS PIOGÉNICOS ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE HECES Y ORINA ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE ORGANOS ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE ALIMENTOS ANEXO 1. RIESGO BIOLÓGICO ANEXO 2. CUIDADOS DEL MICROSCOPIO ANEXO 3. LAVADO, ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCION DE MATERIALES ANEXO 4. Formatos de Reporte

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INTRODUCCIÓN

La adquisición de habilidades y conocimientos que implican el aprendizaje de la Bacteriología y la Micología Veterinaria tiene implícito para el facilitador del curso y el estudiante, el manejo de microorganismos potencialmente patógenos o patógenos para su salud. De ahí que resulta indispensable la comunicación clara y participación responsable de cada uno de los integrantes del grupo con la finalidad de minimizar y controlar los riesgos biológicos, físicos y químicos que se presentan en la realización de cada una de las prácticas que se describen en este manual. El Manual de Bacteriología y Micología Veterinaria del Instituto Tecnológico de Sonora tiene como objetivo ser una guía para el alumno y el facilitador del curso en el proceso de aprendizaje, da inicio con la presentación de los lineamientos del Laboratorio de Bacteriología y Micología Veterinaria y se desarrolla de tal forma que permite al alumno construir su propio conocimiento a través de la adquisición de habilidades manuales, de observación minuciosa y del conocimiento a un nivel descriptivo, por lo que al inicio las prácticas de laboratorio son muy sencillas y permiten la integración gradual del conocimiento, hasta la participación del alumno en actividades de campo como la toma de muestras, la integración de la historia clínica, que implican el manejo y contacto con las diferentes especies animales, así como la interacción con los productores para recabar la información necesaria, culminando en la aplicación e integración del conocimiento para llegar a un diagnóstico definitivo. Se incluyen además en las últimas sesiones el manejo de pruebas semi automatizadas con principios biotecnológicos, que tienen gran demanda por su precisión y rapidez, con esto se pretende brindar al alumno herramientas actualizadas y conocimientos de vanguardia para su posterior aplicación en el área médica.

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INTRODUCCIÓN

La adquisición de habilidades y conocimientos que implican el aprendizaje de la Bacteriología y la Micología Veterinaria tiene implícito para el facilitador del curso y el estudiante, el manejo de microorganismos potencialmente patógenos o patógenos para su salud. De ahí que resulta indispensable la comunicación clara y participación responsable de cada uno de los integrantes del grupo con la finalidad de minimizar y controlar los riesgos biológicos, físicos y químicos que se presentan en la realización de cada una de las prácticas que se describen en este manual. El Manual de Bacteriología y Micología Veterinaria del Instituto Tecnológico de Sonora tiene como objetivo ser una guía para el alumno y el facilitador del curso en el proceso de aprendizaje, da inicio con la presentación de los lineamientos del Laboratorio de Bacteriología y Micología Veterinaria y se desarrolla de tal forma que permite al alumno construir su propio conocimiento a través de la adquisición de habilidades manuales, de observación minuciosa y del conocimiento a un nivel descriptivo, por lo que al inicio las prácticas de laboratorio son muy sencillas y permiten la integración gradual del conocimiento, hasta la participación del alumno en actividades de campo como la toma de muestras, la integración de la historia clínica, que implican el manejo y contacto con las diferentes especies animales, así como la interacción con los productores para recabar la información necesaria, culminando en la aplicación e integración del conocimiento para llegar a un diagnóstico definitivo. Se incluyen además en las últimas sesiones el manejo de pruebas semi automatizadas con principios biotecnológicos, que tienen gran demanda por su precisión y rapidez, con esto se pretende brindar al alumno herramientas actualizadas y conocimientos de vanguardia para su posterior aplicación en el área médica.

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REGLAMENTO INTERNO LABORATORIO LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIA Este documento tiene como objetivo evitar los riesgos de exposición y accidentes de contaminación con microorganismos en el laboratorio. 1. Los maestros, alumnos de servicio social y estudiantes usaran siempre bata blanca, limpia, abotonada y de manga larga. 2. La tolerancia máxima para permitir el acceso de los alumnos al laboratorio es de 10 minutos. 3. Usar el cabello recogido, calzado cerrado. No se permitirá el acceso con pantalón corto por riesgo de quemaduras y contaminación. 4. Los alumnos deben tener las uñas cortas, sin alhajas (anillos, reloj, pulsera, etc.) 5. No se permite el uso de sombrero y gorras. 6. El alumno guardará sus objetos personales en las gavetas. 7. Está prohibido introducir alimentos, comer, beber, fumar y masticar chicle en el laboratorio. 8. Apagar el teléfono celular al ingresar al laboratorio, no se permitirá su uso interno. 9. Evitar llevarse objetos a la boca, tocarse la cara, cabello, ojos, etc. 10. Mantener limpia la mesa de trabajo, desinfectarla al inicio y al término de la práctica. 11. Las cajas de petri y materiales de laboratorio contaminados se les retirara la cinta adhesiva y etiquetas y se colocarán en el área sucia para su posterior esterilización y lavado. 12. Los portaobjetos y pipetas contaminados, se colocarán en recipientes con desinfectante, en el área sucia, para su posterior lavado. 13. Es requisito indispensable para el ingreso al laboratorio que el alumno lleve el manual de practicas correspondiente. 14. En caso de heridas o erosiones en la superficie corporal, el alumno dará aviso al maestro, quien evaluará la magnitud de la lesión y aplicará las medidas de seguridad necesarias para el caso. 15. El alumno dará aviso inmediato al maestro en caso de derramarse un cultivo viable o romperse una caja de petri. 16. Antes de salir verifique que las llaves de gas y agua estén bien cerradas.

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17. Lavar perfectamente sus manos con agua y jabón y aplicarse el antiséptico a disposición antes de salir del laboratorio. 18. Los reportes de cada práctica se entregarán una semana después de concluida, sin excepción. 19. Los exámenes se aplicarán al inicio de cada práctica. 20. Es obligatorio que el alumno entregue el diagrama de flujo previo a la realización de la práctica. 21. Todos los alumnos están obligados a participar en el día asignado para la esterilización y limpieza de los materiales.

ATENTAMENTE

ACADEMIA DE BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIA

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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA PRACTICA 1 MEDIDAS DE SEGURIDAD Y REGLAMENTOS DE LABORATORIO INTRODUCCIÓN:

Ante los múltiples casos que se han presentado de infecciones asociadas al laboratorio en los últimos años, organismos internacionales como la Organización Mundial de la Salud (OMS), han recomendado tomar medidas preventivas para proteger la salud de los investigadores, técnicos laboratoristas y estudiantes. Si se consideran estas medidas de seguridad el personal que trabaja en laboratorios de microbiología puede minimizar el riesgo de infección. Las medidas de seguridad deben ser adecuadas para el tipo de microorganismo en estudio, pues estos varían en su capacidad de producir infecciones. Algunos pueden ser inofensivos, otros pueden causar síntomas leves; otros más pueden ser graves para la salud y los menos pueden tener una amplia capacidad de difundirse y causar brotes epidémicos. Esta gama ha permitido a los investigadores clasificar a los microorganismos en cuatro grupos de riesgo. Estos se han publicado en las Medidas de seguridad del programa de Microbiología de la Organización Mundial de la Salud.

COMPETENCIA: El alumno aplicara las medidas de seguridad que se han implementado en el laboratorio de bacteriología y micología veterinaria para la protección de la salud y se comprometerá a seguir los lineamientos marcados en el Manual de Laboratorios del ITSON.

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DESARROLLO DE LA PRÁCTICA: El alumno leerá junto con el maestro el capítulo anexo de Riesgo Biológico del Manual de Laboratorios del ITSON.

ASIGNACIÓN Elaborar un mapa conceptual del capitulo I “Seguridad en microbiología” Del libro Métodos Microbiológicos de C.H. Collins y Patricia M. Lyne. (falta completar la referencia, año, editorial, país, páginas )

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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA PRÁCTICA 2 MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA Y TINCIONES SIMPLES INTRODUCCIÓN El microscopio es un instrumento que seguramente ha sido utilizado por los estudiantes en otros cursos, sin embargo se ha incluido en este curso para recordar su manejo y desarrollar la habilidad para trabajar con el objetivo de inmersión cuyo uso es obligado en la observación de microorganismos y sus estructuras. El microscopio compuesto es un instrumento de precisión que consiste en una serie de lentes diseñadas y acomodadas para proveer las máximas amplificaciones posibles del espécimen que se va a observar. El aumento total que se puede alcanzar en un microscopio compuesto depende de la combinación del ocular con el objetivo y se obtiene multiplicando el número de aumentos del ocular por el número de aumentos del objetivo. Tratar de observar a los microorganismos con un microscopio óptico sin un contraste adecuado es casi imposible, ya que como los microorganismos están compuestos sobre todo de agua, que es el medio en el que normalmente están suspendidos, es como tratar de ver un objeto blanco sobre un fondo blanco. Las tinciones que se usan en microbiología se desarrollaron para incrementar el contraste entre el espécimen y el fondo que lo rodea, ante la necesidad de poner de manifiesto la forma, tamaño y agrupación de las bacterias, así como sus estructuras. Fue Roberto Koch quien introdujo en microbiología el uso de preparaciones fijas o permanentes (frotas), al dejar secar al aire las preparaciones en fresco y sin teñir, para fijarlas químicamente y teñirlas después con colorantes derivados de la anilina. En la actualidad, la mayoría de las técnicas de tinción usan frotis fijos que consisten en colocar sobre un portaobjetos, una 7

suspensión de bacterias que se deja secar. A la preparación así obtenida, se le pasa rápidamente sobre una flama para que el calor fije las células al portaobjetos. La acción desnaturalizante del calor deshidrata la suspensión y mata a la mayoría de las bacterias, dejándolas en posibilidad de ser teñidas posteriormente, así mismo, evita que las bacterias se desprendan del portaobjetos durante los diferentes procesos de tinción. Es importante saber que algunas bacterias pueden sobrevivir a la fijación del calor, por lo que todo frotis fijo debe considerarse potencialmente infeccioso. En el procedimiento de tinción se emplea un sólo colorante. Una vez fija la preparación, se le agrega la solución colorante y se deja actuar aproximadamente un minuto, se enjuaga con agua para quitar el exceso de colorante, se deja secar y se procede a observar al microscopio. Los colorantes son sustancias que originalmente se derivaron de la anilina y que químicamente están constituidos por uno o más anillos aromáticos. Estos anillos aromáticos presentan sustituyentes llamados cromóforos que son responsables del color, formando los compuestos cromógenos. Estos cromógenos presentan además, grupos ionizables llamados auxocromos que permiten unir el colorante a estructuras de carga contraria de células y tejidos. Sin estos grupos las soluciones coloridas no podrían teñir. Incluir una imagen que ejemplifique los anillos aromaticos en un colorante. COMPETENCIA: El alumno diferenciará la forma y agrupación microscópica de los microorganismos mediante el uso de tinciones simples y el microscopio compuesto.

MATERIAL: Microscopio de campo luminoso

Tela suave y papel seda

Aceite de inmersión

Lápices de colores

Soluciones de cristal violeta, azul de metileno, verde de malaquita, safranina y fucsina básica. Cultivo de bacterias Portaobjetos 8

Asa bacteriológica Mechero de Bunsen Puente de coloración. MÉTODOS: Antes de iniciar con los procedimientos de la práctica leer el anexo 1. Elaboración de frotis a partir de un medio sólido Marca en un extremo los portaobjetos limpios y desengrasados Con el asa bacteriológica o un gotero, coloca una pequeña gota de agua en el centro del portaobjetos. Con el asa estéril toma una pequeña cantidad de crecimiento y con movimientos giratorios haz una suspensión homogénea en la gota de agua, extendiéndola para formar una película delgada. Esterilice nuevamente el asa. Deja secar al aire el frotis Fija el frotis al calor pasando la parte posterior del portaobjetos dos o tres veces por la flama del mechero, hasta alcanzar una temperatura que sea soportable en el dorso de la mano. Es importante que la laminilla no se caliente demasiado pues podrías calcinar a las bacterias modificando así sus características morfológicas y tintoriales. Colocar el frotis en el puente de tinción y cubrirlo con el colorante seleccionado durante un minuto Lavar con chorro de agua suave y escurrir dejar secar al aire y observar al microscopio con todos los objetivos 10X, 40X y 100X 2. Elaboración de frotis a partir de medio líquido - Marca en un extremo los portaobjetos limpios y desengrasados. - Sin poner agua, coloca con el asa estéril dos o tres gotas del cultivo en el centro del portaobjetos y extiéndelas para formar una película delgada y homogénea. - Deja secar al aire los frotis - Fija los frotis al calor como se explico en el caso anterior.

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- Colocar el frotis en el puente de tinción y cubrirlo con el colorante seleccionado durante un minuto - Lavar con chorro de agua suave y escurrir - Dejar secar al aire y observar al microscopio con todos los objetivos 10X, 40X y 100X - Realizar los dibujos correspondientes de cada una de las observaciones realizadas, indicando formas y agrupaciones.

ASIGNACIÓN 1.- Incluir en el reporte los esquemas de las preparaciones observadas con los objetivos 10x, 40x y100x de cada uno de los microorganismos. 2.- Investiga quien fue Roberto Koch y haz una reseña de sus principales aportaciones a la microbiología. 3.- Investiga la forma, y características generales de los microorganismos que observaste e incluye la referencia de las fuentes consultadas.

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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA PRÁCTICA 3 MORFOLOGÍA COLONIAL Y AISLAMIENTO POR ESTRÍA CRUZADA

INTRODUCCIÓN: Además del método de las diluciones para aislar microorganismos, existen otros que son cualitativos, siendo el de la estría cruzada el más común. Este consiste en tomar directamente de la muestra que nos interesa, una pequeña cantidad con ayuda del asa bacteriológica que se deposita en la superficie del medio de cultivo sólido; luego se hacen estrías con movimientos sucesivos del asa hacia un lado y otro, a la vez que se recorre de una orilla hacia el centro de la placa. Este procedimiento es equivalente a las diluciones ya que cada vez que se va extendiendo el contenido microbiano a lo largo de la estría, llegará el momento en que aún cuando se tenga en un principio una gran cantidad de organismos, se obtendrán colonias aisladas en algún punto a lo largo de la serie de estrías. Un buen aislamiento en placa se dará cuando se obtengan colonias aisladas de microorganismos, con una distancia que nos permita distinguir y describir su morfología colonial. La observación cuidadosa de las colonias ha mostrado que las características morfológicas suelen ser constantes el medio de cultivo usado y que éstas varían en apariencia dependiendo del grupo microbiano. Esto ha permitido iniciar el reconocimiento de los principales grupos de microorganismos sin llegar a ser una identificación definitiva. Las características que se toman en cuenta para describir la morfología colonial son las siguientes: Tamaño: medir el diámetro en milímetros Color: coloración de la colonia y del medio de cultivo Forma: pueden ser puntiformes, circulares o irregulares Elevación: pude ser plana, elevada, convexa, pulvinada, umbonada, umbilicada o crateriforme. 11

Bordes: pueden ser enteros, lobulados, ramificados, filamentosos, dentados o irregulares. Superficie: puede ser lisa, rugosa o granular. Luz reflejada: puede ser brillante o mate Luz transmitida: puede ser opaca, transparente o translúcida. Consistencia: puede ser dura o suave, esta última puede ser butirosa, mucoide o friable.

COMPETENCIA: Adquirir los conocimientos necesarios para diferenciar las formas coloniales bacterianas y desarrollar las habilidades para poder llevar acabo el aislamiento de bacterias por medio de la técnica de estría cruzada.

MATERIAL: Cajas petri con medios de cultivo: 1. generales ( Agar Nutritivo) 12

2. y diferenciales ( Agar Sal Manitol, Verde Brillante y TCBS ) Caldo tripticaseina de soya ( medio líquido en tubo ). Agar Nutritivo inclinado ( en tubo). Cultivos bacteriológicos varios 1. Bacillus,

.- Escherichia coli,

2. Pseudomonas

- Staphylococcus .

- Klebsiella pneumoniae 

Cultivos de levaduras: 1. Torula sp,

- Sacharomyces.

Asa bacteriológica

Portaobjetos

Mechero de Bunsen

Cubreobjetos

Chispa

Regla

Gradilla Puente para tinción

Bolsa de plástico transparente

MÉTODO Descripción de la morfología colonial. 1. Escoger 2 medios de cultivo diferentes y seleccionar una colonia aislada . 2. Medir cada una de las colonias (usar regla) y expresarlo en mm. 3. Describir el color de cada colonia. 4. Describir la forma, borde, elevación y superficie de acuerdo a la guía anexa. 5. Observar la luz reflejada y transmitida a contraluz, sin abrir la caja de Petri. 6. Apreciar la consistencia tocando la colonia con el asa previamente flameada y enfriada. I. Procedimiento para la siembra en estría cruzada.

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NOTA IMPORTANTE Sembrar y manipular los cultivos en un área aproximada de 20 cm alrededor del mechero de Bunsen. No abrir la caja fuera de esta área. No hablar mientras siembres y manipules los cultivos.

1. Flamear y enfriar el asa bacteriológica. 2. Tomar una pequeña porción de una colonia aislada. 3. Tocar el agar suavemente y deslizar el asa sin rasgarlo a manera de zigzag. (Observar el esquema anexo en la parte marcada con el número 1. (”primer cuadrante”)). 4. Flamear al rojo el asa, enfriar y extender las últimas líneas de siembra del primer cuadrante. (Observar el esquema anexo en la parte marcada con el No.2. (“segundo cuadrante”). 5. Repetir el mismo procedimiento según se indica en el esquema, en el “tercero y cuarto cuadrante”. 6. Practica este procedimiento en las circunferencias anexas al final de esta práctica usando un lápiz.

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7. Identifica las cajas con los siguientes datos: Número de equipo. Horario de laboratorio Nombre del cultivo bacteriano. 8. Incubar las cajas hasta las 24 horas a 37°C. (El maestro indicará el área a usar de la incubadora). 9. Describir la morfología colonial de una colonia aislada de cada una de las cepas bacteriológicas que se proporcionaron. 10. Introducir las cajas de Petri en una bolsa de plástico (solicitarla en el almacén) y colocarlas en el refrigerador con su respectiva identificación. II. Siembra en medios sólidos en tubo con agar inclinado 1. Tomar una asada del cultivo a sembrar con el asa previamente esterilizada y enfriada 2. Abrir el tubo de agar cerca de la flama, sin soltar la tapadera 3. Introducir el asa con el cultivo hasta el fondo del tubo 4. Arrastrar el asa haciendo zigzag sobre la superficie del agar 5. Incubar los tubos durante 24 hrs a 37ºC (el maestro indicará el área a usar de la incubadora) 6. Introducir los tubos en una bolsa de plástico y colocarlas en el refrigerador con su respectiva identificación III. Siembra en medio líquido 1. Tomar una asada del cultivo a sembrar con el asa previamente esterilizada y enfriada 2. Abrir el tubo de agar cerca de la flama, sin soltar la tapadera 3. Introducir el asa con el cultivo hasta el fondo del tubo 4. Agitar el asa vigorosamente dentro del medio de cultivo 5. Incubar los tubos durante 24 hrs a 37ºC (el maestro indicará el área a usar de la incubadora) 6. Introducir los tubos en una bolsa de plástico y colocarlas en el refrigerador con su respectiva identificación

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ASIGNACIÓN 1. Investiga al menos otros 2 métodos de aislamiento de cultivos bacterianos. 2. Compara el método desarrollado en la practica con los métodos que investigaste, señala además las ventajas y desventajas de cada uno de ellos.

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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA PRÁCTICA 4 TINCIÓN DE GRAM INTRODUCCIÓN En 1884 un médico danés, Hans Cristían Gram, desarrolló y publicó un método de tinción que lleva su nombre y que es de enorme utilidad en cualquier laboratorio de bacteriología. La técnica además de revelar detalles referentes a la forma y agrupación bacteriana, como cualquier otra técnica de tinción, permite clasificar a las bacterias en dos grandes grupos Gram positivas y Gram negativas. La diferenciación de Gram se tiene en el color que adquieren las bacterias cuando se tratan con el colorante cristal violeta seguido por una solución yodurada de potasio (lugol), como mordiente o mordente. Ciertas bacterias pierden la coloración violeta rápidamente cuando se decoloran con alcohol etílico, en tanto que otras la pierden con más lentitud. Después de la decoloración se usa un colorante de contraste que casi siempre es safranina. Las bacterias resistentes a la decoloración conservan una tonalidad azul o morada clasificándose como Gram positivas. Las bacterias que no pueden retener la tinción con cristal violeta, toman la coloración de contraste presentando una coloración rosa o roja; a estas bacterias se les denomina Gram negativas. Es importante observar que la base de esta diferenciación es más bien la velocidad de decoloración que una característica absoluta de las bacterias, por lo que el procedimiento se debe realizar con mucho cuidado. La afinidad tintorial mostrada por las bacterias Gram positivas y gram negativas, se debe a las diferencias en la estructura de la pared celular. Las bacterias Gram negativas tienen una capa delgada de peptidoglicano rodeada de una membrana externa construida de fosfolípidos y lipopolisacárido. 17

La tinción de Gram es aplicada en forma universal como primer paso en la identificación de las bacterias. Desafortunadamente existen algunos grupos bacterianos en los cuales la tinción de Gram no es de utilidad taxonómica, por ejemplo: las espiroquetas, micobacterias, clamidias, rickettsias y micoplasmas. El método de la tinción de gram ha sufrido varías modificaciones y algunas de éstas son incluso mejores que el método original. Los objetivos principales para modificar la tinción han sido: 1. Obtener un colorante primario más estable que el original, ya que éste se deteriora rápidamente 2.

Reducir el tiempo requerido para completar la técnica.

COMPETENCIA: Los alumnos adquirirán los conocimientos necesarios para aplicar la técnica de tinción de Gram en especies bacterianas conocidas y poder determinar si pertenecen al grupo Gram positivo o Gram negativo. MATERIAL Solución de cristal violeta Solución de lugol Solución de alcohol-acetona Solución de safranina Portaobjetos Asa bacteriológica Mechero Bunsen Microscopio Aceite de inmersión Cepas de Bacillus megaterium , Staphylococcus aureus  y Escherichia coli. Puente para tinción

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MÉTODOS 1. Tinción de Gram - Haga frotis de cada bacteria y fíjelos a la flama del mechero, tome en cuenta el procedimiento a seguir si los hace a partir de medio sólido o líquido. - Cubra los frotis con la solución de cristal violeta (colorante primario). Deje actuar esta mezcla por 1 minuto. - Escurra el exceso de colorante y lave con un chorro suave de agua. - Sacuda la laminilla para evitar gotas gruesas de agua y aplique la solución de lugol (mordente). Deje actuar por 1 minuto. - Escurra el exceso de lugol y lave con un chorro suave de agua. - Sacuda la laminilla y aplique el alcohol-acetona (agente decolarante) durante 3 a 5 segundos. Corte el proceso de decoloración lavando con agua. - Sacuda el frotis y aplique safranina (colorante de contraste) y déjelo actuar por 10 20 segundos. - Lave por último con un chorro de agua suave y deje secar el frotis al aire y use un papel absorbente presionando ligeramente sin tallar. - Observe al microscopio con el objetivo de inmersión.

INFORME 1. Haga esquemas de las preparaciones realizadas con las cepas de referencia y anote nombre de las bacterias, la forma, agrupación y su reacción de Gram. 2.

el

Haga esquemas de las preparaciones de las mezclas de bacterias teñidas .

ASIGNACIÓN 1.

Explique cual es el paso crítico en la tinción de Gram.

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2.

Indique al menos dos factores que pueden alterar los resultados en la tinción de Gram.

3.

Anote cinco géneros bacterianos de importancia veterinaria que sean Gram positivos y cinco Gram negativos.

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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA PRÁCTICA 5 TINCIÓN DE ZIEHL-NIELSEN INTRODUCCIÓN: Además de la tinción de Gram, hay otra tinción diferencial empleada en bacteriología que es la tinción de Ziehl-Nielsen o ácidorresistente. Esta tinción se fundamenta en que la mayoría de las bacterias son decoloradas por una mezcla de alcohol-ácido siendo la excepción las de los géneros Mycobacterium  y Nocardia . Estos géneros bacterianos forman un grupo de microorganismos que se definen, con base en sus propiedades tintoriales, como bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR). Son relativamente impermeables a los colorantes básicos, pero una vez teñidos, retienen fuertemente el colorante y resisten la decoloración con solventes orgánicos acidificados. La propiedad de ser ácido-alcohol resistente está determinada por la composición de la pared celular, la cual además de la peptidoglicana, está constituida por un alto porcentaje de glicolípidos hidrofóbicos (ceras), como el ácido micólico en Mycobacterium  y el ácido nocárdico en el género Nocardia . La presencia de éstas cepas hidrofóbicas previenen la penetración de soluciones acuosas, siendo la causa de que estos microorganismos no puedan ser teñidos por los métodos convencionales como la técnica de Gram. En la actualidad la tinción de Ziehl-Neelsen tiene gran importancia como una de las pruebas en el diagnóstico de Mycobacterium tuberculosis  agente causal de tuberculosis, enfermedad granulomatosa crónica tanto del hombre como de los animales y cuya incidencia ha aumentado recientemente. Es importante mencionar que en el análisis de un frotis de material clínico sospechosos de contener bacilos tuberculosos, el hallazgo de un solo bacilo ácido alcohol resistente tiene valor diagnóstico ya que en la mayoría de los casos no son abundantes. Sin embargo la interpretación 21

del hallazgo debe hacerse con cautela y con base en la historia clínica y otras pruebas de laboratorio, debido a la existencia de especies saprofitas de Mycobacterium  y que podrían conducir a un diagnóstico falso. Por otra parte, existen algunas especies de Corynebacterium  y Nocardia  que ocasionalmente pueden comportarse como bacterias ácido-alcohol resistentes.

COMPETENCIA: Los alumnos adquirirán los conocimientos para llevar a cabo la tinción de ZiehlNielsen sobre células bacterianas conocidas para poner de manifiesto las diferencias entre las bacterias ácido alcohol-resistentes y las que no lo son. MATERIAL: Solución fucsina fenicada Solución de alcohol ácido Solución de azul de metileno puente de coloración Portaobjetos Mechero de Bunsen Microscopio Asa bacteriológica Aceite de inmersión Cepas de Staphylococcus aureus, Bacillus y Klebsiella  Montajes de Mycobacterium tuberculosis  teñidos con Zielh-Neelsen

MÉTODOS: 1. Técnica de Ziehl-Neelsen. haga dos frotis con las cepas asignadas. Deje secar los frotis al aire y fíjelos con calor. colocar papel filtro sobre el frotis Cubra los portaobjetos con fucsina fenicada.

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-

Caliente suavemente con la flama del mechero hasta la emisión de vapores y mantenga la emisión durante cinco minutos. El colorante no debe hervir ni secarse, por lo que puede continuar agregando colorante conforme sea necesario.

-

Dejar enfriar Escurra el exceso de colorante y retire suavemente el papel lave con un chorro de agua suave. Decolore exhaustivamente con alcohol ácido, realizando dos decoloraciones de un minuto cada una Lave con un chorro suave de agua. Cubra el frotis con azul de metileno y déjelo actuar durante un minuto. Lave por último con un chorro suave de agua y deje secar la preparación. Observe los frotis con objetivo de inmersión. Describa la morfología microscópica de las cepas a las que realizó la tinción y y al montaje de Mycobacterium tuberculosis y realice esquemas de cada uno de los frotis Las bacterias ácido alcohol resistentes (BAAR +) se tiñen de color rojo y las no

ácido-alcohol resistentes (BAAR -) de color azul.

INFORME: 1.-

Describa la morfología microscópica de las cepas a las que realizó la tinción de ZiehlNielsen y haga esquemas de cada uno de los frotis

ASIGNACIÓN 1 Investigar ¿Por que es necesario calentar el colorante primario en esta técnica? 2. Investigar a que se debe la propiedad de algunas bacterias de ser ácido-alcohol resistentes

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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA PRÁCTICA 6 TINCIONES SELECTIVAS INTRODUCCIÓN Muchas estructuras bacterianas se pueden observar en condiciones adecuadas, sobre todo cuando se aplican ciertas técnicas de tinción. Aunque algunos constituyentes celulares son comunes en todas las células, otros solo los poseen ciertas especies. Las tinciones selectivas se utilizan para poner de manifiesto estructuras celulares o bien para obtener información acerca de sus componentes a través de su reacción con los colorantes. En general las técnicas de tinción se basan en el hecho de que la estructura celular que se desea poner de manifiesto tiene mayor grado de afinidad por los colorantes utilizados, que el resto de la célula. Así se puede teñir o poner de manifiesto estructuras como la cápsula, pared celular, material genético, fimbrias o pilis, flagelos, endoesporas e inclusiones citoplasmáticas. Los colorantes ácidos, que no tiñen a la célula, son a veces útiles para revelar las capas superficiales con bajo índice de refracción, como la cápsula, que se encuentra sobre la pared celular envolviendo a las bacterias. La mayoría de las cápsulas bacterianas están compuestas por polisacáridos mientras que otras son de naturaleza polipeptídica. La cápsula desempeña un papel importante en la virulencia de algunas bacterias patógenas, ya que les confieren propiedades antifagocíticas que interfieren con los mecanismos de defensa de los organismos infectados. Las cápsulas no pueden observarse en frotis teñidos con las técnicas usuales, porque son incapaces de retener el colorante y porque los procesos de fijación al calor y el lavado las disuelven; por lo tanto, las tinciones negativas como la de rojo congo y la de tinta china o nigrosina donde no se tiñe la bacteria pero sí su alrededor y no se usa el calor, ni sustancias químicas fuertes, resultan ser la mejor opción.

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Las esporas bacterianas o endoesporas son estructuras producidas durante el ciclo de vital de ciertos géneros, que presentan una gran resistencia a agentes físicos y químicos debido al número y estructura química de sus cubiertas. Por ésta misma razón, las endoesporas son impermeables a los colorantes y en una tinción normal, se observan como estructuras altamente refringentes y sin teñir. Sin embargo cuando se aplica calor a un frotis cubierto de verde malaquita como en el caso de la técnica de Schaeffer y Fulton, se facilita la penetración del colorante. El lavado y teñido posterior con safranina como colorante de contraste, permite ver a las endoesporas de color verde dentro de células rojas.

COMPETENCIA: Los alumnos adquirirán y aplicaran los conocimientos para realizar algunas técnicas de tinción selectivas y observar algunas estructuras bacterianas (cápsulas y endoesporas).

MATERIAL Solución de cristal violeta Solución de lugol Solución de alcohol-acetona Solución de verde malaquita Solución de safranina Solución de rojo congo Solución mordente de cápsula Papel filtro Agua destilada Portaobjetos Pinzas de disección sin dientes Puente de tinción Mechero de Bunsen Asa bacteriológica Pizeta Microscopio 25

Aceite de inmersión Cepas de Klebsiella pneumoniae, Bacillus sp y Staphylococcus aureus  MÉTODOS I. Observación de cápsula Técnica del rojo congo 1. Coloque una pequeña gota de rojo congo en el centro del portaobjetos. 2. Tome un poco de cultivo de Klebsiella pneumoniae  y suspéndala en la gota de rojo congo, extiéndala hasta formar una película delgada. 3. 4. 5. 6.

Deje secar al aire y NO FIJE EL FROTIS AL CALOR. Cubre el frotis con mordente de cápsula y déjelo actuar por un minuto. Lave el frotis con agua destilada y deje secar al aire. Observe el portaobjetos con lente de inmersión. 7. Repita el mismo procedimiento con la cepa de Staphylococcus aureus. 8. Realice los esquemas de sus observaciones. 9. Al terminar la observación, deseche la preparación en un frasco con desinfectante.

La cápsula se observará como una zona clara o transparente alrededor de la bacteria, que se observa de color rojo en un campo color azul oscuro.

Estructura bacteriana. Tomado de www.alaquarium.com/bacterias 26

II. Observación de esporas. Técnica de tinción de Gram. 1. Haga un frotis de la manera usual con Bacillus. 2. 3. 4. 5. 6.

Tiña el frotis por la técnica de Gram. Observe el frotis con lente de inmersión. Repita el mismo procedimiento con el cultivo de K.pneumoniae . Realice los esquemas de sus observaciones. Al terminar la observación, deseche la preparación en un frasco con desinfectante.

0 bacterias Gram positivas se verán de color azul o morado, y las Las esporas se observaran como zonas claras sin teñir. Las bacterias Gram negativas se verán de color rosa o rojo, observe la ausencia de las esporas.

Técnica de Schaeffer y Fulton. 1. Haga un frotis de la manera usual con Bacillus. 2. Cubra el frotis con un papel filtro e imprégnelo con verde malaquita. 3. Caliente el frotis con el mechero hasta la emisión de vapores. 4. Mantenga la emisión por cinco minutos. Evite que el colorante hierva o se seque el frotis. 5. Deje enfriar y desprenda suavemente el papel filtro. 6. Lave el frotis exhaustivamente con un chorro de agua suave y sacúdalo para eliminar el exceso de agua. 7. Cubra el frotis con safranina y déjela actuar por un minuto. 8. Lave con un chorro de agua suave. 9. Secar al aire la preparación o con ligera presión con toallas absorbentes. 10. Observe con lente de inmersión.

Las esporas se observarán de color verde y las bacterias de color rojo 27

Fig.1: Esporas bacterianas. a) subterminales b y c) centrales d) terminales Tomado de Johnson T. And Case C. Laboratory experiments in Microbiology. 3 rd edition. Benjamin Cummings. 1992.

ASIGNACIÓN 1. 2. 3. 4.

Investigue cinco ejemplos de bacterias de importancia en veterinaria que tengan cápsula. Investiga que compuestos químicos pueden formar a las cápsulas. Investigar tres ejemplos de bacterias de importancia en veterinaria que formen esporas. Investigar cuales son las partes que forman a una espora bacteriana.

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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA PRÁCTICA 7 AISLAMIENTO DE HONGOS Y MORFOLOGÍA COLONIAL

INTRODUCCIÓN Los hongos son organismos eucarióticos unicelulares o filamentosos con paredes celulares compuestas de quitina y otros polisacáridos, no fotosintéticos, saprofitos o parásitos, quimiorganotróficos aerobios que se nutren por absorción y se propagan por esporas producidas en condiciones normales de reproducción sexual y asexual. Esta definición tan vaga y amplia se hizo para abarcar todas las anomalías morfológicas y fisiológicas que ocurren entre los hongos. La clasificación de los hongos se basa en gran parte en las estructuras de reproducción que incluyen la naturaleza del ciclo biológico, las estructuras reproductoras y las esporas. Los principales grupos taxonómicos se basan en las esporas de reproducción sexual. Aunque en un sentido sistemático formal las levaduras no son diferentes del resto de los hongos, en la práctica es frecuente que éstas se traten por separado de los hongos filamentosos tanto en los sistemas de clasificación como de identificación, ocurriendo lo mismo para otro tipo de hongos como son las setas. Algunos hongos presentan un comportamiento dimórfico, esto significa que pueden presentar una forma filamentosa y otra levaduriforme dependiendo del ciclo de vida, del hábitat en el que se encuentren o de las condiciones de cultivo. Tradicionalmente los hongos se han separado en dos grandes grupos, los Mixomicetos y los Eumicetos. Los mixomicetos representan la línea divisoria entre los protozoos y los hongos. Desde el punto de vista veterinario, los hongos tienen gran interés debido a que algunas especies

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causan enfermedades (micosis) y otras se desarrollan en el alimento para animales produciendo micotoxinas, que pueden provocar intoxicaciones alimenticias.

COMPETENCIA: Los alumnos adquirirán las habilidades para llevar a cabo el aislamiento de hongos, y realizar la diferenciación de las estructuras que los forman mediante una descripción morfológica tanto macroscópica como microscópica MATERIAL Cajas de petri con agar rosa de bengala Cajas petri con agar dextrosa Sabouraud Tubos de ensaye de 16 X 150 con 10 ml de formaldehído al 10% Asa en ángulo recto Portaobjetos y cubreobjetos Puente de coloración Solución de lactofenol azul de algodón. Barniz de uñas transparente Fenol al 3 %. Papel Kraft. Microscopio Cepas de Penicillium sp, Aspergillus sp  y Sacharomyces cerevisae  o Torula sp. MÉTODOS PRIMERA SESION Aislamiento de hongos

NOTA IMPORTANTE

Coloca el cubre bocas de modo que proteja tu nariz y boca. Evita moverte de un lugar a otro para evitar el desplazamiento de las esporas. Coloca un tapete humedecido con fenol al 3 % en la superficie de la mesa donde vas a trabajar. 30

1. Revisa antes de iniciar que hayas cumplido con las indicaciones de la NOTA IMPORTANTE. 2. Coloca sobre el papel humedecido los cultivos de hongos a sembrar, el mechero de bunsen y los medios de cultivo. 3. Esteriliza al fuego el asa doblada en ángulo recto (90°) y toma un poquito del micelio aéreo. 4. Siembra el hongo por picadura en el centro de una placa de agar dextrosa Sabouraud. 5. Repite el mismo procedimiento con la placa de agar Rosa de Bengala. 6. Siembra el hongo levaduriforme ( Sacharomyces  o Torula ) estriando sobre la placa de agar.(como en la práctica3) 7. Sella las placas con cinta maskintape. 8. Incuba los medios de cultivo inoculados a temperatura ambiente durante 3 -4 días. 9. Revisa los medios de cultivo cada 24 a 48 hrs. 10. Anota los cambios de forma y color que se presentan.

Observación de la morfología microscópica. 1. Revisa antes de iniciar que hayas cumplido con las indicaciones de la NOTA IMPORTANTE. 2. Coloca sobre el papel humedecido los cultivos de hongos a sembrar, el mechero de bunsen y los medios de cultivo. 3. Marca con lápiz de cera los portaobjetos y coloca en el centro una gota de lactofenol azul de algodón. 4. Haz una suspensión con un poquito del micelio revolviendo exhaustivamente para separarlo. 5. Coloca un cubreobjeto. 6. Observa con objetivos 10X y 40X. 7. Realiza los dibujos de las estructuras que observes. 8. Compara tus dibujos con los esquemas anexos. 9. Repite el procedimiento para la levadura, pero tiñendo con Gram 31

SEGUNDA SESIÓN 1. Revisa antes de iniciar que hayas cumplido con las indicaciones de la NOTA IMPORTANTE. 2. Coloca sobre el papel humedecido los cultivos de hongos que sembraste en la primera sesión y el mechero de bunsen. 3. Describe la morfología colonial de los hongos, intercambiándolos entre los equipos. 4. Describe las siguientes características: Tamaño: Mide en cm, el diámetro de la colonia fungal. Aspecto: Observa la superficie del hongo, que puede ser; algodonoso, aterciopelado, gránulos o pulvurulento. Color del micelio aéreo: Observa los cambios de color y descríbelos partiendo del centro a la periferia. Color del micelio vegetativo: Observa el grueso del agar y describe el color del crecimiento fungal . Producción y color del pigmento difusible: Nota algún cambio de color en el medio de cultivo original. Registra las características de la morfología colonial de los hongos observados. Tamaño (cm)____________________________________________________  Aspecto_______________________________________________________________________   ___________________________________________________  Color del micelio aéreo______________________________________________  Color del micelio vegetativo__________________________________________  Producción de pigmento difusible______________________________________  5. Realiza preparaciones en fresco de los dos hongos seleccionados. 6. Coloca un poco de micelio aéreo en un portaobjetos que contenga una gota de lactofenol azul de algodón. 7. Dispersa el micelio en el colorante. 8. Cubre la preparación con un cubreobjetos. 32

9. Observa la preparación al microscopio usando objetivos seco débil y seco fuerte. 10. Describe la morfología microscópica considerando las siguientes características: Diámetro del micelio: microsifonado o macrosifonado Tipo de micelio: Observa las hifas, si son septados o ramificadas. Hifas: pigmentadas o hialinas Tipo de esporas y estructuras reproductoras.

Fig.1. Ejemplos de estructuras reproductoras. Tomado de . Koneman. Color atlas and textbook of Diagnostic Microbiology. 5th ed. Lippincott Williams and Wilkins. 1997.

Fig.2. Tipos de Hifas. Tomado de Koneman. Color atlas and textbook of Diagnostic Microbiology. 5th ed. Lippincott Williams and Wilkins. 1997.

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Registra las características de la morfología colonial de los hongos observados. Tamaño (cm)_____________________________________________________  Aspecto_______________________________________________________________________   ___________________________________________________  Color del micelio aéreo______________________________________________  Color del micelio vegetativo__________________________________________  Producción de pigmento difusible______________________________________ 

ASIGNACIÓN 1. realice los esquemas de la morfología colonial de los hongos que se observaron. 2. investigue sus características y estructuras microscópicas. 3. realice esquemas de sus estructuras microscópicas.

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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA PRÁCTICA 8 CULTIVO DE ANAEROBIOS INTRODUCCIÓN Un factor que influye de manera importante en el crecimiento microbiano es el oxígeno y aunque es un gas muy reactivo, muchos microorganismos dependen de la disponibilidad del oxígeno molecular como nutriente. Los microorganismos se pueden clasificar de acuerdo a sus necesidades y tolerancia al oxígeno en: aerobios estrictos, microaerofilicos, anaerobios facultativos, anaerobios estrictos y anaerobios aerotolerantes. Los aerobios estrictos dependen del oxígeno, ya que lo utilizan como aceptor final de electrones en la cadena respiratoria y no pueden llevar a cabo la fermentación. Los microaerofilicos no requieren de oxígeno pero lo toleran a bajas concentraciones. Los anaerobios facultativos utilizan el oxígeno si está disponible, pero también pueden crecer en ausencia del mismo, ya que pueden realizar un metabolismo oxidativo o fermentativo dependiendo de las condiciones de cultivo. Los anaerobios estrictos no pueden utilizar el oxígeno ya que solo pueden efectuar un metabolismo fermentativo e incluso no crecen o mueren en presencia de oxígeno debido a que les resulta tóxico aún a bajas concentraciones, mientras que los anaerobios aerotolerantes crecen a bajas o elevadas concentraciones de oxígeno aunque no lo utilicen en su metabolismo. Aún cuando la toxicidad del oxígeno se manifiesta claramente sobre los anaerobios, a concentraciones elevadas resulta tóxico incluso para los aerobios estrictos ya que el oxígeno es un agente oxidante fuerte, capaz de generar un grupo de radicales libres (singlete, superóxido, peróxido e hidróxilo), que reaccionan sobre moléculas orgánicas. Los microorganismos que toleran el oxígeno, por lo general contienen enzimas que los protegen de la toxicidad como son la catalasa, peroxidasa y la superóxido dismutasa.

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Mientras que la aereación se emplea para incrementar el crecimiento de los microorganismos aerobios, el oxígeno debe ser excluido del medio de cultivo para permitir el crecimiento de los anaerobios estrictos. Esto se puede hacer agregando sustancias reductoras al medio de cultivo que reaccionan con el oxígeno molecular disuelto, eliminándolo. Por ejemplo, frecuentemente se añade tioglicolato de sodio, cisteína u otros compuestos que contienen grupos sulfhidrilos. En los medios líquidos se suele burbujear nitrógeno, hidrógeno o bióxido de carbono para desplazar al oxígeno y posteriormente se sella el recipiente para evitar que entre de nuevo el oxígeno. Además, hay muchos modelos de cámaras de cultivo para anaerobios que se emplean para eliminar el oxígeno de la atmósfera. Estos modelos como el sistema GasPack, generan hidrógeno el cual reacciona con el oxígeno mediante un catalizador dentro de la campana produciendo agua; también se genera bióxido de carbono para reemplazar el volumen de gas agotado por la conversión de oxígeno a agua. En todos estos métodos es recomendable utilizar indicadores de oxido-reducción como el azul de metileno y la resarzurina que permiten conocer las condiciones del sistema; en condiciones oxidadas los indicadores están coloreados y en condiciones reducidas son incoloros. La cuantificación del estado de oxidación de un medio se expresa por la relación del potencial de óxido-reducción (O/R). El potencial se puede medir utilizando electrodos y un potenciómetro, cuando los valores son positivos significa que hay oxígeno disuelto en el medio y los compuestos orgánicos están parcialmente oxidados, cuando son negativos significa que no hay oxígeno disuelto y los compuestos orgánicos están reducidos. COMPETENCIA: Los alumnos adquirirán los conocimientos y habilidades para poner en práctica algunas técnicas para el aislamiento y cultivo de bacterias anaerobias. MATERIAL Tubos de 16 X 150 con 5 ml de agua destilada estéril Tubos de 16 X 150 con tapón de rosca con caldo tioglicolato Tubos de 16 X 150 con tapón de rosca con caldo nutritivo Pipetas Pasteur estériles Cajas de petri con gelosa sangre Plastilina Muestra de material fecal animal Cepas de Clostridium sp, Bacillus subtilis y Escherichia coli  36

MÉTODOS PRIMERA SESION 1. Aislamiento de bacterias anaerobias de material fecal. - Adicionar aproximadamente un gramo de muestra a un tubo con 5 ml de agua destilada estéril, agitar y dejar sedimentar durante 10 minutos. - Tomar una asada del sobrenadante y sembrar por estría cruzada en una placa de gelosa sangre. - Agitar de nuevo el tubo y calentar la muestra a ebullición por 10 minutos y dejar sedimentar otros 10 minutos. - Sembrar otra placa con gelosa sangre. - Incubar la cajas en anaerobiosis a 37º C durante 40 horas.

2. Cultivo de bacterias anaerobias en medios líquidos. - Inocular con ayuda de una pipeta Pasteur estéril cada una de las cepas proporcionadas en los tubos con caldo tioglicolato y caldo nutritivo. - Incubar a 37 ºC durante 24 - 48 horas. 3. Cultivo de microorganismos anaerobios por comensalismo. - Divide una caja de gelosa sangre en dos y en un lado siembra una asada de

Clostridium 

sp y del otro lado una asada de Bacillus subtilis .

-

Sella con plastilina los bordes de la caja Incuba a 37 º C durante 24 - 48 horas.

SEGUNDA SESION 1. Describe la morfología colonial de dos colonias aisladas a partir de la muestra materia fecal y la morfología microscópica utilizando la tinción de Gram. 2. Observa el crecimiento de las cepas bacterianas sembradas en los medios discute los resultados.

líquidos

de

y

37

3.

Observa el crecimiento de la bacteria anaerobia y de la aerobia y realice un tinción de Gram de cada uno. Haga esquemas.

frotis

y

ASIGNACION - Investiga al menos tres bacterias anaerobias de importancia en medicina veterinaria - Investiga los patrones de crecimiento bacteriano en diferentes medios de cultivo de las bacterias anaerobias

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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA PRÁCTICA 9 USO DE MEDIOS SELECTIVOS

INTRODUCCIÓN Los requerimientos nutricionales de las bacterias son muy variados, lo cual hace necesario contar con una amplia gama de medios de cultivo. La selección de éstos depende de la cantidad y variedad de microorganismos en la muestra a estudiar, del tipo de microorganismo que se prefiere aislar y los que se quiere eliminar para que su abundancia no los encubra o dificulte el aislamiento. Basados en la utilidad diagnóstica de los medios de cultivo, es posible hacer la siguiente clasificación: Medios simples.- Son medios que promueven el desarrollo de microorganismos nutricionalmente poco exigentes. Estos medios reciben también el nombre de medios básicos o generales. Se utilizan principalmente para muestreos de medio ambiente o superficies, análisis cuantitativos y conservación de cepas. Medios enriquecidos.- Son medios que han sido suplementados con nutrientes que proporcionan factores de crecimiento para promover el desarrollo de microorganismos de requerimientos nutricionales exigentes. Estos medios contienen generalmente uno o más de los siguientes ingredientes: sangre, suero, plasma líquido ascítico, huevo carne vitaminas, aminoácidos específicos, NAD o hemina, entre otros.

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Medios selectivos: Estos medios contienen sustancias inhibidoras para suprimir parcial o totalmente el desarrollo de microorganismos no deseados. Las sustancias utilizadas con mayor frecuencia son colorantes, sales inorgánicas, sales biliares, antibióticos y detergentes. Los medios selectivos tienen una gran utilidad para el aislamiento de gérmenes patógenos a partir de muestras clínicas que contengan bacterias de la microflora normal. Medios diferenciales.- Estos medios contienen indicadores que permiten diferenciar algunos géneros o especies bacterianas por el aspecto característico de sus colonias. La mayoría de los medios selectivos son también diferenciales. Ejemplos: Agar verde brillante, agar ENDO, agar eosina azul de metileno, agar Salmonella-Shigella, agar McConkey. Estos permiten diferenciar enterobacterias fermentadoras de lactosa (coliformes). Medios de enriquecimiento.- Estos medios son líquidos y poseen efecto inhibitoria sobre ciertos géneros bacterianos, favoreciendo al mismo tiempo el desarrollo de otros que se encuentran en menor proporción en la muestra. Son medios muy utilizados en la bacteriología del tracto intestinal, principalmente para el enriquecimiento de Salmonella sp . a partir de muestras de heces en las cuales el número de salmonelas puede ser muy pequeño en comparación al elevado número de bacterias que normalmente habitan el tracto intestinal. Estos medios se inoculan mediante un hisopo o bien depositando la muestra en el medio a una proporción de 1:10, ejemplo, un gramo de muestra en 10 ml de medio, El período de incubación de estos medios debe ser de 12-18 horas y es necesario resembrar a partir de ellos, en medios selectivos y diferenciales para identificar colonias características. Ejemplos de éstos medios son el caldo selenito y el caldo tetrationato, medios de enriquecimiento para Salmonella sp . Medios de transporte.- Son medios utilizados para el transporte de las muestras clínicas desde el lugar de su colección hasta el laboratorio. Su finalidad es preservar la viabilidad de los microorganismos cuyo aislamiento va a intentarse posteriormente. La composición de este tipo de medios varía considerablemente de acuerdo al microorganismo cuya viabilidad se desea preservar. Estos medios pueden ser desde una simple solución fisiológica amortiguada, hasta medios más complejos que contengan sustancias inhibidoras, agentes reductores, sustancias osmóticamente activas (sacarosa), suero, etc. Algunos ejemplos de estos medios son: Medio de Stuart, medio de Carry-Blair, utilizados como medios de transporte de uso general para un gran número de bacterias aerobias y anaerobias. Medio Campy-thio y medio Clark-Dufty, diseñados 40

para preservar la viabilidad de Campylobacter  sp. y la solución amortiguadora de Bovarnyk, para preservar la viabilidad de Chlamidias y Riquettsias. Medios especiales.- Son medios que no pueden ser fácilmente agrupados en alguno de los grupos de medios descritos anteriormente y la mayoría son utilizados para comprobar una o más características bioquímicas de los microorganismos.

COMPETENCIA: Los alumnos adquirirán las habilidades para poder identificar diferentes tipos de medios de cultivo y su utilidad en el aislamiento e identificación de bacterias.

MATERIAL Caja petri con agar Mac Conkey Caja petri con agar eosina azul de metileno Caja petri con agar Staphylococcus Caja de petri con agar Sal y manitol Tubo de 13X100 con caldo glucosado Tubo de 13 X 100 con medio Stuart Tubo de 16 X150 con Caldo bilis verde brillante al 2% Cepas de Escherichia coli, Salmonella cholerae suis, Proteus sp y Staphylococcus aureus, Bacillus sp.

MÉTODOS 1. Medios de cultivo selectivos 41

1) Sembrar por estría cruzada la mezcla de bacterias (Gram + y -) proporcionada por el profesor en el Agar Sal y manitol y el Agar Verde brillante. 2) Sembrar por estría cruzada los cultivos puros antes mencionados en los medios de cultivo restantes, conforme lo indica la tabla anexa. 3) Identificar las cajas de petri y los tubos con el nombre del cultivo. 4) Formar un paquete con las cajas y los tubos sembrados para incubar a 37ºC durante 24-48 horas. 5) Observar el cambio de color que se da en los medios de cultivo, la morfología colonial de los cultivos. 6) Interpretar los resultados.

INFORME 1) 2) 3) 4)

Describa la morfología colonial de las cepas proporcionadas y sembradas en los diferentes medios de cultivo. Indica los cambios de color que se aprecian en los medios de cultivo y a que se atribuyen. Interprete y discuta los resultados. Complete las tablas anexas con sus observaciones.

ASIGNACIÓN: 1) Investiga la composición química de los medios de cultivo líquidos y sólidos que sembraste.

42

2) Investiga y explica a que se atribuyen los cambios que observaste en los medios de cultivo conforme a la cepa bacteriana que sembraste en cada uno de ellos. Medio de

Color del

Indicador

Tipo de

Cepa

Forma de

cultivo

medio de

que

medio de

bacteriana

siembra en el

cultivo

contiene el

cultivo

medio de

medio Caldo glucosado

cultivo E.coli ó  Salmonella 

Caldo bilis verde brillante

E.coli 

Medio Stuart

S.aureus 

Mac Conkey

Salmonella 

Verde brillante

Mezcla de 

Eosina Azul de metileno

Proteus 

A.Estafilococ cus 110.

S.aureus ó 

Sal y manitol

Mezcla de 

bacterias 

bacterias 

Agar nutritivo

Bacillus 

43

Medio cultivo

de Cepa

Morfología colonial Forma

bacteriana

y Modificación en

agrupación

el medio a las

bacteriana y 24 tinción

hrs

de

de cultivo

Gram Caldo glucosado

E.coli

ó 

Salmonella 

Caldo bilis verde E.coli  brillante Medio Stuart S.aureus 

Mac Conkey Salmonella  Verde brillante

Mezcl  a

de 

bacter  ias 

Eosina Azul Proteus  de metileno A.Estafilococ S.aureus ó  cus 110. 44

Sal y manitol Mezcla

de 

bacterias 

Agar nutritivo Bacillus 

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INSTITUTO TECNOLOGICO DE SONORA LABORATORIO LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIA PRACTICA 10 USO DE PRUEBAS BIOQUIMICAS INTRODUCCION La identificación de una bacteria a partir de una muestra clínica exige su aislamiento en cultivo puro, de ahí que es muy importante la técnica d siembra y el uso de diferentes medios de cultivo. Sin embargo el crecimiento de las bacterias implica necesidades de ciertos nutrientes para llevar a cabo su metabolismo, el cual puede variar según el tipo de bacteria de que se trate, de ahí el uso de una gran variedad de pruebas bioquímicas que miden la presencia o ausencia d enzimas que participan en el catabolismo del sustrato que se añade al medio diferencial. Muchas de estas pruebas se leen mediante los cambios de color que se producen en los medios de cultivo por la presencia de indicadores de pH. Así se usan medios diferenciales como por ejemplo: el caldo rojo de fenol, al cual se le adicionan carbohidratos (glucosa, trehalosa, maltosa, fructosa) para valorar la fermentación de azucares mediante la observación de burbujas de gas de hidrogeno o dióxido de carbono atrapadas en un vial invertido y la acidificación del medio original se hará evidente por po r el viraje de color rojo original a amarillo. a marillo. Existe una gran variedad de pruebas bioquímicas que auxilian al médico clínico o al microbiólogo en la identificación del género y la especie del agente patógeno presente en una muestra clínica, esto es de gran importancia, pues con la correcta interpretación de estos hallazgos podrá confirmarse el diagnóstico del agente causal de la enfermedad y con ello podrán adoptarse las medidas terapéuticas y preventivas idóneas según el caso. COMPETENCIA: Los alumnos adquirirán los conocimientos y habilidades para identificar, inocular e interpretar las diferentes pruebas bioquímicas utilizadas para la identificación bacteriana.

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MATERIAL Tubos de 13x100 con medio SIM Tubos de 13x100 con citrato de Simmons Tubos de 13x100 con caldo glucosado Tubos de 13x100 con medio TSI Tubos de 13x100 con agar urea Portaobjetos Solución de rojo de metilo Solución de alfa-naftol Solución de KOH creatina Solución de KOH al 3% Reactivo de Kovac`s Cepas bacterianas de: E. coli, Salmonella sp, Klebsiella sp, Proteus sp, Streptococcus sp y  Staphylococcus Staphylococcus aureus 

METODOS 1. Prueba para confirmación de la tinción de Gram o de KOH al 3%

-

Esta prueba consiste en colocar sobre un portaobjetos una gota de KOH al 3% y con el asa hacer una suspensión de la colonia de bacterias a probar Mezclar con movimientos giratorios de 1 a 3 minutos

-

Separar el asa de la mezcla, si se forma una hebra o hilo viscoso, indica que se trata

-

de bacterias Gram negativas, si esto no sucede, se tratará de bacterias Gram positivas -

Realiza esta prueba con diferentes cultivos Gram + y –

2. Pruebas bioquímicas bioquímicas para bacterias Gram Gram negativas negativas Medio TSI -

Sembrar por picadura y estría en la superficie de los tubos de TSI cada una de las cepas proporcionadas

-

Incubar los tubos a 37ºC durante 24 horas Observar e interpretar los resultados como sigue:

-

a) fermentación de glucosa: color amarillo en el fondo del tubo tubo 47

b) fermentación de lactosa: color amarillo en la superficie superficie del medio c) Producción de gas: gas: burbujas en el fondo del tubo Producción de ácido sulfhídrico: precipitado de color negro en el fondo del tubo prueba de rojo de metilo y Vogues-Proskauer -

Sembrar en dos tubos de caldo glucosado o medio RM-VP las cepas proporcionadas Incubar a 37ºC durante 24-48 hrs Observar e interpretar los resultados como sigue: a) Prueba de rojo de metilo: Añada al tubo 5 gotas del reactivo rojo de metilo y sin agitar observe la presencia de un anillo de color rojo en la superficie del medio; la prueba será negativa cuando no exista el color rojo b) Prueba de Vogues-Proskauer: Añada al tubo 6 gotas de alfa-naftol y dos gotas de KOH creatina, agitar suavemente y dejar reposar el tubo de 10 a 15 min. La prueba positiva será la aparición de color rojo en la superficie del tubo y en la negativa no hay coloración roja

Utilización de citrato Sembrar un tubo de citrato de Simmons por estría en la superficie, para cada cepa proporcionada -

Incubar los tubos a 37ºC durante 24-48 hrs.

-

Observar e interpretar el resultado como sigue: El crecimiento y vire del indicador de verde a azul, significan que el microorganismo dio la prueba a la utilización del citrato.

Medio SIM -

-

Sembrar por picadura utilizando el asa recta, un tubo con medio SIM para cada cepa proporcionada Incubar los tubos a 37ºC durante 24-48 hrs Observe e interprete los resultados como sigue: a) Producción de ácido sulfhídrico: precipitado de color negro b) Movilidad: positivo si hay turbiedad, e inmóvil si solo hay crecimiento en la picadura c) Producción de indol: Añada 5 gotas de reactivo de Kovacs, la coloración roja indica que la prueba es positiva. positiva.

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Producción de ureasa – Siembre el agar inclinado una asada de cultivo abundante sobre la superficie – – –

Incube a 37ºC de 1 a 7 días La reacción positiva se observa al virar el medio a un color rosa intenso Si no hay cambios en el medio de cultivo, es negativo

3 Pruebas bioquímicas para bacterias Gram positivas 3.1 prueba de catalasa: Esta prueba es muy útil para la diferenciación de los estreptococos de los estafilococos y micrococos - Sobre un portaobjetos colocar una gota de peróxido de hidrógeno al 3%, y con el asa tomar una de las colonias - Mezclar la colonia con la gota con movimientos giratorios - La lectura se hace inmediatamente, si aparece un burbujeo la prueba es positiva NOTA: Pueden presentarse falsos positivos si la colonia se toma de un medio adicionado con sangre 3.2 Prueba de coagulasa - Tomar con el asa aproximadamente 5 colonias del medio de Baird Parker e introducirlas en el vial que contiene el plasma hidratado e incubar a 37ºC de 1 a 3 hrs - Evitar agitar el tubo para observar la formación del coagulo, se considera la prueba positiva si el contenido del tubo en más de tres cuartas partes presenta la formación de un coagulo compacto INFORME Haga una tabla donde coloque los resultados de las pruebas bioquímicas de las cepas utilizadas en la práctica ASIGNACION Investiga las reacciones bioquímicas de las cepas bacterianas que utilizaste en la práctica.

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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA PRÁCTICA 11 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS

INTRODUCCIÓN La observación del afecto inhibidor de algunos microorganismos sobre otros data desde 1874. Pasteur y otros investigadores observaron que infectando a un animal con Pseudomonas  aeruginosa , lo protegía contra Bacillus anthrasis . Posteriormente se usó el término antibiosis para explicar el efecto de inhibición sobre otros microorganismos y el término de antibiótico para la sustancia que causa tal efecto. Este fenómeno puede apreciarse al realizar pruebas de sensibilidad a antimicrobianos. Las pruebas de uso más común y comercial son las de difusión en agar, en las que se aplica una fuente de antibiótico a una superficie de medio sólido: el agente difunde a través del medio inhibiendo el crecimiento del microorganismo sensible. Sin embargo, en la actualidad se conocen varios factores que pueden influir en el tamaño de la zona de inhibición. Ejemplo: 1) Los componentes del medio de cultivo: Ingredientes como la peptona, triptona y extracto de levadura, pueden variar en su contenido mineral, y minerales como el calcio, magnesio y el hierro, disminuyen la actividad de los aminoglucósidos y aumentan el efecto del ácido fusídico. Otro ejemplo es el efecto de los carbohidratos sobre la ampicilina y la furantoína. 2) Efecto del pH: La actividad de los aminoglucósidos se ve aumentada en medio alcalino; así como la presencia de dióxido de carbono en la estufa y carbohidratos fermentables en los medios de cultivo, pueden inducir condiciones ácidas.

50

3) Tamaño del inóculo: Se ha observado que las siembras densas disminuyen en algún grado las zonas de inhibición, por lo que los cultivos en caldo y las suspensiones en medio sólido se pueden diluir para obtener el inóculo idóneo. Las pruebas de susceptibilidad bacteriana por el método de difusión en agar, son pruebas cualitativas en las que se utilizan discos de papel filtro impregnado con concentraciones conocidas de los diferentes agentes quimioterapéuticos (sensidiscos). Estos discos se colocan sobre la superficie del agar previamente sembrado con la cepa problema. Después de la incubación, se observan zonas o halos de inhibición del desarrollo bacteriano alrededor de los discos con los quimioterapéuticos, a los cuales el microorganismo es susceptible. Por el contrario, si la cepa bacteriana es resistente, se presenta crecimiento alrededor del disco. El uso indiscriminado de los antimicrobianos ha originado la selección de cepas bacterianas multiresistentes, por lo que resulta difícil predecir la susceptibilidad con base a la experiencia clínica. Muchas cepas de microorganismos tradicionalmente sensibles a ciertos antibióticos son ahora resistentes, debido principalmente a la amplia distribución de plásmidos de resistencia múltiple.

COMPETENCIA: Los alumnos adquirirán los conocimientos y habilidades para realizar e interpretar las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos por difusión en agar MATERIAL Colorantes para tinción de Gram. 2 portaobjetos. Cajas petri con agar Mueller-Hinton Hisopos estériles Discos de papel filtro impregnados con quimioterapéuticos Frascos de alcohol Pinzas y gradilla Mechero Bunsen 2 tubos con Solución salina fisiológica Tubo 0.5 de la serie de Mac Farland. 51

Cepas crecidas de Escherichia coli  y Staphylococcus aureus  MÉTODOS Realice una tinción de Gram de una colonia característica de E.coli y S. -  aureus.

PREPARACIÓN DE INOCULO: -  Tome varias colonias (2-3) características de E .coli y suspéndalas en una tubo con sol. Salina fisiológica homogenizando con movimientos suaves para evitar derrames. -  Compare la turbidez de esta suspensión con la turbidez del tubo 0.5 de Mac. Farland. Ajuste la turbidez si es necesario adicionando una colonia más. -  -  Repita este mismo procedimiento con la cepa de S.aureus . INOCULACIÓN DE LAS PLACA DE MUELLER –HINTON: -

-

Humedezca un hisopo en la suspensión de la cepa de E. coli  y exprima el exceso en las paredes del tubo. Inocule una placa de agar Mueller-Hinton sembrando en toda la superficie del agar con el hisopo y permita que la placa seque de 3 a 5 minutos. Coloque los sensidiscos sobre la superficie del agar ayudándose con la pinza previamente flameada en alcohol y presiónalos ligeramente para poner en contacto el antibiótico con la cepa. Repita el procedimiento anterior, con la cepa de Staphylococcus aureus . Incube las placas a 37ºC durante 24 horas Mida (en mm) el diámetro de inhibición del crecimiento producido por cada antibiótico y anote los resultados.

INFORME 1.

Anote el resultado de la actividad de los antibióticos en placa sobre E. coli y S. aureus . ANTIBIÓTICO Nombre / abreviatura

E. coli

S.aureus 

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Medida en mm del halo Medida en mm del halo

2. Mencione aquellos antibióticos con mejores resultados de inhibición para cada cepa bacteriana y si se trata del mismo antibiótico o no. Explique porqué.

ASIGNACIÓN: Investigar acerca de las consecuencias del uso irracional de los antimicrobianos en los animales en producción y elabora un ensayo. (incluye las copias de la fuente de información).

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INSTITUTO TECNOLOGICO DE SONORA LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIA PRÀCTICA 12 COLECCIÓN Y ENVIO DE MUESTRAS AL LABORATORIO INTRODUCCION La bacteriología y micología clínicas se encargan del estudio de las muestras de pacientes de los cuales se sospecha una enfermedad infecciosa. El laboratorio de bacteriología y micología veterinaria puede apoyar al médico veterinario de la siguiente manera: Confirma el diagnóstico presuntivo Sugiere la quimioterapia de la enfermedad Colabora en el conocimiento epidemiológico de las enfermedades Permite la elaboración de productos biológicos como las bacterinas Los resultados del examen bacteriológico y micológico, así como la rapidez con que éstos sean obtenidos, no dependen solo de los métodos de laboratorio empleados, sino también de la forma en que sean colectadas y envidas las muestras clínicas. Dichos resultados pueden verse influenciados por la presencia de microorganismos que son parte de la flora microbiana normal, por la migración bacteriana post-mortem o por la aplicación de antimicrobianos antes del envío de la muestra. El médico debe tener en mente estos factores para realizar la interpretación de los resultados obtenidos por el laboratorio. Los problemas que con mayor frecuencia se presentan en la identificación bacteriana y micológica en el laboratorio son: Envío de muestras no representativas de la enfermedad en cuestión Toma de muestras sin asepsia Envío de muestras en condiciones inadecuadas Falta de historia clínica completa y de un diagnóstico presuntivo 54

Por lo tanto, es indispensable tener conocimientos previos sobre la correcta obtención y envío de muestras al laboratorio. A continuación se enlistan algunas normas generales: 1. Tomar la muestra del sitio anatómico más representativo del problema, de preferencia en la etapa aguda de la enfermedad. 2. Las muestras obtenidas a partir de animales muertos deberán tomarse dentro de las tres primeras horas de ocurrida la muerte o sacrificio. 3. Las muestras deben colectarse bajo estrictas condiciones de asepsia. Tanto el material de colección como el recipiente en que la muestra sea transportada deberán ser estériles. Este último preferentemente debe tener un tapón de rosca. 4. Los especimenes colectados no deben entrar en contacto con desinfectantes 5. Las muestras deben identificarse con los siguientes datos: especie, raza, edad, sexo, arete o nombre del animal, así como la dirección, teléfono y nombre del propietario 6. Una vez colectadas las muestras deben enviarse al laboratorio dentro de las siguientes 424 hrs, en hielo o congelantes, en cajas de poliuretano 7. Cuando sea necesario el uso de hisopos para la colección de muestras, estas deben enviarse en medio de transporte (Stuart, Cary-Blair, etc) 8. Debe de anexarse la historia clínica completa que incluya: La hora de colección de la muestra, hora de la muerte del animal (si es el caso), número de animales infectados, signos y lesiones que presenta el animal; además si el animal del que proviene la muestra fue tratado con antimicrobianos (cual) y el diagnóstico presuntivo. 9. Es muy importante hacer notar que el manejo de las muestras debe realizarse con precaución, ya que algunos agentes causantes de las enfermedades infecciosas de los animales, constituyen un riesgo para la salud humana.

COMPETENCIA: Los alumnos desarrollaran las habilidades necesarias para seleccionar los procedimientos más adecuados de la toma y envío de muestras para su envío al laboratorio de diagnóstico bacteriológico. MATERIAL Tubos con medio de transporte Stuart Hisopos estériles 55

Frascos estériles Jeringas desechables estériles Bolsas de plástico estériles METODOS 1. Asignar a cada equipo el tipo de muestra que deberá traer, de que forma la podrá colectar y la forma de transportación al laboratorio. Es indispensable que provenga de un animal enfermo. -

Muestra 1: Pus, abscesos, exudado de heridas, hisopos nasales, hisopos auditivos, exudados faríngeos, según lo asignado por el maestro

-

Muestra 2: Orina o heces de cerdo, bovino o equino según lo asignado por el maestro

-

Muestra 3: Órganos afectados con lesiones visibles de la especie animal asignada por el maestro.

INFORME 1. Anexe la historia clínica de la muestra en cuestión en el reporte. 2. Describa detalladamente los pasos seguidos para la toma y envío de la muestra que obtuvo para la práctica de análisis bacteriológico de productos biológicos. ASIGNACIÓN Entregar una secuencia fotográfica numerada de los pasos de la toma de muestra, con la descripción del procedimiento en cada imagen. La asignación se entregará en un disco (por equipo).

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. 56

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA PRÁCTICA 13 ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE PROCESOS PIOGÉNICOS INTRODUCCIÓN El estudio de la microflora normal o patógena de los animales o humanos, requiere de conocimientos previos sobre toma y envío de muestras al laboratorio, tipos de medios de transporte y de aislamiento de microorganismos, así como de antecedentes propios de los microorganismos que se deben estudiar. Para esta práctica se han seleccionado algunos productos biológicos a estudiar y se hace referencia a los posibles microorganismos involucrados en procesos infecciosos.

Procesos piogénicos: Son aquellas infecciones asociadas a microorganismos que estimulan la formación de pus, que se forma po la acumulación de leucocitos y restos del microorganismo. Dentro de los procesos infecciosos quedan incluidos los abscesos que son una forma de inflamación localizada y llena de pus, la mayoría están rodeadas de tejido conectivo, capilares proliferantes y leucocitos. Las manifestaciones clínicas asociadas a la presencia de abscesos dependen de su localización y etiología. Hay abscesos que no son detectados, sino hasta el momento de la necropsia, por ejemplo: abscesos hepáticos, cervicales, etc. Mientras que otros producen un malestar generalizado en el animal, como los abscesos en la cavidad oral, pulmón, etc. La etiología de los procesos piogénicos puede ser muy variada, sin embargo, la más común es la bacteriana. Entre los microorganismos piogénicos más comunes se encuentran:

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Aerobios y facultativos

Anaerobios

Staphylococus aureus

Actinomyces spp.

Streptococcus spp. Corynebacterium spp. Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Proteus spp. Pasteurella multocida

Fusobacterium necrophorum  Clostridium perfringens  Peptococcus spp. Peptostreptococcus spp. Propionibacterium spp. Bacteroides spp. Eubacterium spp 

COMPETENCIA: El alumno enviara correctamente una muestra de un proceso piogénico, para su estudio y seleccionará los materiales necesarios para el aislamiento e identificación de un posible agente patógeno. MATERIAL Hisopos estériles Microscopio

Placas con agar sal manitol Placas con agar sangre

Asa bacteriológica

Pruebas bioquímicas para Gram (-)

Mechero de bunsen Puente de tinción Portaobjetos

Agar TSI o Kliger Agar urea de Christensen Agar citrato de Simons

Encendedor de piedra

Medio SIM

Agua destilada Peróxido de hidrógeno al 3% Hidróxido de potasio al 3%

Prueba de oxidasa Reactivo de Kovacs Reactivo de rojo de metilo

Colorantes para t. De Gram Sensidiscos para Gram + y – Agar Mueller Hinton Pinzas para flamear

Pruebas bioquímicas para Gram (+) Caldo sangre Caldo urea o agar urea de Christensen Cloruro de sodio al 6.5% 58

Alcohol al 70% Frascos de vidrio

Carbohidratos, etc.

Metodología para procesos piogénicos: Primera sesión •

•

Con un hisopo estéril toma la muestra y deposítala en el primer cuadrante de cada una de las placas de agar sangre y agar sal y manitol. Con el asa bacteriológica, completa la siembra aislando por estría cruzada e placas a 37 ºC durante 24 - 48 horas.

incuba las

Segunda sesión •

Describe en cada placa, la morfología colonial de aquellas que sospeches sean causantes del proceso infeccioso.

NOTA: Considera a las colonias predominantes de un solo tipo. •

•

•

•

•

Realiza un frotis de cada colonia y tíñelos por Gram. Si son bacterias gram negativas, siembra las pruebas bioquímicas e incúbalas por 24 hrs a 37 °C, si no hay cambios espera hasta 72 hrs. Realiza un antibiograma. Si son bacterias gram positivas realiza las pruebas bioquímicas e incúbalas por 24 hrs a 37 °C, si no hay cambios espera hasta 72 hrs. Realiza un antibiograma.

Tercera sesión •

Interpreta junto con el profesor los resultados de las pruebas bioquímicas y del antibiograma para identificar al microorganismo aislado y su sensibilidad a los antimicrobianos.

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ASIGNACIÓN 1. Investiga en fuentes de información confiables, las características morfológicas de las bacterias identificadas 2. Investiga la enfermedad que la bacteria identificada produce, incluyendo la descripción de la enfermedad, especies afectadas, modo de transmisión y tratamiento. 3. Incluye al menos dos referencias bibliográficas consultadas.

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INSTITUTO TECNOLOGICO DE SONORA LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIAS PRÁCTICA 14 ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE HECES Y ORINA Muestras de orina: Las infecciones urinarias se diagnostican frecuentemente en los perros. Estas se presentan también en otras especies, pero por lo general no se envían muestras al laboratorio de estos animales. Algunos de los microorganismos que causan infecciones en los perros, pueden producirlas también en otras especies de animales domésticos. Ejemplos: Perro Proteus mirabilis

Bovinos

Porcinos

Corynebacterium renale

Pseudomonas aeruginosa

Eubacterium suis  C.renale 

Staphylococcus aureus  Enterococcus  Escherichia coli  Enterobacter spp. Streptococcus pyogenes  Streptococcus viridans  Corynebaterium renale 

Las infecciones urinarias causadas por bacterias del género Leptospira , son por lo general enfermedades primarias de los animales, que en ocasiones pueden transmitirse al hombre. Algunas especies o serotipos importantes son: Leptospira icterohemorragiae  L. canicola 

Rata, ratones Perros, bovinos, porcinos, zorrillos, chacales.

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L. pomona 

L. grippotyphosa 

L. hardjo 

Bovinos, porcinos, zorrillos, mapaches, gato montes. Mapache, ratón, zorro, ardilla,, conejo Bovinos.

El hombre puede adquirir la enfermedad a partir de animales infectados y aguas contaminadas. Los veterinarios y empleados del rastro se encuentran sujetos a mayor riesgo de adquirir la infección. Para obtener muestras de orina se recomienda tomar en cuenta varias condiciones de bioseguridad como son el uso de bata abotonada, guantes, lentes y cubrebocas. Se puede realizar la punción de vejiga, la cateterización de la uretra o durante la micción. Para la obtención de las muestras del tracto reproductor se pueden usar hisopos estériles para el útero, cuello o vagina y de semen en caso de machos, enviándolas en un medio líquido, o en un medio de transporte. Las muestras de orina y de semen deben conservarse en refrigeración. Muestras de heces: Cuando existe una infección bacteriana del intestino, una de las primeras manifestaciones clínicas es la diarrea y ocasionalmente otros signos como deshidratación, dolor abdominal, septicemia, toxemia y fiebre dependiendo del agente etiológico, además de la edad; la especie del animal y la resistencia individual. De acuerdo con la presentación en el animal, la enteritis puede ser aguda o crónica. En la enteritis aguda la diarrea se presenta súbitamente, las heces son blandas y liquidas con olor desagradable y en algunos casos con moco o sangre abundante. La coloración es variable dependiendo del agente etiológico. A este tipo de diarreas se asocian las siguientes bacterias: Escherichia coli

Salmonella spp.

Serratia spp.

Serpulina hyodisenteriae 

Clostridium spp.

Candida spp.

Actinobacillus spp.

Campylobacter spp.

En la enteritis crónica la diarrea se caracteriza por ser de consistencia blanda, con o sin presencia de moco y por lo general su olor es normal. La pérdida progresiva de peso y la emaciación son 62

frecuentes y generalmente no hay anormalidades sistémicas. A estas diarreas se asocian las siguientes bacterias: Mycobacterium paratuberculosis

Proteus spp.

Pseudomonas

Candida spp.

Salmonella spp.

El diagnóstico de los problemas entéricos incluye el análisis por parte del médico veterinario de los cambios patológicos funcionales en los animales, así como problemas de higiene en el manejo de excretas, agua y alimentos como posibles fuentes de contaminación, y del análisis bacteriológico para determinar el agente infeccioso involucrado, con el fin de establecer un control epidemiológico y evitar pérdidas económicas.

COMPETENCIA: El alumno colectara correctamente una muestra y la transportara al laboratorio, es indispensable que provenga de un animal enfermo.

La muestra de orina debe ser turbia o sanguinolenta, las heces deben ser diarreicas., de un animal enfermo para su estudio, y habrá seleccionado el material necesario y llevado a cabo el aislamiento e identificación de un posible agente patógeno así como su prueba de sensibilidad a antimicrobianos.

MATERIAL Hisopos estériles Microscopio Asa bacteriológica Mechero de bunsen Puente de tinción

placas con agar verde brillante Placas con agar MacConkey Placas con agar sangre Placas con agar Mueller-Hinton Tubos con caldo lactosado Tubos con caldo selenito 63

Portaobjetos Encendedor de piedra Agua destilada

Pruebas bioquímicas para Gram (-) Agar TSI o Kliger Agar urea de Christensen Agar citrato de Simons

Prueba de oxidasa

Medio SIM

Peróxido de hidrógeno al 3% Hidróxido de potasio al 3%

Reactivo de Kovacs Reactivo de rojo de metilo

Colorantes para t. De Gram Sensidiscos para Gram + y – Frascos de vidrio Pinzas para flamear Alcohol al 70%

Pruebas bioquímicas para Gram (+) Caldo sangre Caldo urea o agar urea de Christensen Cloruro de sodio al 6.5% Carbohidratos, etc.

Muestras de orina * Primera sesión - Usando una pipeta Pasteur estéril, inocula aproximadamente 1 ml de orina en un tubo con caldo lactosado e incuba a 37 ºC durante 18 - 24 horas. Del crecimiento obtenido, siembra una placa con agar verde brillante. - Siembra con el asa 2 o 3 gotas de orina en una placa de agar sangre y aísla por estría cruzada. Incuba la placa a 37 ºC por 24 - 48 horas.

* Segunda sesión - Describe la morfología colonial de al menos una colonia de las aisladas en las placas de agar sangre y verde brillante, haga los frotis respectivos y tíñelos por la técnica de Gram para describir la morfología microscópica. - Los aislamientos que resultaron siémbrelos en los tubos para las pruebas bioquímicas correspondientes. * Tercera sesión

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- Lee los resultados de las pruebas bioquímicas y junto con apoyo del maestro identifica a nivel de género tus aislamientos. - De las bacterias identificadas, selecciona una e inocula una placa de agar para realizar un antibiograma. Interpreta tus resultados a las 24 hrs.

3. Muestras de heces * Primera sesión - Siembra una asada de la muestra en la placa de agar Mac Conkey y aísla por estría cruzada. Incuba la placa a 37 ºC durante 24 - 48 horas. - Inocula aproximadamente 0.5 g de la muestra en el tubo con caldo selenito. - Incuba a 37ºC durante 18-24 horas y subcultiva en el medio de verde brillante sembrando por estría cruzada e incuba a 37 ºC durante 24 horas. * Segunda sesión - Describe el crecimiento microbiano en ambos medios de cultivo, selecciona una colonia de cada placa y anota las características de la morfología microscópica de las colonias sembradas. Realiza un frotis y tiñélo con Gram, siembra las pruebas bioquímicas correspondientes. * Tercera sesión - Lee los resultados de las pruebas bioquímicas y con apoyo del maestro, identifica a nivel género tus aislamientos. - De las bacterias identificadas, selecciona una y siembra una placa de agar para realizar el antibiograma. - Interpreta tus resultados a las 24 hrs. ASIGNACIÓN 4. Investiga las características morfológicas de las bacterias identificadas 5. Investiga la enfermedad que la bacteria identificada produce, incluye la descripción de la enfermedad, especies animales afectadas, modo de transmisión y tratamiento.

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INSTITUTO TECNOLOGICO DE SONORA LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIAS PRÁCTICA 15 ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE ORGANOS El análisis bacteriológico de órganos está recomendado cuando se sospecha de muertes por septicemia o por el hallazgo de lesiones macroscópicas en uno o varios órganos específicamente relacionados con alguna enfermedad. Ejemplo: en las neumonías (pulmón), enteritis (intestino), abortos (órganos fetales), encefalitis (cerebro), etc. La elección de las muestras dependerá de la experiencia del clínico, del diagnóstico presuntivo y de los hallazgos a la necropsia. El análisis bacteriológico y micológico constituye en estos casos un apoyo en el diagnóstico definitivo. Los siguientes son algunos ejemplos de microorganismos típicamente asociados a septicemias:

Brucella spp

Erysipelothix spp.

Leptospira spp.

Haemophilus spp.

Pasteurella spp.

Bacillus anthracis 

Clostridium spp.

Pseudomonas spp.

Listeria monocytogenes 

Campylobacter spp.

Salmonella spp.

Escherichia coli 

Criptococcus spp.

Leccidioides spp.

Histoplasma spp 

Blastomyces spp.

COMPETENCIA: El alumno enviará una muestra de órganos afectados correctamente al laboratorio, y llevará a cabo la identificación del agente bacteriano, así como la prueba de sensibilidad a antimicrobianos.

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MATERIAL Placas con agar sangre Placas con agar verde brillante Tubos con TSI Tubos con caldo glucosado Tubos con citrato de Simmons Tubos con caldo selenito Equipo de tinción de Gram Asa bacteriológica Microscopio Muestra de órganos

Placas con agar sal y manitol Placas con agar Mac Conkey Tubos con caldo glucosado para VP Tubos con SIM Tubos con medio de transporte Stuart Tubos con caldo tioglicolato Mechero de Bunsen Hisopos estériles Pinzas y tijeras de disección

MÉTODOS En esta práctica se analizarán las muestras asignadas a cada equipo en la práctica anterior, mismas que deberán haber tomado y transportado correctamente al laboratorio.

4. Muestras de órganos * Primera sesión - Deposita la muestra sobre un papel limpio y esteriliza la superficie utilizando cualquiera de los siguientes métodos: a) Con pinzas esteriles toma el fragmento de órgano y humedecelo con alcohol, flaméalo rápidamente y deposítalo en una caja estéril. b) Calienta la espátula en el mechero de Bunsen y quemar la superficie del órgano. c) En el caso de órganos muy pequeños, se recomienda introducir la muestra en un recipiente con agua hirviendo durante 2 o 3 segundos. - Con instrumental estéril (previamente flameado), corta un trozo de la muestra a través de la superficie que fue previamente descontaminada.

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- Con pinzas estériles toma el trozo de tejido por la parte externa y frota con la cara interna el primer cuadrante de la caja con agar sangre, y con el asa bacteriológica completa la técnica de aislamiento por estría cruzada. - Introduce el trozo de la muestra en el caldo tioglicolato, asegúrate de que llegue al fondo del tubo para lo cual puedes auxiliarte con el asa estéril. Sella el tubo con aceite mineral. - Incuba los medios de cultivo a 37 ºC durante 24 - 48 horas.

* Segunda sesión - Describe la morfología de al menos una colonia aislada en la placa con agar sangre, realiza un frotis y tíñelo por la técnica de Gram para describir su morfología microscópica. - A partir del crecimiento en el tubo con caldo tioglicolato, realiza un frotis y tíñelo por Gram para describir la morfología microscópica. Según el desarrollo en caldo tioglicolato, determina los requerimientos de oxígeno de las bacterias problema. - De los aislamiento obtenidos siembra en los tubos para pruebas bioquímicas. * Tercera sesión - Lee los resultados de las pruebas bioquímicas y junto con el profesor trata de identificar a nivel de género los aislamientos. -Realiza el antibiograma de las bacterias identificadas, y lee los resultados a las 24 hrs

INFORME Realiza tu informe anotando cada uno de los pasos que seguiste desde la obtención de la muestra hasta los resultados. ASIGNACIÓN 6. Investiga las características morfológicas de las bacterias identificadas 7. Investiga la enfermedad que la bacteria identificada produce, incluyendo descripción de la enfermedad, especies afectadas, modo de transmisión y tratamiento.

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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA PRÁCTICA 16 ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE ALIMENTOS

INTRODUCCIÓN Con el análisis bacteriológico de los alimentos se pretende detectar y controlar las fuentes de contaminación de los alimentos para consumo humano y animal. Para este fin la microbiología sanitaria toma en consideración los siguientes aspectos: - Determinar la calidad sanitaria de las materias primas y del producto final. - Determinación de las causas de alteración de un alimento. - Evaluación de la eficiencia en los procesos de lavado, desinfección de equipo, utensilios y superficies de trabajo. - Evaluación de la eficacia de los desinfectantes. - Evaluación de la eficacia de los procesos de esterilización y pasteurización. - Detección de portadores sanos de microorganismos potencialmente patógenos entre el personal que maneja alimentos. - Diagnóstico de posibles causas de brotes infecciosos e intoxicaciones asociadas al consumo de alimentos. Debido al riesgo en salud pública que representa el consumo de alimentos contaminados es necesario reglamentar las normas de calidad e higiene para los diferentes tipos de alimentos. Análisis bacteriológico de alimento concentrado: Este análisis se recomienda realizarlo en alimento para animales elaborado con harinas producidas a partir de carne, sangre, hueso,

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pluma y pescado, cuando exista la posibilidad de que este producto sea el responsable de infecciones entéricas en grupos de animales. En este caso el análisis es primordialmente cualitativo, no obstante, cuando se pretende relacionar la carga bacteriana con enterotoxémias, se han establecido límites de 1X10 2 a 1X103 UFC/g de muestra.

COMPETENCIA: El alumno conocerá las técnicas para el diagnóstico bacteriológico de los alimentos y desarrollara las habilidades necesarias para ponerlas en práctica con diferentes tipos de alimentos. MATERIAL Tubos de 16x150 con 4.5 ml de solución amortiguadora de fosfato pH 7.2 estéril Mortero Mechero de Bunsen Pipetas volumétricas de 1 ml estériles Tubos de 16x150 con caldo selenito cistina Tubos de 20x150 con 15 ml de agar de soya tripticaseína Pruebas bioquímicas para Gram Negativos. Cajas de petri estériles Caja de petri con agar Mac Conkey Caja de petri con agar Salmonella-Shigella Varilla acodada y alcohol para flamear Muestras de alimentos sólidos: Concentrado para ave, cerdo, bovinos, perros y conejos.

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MÉTODOS Previo a la práctica, se pedirá a los equipos que traigan una muestra de alimentos concentrados para diferentes especies, a los cuales se les harán los siguientes análisis: Cuenta de mesófilicos aerobios, cuenta de coliformes y determinación de Salmonella.

1. Preparación de la muestra Por tratarse de una muestra sólida: alimento concentrado, en este caso es necesario mezclar la muestra con un diluyente a una dilución 1:10 (una (una parte del alimento por 9 del diluyente). El diluyente recomendado es solución amortiguadora de fosfatos (SAF) a pH 7.2 Para la homogenización de la muestra se requiere de un mortero. 2. Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias. aerobias. 2.1 Realiza diluciones decimales del alimento, utilizando los tubos con 4.5 ml de SAF. Se recomienda hacer las diluciones de 10-1 a 10-5. 2.2 Etiqueta tres cajas de petri estériles con las tres últimas diluciones y deposita en la base de la caja, 0.5 ml de cada dilución en su caja correspondiente, comenzando por la dilución mayor. 2.3 A cada caja de petri conteniendo las diluciones de la muestra, agrega el contenido de un tubo con agar de soya tripticaseína (fundido y enfriado hasta 45º C), mezcla con movimientos rotatorios y deja solidificar. Incuba a 37ºC durante 24 - 48 horas. 2.4 Realiza el conteo de colonias de aquellas cajas que tengan entre 30 y 300 colonias y reporta el resultado como UFC / ml (toma en cuenta que sembraste 0.5ml) y multiplícalo por la inversa de la dilución para calcular el número de UFC / ml de la muestra. Toma en cuenta la primera dilución para el caso de las muestras sólidas (mezcla 1:10) y reporta como UFC / g.

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3. Cuenta de organismos coliformes Dentro de este grupo se incluyen a bacilos gram negativos aerobios, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas dentro de 48 horas de incubación a 35ºC. Se utilizan como indicadoras de contaminación fecal. 3.1 Repetir los procedimientos descritos en el paso 2.1 o utilizar los mismos tubos si se trata del mismo alimento. 3.2 Inocule 0.5 ml de las tres últimas diluciones a las cajas de petri con agar Mac Conkey, empezando por la más diluida, y distribuya la muestra usando la varilla acodada. Espere a que seque la muestra e incube las cajas a 37ºC durante 24 - 48 horas. 3.3 Realiza el conteo de aquellas colonias de apariencia rosa (fermentadoras de lactosa) y efectúa los cálculos como se indicó en el punto 2.4. 4. Determinación de la presencia de Salmonella sp. 5.1 Realiza una suspensión del alimento en caldo soya tripticaseína e incuba por 24 horas a 37ºC. 5.2 Transcurrida la incubación, transfiere 1 ml del cultivo a un tubo con 10 ml de caldo selenito cistina. Homogeniza e incuba a 37ºC por otras 24 horas. 5.3 Agita los tubos con selenito y siembra aislando por estría cruzada en cajas de petri con agar salmonella-shigella. Incuba a 37ºC por 24 horas. 5.4 Observa los cultivos para identificar las colonias sospechosas de Salmonella  (no fermentadoras de lactosa) y selecciona dos colonias típicas para realizar pruebas bioquímicas. INFORME Presente un concentrado de los resultados de los análisis realizados por todos los equipos de su grupo de laboratorio y discuta dichos resultados. ASIGNACIÓN 1.- Investiga la técnica para la cuenta viable de Staphylococcus aureus .

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2.- Investiga y realiza un ensayo acerca de cómo repercute en la salud de los animales la Staphylococcus  y bacterias coliformes. contaminación del alimento con Salmonella, Staphylococcus  BIBLIOGRAFIA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

C.H.Collins, Patricia M. Lyne: Métodos microbiológicos. ACRIBIA. Zaragoza, España. 1989 Collins, Lyne, Grange. : Microbiological Methods. Methods. Butterworth Heinemann. 1995. Black, J.: Microbiology, principles and applications. 3rd ed. PRENTICE HALL. 1996. Cottral. George.1989. Microbiolgía Veterinaria. LA PRENSA MEDICA MEXICANA, MEXICANA, S. A. México, D. F. Alexander K.Steve y Strete Dennis. Microbiology. Microbiology. A photographic atlas for the laboratory. Benjamín Cummings 2001. Johnson T. And Case C. Laboratory experiments in Microbiology. 3rd edition. Benjamin Cummings. 1992. Koneman. Color atlas and textbook of Diagnostic Microbiology. 5 th ed. LIPPINCOTT WILLIAMS AND WILKINS. 1997. Perez, M,J, Suarez, F, Flores R. 1990. Bacteriología General. Principios Químicos Biológicos. Primera edición. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MEXICO.

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ANEXO 1. RIESGO BIOLÓGICO

Definición. Riesgo biológico es aquel susceptible de ser producido por una exposición no controlada a agentes biológicos. Entenderemos por agente biológico cualquier microorganismo y sus excreciones, cultivo celular o endoparásito humano capaz de producir enfermedades, infecciones, alergias, o toxicidad. Existe riesgo biológico en los laboratorios donde se trabaja con microorganismos, cultivos celulares, se experimenta con animales. También existe este riesgo cuando se efectúan actividades médicas y paramédicas con seres humanos o animales. El trabajo con animales en granjas y establos, así como trabajo con muestras como las aguas residuales. Recomendaciones generales. 1. Se delimitará y señalizará las zonas de trabajo 2. No se comerá, beberá o fumará en el laboratorio. Bajo ningún concepto se guardarán alimentos o bebidas en refrigeradores del laboratorio. 3. Se extremará la higiene personal, lavándose las manos antes y después de cada tarea. 4. En caso de que hubiere, cubrir las heridas cutáneas con guantes. No emplee anillos, pulseras, joyas, etc. 5. La manipulación de cualquier muestra se efectuará siempre con guantes y con gafas o pantallas antisalpicaduras. Cuando menos mascarillas contra vapores. 6. Toda muestra se transportará siempre en recipiente con tapa ajustable y cierre hermético que impida la salida de fluidos y vapores. 7. Todas las actividades al trabajar con productos biológicos deben realizarse cuidadosamente para evitar la formación de gotas y aerosoles. 8. En el caso de que durante una operación de centrifugación se produjese la ruptura de los tubos en el interior del equipo, se esperará al menos durante 5 minutos para abrir la tapa del mismo. Posteriormente se desinfectará equipos, materiales y superficies de trabajo con un producto de efectividad constatada (para el tipo de agente infeccioso que se este trabajando; esto de acuerdo a recomendación por el instructor. 74

9. Se restringirá en la medida de lo posible, el uso de agujas y jeringuillas. Se desechará las  jeringas y agujas de un solo uso en contenedores especiales (indeformables, no perforables, sin fisuras para evitar derrames) sin ser encapsuladas. 10. El material contaminado que deba ser descontaminado en un lugar exterior al laboratorio se colocará en un contenedor especial (indeformables, no perforables, sin fisuras para evitar derrames), debidamente señalizado. 11. Todo material de desecho o residuo biológico previamente esterilizado debe ser sometido a un programa de gestión de residuos (ver manual de disposición de residuos). No mezcle los residuos contaminados biológicamente con otro tipo de residuos. PARA TAREAS CON ANIMALES 12. Se manipulará al animal siempre en silencio y con tranquilidad. Evitar en todo momento su sufrimiento innecesario ya que además puede inducir al animal a defenderse y a producir lesiones. 13. Se usará siempre guantes en la extracción de sangre o procedimientos invasivos, en el contacto con líquidos que requieran precauciones universales (líquido amniótico, pericardio, peritoneal, pleural, semen, secreciones vaginales y cualquier líquido contaminado con sangre), en contacto con mucosas, piel no intacta y para manipular objetos o superficies manchados con líquidos corporales. También se han de usar guantes cuando se tengan cortes, arañazos o lesiones en la piel de las manos. 14. Se efectuará lavado de las manos después de quitarse la bata y los guantes antes de dejar la estancia, e inmediatamente si se han ensuciado de sangre. En los trabajos en granjas y establos se extremará la higiene personal tras la realización de las tareas. 15. Se recomienda el uso de batas desechables cuando la ropa pueda ser manchada por líquidos corporales, sangre, excreciones o secreciones. El resto de ropa que se utilice para estas actividades, será lavada frecuentemente, preferiblemente sin mezclar con ropa que vaya a ser utilizada en menesteres no laborales. 16. Se debe usar pantalla anti salpicaduras, bata y mascarilla protectoras cuando haya riesgo de salpicaduras o proyección de líquidos corporales. 17. Las gotas de sangre que se derramen deberán limpiarse rápidamente con un desinfectante.

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ANEXO 2. Cuidados del microscopio.

1.Transportar el microscopio sujetándolo del brazo con una mano y colocar la otra debajo de la base para sostenerlo 2.Colocar cuidadosamente el microscopio en su mesa de trabajo en un sitio sin vibraciones. 3.Limpiar el sistema mecánico con un trapo suave que no deje pelusa y

5.-

el sistema óptico con papel seda. No manejar las lentes con los dedos. Limpiar las lentes antes y después de usarlo en clases, solo con papel seda. No arrastrar, golpear o inclinar el microscopio.

II.

Manejo del microscopio

1.2.3.4.-

Conectar y encender la lámpara. Colocar el objetivo seco débil (10 X) en posición. Subir el condensador hasta el tope Abrir o cerrar el diafragma hasta lograr una adecuada iluminación. La iluminación excesiva disminuye el contraste Colocar la preparación en la platina y ajustarla con las pinzas o en el carrete para portaobjetos. Iniciar el enfoque usando el tornillo de ajuste grueso (macrométrico) y después de ajuste fino (micrométrico), hasta obtener una imagen nítida. Sin mover los tornillos cambiar al objetivo seco fuerte (40 X) usando el porta objetivos giratorio ( revólver ) y enfocar de nuevo usando el micrométrico. Una vez localizado el campo de interés y antes de cambiar al objetivo de inmersión, colocar una pequeña gota de aceite de inmersión en la preparación y sin mover los tornillos proceda a colocar el objetivo de (100X) en posición. Enfocar la preparación usando solamente el tornillo micrométrico y cuidando de no presionar demasiado el portaobjetos con el objetivo porque puede romper la preparación y rayar la lente.

4.-

5.6.7.8.-

76

9.-

Al terminar de hacer sus observaciones, limpiar el microscopio como se indicó, bajar la platina hasta el tope inferior y dejar el revólver en el objetivo de menor aumento o donde no lo tiene.

10.-

Entregar o guardar el microscopio con el cable enrollado y cubierto con la

11.-

Avise a sus profesores de cualquier irregularidad que note en el microscopio puesto que en otras clases de laboratorio pueden utilizar el mismo instrumento y culparse a usted por cualquier parte que se haya dañado anteriormente y que se notifique después.

funda.

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ANEXO 4. Formatos de Reporte

REPORTE DE PRÁCTICA. 2 I. RESULTADOS 1. A partir del frotis elaborado en un medio sólido: Cuadro1. Resultados de la morfología microscópica. Esquemas del microorganismo 1 con el objetivo 10 X. FORMA:__________________________________  AGRUPACIÓN: ____________________________  Esquemas del microorganismo1 con el objetivo 40 X. FORMA:_________________________________   ___________________________________________   _  AGRUPACIÓN:______________________________   ___________________________________________   _  Esquemas del microorganismo 1 con el objetivo 100X. FORMA:_________________________________   ___________________________________________   _  AGRUPACIÓN:______________________________   ___________________________________________   _ 

2. Frotis elaborado a partir de un medio líquido: Cuadro2. Resultados de la morfología microscópica. 78

Esquemas del microorganismo 2 con el objetivo 10 X. FORMA:_________________________________   ___________________________________________   _  AGRUPACIÓN:______________________________  Esquemas del microorganismo 2 con el objetivo 40 X. FORMA:_________________________________   ___________________________________________   _  AGRUPACIÓN:_____________________________  Esquemas del microorganismo 2 con el objetivo 100 X. FORMA:_________________________________   ___________________________________________   _  AGRUPACIÓN:______________________________ 

II. DISCUSIÓN DE RESULTADOS  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________  III. ASIGNACIÓN 1. Investiga quien fue Roberto Koch y haz una reseña de sus principales aportaciones a la microbiología.  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   _____________________  79

2. Investiga la forma y las características generales de los microorganismos que investigaste.  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________  IV. CONCLUSIONES  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   _____________________  V. FUENTES DE INVESTIGACIÓN  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________ 

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REPORTE DE PRÁCTICA. 3 I. RESULTADOS 1. A partir de la siembra en un medio sólido: Cuadro1. Resultados de la descripción de morfología colonial ó macroscópica. Descripción: Tamaño: Color: Forma: Elevación: Bordes: Superficie: Luz reflejada: Luz transmitida: Consistencia: Descripción: Tamaño: Color: Forma: Elevación: Bordes: Superficie: Luz reflejada: Luz transmitida: Consistencia: 2. Elaborada a partir de un medio líquido: Cuadro2. Descripción de la morfología colonial o macroscópica. Descripción:_________________________________   _   ___________________________________________   _  II. DISCUSION DE RESULTADOS  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________  81

 ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________  III. ASIGNACIÓN 1. Investiga al menos otros 2 métodos de aislamiento de cultivos bacterianos.  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ________________________________________  2. Compara el método desarrollado en la práctica con los métodos que investigaste, señala además las ventajas y desventajas de cada uno de ellos.  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________  82

 ______________________________________________________________________________   ________________________________________  IV. CONCLUSIONES  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________  V. FUENTES DE INVESTIGACIÓN  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________ 

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REPORTE DE PRÁCTICA 4 I. RESULTADOS Cuadro1. Descripción de la morfología bacteriana Descripción: Nombre de la bacteria: Forma: Agrupación: Reacción de Gram Descripción: Nombre de la bacteria: Forma: Agrupación: Reacción de Gram Descripción: Nombre de la bacteria: Forma: Agrupación: Reacción de Gram Cuadro2. Descripción de la morfología bacteriana. Descripción:_________________________________   _ 

Descripción:_________________________________   _ 

Descripción:_________________________________   _ 

II. DISCUSIÓN DE RESULTADOS  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________  84

 ______________________________________________________________________________   ______________________  III. ASIGNACIÓN 1. Explique cual es el paso crítico de la tinción de Gram.  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________  2. Indique al menos dos factores que pueden alterar los resultados en la tinción de Gram.  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________  3. Anote cinco géneros bacterianos de importancia veterinaria que sean Gram positivos y cinco Gram negativos  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   _______________  IV. CONCLUSIONES  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________ 

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V. FUENTES DE INVESTIGACIÓN  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   _________________________________ 

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REPORTE DE PRÁCTICA 5 I. RESULTADOS Cuadro1. Descripción de la morfología bacteriana o microscópica. Descripción:_____________________   _______________________________   _______________________________   _______________________________   _______________  Descripción:_____________________   _______________________________   _______________________________   _______________________________   _______________  Descripción:_____________________   _______________________________   _______________________________   _______________________________   _______________  Descripción:_____________________   _______________________________   _______________________________   _______________________________   _______________ 

II. DISCUSIÓN DE RESULTADOS  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________  87

 ______________________________________________________________________________   ______________________  III. ASIGNACIÓN 1. Investigar ¿Por que es necesario calentar el colorante primario en esta técnica?  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________  2. Investigar a que se debe la propiedad de algunas bacterias de ser acido-alcohol resistentes.  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________  IV. CONCLUSIONES  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   _______________ 

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V. FUENTES DE INVESTIGACIÓN  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   _______________ 

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REPORTE DE PRÁCTICA 6 I. Observación de la cápsula con la tinción de rojo congo. Cuadro1. Resultados de la morfología bacteriana ó microscópica. Esquema del microorganismo 1 con el objetivo 100 X. Descripción:_________________________________   _   ___________________________________________   _  Esquema del microorganismo 2 con el objetivo 100 X. Descripción. _________________________________   ___________________________________________   _   ___________________________________________   _   ___________________________________________   _   ___________________________________________   _  2. Resultados de la observación de esporas con la tinción de Gram. Cuadro2. Resultados de la morfología bacteriana o microscópica. Esquema del microorganismo 1 con el objetivo 100 X. Descripción:_________________________________   _ 

Esquema del microorganismo 2 con el objetivo 100 X. Descripción. _________________________________   ___________________________________________   _   ___________________________________________   _   ___________________________________________   _   ___________________________________________   _  90

3. Resultados de la observación de bacterias Gram positivas y Gram negativas con tinción de Scheafer y Fulton. Cuadro3. Resultados de morfología bacteriana (microscópica) Esquema del microorganismo 1 con el objetivo 100 X. Descripción:_________________________________   _ 

II. DISCUSIÓN DE RESULTADOS  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________  III. ASIGNACIÓN 1. Investigue 5 ejemplos de bacterias de importancia en veterinaria que tengan cápsula.  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________  2. Investigue que compuestos químicos pueden formar las capsulas.  ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________   ______________________________________________________________________________  91