FACULTAD DE CIENCIAS EN LA SALUD. LICENCIATURA EN LABORATORIO CLINICO
MANUAL DE DIAGNOSTICO BACTERIOLOGIC O.
INTRODUCCIÓN.
El presente Manual contiene los procedimientos de rutina en el Laboratorio de Bacteriología, con el fin de conocer las vías bioquímicas y metabólicas que sirven de base en las identificaciones bacterianas, a la vez se hace mención de las normas de bioseguridad útiles para mantener la seguridad dentro del laboratorio y de quienes laboran en el, así como también normas generales en toma, manejo y envío de muestras para los diferentes análisis bacteriológicos, y su respectivo control de calidad. Además está elaborado de tal manera que sea aplicable al funcionamiento actual de los diferentes procedimientos de laboratorio en Bacteriología.
2
CONSIDERACIONES PARA SU PROTECCIÓN PERSONAL
Todas las muestras de especimenes biológicos deben considerarse potencialmente infecciosas. Vacunarse contra los principales agentes infecciosos. Procurar no producir "salpicaduras" con la muestra obtenida. Debe limpiarse y desinfectarse cualquier superficie contaminada por algún espécimen biológico. Lavarse las manos correctamente, después de haber tenido contacto con cada paciente y al concluir cualquier procedimiento. No deben ingerirse comidas, bebidas, goma de mascar o fumar durante los diferentes procedimientos en el Laboratorio. Vigile que los elementos de trabajo estén en perfectas condiciones físicas. Algún elemento en mal estado, podría causarle una herida. ESTERILIZACIÓN Proceso mediante el cual se eliminan todas las formas de vida de los microorganismos de un objeto o de una sustancia para evitar su reproducción. ASEPSIA: Libre de microorganismos. MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN Comprende todos los procedimientos físicos, mecánicos y preferentemente químicos, que se emplean para destruir gérmenes patógenos. A través de esta, los materiales quirúrgicos y la piel del enfermo alcanzan un estado de desinfección que evita la contaminación operatoria. Hay varias formas de esterilizar como:
3
MÉTODOS QUÍMICOS Estos métodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos. Hipoclorito de Sodio: Es el mas utilizado por su fácil adquisición y por su efectividad
en
la
desinfección.
Vida
media
20
minutos.
Oxido de etileno: Destruye todos los microorganismos incluso virus. Aldehídos: Son agentes alquilantes que actúan sobre las proteínas. Estos compuestos destruyen las esporas. Glutaraldehído: Este método tiene la ventaja de ser rápido y ser el único esterilizante efectivo frío. Formaldehído: Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 horas. Gasplasma de Peróxido de Hidrógeno: Es proceso de esterilización a baja temperatura la cual consta en la transmisión de peróxido de hidrógeno en fase plasma. Alcohol: Esteriliza superficies, pero se evapora fácilmente.
MÉTODOS FÍSICOS Calor: La utilización de este método y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de exposición y la temperatura. Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos. Calor Húmedo: El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas.
4
Autoclave Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado es el de Chamberland. Esteriliza a 121º C, 15Lb de presión, por 20 minutos.
Calor seco: El calor seco produce desecación de la célula, es esto tóxico por niveles elevados de electrolitos, fusión de membranas.
Estufas –Hornos Doble cámara, el aire caliente generado por una resistencia, circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras, a temperatura de 170º C para el instrumental metálico y a 140º C para el contenido de los tambores.
NORMAS DE BIOSEGURIDAD •
Mantenga el lugar de trabajo en óptimas condiciones de higiene y aseo.
•
Evite fumar, beber y comer cualquier alimento en el sitio de trabajo.
•
NO SE DEBE UTILIZAR ELTELEFONO CELULAR DENTRO DE LAS PRACTICAS DE LABORATORIO
•
No guarde alimentos, en las neveras ni en los equipos de refrigeración de sustancias contaminantes o químicos.
•
Maneje todo paciente como potencialmente infectado. Las normas universales deben aplicarse con todos los pacientes, independientemente del diagnóstico, por lo que se hace innecesaria la clasificación específica de sangre y otros líquidos corporales.
5
•
Lávese
cuidadosamente
las
manos
antes
y
después
de
cada
procedimiento e igualmente si se tiene contacto con material patógeno. •
Utilice en
forma
sistemática
guantes plásticos
o de látex
en
procedimientos que con lleven manipulación de elementos biológicos y/o cuando maneje instrumental o equipo contaminado en la atención de pacientes. •
Utilice un par de guantes por paciente.
•
Absténgase de tocar con las manos enguatadas alguna parte del cuerpo y de
manipular
objetos
diferentes
a
los
requeridos
durante
el
procedimiento. •
Emplee mascarilla y protectores oculares durante procedimientos que puedan generar salpicaduras góticas -aerosoles- de sangre u otros líquidos corporales.
•
Use batas o cubiertas plásticas en aquellos procedimientos en que se esperen salpicaduras, aerosoles o derrames importantes de sangre u otros líquidos orgánicos.
•
Evite deambular con los elementos de protección personal por fuera de su sitio de trabajo.
•
Mantenga sus elementos de protección personal en óptimas condiciones de aseo, en un lugar seguro y de fácil acceso.
•
Evite la atención directa de pacientes si usted presenta lesiones exudativas o dermatitis serosas, hasta tanto éstas hayan desaparecido.
•
Las mujeres embarazadas que trabajen en ambientes hospitalarios expuestas al riesgo biológico VIH/SIDA y/o Hepatitis B, deberán ser muy estrictas en el cumplimiento de las precauciones universales y cuando el caso lo amerite, se deben reubicar en áreas de menor riesgo.
•
Aplique en todo procedimiento asistencial las normas de asepsia necesarias.
•
Utilice las técnicas correctas en la realización de todo procedimiento. 6
•
No cambie elementos cortopunzantes de un recipiente a otro.
•
Absténgase de doblar o partir manualmente las hojas de bisturí, cuchillas, agujas o cualquier otro material cortopunzante.
•
Evite reutilizar el material contaminado como agujas, jeringas y hojas de bisturí.
•
Realice desinfección y limpieza a las superficies, elementos, equipos de trabajo al final década procedimiento y al finalizar la jornada.
•
En caso de derrame o contaminación accidental de sangre u otros líquidos corporales sobre superficies de trabajo, cubra con papel u otro material absorbente; luego vierta hipoclorito de sodio a 5.000 ppm (o cualquier otro desinfectante indicado) sobre el mismo y sobre la superficie circundante, dejando actuar durante 30 minutos; después limpie nuevamente la superficie con desinfectante a la misma concentración y realice limpieza con agua y jabón. El personal encargado de realizar dicho procedimiento debe utilizar guantes, mascarilla y bata.
•
En caso de ruptura de material de vidrio contaminado con sangre u otro líquido corporal, los vidrios deben recogerse con escoba y recogedor, nunca con las manos.
•
Los recipientes para transporte de muestras deben ser de material irrompible y cierre hermético. Deben tener preferiblemente el tapón de rosca.
•
Manipule, transporte y envíe las muestras disponiéndolas en recipientes seguros, con tapa y debidamente rotuladas, empleando gradillas limpias para su transporte. Las gradillas a su vez se transportarán en recipientes herméticos de plásticos o acrílico que retengan fugas o derrames accidentales. Además deben ser fácilmente lavables.
•
En caso de contaminación externa accidental del recipiente, éste debe lavarse con hipoclorito de sodio al 0.5% (5.000 ppm) y secarse.
7
•
Restrinja el ingreso a las áreas de alto riesgo biológico al personal no autorizado, al que no utilice los elementos de protección personal necesarios y a los niños.
•
La ropa contaminada con sangre, líquidos corporales u otro material orgánico debe ser enviada a la lavandería en bolsa plástica roja.
•
Disponga el material patógeno en bolsas resistentes de color rojo que lo identifique con símbolo de riesgo biológico.
•
En caso de accidente de trabajo con material cortopunzante haga el reporte inmediato de accidente de trabajo.
8
GENERALIDADES
A. OBJETIVO GENERAL Conocer las técnicas, procedimientos y controles que se desarrollan en el área de bacteriología dentro de un Laboratorio Clínico.
B. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. Verificar los controles de calidad que se llevan a cabo en el área de bacteriología. Conocer las normas de bioseguridad que se realizan en bacteriología. Conocer el manejo y envío de muestras en el área de bacteriología. Conocer los diferentes procedimientos que se realizan en la preparación de medios de cultivo. Conocer las diferentes técnicas bacteriológicas aplicables para la identificación de cepas bacterianas.
9
I- NORMAS GENERALES DE LA TOMA, MANEJO Y ENVIÓ DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS CLÍNICOS. 1. Los análisis clínicos se practicarán a los pacientes que sean referidos al laboratorio, por el personal autorizado del Establecimiento. 2. Todo examen deberá ser solicitado en el formulario proporcionado por el laboratorio, completando los siguientes datos: Nombre del paciente, número de registro, edad, sexo, servicio que lo refiere, sello del establecimiento, diagnóstico clínico, firma y nombre de quien lo refiere y especificar si es de urgencia. 3. Todo paciente con solicitud de exámenes de Laboratorio, deberá presentarse a éste para que se le de la orientación sobre la colección de la muestra, la hora y la fecha en que se le recibirá. Estos datos deberán ser anotados en la hoja de solicitud del examen y en el libro de citas del laboratorio. 4. Toda solicitud de examen de Laboratorio, deberá revisarse confirmando los datos requeridos y comparando los datos de identificación con la tarjeta del expediente del paciente.
5. El Laboratorio Clínico de cada establecimiento para efecto de control de exámenes llevará un libro de entrada en el que anotará el número correlativo, fecha, nombre del paciente y análisis a realizarse. 6. Los tubos, láminas, cajas de petri y frascos utilizados para colectar las muestras, deberán ser identificados inmediatamente después de tomadas o recibida la muestra con el número correlativo de Laboratorio, nombre o iniciales del paciente.
10
7. Previo al envío de muestras a otro laboratorio debe hacerse contacto con éste para notificar del envió y saber quien recibirá la muestra. 8. Toda muestra clínica que se envíe a otro laboratorio, debe ser transportada en envases y condiciones que proporcionen la mayor seguridad para evitar roturas, derramamientos de la misma o extravío. 9. En el transporte de la muestra se consideran tres aspectos importantes: a) Protegerlas del calor excesivo. b) Protegerlas de la luz solar. c) Acondicionarlas en forma tal que no haya riesgo de derrame.
10. Para el envió de la muestra es conveniente disponer de cajas de madera con tabiques interiores; si no se dispone de ellas se puede usar una caja de cartón grueso en la que se anotará la dirección del Laboratorio al cual se envía y se le marcarán flechas verticales indicado la posición en que debe mantenerse. Cada envío deberá ir acompañado de la lista con la identificación de cada muestra contenida en la caja. RECEPCIÓN DE LA MUESTRA: Comprobar que las muestras están bien identificadas y que correspondan a la lista adjunta.
1. Si hay derrame del material, desinfectar el exterior del envase con algodón o toallas de papel impregnado en fenol al 5 % u otra solución bactericida. Si se comprueba derrame masivo esterilizar el envase por autoclave o incineración 2. Notificar al servicio remitente las deficiencias que hubieren en la calidad y cantidad de las muestras o en la forma en que se hizo el envío.
11
ENVIÓ DE MUESTRAS AL LABORATORIO DE REFERENCIA. ALMACENAMIENTO Y ENVIÓ: 1. Suero: Deben almacenarse entre- 20°C y/o 4°C y transportarse a iguales temperaturas, evitando así el congelamiento y descongelamiento de las mismas que dañaría a los microorganismos. 2. Deben hacerse: llegar al laboratorio con la mayor prontitud, y por la vía más rápida, máximo una semana, además cada envío de muestra debe acompañarse con la ficha epidemiológica correspondiente.
3. Sangre completa: Debe almacenarse a 4° C (refrigeradora) y enviarlas rápidamente al laboratorio dentro de las 24 horas siguientes a la obtención de la sangre. Nunca deben congelarse, pues se hemolizan, además siempre deben ser acompañadas por su ficha epidemiológica correspondiente. 4. Empaque: Los métodos de empaque y envío deben garantizar protección tanto a la muestra como al personal que las manipula. 5. Los sueros enviados estarán en tubos o viales perfectamente cerrados, las tapas o tapones se aseguran bien con cinta adhesiva para que no se aflojen con la vibración del transporte. Se pueden sujetar con una banda de goma y colocar cada lote en un recipiente de plástico o en una pequeña bolsa del mismo material, cada paquete se dispondrá verticalmente en una hielera que contenga bloques refrigerantes. 6. Al enviar sangre completa debe evitarse el contacto de los bloques refrigerantes o del hielo de agua con las paredes de los tubos, para que las muestras no se hemolicen.
12
NORMAS DE BACTERIOLOGÍA. Siempre que sea posible, la muestra para cultivos tiene que ser recolectada antes de la administración de antibióticos.
ORINA. La muestra para cultivo de orina puede ser por cateterismo, punción suprapúbica, muestra limpia o de medio chorro. Esta última exige las siguientes condiciones: a) Antes de tomar la muestra practicar un cuidadoso aseo de la zona genital con agua y jabón. b) Colectar la primera orina de la mañana o tener como mínimo 2 horas de retención urinaria.
c) En un frasco estéril de boca ancha, tapón de rosca, transparente, recoger una cantidad de 15 a 20 ml de orina medio chorro. d) El tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y su proceso, no debe exceder de 2 horas; sino se puede procesar al recibirla, se puede refrigerar hasta por 12 horas.
SECRECIÓN URETRAL. Toma de muestra: efectuar presión suave sobre la uretra, eliminar la secreción luego exprimir desde atrás con fuerza y recoger la secreción con dos hisopos estériles, 1 para el frotis y el otro para el cultivo (Thayer Martín o Agar chocolate). Si la secreción es escasa introducir en la uretra un hisopo fino y raspar la pared uretral con delicadeza. Hacer de inmediato el frotis para coloración de Gram e inocular los medios de cultivo. Si se va a transportar colocarlo en medio de transporte de Stuart , Amies o Cary Blair. Si no se puede sembrar de inmediato hacer frotis y mantener el hisopo en un medio de transporte.
13
SECRECIÓN VAGINAL. Toma de muestra: colocar a la paciente en posición ginecológica, introducir el especulo, tomar la muestra con dos hisopos del endocervix y vagina; se recomienda sea tomada por el médico. El hisopo debe estar estéril e impregnado con solución salina fisiológica al 0.85% estéril. Hacer de inmediato un frotis para coloración de Gram y hacer un examen directo al fresco, colocando una gota de solución salina en un porta objetos y suspender en ella la secreción vaginal;
cubrir
con el cubre objetos
y buscar Trichomonas
vaginalis o levaduras. Si el examen al fresco no se puede hacer de inmediato colocar el hisopo en 0.5 mL de solución salina, en refrigeración no más de 2 horas. En la coloración de Gram reportar Vaginosis bacteriana si hay predominio de bacilos gram negativos.
HECES La muestra debe tomarse en los tres primeros días de la enfermedad y antes de comenzar el tratamiento antimicrobiano. En los lactantes lo indicado es el hisopado rectal. Introducir el hisopo, ( previamente humedecido con solución salina estéril ), dos o tres cms. en el ano imprimiéndole movimientos de rotación amplia, pero con suavidad arrastrando mucosidad de la pared del recto. En el adulto la muestra puede obtenerse del recipiente con heces o del hisopo rectal. Las mejores muestras son aquellas diarreicas, con mucus, o con sangre, la muestra debe ser de 1 a 2 gramos si es sólida y de 3 a 4 mL. si es diarreica. Si el cultivo se hace dentro de las dos horas después de tomada la muestra, no se requiere medio de transporte. Pasado ese período se recomienda usar el medio de transporte Cary & Blair, o el caldo de Selenito o Tioglicolato.
14
SECRECIÓN FARINGEA. La muestra debe tomarse de amígdalas y faringe, colocar al enfermo en posición
cómoda y buscando
la mejor
iluminación, pedir al paciente que
pronuncie la letra A, baje la lengua suavemente con un bajalengua, frote el hisopo con firmeza pero con suavidad en ambas caras de las amígdalas y luego en la pared posterior de la faringe de manera que el hisopo quede impregnado de exudado faríngeo, evite tocar con el hisopo lengua y úvula. Introducir el hisopo en 1mL. de medio de enriquecimiento, 0.5 mL de caldo de tripticasa soya, infusión cerebro corazón, o sembrar de inmediato en agar sangre y Mac Conkey. Si hay pseudomembrana hacer un frotis y colorear por Gram para investigar difteria.
EXPECTORACIÓN. Toma de muestra: el paciente debe efectuar repetidos enjuagatorios previos con solución de bicarbonato de sodio o con solución salina estéril. Tomar la primera expectoración de la mañana (este esputo debe ser purulento no saliva). El frasco debe ser de boca ancha, con tapón de rosca y estéril, debe taparse
bien
e
identificarse
correctamente.
Enviarlo
al
Laboratorio
inmediatamente.
SECRECIÓN NASAL. Introducir el hisopo con solución salina estéril profundamente en dirección paralela al piso de la fosa nasal. Frotar suave y firmemente (1 minuto en cada fosa nasal). Colocar el hisopo en 0.5 mL. de caldo de tripticasa soya o inocular de inmediato en agar sangre y Mac Conkey.
SECRECIÓN OCULAR. La muestra debe tomarse con cuidado y con la ayuda de otra persona para que inmovilice la cabeza del paciente. Previa separación del párpado inferior con el
15
pulgar de la otra mano, tomar con un hisopo de la secreción conjuntival dirigida hacia el ángulo interno del ojo, rotar el hisopo suavemente (tomar 2 hisopos uno para úlcera corneal) sembrar en el medio de agar sangre, Mac Conkey, tioglicolato y también un tubo de sabouraud. En este caso es recomendable que el oftalmólogo, con anestesia local tome la muestra con careta. Siempre hacer examen directo.
SECRECIÓN OTICA. Con dos hisopos colectar el pus del conducto auditivo externo. Hacer un frotis y teñirlo con Gram e inocular en agar sangre, agar chocolate y agar Mac Conkey.
PUS DE HERIDAS. En un absceso cerrado si el contenido es fluido extraer con jeringa, si el absceso es abierto tomar con un hisopo o bisturí de las paredes internas y no del centro: hacer frotis de inmediato y colocar los hisopos en medio de tioglicolato.
LESIONES DE LA PIEL. Lavar con agua, jabón y desinfectar con alcohol o yodo. Primero remover las costras y la piel que cubre las pústulas o vesículas, frotar firmemente con hisopo o bisturí dentro de la lesión. Si la lesión es seca usar hisopo húmedo y colocarlo en caldo tioglicolato.
SANGRE. Para la toma de muestra realizar aseo cuidadoso con jabón y agua después aplicar tintura de yodo al 1% y luego limpiar con alcohol al 70%. Con jeringa colectar 5 a 10 mL. y colocar en medio de cultivo líquido en volumen 10 veces mayor.
16
LÍQUIDOS CEFALORRAQUÍDEO Y OTROS LÍQUIDOS DE DERRAME. Este examen es uno de los de mayor urgencia dentro del Laboratorio Bacteriológico, por lo cual debe examinarse sin demora ya que la enfermedad es de evolución rápida y de alta mortalidad o de secuelas importantes. Es básico la identificación del agente causal y su antibiograma. Se necesitan de 1 a 2 mL. de muestra en tubos de tapón de roscas estériles, enviarlos al Laboratorio a temperatura ambiente: usualmente se toman 2 tubos uno para bacteriología y otro para química. Si no es posible, primero procesar bacteriología y luego remitirlo para química, la muestra debe guardarse en la estufa a 35°C. hasta completar la rutina. Centrifugar la muestra y con el sedimento inocular los medios de cultivo y hacer un frotis para Gram y una preparación con tinta china.
1. PUS. Si las lesiones son cerradas colectar en jeringa gruesa, previa asepsia con yodo. Si las lesiones son abiertas, lavar primero con agua y jabón y colectar con bisturí el pus del borde de las lesiones. Colocarlo directamente en los medios de cultivo o en porta - objetos. Si el pus es abundante colocarlo en un tubo estéril con tapón de rosca.
2. SECRECIONES. Lavado bronquial, líquidos de derrame, LCR, médula ósea y biopsia. Serán colectadas por el médico con estricta asepsia y colocadas en un tubo estéril con tapón de rosca u otro recipiente estéril sin preservativo.
17
Las muestras deben ser procesadas de inmediato y si no es posible, guardarlas en refrigeración no más de 24 horas.
EXAMEN DIRECTO. 3. SECRECIONES VAGINALES, URETRALES Y ORALES. Colocar una gota de secreción en un porta objeto y cubrir con laminillaexaminar al microscopio. Es recomendable hacer simultáneamente un frotis de la secreción y colorearla por Gram.
4. PUS Y MEDULA Hacer un frotis delgado en un portaobjeto y colorearlo por Giemsa.
5. ESPUTO Y LAVADO BRONQUIAL. Seleccionar las porciones purulentas y hacer frotis y colorear por Giemsa al mismo tiempo hacer una preparación con KOH al 10 ó 20%.
6. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO Y LÍQUIDOS DE DERRAME Centrifugar la muestra a 3000 rpm. Por 15 minutos. Del sedimento tomar 1 gota pequeña y colocarla a la par de una gota de tinta china. Cubrir ambas gotas con una laminilla para que se forme un gradiente de color negro. Observar con el objetivo 10 x; si se ven círculos claros, contra fondo negro observar con el 45x para apreciar la morfología. Además colocar una gota del sedimento en un porta objeto y dejar secar. Colorear por Giemsa y observar con objetivo de inmersión, esto para LCR. En caso de líquido pleural y ascítico se agrega 3 gotas de citrato de sodio al 10% por cada 10 ml. Y se conserva en refrigeración si la muestra no se procesará inmediatamente.
18
7. BIOPSIA Macerar el tejido con 1 mL. de solución salina en un mortero o con un homogenizador estéril, preparar un frotis y colorear con Giemsa y hacer preparación al fresco.
8. SANGRE Colocar la sangre en un tubo de Wintrobe y centrifugar a 3000 rpm. Por 15 minutos. Con pipeta Pasteur descartar el plasma y tomar 1 gota de la capa de leucocitos, preparar un frotis en un porta objetos y colorearlos por Giemsa.
TOMA DE MUESTRA PARA LA IDENTIFICACION DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS. Para que el Laboratorio pueda obtener resultados confiables, no solo es necesario que ejecute las técnicas en forma correcta, sino que reciba una buena muestra que provenga del sitio de la lesión a investigar y obtenida en cantidad suficiente. La muestra de mayor rendimiento para la baciloscopía es la expectoración, especialmente de la mañana, proveniente del árbol bronquial, se le pide al paciente que inspire profundamente, que retenga un instante el aire en sus
19
pulmones
y que lo expulse violentamente con un esfuerzo
de tos hasta
obtener no menos de tres esputos.
Para el diagnóstico se requiere dos muestras: la primera se tomará en el momento de la consulta, la segunda será recogida al despertar la persona (matinal) previo aseo de la boca. Para control de tratamiento: dos baciloscopías al segundo, cuarto y sexto mes de tratamiento. Para control post tratamiento: se deben realizar baciloscopías a los 12 y 24 meses de finalizado el tratamiento. Al recibir la muestra se debe observar la cantidad y la calidad, tapar bien el recipiente y marcarlos en el cuerpo del recipiente, no en la tapa.
20
CONTROL DE CALIDAD. 1. ALMACENAMIENTO DE CULTIVO DESHIDRATADOS: Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos y absorven agua del exterior, (así como la formación de agua dentro de una botella) como consecuencia de las fluctuaciones de temperatura en el ambiente. Además favorecen el crecimiento bacteriano. Esto puede conducir al consumo de nutrientes, variaciones de pH y cambios de color en el medio. También la exposición a la luz puede llevar a cambios importantes o alteraciones en los constituyentes del medio de cultivo. Tomando en cuenta los factores antes señalados, los medios de cultivo deshidratados deben almacenarse siempre en un lugar fresco, protegidos contra la humedad y la luz. Cuando se requiera abrir un frasco, debe hacerse en un lugar seco, utilizando condiciones de almacenamiento adecuadas, los medios elaborados en forma de polvo tienen una vida útil de al menos un año y los medios en forma granular tienen una duración de al menos tres años. Para asegurarnos que un medio de cultivo está en buen estado, es conveniente marcar cada frasco de medio con la fecha en que fue recibido y tomarse las previsiones necesarias para que la existencia del mismo en bodega cubra las necesidades del laboratorio por períodos de al menos seis meses. De esta manera controlaremos su vida útil y evitaremos que se nos deterioren durante el almacenamiento. El material que ha sufrido cambios sustanciales, tales como hidratación y endurecimiento, debe descartarse. 2. RECONSTITUCIÓN O REHIDRATACIÓN. El grado de disolución del medio deshidratado, así como la eficacia del medio de cultivo ya preparado dependen en gran medida del procedimiento empleado en la rehidratación.
21
Debe
emplearse
siempre
agua
recién
destilada
o
completamente
desmineralizada y erlenmeyers con un volumen, al menos, dos veces mayor a la cantidad de medio que se va a preparar. Siempre se agrega la cantidad indicada de medio deshidratado a la mitad del volumen de agua requerido, se mezcla vigorosamente hasta obtener una suspensión homogénea y luego, se agrega el resto del agua asegurándose que cualquier partícula de medio adherida a la pared del erlenmeyers sea lavada en el proceso. Se ajusta el pH del medio al valor que establece la casa fabricante. Para este propósito, se utilizan soluciones de NaOH y HCL 0.1 N y un potenciómetro debidamente calibrado. En el caso que no se disponga de éste y para medios que no tengan colorantes o indicadores pueden utilizarse las tiras del pH. Si un medio de cultivo contiene Agar, gelatina o cistina, es indispensable calentarlo en un baño de agua hirviendo y agitarlo frecuentemente hasta lograr su disolución completa. Esta se logra cuando no se observen partículas adheridas a la pared del erlenmeyer y el medio disuelto se observe homogéneo. Una vez logrado el propósito anterior, debe suspenderse el calentamiento, ya que un exceso del mismo puede ocasionar deterioro de algunos constituyentes del medio, tornándolo inadecuado. Si el medio debe ser distribuido en tubos (TSI, Citrato, etc.) debe agitarse frecuentemente para asegurar una distribución homogénea del mismo en cada tubo. Los medios que no contienen agar, gelatina o cistina se solubilizan sin necesidad de calentarlos.
3. ESTERILIZACIÓN. El medio de cultivo una vez disuelto (y distribuido en tubos si fuera necesario) debe someterse al proceso de esterilización, excepto aquellos que no lo requieran (agar SS, por ejemplo).
22
Deben seguirse las instrucciones en cuanto a tiempo y temperatura para asegurarse la obtención de medios de cultivo útiles. Debe tenerse en mente que la presión varía de acuerdo con la altura y por tanto no es un factor constante. De tal manera que son el tiempo y la temperatura los parámetros que deben tomarse en consideración en el proceso de autoclavado.
4. DISTRIBUCIÓN DEL MEDIO EN PLACAS. El medio esterilizando debe enfriarse a 45°- 50°C en un baño maría ajustado a esa temperatura para evitar la formación de agua de condensación. Debe ser vertido en las placas evitando la formación de burbujas. En caso de que éstas se presenten, pueden ser eliminadas por calentamiento en la superficie del medio con ayuda de la llama del mechero. Durante el vaciado los componentes del medio deben estar distribuidos uniformemente, por lo que es necesario agitarlo con frecuencia. Si el medio de cultivo se ha enfriado a 45-50°C, el agua de condensación que pueda formarse en las placas será poca y por tanto, pueden mantenerse cerradas para evitar contaminación. Debe guardarse una pequeña cantidad del medio para determinar el pH después de autoclavado. Si el valor no es el indicado para el medio, descártelo. 5. PRUEBA DE ESTERILIDAD. Para cada lote que se prepare debe tomarse una muestra de un 10% y someterla a control de esterilidad a 35°C por 24 horas. Este procedimiento dará una idea sobre la contaminación obtenida en la preparación del medio. Esto a su vez permitirá determinar si se deben tomar medidas más rigurosas en la limpieza y desinfectación del sitio en que se preparan los medios de cultivo y en el procedimiento de distribución del medio.
6. ALMACENAMIENTO DEL MEDIO PREPARADO. El medio de cultivo reconstituido tiene una vida útil limitada. Si no se emplea de inmediato, debe almacenarse bajo condiciones apropiadas para garantizar su utilidad durante un período de tiempo.
23
El almacenamiento a 4°C es el mejor para la mayoría de los medios. Sin embargo, aquellos que contienen tioglicolato es indispensable mantenerlos a temperatura ambiente para que mantengan su viabilidad.
Los medios deben mantenerse en sitios oscuros, ya que la luz puede afectar algunos de sus componentes. Para evitar la desecación los medios pueden guardarse en bolsas plásticas bien cerradas. Las placas de petri almacenadas de esta forma deben colocarse con el fondo hacia arriba.
Dado que los medios almacenados temperatura
ambiente
tienden
en refrigeración cuando pasan
a formar
agua de
a
condensación en la
superficie, se recomienda poner las placas en el incubador a 35°C por un período de dos horas, colocándolas con el fondo hacia arriba. De esta manera se obtendrá una superficie seca.
CONTROL DE CALIDAD EN TINCIONES Y PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN. Para determinar que los reactivos empleados tanto en tinciones como en pruebas de identificación bacteriana funcionen adecuadamente, deben utilizarse bacterias que muestren las diferentes características distintivas para cada prueba o tinción. Para ello, deben hacerse controles diarios con las cepas bacterias de referencia y seguir estrictamente las indicaciones en cuanto al almacenamiento de reactivos, inoculación de medios, períodos de incubación, metodología para efectuar las pruebas y tiempo de lectura de las mismas.
24
PRACTICA No.1 PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO.
PRACTICA No.1 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO. Los medios de cultivo usados en Bacteriología contienen los nutrientes y factores físicos y químicos (pH, concentración de iones), necesarios para la reproducción bacteriana. Existe una gran variedad de medios de cultivo. Los medios líquidos permiten la proliferación bacteriana por todo el medio, son de fácil manejo. Los medios sólidos permiten el crecimiento aislado de grupos de bacterias (colonias) cuyas características macroscópicas sirven de guía para la identificación de ciertas bacterias.
COMPETENCIA. Preparar adecuadamente, medios de cultivos líquidos y sólidos, a partir de medios deshidratados, siguiendo las instrucciones correspondientes. MATERIAL. •
Caldo tripticasa soya o caldo tioglicolato
•
Agar tripticasa soya deshidratado
•
Soporte con maya metálica
•
Frascos Erlenmeyer o balones volumétricos con apon de algodón o gasa
•
Cajas de petri
•
Bajalenguas de madera
•
Balanza
•
Agua destilada
•
Probetas tubos de ensayo 25
•
Olla de presiona
•
Mecheros
PROCEDIMIENTO. MEDIO DE CULTIVO LIQUIDO 1. se pesa el CTS sobre una balanza granataria (calibrada previamente). Se observan las especificaciones en el frasco. 2. el CTS debe ser pesado sobre un papel especial para que no haga contacto con la superficie de la balanza. 3. colocar 50 ml de agua destilada en un erlenmeyer (el volumen se mide en una probeta) 4. agregar el medio deshidratado. Disolver por agitación y calentamiento hasta que empiece a hervir. Luego esterilizar en la olla de presión ( 15 lbs de presión por dos horas). 5. después de esterilizar se procede a colocar el medio de cultivo sobre cada tubo de ensayo (esterilizados previamente) quedando así listo el medio de cultivo. Los medios líquidos deben mantenerse debidamente
enroscados o sellados para
evitar la contaminación.
MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO. 6. se pesa el medio TSA o algún medio sólido, en una balanza granataria ( instrucciones en el frasco) 7. el procedimiento es igual a la de los medios líquidos
26
PRACTICA No. 2 OBTENCION DE BACTERIAS EN CULTIVO PURO Un paso fundamental para el diagnostico bacteriológico es el aislamiento de bacterias en cultivo puro. Luego por procedimiento de laboratorio de naturaleza variada (pruebas bioquímicas, coloraciones, serología, etc.) se procede a su identificación. Por lo tanto es de gran importancia poder realizar las técnicas para obtención de cultivos puros a partir de una flora mixta. OBJETIVOS 1- Que el alumno obtenga cultivos puros de bacterias Grampositivas y Gramnegativas, a partir de una muestra con flora mixta.
2- Que utilice medios de cultivos selectivos y diferenciales e interprete los resultados que obtenga en esos medios.
3- Que constate por observación macroscópica y microscópica si obtuvo cultivo puro.
PARTE I. MATERIAL POR LADO DE MESA. -
Una suspensión de heces 1:1000
- Una placa de Agar de tripticasa soya - Una placa de Agar Mac Conkey - Una placa de Agar sangre. PROCEDIMIENTO Sembrar las placas de agar tripticasa soya, Mac Conkey y agar sangre con la suspensión de heces utilizando el método de estrías para extenderlo.
27
Incubar todas las placas a 36ºC +/- 1ºC, hasta la siguiente practica de laboratorio.
PARTE II MATERIAL:
- Colorante para Gram y dos placas de agar tripticasa soya. PROCEDIMIENTO
1- Observar el número y tipo de colonias que hayan crecido en las placas de agar tripticasa soya, Mac Conkey y agar sangre. Notar las diferencias que hay entre el crecimiento de todas las placas, interpretar los resultados.
2- Hacer frotis de colonias diferentes obtenidas en el medio de Mac Conkey y agar sangre, colorearlos por el método de Gram. Observarlos en el microscópio y anotar los resultados. 3- En base a los resultados de los frotis seleccionar una colonia formada por bacterias Grampositivas y resembrarla en el medio de agar tripticasa soya, incubarla a 36ºC hasta el próximo laboratorio. Hacer lo mismo con una colonia Gramnegativa.
28
PARTE III PROCEDIMIENTO
1- De cada una de las placas sembradas tomar tres colonias aisladas, hacer frotis y colorearlo por Gram. Observar al microscopio indicar si obtuvo cultivos puros. 2- Discusión a) Método de estrías (fundamento y objetivo) b) Análisis de cada medio de cultivo: nombre, función, clasificación, composición (sustratos, nutrientes e inhibidores) c) Descripción de colonias. d) Análisis de los resultados. Frotis Bacteriano. 1. Se observa Morfología 2. Se observa tinción ( Gram, Acido resistencia).
29
PRACTICA No. 3 PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS (ANTIBIOGRAMA) PROPOSITOS La prueba de susceptibilidad sirve para determinar IN VITRO a que antibióticos es susceptible o resistente una determinada cepa bacteriana aislada del paciente. Este método permite al médico escoger el antibiótico más adecuado con base científica proporcionada por el laboratorio y así poder dar un buen tratamiento. Básicamente hay dos técnicas para verificar estas pruebas: dilución en tubo y difusión en agar. La técnica del disco sobre agar, se adapta a las necesidades y fines de la práctica diaria en el laboratorio. Además las pruebas de susceptibilidad constituyen una ayuda invaluable para la elección de los agentes
antimicrobianos
más
apropiados
para
el
tratamiento
de
las
enfermedades infecciosas. OBJETIVOS 1. Verificar la prueba estandarizada de susceptibilidad bacteriana a los antimicrobianos por el método de difusión en agar (método de KIRBY BAUER). 2. Reconocer la importancia de adherirse a las normas estandarizadas recomendadas para obtener resultados confiables y reproducibles. 3. Analizar las posibles fuentes de error inherentes al método e indicar la forma de evitarlas. Suceptible: Cuando los microorganismos responsables de una infección son inhibidos por concentraciones de antibióticos obtenidos con un régimen usual de dosificación. 30
Resistente: Si los microorganismos que causan la infección, toleran concentraciones de antibióticos superiores a las que pueden obtenerse en la sangre por medio de un régimen usual de dosificación. Intermedio: Hoy en día se considera como prueba errática, que por lo tanto debe repetirse, ya que realmente se trata de una población bacteriana resistente. PROCEDIMENTO Por medio de la técnica de Kirby-Baver modificada se obtienen resultados confiables, reproducibles y de gran utilidad clínica siempre y cuando se sigan al pie de la letra las instrucciones. Es una técnica relativamente sencilla. Y siempre debe efectuarse con el Agar de Mueller-Hinton; el grosor de la caja, concentración del inoculo, humedad, temperatura y otros factores deben estar perfectamente estandarizados para que los resultados puedan ser comparables entre los diversos laboratorios. Es muy importante tomar en cuenta que esta técnica solo sirve para efectuar el antibiograma a las siguientes bacterias aeróbicas o facultativas de crecimiento rápido: 1. Staphylococcus aureus 2. Enterobacterias 3. Pseudomonas
El antibiograma para Haemophilus spp y Neisseria sp, debe hacerse en Mueller-Hinton con 5% de sangre “achocolatado”. Para prepara el agar de Mueller-Hinton debe seguir las siguientes indicaciones: 1. Las cajas de petri deben tener un tamaño estándar (100 mm de diámetro) deben
llenarse
con aproximadamente
25 mL de agar
líquido
ya
autoclaveado, a manera de obtener un medio de 4mm de grueso.
31
2. Deben guardarse en refrigeración dentro de bolsas plásticas selladas (de 2 a 8°C) por no más de 7 días. 3. El pH del medio debe ser de 7.2 a 7.4. 4. De cada lote de medio, incubar de 2 – 5 cajas por 24 horas a 36°C para comprobar su esterilidad.
ALMACENAMIENTO DE LOS DISCOS CON ANTIBIÓTICOS: Almacenar los discos de acuerdo con las siguientes instrucciones para que no pierdan su potencial: 1. Congelar (idealmente a –20°C) los discos de Penicilina, Ampicilina, Carbenicilina y Cefalosporinas. Descongelar periódicamente sólo los discos que serán usados durante la semana. Descongelarlos por lo menos 2 horas antes de usarlos. 2. Los discos del resto de antibióticos pueden almacenarse refrigerados sin congelación. De preferencia con un desecante.
PROCEDIMIENTO: 1. Con el asa flameada y fría tomar 4 a 5 colonias bien aisladas y de igual morfología del cultivo. Debe trasladarse siempre a un cultivo puro. 2. Inocular un tubo con 4 mL de caldo tripticasa soya o caldo infusión de cerebro - corazón. 3. Incubar el caldo de 2 a 5 horas a 36°C, hasta que aparezca una ligera turbidez.
32
4. Ajustar la turbidez del caldo, con la turbidez del tubo estándar de Mac farland 0.5. Si el caldo es más turbio que el estándar, agregar más caldo o solución salina estéril. 5. Luego inocular la caja presecada de agar Mueller-Hinton así: introducir un hisopo estéril en el caldo, exprimir bien el hisopo presionándolo ligeramente contra las paredes del tubo, arriba del nivel del caldo. 6. Con el hisopo exprimido sembrar la caja en 4 direcciones opuestas sobre toda la superficie, cerca del mechero encendido. 7. Dejar secar la caja de 3 a 5 minutos; pero no más de 15 minutos, con la tapadera cerrada. 8. Con pinzas estériles, colocar los discos impregnados de antibióticos a manera que queden lo más separado entre sí. Escoger los antibióticos a colocar dependiendo de la bacteria aislada. 9. Invertir las cajas o incubarlas por 16 a 18 horas. Nunca usar jarro con candela (excepto para Hemophiles spp y Neisseria spp) INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS. 1. Después de 16 a 18 horas de incubación, examinar con buena luz las cajas ya con crecimiento. 2. Medir en milímetros el diámetro de los halos de inhibición completa con una regla por detrás de la caja petrí. 3. En caso de sulfonamidas, puede ocurrir crecimiento dentro del halo, el cual no debe tomarse en cuenta. 4. Transformar las medidas de los diámetros de los halos de inhibición en milímetros, hacer lecturas de acuerdo a tablas actualizadas.
33
INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LAS ZONAS DE INHIBICIÓN
(mm)
PARA
MIEMBROS
DE
LA
FAMILIA
ENTEROBACTERIACEAE Agente antimicrobiano Amikacina Amoxicilinaácido clavulánico Ampicilina Ampicilinasulbactan Aztreonam Cefamandol Cefazolina Cefmetazol Cefonicida Cefoperazina Cefotaxima Cefotetan Cefoxitina Ceftazidima Ceftizoxima Ceftriaxona Cefuroxima (oral) Cefuroxima (parenteral) Cefalotina Cloranfenicol Ciprofloxacina Gentamicina Imipenem Kanamicina Mezlocilina Netilmicina Piperacilina Tetraciclina Ticarcilina
Contenido del disco (meg)
Resistente
Intermedio
15-16
Moderadamente susceptible 14-17 14-16
Susceptible
30 20/10
14 13
10 10/10
13 11
12-14 16-21
17 15
30 30 30 30 30 75 30 30 30 30
15 14 14 12 14 15 14 12 14 14
15-17 15-17 13-15 15-17 16-20 15-22 13-15 15-17 15-17 15-19
22 18 18 16 18 21 23 16 18 18
30 30 30
14 13 14
14-20 15-22 15-17
20 21 23
30
14
15-17
18
30 30 5 10 10 30 75 30 100 30 75
14 12 15 12 13 13 17 12 17 14 14
15-17
18 18 21 15 16 18 21 15 21 19 20
13-17 16-20 13-14 14-15 14-17 18-20 13-14 18-20 15-18 15-19
17 18
(Continuación) Agente antimicrobiano
Ticarcilina-ácido clavulánico Tobramicina Trimetoprimsulfametoxazol
Contenido del disco (mcg) 75/10
Resistente
Intermedio
14
10
12
1.25/23.75
10
Moderadamente susceptible 15-19
13-14
Susceptible 20 15
11-15
16
34
Reportar sólo en Urocultivo Carbenicilina
100
19
Cinoxacina
100
14
15-18
19
Nitrofurantoína
300
14
15-16
17
Norfloxacina
10
12
13-16
17
Ofloxacina
5
12
13-15
16
Sulfisoxazol
250 ó 300
12
13-16
17
Trimetroprim
5
10
11-15
16
20-22
23
INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LAS ZONAS Agente Contenido del antimicrobiano disco(mcg)
Amoxicilinaácido clavulánico Ampicilina Ampicilinasulbactan Cefazolina Cefotaxima Ceftriaxona Cefalotina Cloranfenicol Ciprofloxacina Clindamicina Eritromicina Gentamicina Imipenem
Resistente Intermedio
20/10mcg
19
10mcg/ml 10/10mcg.
28 11
30mcg. 30mcg 30mcg 30mcg 30mcg 5mcg 2mcg 15mcg 10mcg. 10mcg.
14 14 13 14 12 15 14 13 12 13
Moderadamente susceptible
Susceptible
14-16
20
12-14
29 15
15-17 15-22 14-20 15-17 13-17 16-20 15-17 14-22 13-14 14-15
18 23 21 18 18 21 18 23 15 16
Continuación Agente antimicrobiano
Contenido del disco (mcg)
Meticilina 5mcg Ofloxacina 5mcg Oxacilina 1 mcg Penicilina G 10 U Rifampicina 5mcg Tetraciclina 30mcg Trimetoprim1.25/23.75m sulfametoxazol cg. Vancomicina 30mcg Reportar sólo en Urocultivo
Resistente
9 12 10 28 16 14
Intermedio
10-13 13-15 11-12 17-19 15-18
10 9
Moderadamente susceptible
11-15 10-11
Susceptible
14 16 13 29 20 19 16 12
35
Nitrofurantoína Norfloxacina Sulfisoxazol Trimetroprim
300mcg
14
15-16
17
10mcg
12
13-16
17
250 ó 300mcg
12
13-16
17
5mcg
10
11-15
16
DISCUSION 1- Características del medio de cultivo. 2- Principio del método de difusión. 3- Elaboración del reporte. 4- Antibiótico. Quimioterapéutico. 5- Otros controles: inóculo, discos, siembra e incubación.
PRACTICA No. 4 COPROCULTIVO La infecciones éntericas pueden ser causadas por varios microorganismos, siendo de mayor importancia las bacterias del genero Shigella, Salmonella y desde 1991 el Vibrio cholerae O1 PROPÓSITO: Demostrar por medio del cultivo, la presencia de bacterias enteropatógenas, es decir que infectan el intestino penetrando o no su mucosa. Esto causa diarrea, dolor abdominal, fiebre y a veces la muerte. OBJETIVOS 1- Observar y describir la morfología de las Enterobacterias aisladas de la muestra de heces. 36
2- Utilizar un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias entéricas y sepa interpretar los resultados obtenidos.
3- Utilizar medios diferenciales para evaluar la actividad bioquímica de las bacterias que aisle e intérprete los resultados obtenidos. 4- Realizar pruebas serológicas para la identificación de las principales Enterobacterias patógenas.
5- Elaborar su reporte final en base a los resultados obtenidos utilizando las tablas de referencia para la identificación de Enterobacteriaceae.
MUESTRA: Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes muestras:
Heces frescas (la mejor muestra)
Hisopo rectal (cuando no se obtienen heces)
Material obtenido por proctoscopia.
Biopsia de mucosa intestinal.
Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibióticos. Las heces deberán procesarse lo más pronto posible, de preferencia antes de 2-3 horas de ser emitidas. El hisopo rectal es una buena toma de muestra (en caso de no ser posible obtener muestras de heces recientes), porque arranca las bacterias que se encuentran dentro de la mucosa. En los adultos, introducir con cuidado en el ano un hisopo estéril 4 centímetros, dar 3 vueltas a la derecha y 3 vueltas a la izquierda. En niños, introducir el hisopo 2.5 centímetros y dar la misma cantidad de vueltas. Cuando las heces, que se encuentran a 37°C dentro del intestino, son colocadas y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20°C), el pH baja considerablemente (acidez) y hace que las bacterias, especialmente
37
Shigella sp pierdan su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por esta razón si la muestra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada, debe colocarse en un medio de transporte bufferado que evite los cambios bruscos de pH. Para éste propósito colocar con hisopo estéril una porción de las heces (con sangre, moco o pus) bien cargado en tubos con 3 mL del siguiente medio de transporte:
Glicerol – Salino bufferado, (especialmente para Shigella).
Caldo de Hagna GN (Gramnegativo).
Pero el mejor medio de transporte para Enterobacterias es el Cary - Blair.
Otros caldos de enriquecimiento como Selenito, no deben usarse excepto en encuestas especiales para buscar Salmonella sp, ya que su uso retrasa 24 horas el resultado del coprocultivo, lo que disminuye considerablemente su utilidad clínica. La coloración de Gram en heces nunca debe practicarse por carecer de significado clínico a menos que el médico lo solicite. PROCEDIMIENTO: Debe conocerse la edad del paciente, anotar si es niño menor de 6 meses. Para efectuar el coprocultivo deben usarse medios que sean selectivos (contienen inhibidores, por lo que sólo permiten el crecimiento de bacilos gram-negativos) y diferenciales (contienen lactosa e indicadores de pH que viran cuando se produce ácido, lo que hace cambiar el color de las colonias y así las diferencia). Algunos de estos medios contienen sales de hierro que precipitan en forma de sulfuro ferroso de color negro intenso si las bacterias producen ácido sulfídrico. El coprocultivo debe efectuarse en dos medios selectivos-diferenciales de preferencia uno más inhibidor que otro. Se recomienda usar rutinariamente agar
38
Mac Conkey, Agar XLD o Agar SS (Salmonella-Shigella). En caso de heces con moco y sangre (disentería) debe incluirse adicionalmente el medio de Hektoen.
EFECTUAR EL COPROCULTIVO DE LA SIGUIENTE MANERA: 1. Inocular una porción anormal de heces (con moco, sangre o pus) o de muestra similar, directamente en una caja de Mac Conkey y una caja de SS. El inóculo se coloca con asa en anillo (flameada y fría) o con hisopo en las cajas de ambos medios. Inocular sólo ½ cm en un extremo en el Mac Conkey y 1 cm en el SS. El Hektoen se inocula igual que el Mac Conkey. 2. Diseminar el inóculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asas mientras la otra se enfría. 3. Ya diseminadas de esta manera las muestras en la superficie de las cajas, incubar a 36°C por 18 a 24 horas.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: 1. Después de incubadas, observar cuidadosamente las placas. Debe contarse con una luz de lámpara que ilumine las cajas por detrás y observarlas. Marcar por detrás con un círculo de crayón graso cada tipo diferente de colonias sospechosas así: primero Mac Conkey escoger colonias lactosanegativo (incoloras). Si el paciente es un niño menor de un año, se marcaran colonia típica de Escherichia colí (roja, brillante y de bordes lisos pero no mucosa). Examinar el SS de la misma forma, en este medio el crecimiento será más escaso ya que es más inhibidor. Marcar por detrás una colonia lactosanegativo (incoloras), o incluyendo una colonia con centro negro (ácido
39
sulfhídrico) si las hay. Si inocula Hektoen, marcar una colonia pequeña verde azulado (lactosa-negativo). 2. Colocar las cajas con las colonias previamente marcadas, usando una asa en aguja bien recta, flameada y fría, toque la superficie de la colonia seleccionada, teniendo cuidado de no pincharla o pasar tocando otras colonias cercanas. Con cuidado de no contaminar la punta del asa que ya tocó la colonia sospechosa, destape un tubo (13 x 100mm) de TSI flameé la boca del tubo, luego pínche el medio en el centro y hasta el fondo a manera de tocar exactamente el centro del fondo del tubo, retire el asa sin salir del tubo de TSI y estríe rápido y parejo en la superficie inclinada. Flamear y con la misma asa inocule el medio de Citrato de Simmons, estríe la superficie del medio, flamear y con la misma asa toque la misma colonia e inocule al medio de urea, flamee nuevamente y proceda a inocular el medio de movilidad y los caldos, siempre tocando la misma colonia inocule indol, rojo metilo y el Voges Proskauer. 3. Incube a 36°C la gradilla que contiene las bioquímicas. Deben permanecer en incubación de 18-24 horas. Los tapones de rosca deben quedar ligeramente flojos para permitir la entrada de oxígeno. 4. Examine las reacciones e interprete los resultados de acuerdo a la tabla de identificación de pruebas bioquímicas. 5. Complete haciendo la respectiva sensibilidad (Antibiograma).
40
COPROCULTIVOS Heces frescas o Hisopo rectal Inocular Mac Conkey, SS y Selenito Incubar 18 – 24 horas a 36ºC Crecimiento colonias lactosa Lactosa
Incubar 8 horas Subcultivar Mac Conkey (placas standard)
Incubar de 18 a 24 horas a 36ºC
(-)
41
Incubar TSI-Movilidad - Urea (-) Reportar NBP (adultos) Según crecimientos y numero de Colonias Identificar y hacer antibiogramas en niños.
K/A
(+) Otras Enterobacterias Antibiograma
Urea
Urea
(-) Urea
Urea
Shigella
Urea
Pruebas bioquímicas Primarias Tipeo Serológico (Antisueros: B.C.D.A.AD.
PRACTICA No.5 CULTIVO PARA EL AISLAMIENTO DE VIBRIO CHOLERAE O1 En el caso de cólera el reporte debe ser inmediato, ya que en los casos graves la vida del paciente puede depender de éste resultado. MATERIALES:
Hisopos estériles
42
Tubos de vidrio 15 x 100 mm
Tubos de vidrio 16 x 100 mm
Asa redonda
MEDIOS:
Cary Blair 2 hisopos impregnados con heces o vómito.
Agua pectonada alcalina (APA)
Agar T.C.B.S.(Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa).
MUESTRAS:
Heces líquidas
Hisopo rectal
Vómito
PROCEDIMIENTO: 1. Con uno de los hisopos del tubo con medio de transporte colocar el inoculo en el medio T.C.B.S regresar el hisopo al tubo de medio.
2. Estriar por agotamiento e incubar a 35°C por 18 a 24 horas.
3. El otro hisopo introducirlo en el agua peptonada alcalina e incubar a 35°C por 6 a 8 horas máxima a las 8 horas, hacer un subcultivo del agua peptonada, tomando 2 a 3 asadas de la superficie de dicho caldo o inocular otra caja de medio de TCBS, estriar por agotamiento o incubar a 35°C por 18 a 24 horas. LECTURA:
43
Observar ambas cajas de TCBS buscando colonias amarillas cremosas y chiclosas, de estas inocular un TSI y un TSA (Tripticas soya agar), incubar a 35°C por 18 a 24 horas.
Al observar el TSI A/A sin gas, hacer del TSA la prueba del hilo mucoso: en una lámina porta objetos suspender el inoculo de un cultivo de 18 a 24 horas en una gota de suspensión acuosa de desoxicolato de sodio al 0.5%) y la prueba de oxidasa.
Si ambas pruebas son positivas pasar a la serotipificación con: antisuero polivalente y solución salina para ver si es una cepa autoaglutinable. Con solución salina no tiene que aglutinar.
Si aglutina con el suero polivalente continuar con el antisuero INABA, si con éste antisuero también aglutina reportamos: Se aísla Vibrio cholerae O1 INABA, si no aglutina con el INABA, continuar con el antisuero OGAWA. Si este aglutina, reportamos. Se aísla Vibrio cholerae 01 OGAWA.
Si en los tres antisueros aglutina se reporta: Se aísla Vibrio cholerae O1 HIKOJIMA.
Si la oxidasa nos da positiva y con el antisuero polivalente no aglutina se reporta: Se aísla Vibrio cholerae Nº O1.
Si no se observan colonias con características antes mencionadas se reporta: No se aísla Vibrio cholerae.
VIBRIO CHOLERAE Cary Blair
Agar Mac Conkey
TCBS Colonias lactosa (-)
Hisopo rectal Vómito Heces
Agua Peptona Resiembra en TCBS a las 6-8 horas
Colonias amarilla de ± 3 mm de diámetro (Trabajar con varias colonias sospechosas)
44
Identificar Salmonella o Shigella Si
No crecimiento No se aísla Vibrio cholerae
TSI TSA A/A ó K/A Gas (-) H-S(-)
Si
Reporte No
TSA
No se aísla Vibrio cholerae
Oxidasa y prueba del collar
NEGATIVO
Reporte No se aísla Vibrio cholerae
POSITIVO
Aglutina con Antisuero Polivalente anti. V.Cholerae Serogrupo 01.
POSITIVO V. cholerae Serogrupo 01
NEGATIVO V. cholerae No Serogrupo 01
DISCUSION 1. Definir coprocultivo. Casos especiales (niños menores de 5 años e inmunodeprimidos) 2. Muestras clínicas: ¿Cómo se toman? ¿Cuándo se indican? Cuidados en el manejo. Procesamiento. 3. Medios de cultivo: consistencia, composición, aplicación e importancia. 4. Reporte preliminar. Importancia, indicación, como se hace, como se reporta. 5. Análisis del resultado del cultivo.
45
6. Siembra de medios diferenciales. Lectura, incubación e interpretación. 7. Antibiograma. Importancia. Antibióticos recomendados por la Organización mundial de la salud. 8. Uso de tablas para identificación bacteriana. Reporte.
PRACTICA No. 6 UROCULTIVO PROPÓSITO: El cultivo de orina que ha sido colectada adecuadamente o Urocultivo se efectúa para demostrar la presencia de un número significativo de bacterias.
46
En condiciones normales, la orina dentro del cuerpo es estéril, pero siempre se contamina con bacterias al obtener la muestra. Por esta razón, el criterio para interpretar el crecimiento es cuantitativo. De acuerdo con el llamado “Criterio de Kass” un número de bacterias mayor o igual a 100,000 UFC/ml (Unidades formadoras de colonias por mililitro de orina) se considera infección verdadera, es decir es un recuento significativo. A diferencia de otros cultivos bacteriológicos, las bacterias que causan la infección urinaria, se limitan a unos pocos microorganismos de crecimiento rápido. Las principales bacterias que afectan el sistema urinario son las Enterobacterias (bacilos Gramnegativos). La Escherichia coli es sin duda la bacteria que con más frecuencia se aísla de urocultivos positivos, luego tenemos:
Klebsiella spp.
Enterobacter spp.
Proteus spp.
Pseudomona aeruginosa (no es Enterobacteria).
De menor frecuencia tenemos los cocos grampositivos:
Enterococcus spp.
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes y Streptococus spp. (raros).
Staphylococcus epidermidis (puede ser por contaminación)
Staphylococcus saprophyticos(puede ser por contaminación).
Las infecciones mixtas causadas por dos o más especies bacterianas son raras, por lo que el crecimiento con varios tipos de colonias indican contaminación. La demostración de piuria (presencia de leucocitos poliformonucleares en el sedimento urinario) y la Bacteriuria (bacterias en orina), son ambas de gran importancia para establecer el diagnóstico de infección urinaria. OBJETIVOS 47
1. Aprender a tomar una muestra limpia de orina y a dar indicaciones sobre dicho procedimiento. 2. Realizar examen directo con coloración de Gram de las muestras de orina proporcionadas. Observar los resultados, los interprete y hacer el reporte preliminar. 3. Verificar el recuento de bacterias en las muestras por el método del asa calibrada, sembrar en placas e interpretar los resultados. 4. Identificar
los
posibles
microorganismos
patógenos.
Interprete
los
resultados. RECOMENDACIONES GENERALES. TOMA DE UROCULTIVO EN EL HOMBRE: a) Desinfectar bien el glande del pene del paciente con una gasa estéril empapada con jabón antiséptico no irritante. Remover el jabón con otra gasa estéril, empapada en agua estéril. b) Pedir al paciente que orine directamente en el inodoro. c) Después de transcurrido unos 3 a 5 segundos, destapar rápidamente pero con cuidado un frasco estéril de boca ancha tomar “al vuelo” a medio chorro una muestra de orina de la parte central de la micción. Se deja correr la primera porción de orina para que remueva las bacterias de la parte anterior del meato urinario, que contaminaría el Urocultivo. Tapar rápidamente el frasco. d) Si no es posible inocular el Urocultivo antes de una hora de obtenida la muestra, refrigerarla (no congelar). La muestra conservada en refrigeración se mantiene en buenas condiciones para ser inoculada, por un máximo de 48 horas. TOMA DE UROCULTIVO EN LA MUJER:
48
En el caso de la mujer, debe observarse especial cuidado en la toma de la muestra, ya que sus genitales están expuestos, por lo tanto hay una abundante colonización de bacterias. Proceder de la siguiente manera: a) Solicitar a la paciente que se coloque sobre la tasa del inodoro con las piernas abiertas. Con los dedos índices y medio de la mano derecha izquierda debe separarse los labios genitales mayores. b) Con una gasa empapada con jabón antiséptico no irritante, limpiar bien toda el área y luego remover el jabón con otra gasa empapada con agua estéril. c) Obtener la muestra de orina a medio chorro, que corra el chorro de orina unos segundos y luego la tomar de la porción central de la micción. Tapar rápidamente. d) Sembrar antes de una hora ó refrigerar la muestra. TOMA DE UROCULTIVO EN NIÑOS PEQUEÑOS: a) En niños varones desinfectar bien con jabón antiséptico no irritante, todo el pene y el área genital. En las niñas desinfectar bien los labios mayores y el área genital que los rodea. Quitar bien el jabón con gasa y agua estéril, luego secar
finalmente con una
gasa estéril seca. b) Pegar una bolsita de plástico estéril y descartable, especial para tomar urocultivos pediatricos. En niños tener la precaución de introducir todo el pene en el orificio del llenado y en las niñas que el agujero de la bolsa quede pegado al centro por donde saldrá la orina. MATERIALES
Placas de agar sangre.
Placas de Mac Conkey
Tubos de orina de pacientes con pielonefritis (la traerá el alumno)
Asa calibrada de 0.001ml
49
PROCEDIMIENTO: 1. Sembrar la orina en dos medios de cultivo según la técnica del Asa calibrada. Los medios de cultivo a utilizar son: a. Agar sangre de carnero al 5% crecen la mayoría de microorganismos b. Agar Mac Conkey: Crecen solo bacilos Gramnegativos aerobios (Enterobacterias) pues es selectivo y diferencial.
2. Para sembrar usar un asa calibrada de platino (95% platino, 5% radio) que tome 0.001 mL. agitar el frasco de orina, abrir delante del mechero y flamear la boca del mismo. Introducir verticalmente el asa flameada y fría en la orina, justamente por debajo de la superficie.
3. Inocular primero el agar sangre deslizando el asa una sola vez a lo largo de la caja de petri pasando por el centro. Flamear o inocular en igual forma el medio de Mac Conkey.
4. Inmediatamente estriar con asa corriente en anillo el inoculo de orina, en ambas cajas, haciendo estrías tupidas y perpendiculares a la estría dejada por el asa calibrada.
5. Inmediatamente incubar el agar sangre a 36°C en jarro de boca ancha con un trozo de papel absorbente húmedo y una candela encendida, cerrar bien.
6. Incubar el Mac Conkey sin jarro en la incubadora a 36°C.
INTERPRETACIÓN:
50
1. Después de incubar ambas cajas durante 18-24 horas interpretar resultados de ambas cajas simultáneamente y con buena luz. 2. Contar el número de colonias presentes y multiplicar por 1000; si se usó el asa calibrada de 0.001 mL, multiplicar por 100 si se utilizó un asa calibrada de 0.01 mL. 3. Recuento mayores de 100,000 UFC/ml de orina, cepa pura: identificarlo con bioquímica, hacer sensibilidad y reportarlo. UFC/ML 0 –10,000
CRITERIO PARA REPORTAR Negativo a las 24 horas de incubación a 36°C Sugerir repetir cultivo. Revisar condiciones de toma
10,000-50,000
de muestra y correlación de leucocitos en sedimento urinario. Se aisló ___, _____, 000 UFC / mL(reportar el
50,000-100,000
100,000 ó más
número de UFC contado y especie bacteriana con su sensibilidad antimicrobiana. Se aisló ___, más de 100,000 UFC / mL infección urinaria verdadera, hacer antibiograma y reportar.
UROCULTIVOS Sembrar con Asa calibrada de 0.001 mL Agar sangre (carnero) Agar Mac Conkey Incubar 18 a 24 horas
Crecimiento
No Crecimiento
51
Recuentos mayores de 50,000 de un solo tipo de bacterias
Recuentos menores de 50,000 de un solo tipo de bacterias
Reporte Recuento de más de un tipo de bacterias
Recuento y cultivo negativo
Reporte
Identificar bacteria sensibilidad
Identificar bacteria
Reporte
Reporte
Recuento Bacteriano Sensibilidad
Crecimiento mixto. Pedir nueva muestra
Recuento y nombre de bacteria
DISCUSION 1- Muestra de orina. Obtención. Cantidad y procesamiento. 2- Detección de bacterias por la coloración de Gram en orina no centrifugada. Aplicación 3- Utilidad de usar agar sangre y agar Mac Conkey. 4- Cultivo. Inóculo. Uso del asa calibrada. Siembras en los medios de cultivo. 5- Uso del factor y reporte.
52
PRACTICA No. 7 LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Y OTROS LÍQUIDOS DE DERRAME. PROPÓSITO: Demostrar por medio de la tinción de Gram y el cultivo, la presencia de bacterias en estas muestras que normalmente deben ser líquidos estériles ya 53
que son tomadas por el médico que las solicita en condiciones quirurgicas estériles, por eso, todo microorganismo que se aisle es patógeno. Las bacterias de mayor importancia en el líquido cefalorraquídeo son: GRAMNEGATIVOS.
Neisseria meningitidis (causa meningitis meningococica severa)
Haemophilus influenzae (Meningitis en niños de 6 meses a 4 años de edad)
Escherichia coli y otras Enterobacterias (en pacientes inmunodeficientes)
Pseudomonas aeruginosa
GRAMPOSITIVOS:
Streptococcus pneumoniae (muy importante)
Staphyloccus aureus
Streptococcus sp
Streptococcus pyogenes.
OTROS MICROORGANISMOS IMPORTANTES:
Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum
Cryptococcus neoformans, Candida albicans
OBJETIVOS 1. Realizar el examen directo del Líquido cefalorraquideo, interpretar y hacer su reporte. 2. Identificar los medios de cultivo de utilidad para muestras de LCR y otros líquidos de derrarme, inocularlos e incubarlos en condiciones adecuadas. 3. Identificar las bacterias aisladas y reportar sus resultados. 4. Aislar e identificar hongos causantes de meningitis. 5. Procesar otros líquidos de derrame. MUESTRA:
54
Las muestras incluidas en los fluidos corporales son:
Líquido cefalorraquídeo
Líquido ventricular
Fluido abdominal (líquido peritoneal o ascítico)
Líquido pleural
Líquido pericardico
Líquido sinovial
Médula ósea.
Las muestras deben transportarse rápidamente al laboratorio y ser procesadas inmediatamente no después de 30 minutos de recolectados. Rotular con el nombre del paciente, número de registro, fecha y naturaleza de la muestra. Si el médico sospecha que la muestra puede contener bacilos alcohol ácido resistentes debe hacerlo saber en su solicitud al laboratorio. PROCEDIMIENTO: 1. El médico debe obtener la muestra (LCR o cualquier otro fluido corporal del cual desee examen completo). 2. Uno de los tubos no se centrífuga, enviarlo para que se le haga el citoquímico (recuento total de células) recuento diferencial (fórmula) y análisis químico. El otro tubo sirve para análisis microbiológico. 3. Centrifugar la muestra 15 minutos a alta velocidad. (2500-3000 RPM). Decantar asépticamente, tapar, agitar y procesar sólo el sedimento. 4. Sembrar una asada del sedimento en cada uno de estos medios: a. Agar sangre de carnero al 5% b. Agar chocolate c. Agar Mac Conkey d. Sabouraud (hongos) e. Tioglicolato f. Lowenstein-Jensen (solo si se investiga BAAR) 55
5. Diseminar por estrías en toda la superficie de los medios sólidos. Introducir el agar sangre de carnero y el agar chocolate en jarro húmedo con candela encendida. Incubar todos los medios a 36°C, excepto el sabouraud que se incuba a temperatura ambiente, para el aislamiento de hongos patógenos especialmente (Cryptococcus neoformans). 6. En porta-objetos nuevos o bien limpios con alcohol, hacer dos frotis pequeños (de aproximadamente un centímetro de diámetro) en el centro de la lámina. 7. Colorear un frotis con Gram y otro con Ziehl- Neelsen. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: Observa los frotis de sedimento de LCR con el objetivo de inmersión. En vista que del resultado de los frotis depende el tratamiento inmediato de pacientes con infección grave de las meninges, su observación debe hacerse con todo cuidado. Observar las siguientes morfologías: 1. Diplococos gram-negativos (rojos o rosados), arriñonados, dispuestos en parejas como granos de café, idénticos a N. gonorrhoeae de pus uretral: morfología
compatible
con
N.
meningitidis.
Dar
alerta
al
médico
inmediatamente. 2. Cocobacilos gram-negativos (rojo pálido) pleomorficos, con escasas formas bacilares: morfología compatible con H. Influenzae agente de meningitis en niños de 6 meses a 4 años. 3. Cocos gram-positivos (morados), lanceolados, ovalados, dispuestos en parejas o cadenas cortas, la cápsula se insinúa como halo claro alrededor de las bacterias: En LCR morfología compatible con Streptococcus pneumoníae.
56
4. Bacilos gram-negativos (rojos) de coloración sólida, no pleomorficos, bacilos alargados: morfología compatible con Enterobacterias o Pseudomonas (E. Coli, Salmonella sp, Pseudomonas aeruginosa). 5. Levaduras redondeadas. Algunas con gemaciones laterales, gram positivo se insinúa cápsula, hacer “tinta china”, para demostrar la presencia de levadura capsulada sugestiva de Cryptococcus neoformans. 6. En Zielh-Neelsen: bacilos alcohol-ácido resistente (rojos) cortos, algunos con coloración dispareja en forma de gránulos: morfología compatible con Mycobacterium tuberculosis. INFORME: El primer informe, entregar el mismo día de la obtención del muestra: Frotis de Gram: se observan morfología de bacterias, cantidad de leucocitos. Cultivo pendiente. El segundo informe; entregar el día que termina la identificación: Cultivo: se aísla: Nombre de la bacteria, género, especie más antibiograma.
L.C.R. Y LÍQUIDOS DE DERRAME
Agar sangre Agar chocolate Caldo, Tripticasa soya Gram Incubar 18 a 24 horas
57
Crecimiento
No crecimiento Reincubar 24 horas
más
Gram Identificar bacteria Sensibilidad
Crecimiento
Reporte
No crecimiento Reporte
Bacteria aislada
Gram
Sensibilidad
Subcultivo del caldo
Cultivo negativo a las 48 horas
Identificar bacteria Antibiograma Reporte
Se aislo: (Dar nombre de bacteria y sensibilidad
DISCUSIÓN 1- Muestra. Cantidad y procesamiento. 2- Frotis coloreado. Cuidados al hacerlo, importancia y significado clínico. 3- Diagnostico preliminar. 4- Medios de cultivo. 5- Aislamiento e identificación bacteriana. 6- Prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos. 7- Reporte definitivo.
58
PRACTICA Nº. 8 HEMOCULTIVO PROPÓSITO: El hemocultivo o cultivo de sangre, sirve para detectar las bacterias que se están reproduciendo en la sangre, lo que provoca septicemia. Cuando las bacterias se multiplican a una velocidad que excede la capacidad del sistema retículo-endotelial para removerlos de la sangre, ocurre la septicemia. Se
59
diferencia de la bacteremia, que es la presencia transitoria de bacterias en el torrente circulatorio. Usualmente causa septicemia una sola especie bacteriana. OBJETIVOS 1. Aprender la toma de sangre venosa en condiciones asépticas e inocularlas en los medios de cultivo apropiados. 2. Reconocer en forma macroscópica los signos visibles de crecimiento bacteriano de un hemocultivo positivo. 3. Conocer los medios de cultivo necesarios para la inoculación de muestras de sangre en el laboratorio, así como también los procedimientos efectuados para la identificación bacteriana. 4. Elaborar el reporte final en base a los microorganismos encontrados, si los hay. MUESTRA: Los síntomas del paciente que indican la necesidad de obtener un hemocultivo son: Aumento súbito del pulso y la temperatura, cambios sensoriales, escalofríos, postración y presión baja. Además la recuperación de las bacterias de la sangre depende de los siguientes factores. 1. Cantidad de sangre que se cultiva. En niños debe ser al menos 2.5 mL y en adultos usualmente 5 mL. 2. La relación entre la sangre y caldo de cultivo debe ser siempre 1:10 es decir sangre al diez por ciento en caldo, con el objeto de evitar coagulación. 3. La presencia de inhibidores bacterianos en el suero tales como anticuerpos, complemento o antibióticos. 4. La característica de la bacteria de ser “fastidiosa” es decir que requiere de un medio de cultivo enriquecido y complejo. 5. El hemocultivo debe obtenerse siempre antes de iniciar el tratamiento con antibióticos. 6. En algunos casos se justifica obtener varias muestras del paciente, en tiempo y sitios diferentes, es decir “seriado”. 60
INSTRUCCIONES PARA LA TOMA DE UN HEMOCULTIVO: 1. Destapar el frasco con caldo de hemocultivo, para descubrir el tapón de hule perforable. Dejar la tapadera a un lado y con un algodón empapado en solución de yodo al 3% y alcohol, limpiar bien el tapón perforable. Dejar secar mientras se atiende al paciente. 2. Colocar la ligadura en el brazo del paciente, luego palpar la vena y localizar con precisión el sitio donde se va a puncionar. 3. Lavar con agua y jabón el brazo del paciente, antes de aplicar desinfectante. Limpiar el sitio correcto con un algodón empapado en tintura de yodo al 3%. Dejar secar y luego limpiar el sitio de punción con un algodón empapado en alcohol, con movimientos circulares en forma de espiral que se inicia en el sitio de punción. 4. Con aguja y jeringa estériles, puncionar la vena y obtener asépticamente 5 mL o más de sangre. 5. Inyectar exactamente 5 mL de sangre en el frasco que contiene 45 mL de caldo o 10 mL en un frasco con 90 mL de caldo. En los hemocultivos pediátricos, inyectar 2.5 mL de sangre en 25 mL de caldo. 6. Agitar suavemente las botellas ya inoculadas e incubar a 36°C.
PROCEDIMIENTO: 1. Incubar los hemocultivos por siete días, excepto en casos especiales en los cuales debe prolongarse la incubación, por ejemplo para el aislamiento de Brucella spp. 2. Con mucho cuidado para que el caldo no se agite, examinar diariamente los frascos contra la luz, para buscar algunos de los siguientes signos visibles que indican crecimiento bacteriano, los cuales orientan hacia el tipo de bacteria que esta creciendo:
61
Signos Visible Turbidez
Posible Bacteria Bacilos Gramnegativos aerobios
Staphylococcus spp. Bacteroides spp. Estreptococcus spp. Staphylococcus spp
Hemólisis
Listeria spp Clostridium spp.
Formación De Gas Colonias Visibles Como “Motas de Algodón”
Formación De Película
Bacillus spp. Bacilos Gramnegativos aerobios Anaerobios Staphylococcus spp. Streptococcus Pseudomonas spp. Bacillus spp. Levaduras
Coloración Verdosa (Raro)
Pseudomonas aeruginosa
1. En caso de observar cualquiera de estas características, agitar suavemente, limpiar el tapón perforable con algodón y alcohol, puncionar con jeringa y aguja estéril, y aspirar una pequeña cantidad de caldo. Inocular una gota y luego estriar con asa sobre una caja de agar sangre y una caja de agar chocolate; incubar ambas en jarro con candela. Simultáneamente dejar secar dos gotas del caldo sobre un porta objetos, colorear con Gram.
2. Observar cuidadosamente el frotis coloreado por Gram con objetivo de inmersión, pues la observación de las bacterias es la base de su caracterización. Además, algunas bacterias como Haemophilus influenzae, 62
no producen signos visibles en el caldo si se observan bacilos o cocobacilos gram-negativos, inocular adicionalmente una caja de Agar Mac Conkey; incubar
aeróbicamente.
Esto
es
especialmente
importante
para
el
aislamiento o identificación de Salmonella typhi.
3. Si se observan cocos gram-positivos esféricos y con tendencia a agruparse en racimos, inocular una caja de agar manitol-sal, para facilitar el aislamiento e identificación de Staphylococcus aureus. Si se observan diplococos o cadenas cortas de cocos gram-positivo ovalados, aplicar los discos de optoquina y bacitracina sobre la segunda estría del agar sangre, para aclarar la identificación presuntiva de Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes.
4. Rutinariamente
revisar
los
hemocultivos
aparentemente
negativos.
Procederá así: hacer asépticamente un frotis de Gram del caldo a las 48 horas y también al séptimo día de incubación. La incubación prolongada puede producir una leve turbidez de fibrina.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: 1. Con siete días de incubación a 36°C se recupera el 95% de las bacterias clínicamente significativas. Si se observa en Mac Conkey el crecimiento de colonias lactosa-negativo sospechosas de Salmonella typhi, aglutinar inmediatamente el crecimiento en agar sangre con antisuero polivalente antisalmonella, anti-salmonella del grupo D y anti-antígeno Vi. Si hay aglutinación franca, reportar inmediatamente la presencia de salmonella typhi.
63
2. Algunas bacterias importantes en hemocultivos positivos, son las siguientes:
Salmonella typhi Escherichia coli Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Pseudomonas aeruginosa Haemophilus influenzae
3. Algunas bacterias que frecuentemente crecen en hemocultivos como contaminantes provenientes de la microbiota de la piel son:
Bacillus sp Corynebacterium sp.
INFORME: 1. Los hemocultivos deben reportarse como negativos si no se observan bacterias en el Segundo control por coloración de Gram, a los siete días de incubación, NUNCA ANTES. Reportar así: NEGATIVO A LOS SIETE DÍAS DE INCUBACIÓN A 36°C.
2. Si el hemocultivo presenta crecimiento a cualquier tiempo de incubación reporta cuanto antes la bacteria aislada, identificada si es posible, hasta 64
especie, aunque la identificación sea presuntiva. Reportar así: SE AISLÓ ____________________SUSCEPTIBILIDAD PENDIENTE.
3. En el caso del aislamiento e identificación de Streptococcus pneumoniae ó Streptococcus
pyogenes
de
hemocultivo,
Streptococcus________________,
se
reportar
recomienda
así:
SE
AISLO
tratamiento
con
penicilina. Sí se trata de S. pneumoniae, hacer la prueba de sensibilidad a la penicilina.
4. Después de interpretar
los resultados de la prueba de susceptibilidad
antimicrobiana, enviar otro reporte, así: Se aisló:__________________________________ Susceptible a:______________________________ Intermedio a:_______________________________ Resistente a: _______________________________
HEMOCULTIVOS Muestra N° 1 Muestra N° 2 5 mL de sangre 45 mL de medio Incubar 24 horas Sub-cultivo en agar chocolate y hacer coloración de Gram 65
Subcultivo y Gram positivo
Subcultivo y Gram negativo Incubar
Identificar bacteria Sensibilidad
Observar diariamente
Reporte Bacteria Sensibilidad
7° día hacer Subcultivo en agar chocolate y Gram
Cultivo negativo al 6° día de incubación
DISCUSION 1- Obtención de la muestra 2- Medios de cultivo utilizados e incubación 3- Elaboración del reporte preliminar 4- Resultado Final 5- Resultado del antibiograma
66
PRACTICA N0.9 IDENTIFICACION DE MICOBACTERIAS Este grupo de bacterias en forma de bacilos, se tiñen con dificultad por el alto contenido de grasa en su pared celular. Para lograr teñirlas deben usarse coloraciones con fenol y calor. Una vez teñidas con fucsina carbólica, no se decoloran con alcohol acidificado. Por esta característica muy particular se les llama “BACILOS ALCOHOL-ÁCIDO RESISTENTES”. Las mycobacterias son aerobios estrictos, no móviles, no poseen cápsula no producen esporas. Su crecimiento es sumamente lento, la mayoría de especies patógenas crecen después de 2 a 6 semanas de incubación a 36°C en el medio de Lowenstein-Jensen. Aproximadamente 12 especies de Mycobacterium se
67
asocian con enfermedad , en nuestro medio, sin lugar a duda,
M. tuberculosis
es la especie más importante PROPOSITO. Demostrar por medio de coloración y cultivos especiales la presencia de bacterias
pertenecientes
al
género
Mycobacterium,
especialmente
Mycobacterium tuberculosis. OBJETIVOS 1-Conocer las técnicas de laboratorio útiles para la identificación de M. tuberculosis. 2-Conocer las tinciones utilizadas para la identificación presuntiva de M. tuberculosis. MUESTRAS. 1. Esputo: Es la muestra que con mayor frecuencia se remite al laboratorio para la investigación de tuberculosis.
El esputo debe colectarse temprano en la mañana, inmediatamente al despertar. De preferencia tres a cuatro muestras (seriadas) en días alternos.
El primer esputo de la mañana es la más adecuada para el análisis, pues es más concentrada y menos contaminada.
Colectar la muestra antes de iniciar tratamiento. Indicar al paciente que al despertar se enjuague la boca dos veces con agua corriente, no debe de usar pasta dental o cualquier otro antiséptico.
El paciente debe depositar la muestra en un recipiente estéril de boca ancha.
El paciente que tiene dificultad para producir esputo puede usar estos métodos:
68
b) Nebulización de solución salina hipertónica (cloruro de sodio al 10%, sin propilenglicol), es excelente para inducir la producción de esputo, generalmente diluido. c) Los hisopos faríngeos pueden ser usados en estos pacientes para extraer el esputo. Especialmente este procedimiento es aconsejable para niños pequeños a los cuales no se les pude pedir una muestra adecuada. d) Broncoscopía:
Puede
ser
usada
para
obtener
las
muestras
directamente del sitio infectado. 2. Lavado gástrico: Frecuentemente se solicita lavado gástrico para análisis de micobacterias. No se usa para detectar tuberculosis del estómago, sirve para demostrar micobacterias del esputo que el paciente involuntariamente se ha tragado. 3. Orina: Se debe examinar un mínimo de tres muestras de la PRIMERA ORINA DE LA MAÑANA colectar a “medio chorro” en un recipiente estéril de boca ancha. 4. Otro tipo de Muestra:
Lavado bronquial Fragmentos de pulmón Hisopado faríngeo Líquido cefalorraquídeo Líquido pleural Líquido articular Pus Raspado endometrial (sangre menstrual) Médula ósea
69
Líquido pericardico Trozos de tejido de biopsias.
PROCEDIMIENTO: El diagnóstico de Micobacterias se basa en la observación de los bacilos alcohol-ácido resistentes en la muestra y su cultivo IN VITRO. Los bacilos alcohol-ácido resistentes deben teñirse con las coloraciones de Zielh-Neelsen o Kinyoun. Ambas técnicas dan buen resultado.
COLORACIÓN DE KINYOUN: Tiene la ventaja de que no necesita calentamiento. Proceder así: 1. Preparar el frotis de igual forma que para Zielh-Neelsen y fijarlo con calor. 2. Colocar la lámina en la gradilla de coloración y dejar que enfríe. Cubrir el frotis con Fucsina de Kinyoun y dejar que se coloree por 4 minutos. No es necesario calentar. 3. Lavar con agua corriente 4. Decolorar el frotis con alcohol-ácido hasta que ya no salga más colorante rojo. 5. Lavar con agua corriente. 6. Cubrir el frotis con azul de metileno por 1 ó 2 minutos. 7. Lavar con agua corriente. 8. Dejar secar y examinar con lente de inmersión.
COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN: 1-Cubrir el frotis previamente fijado con fucsina fenicada por 5 minutos y calentar hasta la emisión de vapores. (No hervir). 2- Lavar con agua de chorro.
70
3- Decolorar con alcohol-ácido por 2 minutos. 4- Lavar con agua de chorro. 5- Cubrir el frotis con azúl de metileno por 1 minuto. 6- Lavar con agua de chorro y dejar secar.
INTERPRETACIÓN DE LA BACILOSCOPÍA: Número de Bacilos
Reporte
Alcohol-Ácido Resistente 0 1 a 2 en todo el frotis
No se observan bacilos Alcohol-Ácido Resistente Informar el número de BAAR encontrados y
3 a 9 en todo el frotis 10 ó más en todo el frotis 1 ó más por campo
pedir nueva muestra + ó escasos ++ ó regular cantidad +++ abundantes
CULTIVO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS. Antes de inocular los medios de cultivo para la identificación final de M. tuberculosis deben realizarse una serie de procedimientos para tener éxito en los aislamientos. Dentro de los procedimientos a realizar tenemos: A) Descontaminación B) Neutralización C) Centrifugación Luego de realizar estos procedimientos se procede a inocular los medios de cultivo apropiados. DISCUSION 1- Medios de cultivo utilizados en la identificación de Mycobacterias. 2- Tinciones utilizadas. Uso de cada colorante.
71
3- Reporte preliminar. 4- Baciloscopia. Ventajas, desventajas y utilidad clínica.
PRACTICA No. 10 CULTIVO DE GARGANTA. Debido a la gran ocurrencia de procesos infecciosos en el área faríngea, el estudio bacteriológico del exudado faríngeo es uno de los procedimientos que con mayor frecuencia se realizan en el laboratorio clínico. La flora aislada incluye cocos y bacilos, tanto Grampositivos como Gramnegativos además de encontrarse cierto número de levaduras. Para un estudio satisfactorio del exudado faríngeo es necesario tomar una adecuada muestra de la región de amígdalas y faringe. El cultivo se efectúa para demostrar la presencia de Sreptococcus pyogenes, Steptococcus agalactiae y otras especies del género Streptococcus. Otras bacterias que frecuentemente se pueden aislar en un cultivo de garganta son las siguientes: 72
Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Estos microorganismos solo se deben reportar si predominan sobre la microbiota normal. OBJETIVOS 1- Colectar muestras de exudado faríngeo en forma adecuada y cuando sea conveniente la estudie por la técnica del examen directo con la coloración de Gram y Azul de metileno. 2- Observar los microorganismos presentes en las preparaciones anteriores y determinar cuales pudieran ser patógenos de la faringe. Escribir el reporte correspondiente. 3- Inocular los medios de cultivo apropiados con las muestras colectadas de sus compañeros. 4- identificar los posibles microorganismos patógenos aislados en los medios de cultivo y realizar pruebas especiales para su identificación. MUESTRA: La muestra debe tomarse siempre antes de iniciar algún tratamiento con antibióticos. Además si el paciente ya comió se recomienda dejar pasar unas dos horas para que se vuelva a formar la secreción deglutida.
73
Localizar el fondo de la garganta y en las amígdalas (que se encuentran a los lados), observar las siguientes lesiones:
Inflamación (Enrojecimiento)
Pus (secreción blanquecina o amarillenta)
Úlceras blanquecinas.
Con un hisopo estéril frotar firmemente las lesiones con sumo cuidado de no tocar la lengua, la campanilla, la pared interna de los carrillos, labios y dientes al retirar el hisopo.
PROCEDIMIENTO: 1. Inocular inmediatamente una caja (placa) de agar sangre al 5%, hacer dos cortadas en el agar durante la siembra. Las cortadas deben ser aproximadamente de 1 cm de largo y el asa debe llegar al fondo de la caja. El propósito de las cortadas es introducir las bacterias dentro del agar para alejarlos del oxígeno atmosférico y así incrementar la hemólisis tipo beta. 2. Con el objeto de obtener cultivos evidentes de Streptococcus pyogenes, sin necesidad de hacer sub-cultivos proceder así: Con pinza flameada y fría, colocar en la zona de más fuerte inoculación en el agar sangre de carnero (primera estría), un disco de 30 mcg de neomicina. A unos 8 –10 mm de distancia, colocar un disco de 0.04 unidades de bacitracina. Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae son resistentes al antibiótico neomicina, por lo que crecen en cultivos casi puro alrededor de éste disco. 3. Introducir la caja en un frasco de vidrio de boca ancha, poner en el fondo una toalla de papel húmeda, colocar la caja con el medio y luego introducir una candela corta y encendida, cerrar el frasco. La candela se apagará sola. 4. Incubar por 18 a 24 horas a 36°C
74
INTERPRETACIÓN. Para interpretar correctamente los crecimientos de los cultivos de exudados faríngeos, tomar en cuenta lo siguiente: Tipo de Hemólisis ALFA
Apariencia del Halo Verde (Incompleta)
BETA
Claro, del color del medio (Completa ) REPORTE
Inhibición por Bacitracina + (Si produce halo)
Reportar Se aisló Streptococcus pyogenes beta hemolítico
del
grupo
“A”
de
Lancefield - (No inhibición)
Streptococcus sp. beta hemolítico no del grupo “A” de Lancefield
DISCUSION 1- Reporte preliminar 2- Toma de muestra. 3- Cultivo. Medios utilizados. Inoculación. Lectura e interpretación. 4- Subcultivo. Identificación. Antibiograma. 5- Reporte final.
75
PRACTICA No.11 SECRECIONES GENITALES PROPÓSITO: Demostrar la presencia de microorganismos de varios tipos bacterianos que infectan los órganos genitales femeninos y masculinos, tales como:
Neisseria gonorrhoeae: Bacteria, causante de la gonorrea.
Garnerella vaginalis: Bacilo gramnegativo causante de la vaginosis.
Treponema pallidum: Bacteria causante de la sífilis.
Candida albicans: Hongo levaduriforme, causante de la vulvovaginitis.
Trichomonas vaginalis: Protozoo, causante de tricomoniasis vaginal.
OBJETIVOS
76
1. Realizar el examen directo de la secreción uretral utilizando la coloración de Gram. 2. Elaborar el reporte preliminar. 3. Cultivar la muestra en los medios de cultivo adecuados y seguir la marcha bacteriológica correspondiente para la identificación del microorganismo causante de la infección. 4. Realizar la prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos. 5. Elaborar el reporte final.
LA TOMA DE LA MUESTRA HOMBRES: 1. Tener listo: hisopos estériles, porta-objetos limpios, agar sangre y agar Thayer –Martin. 2. Con el hisopo estéril tomar una gota de la secreción. 3. Preparar cuidadosamente un frotis delgado sobre el porta objetos, haciendo rodar el palillo sobre la lámina, no frotar 4. Simultáneamente inocular los medios sólidos (agares) MUJERES: 1. En las mujeres la muestra la debe obtener el ginecólogo. Tener listo el mismo material que en el caso de los hombres. 2. Hacer el mismo procedimiento. PROCEDIMIENTO: 1. Colorear los frotis con coloración para Gram. 2. Con asas flameadas y frías, diseminar por estrías el inoculo sobre la superficie de las placas. 3. Incubar el agar sangre y el de Thayer –Martín durante 24 a 48 horas a 36°C en jarro húmedo con candela encendida.
77
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: GRAM: Buscar diplococos adosados en forma de granos de café y Gramnegativos (rojos). Anotar si se encuentran intracelularmente, dentro de los leucocitos polimorfonucleares o fuera de ellos (extracelular.)
CULTIVO: Después de 24 a 48 horas de incubación a 36°C en jarro con candela, examinar el Thayer –Martín, ya que este contiene sustancias enriquecidas que favorecen el crecimiento de Neisseria gonorreae. Efectuar la prueba de oxidasa para verificar género. La prueba de oxidasa puede efectuarse aplicando directamente el reactivo líquido al cultivo o sobre discos de papel filtro ya impregnado con el reactivo. Luego identificar la especie Neisseria gonorreae por medio de la prueba de oxidación de tres azúcares (CTA): maltosa, glucosa y sacarosa (sucrosa). DISCUSION 1- Toma de muestra. 2- Diagnostico preliminar. 3- Medio de cultivo. Composición. Incubación. 4- Interpretación del cultivo 5- Pruebas bioquímicas utilizadas. 6- Prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos. 7- Reporte final.
78
SECRECIONES
Agar Sangre Agar Chocolate Agar Mac Conkey Tioglicolato Gram
Incubar de 18 a 24 horas
Crecimiento
Gram Identificar bacteria Sensibilidad
No crecimiento Reincubar 24 horas más
Crecimiento en placas ó en subcultivos de caldo
No crecimiento Reporte 79
Reporte Bacteria aislada Sensibilidad
Cultivo negativo a las 48Gram horas de Identificar bacteria incubación Sensibilidad
Reporte nombre de bacteria y sensibilidad
BIBLIOGRAFÍA Gustavo A. Gini Q.B. “Manual de Procedimientos para la Identificación de las bacterias con importancia clínica”, Segunda Edición, Guatemala 1995.
Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social. Unidad de Laboratorio “Manual Normativo, toma, manejo y envió de muestras para análisis de laboratorio”. Páginas 1-11, San Salvador. El Salvador 1995.
Miguel Francisco Torres. “Manual Práctico de Bacteriología Médica”. Segunda Edición. Páginas 41-189, Guatemala 1999.
Giuseppe Nicoletti, Vito Nicolosi “Diccionario de Bacteriología Humana” Centro Documentación Científica Menarini Barcelona 1990.
80
Hospital Nacional de Niños Benjamín Bloom. “Manual de Técnicas de Microbiología” Pág. 1-44. San Salvador, El Salvador 1996.
Koneman/ Allen/ Dowell/ Janda y otros. Texto y Atlas, Diagnostico Microbiológico. 4ta Edición. Editorial Médica Panamericana.
Anexos
81
Anexo 1 Coloraciones COLORACIÓN DE GRAM. 1. Hacer un frotis. 2. Fijar el frotis con calor y dejar enfriar. 3. Cubrir el frotis con cristal violeta por 1 minuto. 4. Lavar con agua de chorro, eliminar el exceso de agua 5. Cubrir el frotis con lugol para Gram por 1 minuto. 6. Lavar con agua de chorro. 7. Decolorar con alcohol acetona por 20-30 segundos. 8. Lavar con agua de chorro. 9. Cubrir con safranina el frotis por 30 segundos. 10. Lavar con agua de chorro. Dejar secar al aire y observar al microscopio con objetivo 100x. INTERPRETACION
Bacterias Gramnegativas: Color rojo o rosado.
Bacterias Grampositivas: Color violeta oscuro.
82
TINCION DE ALCOHOL ÁCIDO RESISTENTE. (Ziehl- Neelsen). Esta es una tinción diferencial que permite distinguir entre algunas bacterias que por su alto contenido de sustancias lipídicas o céreas se tiñen con dificultad por los procedimientos usuales; sin embargo, una vez teñidas resisten el colorante aún cuando se les lave con una mezcla de alcohol- ácido clorhídrico. Esta tinción es importante para distinguir, entre otras las bacterias ácido resistentes causantes de la tuberculosis y la lepra. (Mycobacterium sp). Existen varias técnicas para este tipo de tinción, sin embargo nos referimos a la de Ziehl- Neelsen. REACTIVOS: 1. CARBOLFUCSINA: Fucsina básica...................................... 0.3 g Etanol 95°C........................................... 10.0mL Cristales de fenol fundidos por calor...... 5. 0mL Agua destilada....................................... 95.0mL Disuelva la fucsina básica en el alcohol y el fenol en el agua. Mezcle las dos soluciones y deje en reposo por una semana antes de usar. Almacene en frascos ámbar a temperatura ambiente. 2. ALCOHOL- ÁCIDO: Etanol 95°C.............................................97.0mL Ácido clorhídrico concentrado................ 3.0mL Agregue el HCL al alcohol, homogenice y almacene en frascos a temperatura ambiente. 3. AZUL DE METILENO:
83
Azul de metileno.................................... 0.3 g Agua destilada....................................... 100.0mL Disuelva el azul de metileno en el agua mediante agitación. Almacene en frascos ámbar a temperatura ambiente. FILTRE LOS COLORANTES AL MENOS UNA VEZ AL MES. PROCEDIMIENTO: 1.
Prepare un frotis adecuado de la muestra a estudiar.
2. Cubra la lámina con CARBOLFUCSINA y caliente suavemente hasta que haya emisión de vapor. NO DEJE QUE EL COLORANTE HIERVA NI SE SEQUE. Agregue más carbolfucsina si es necesario. Mantenga la emisión de vapor durante 3-5 minutos. 3.
Lave la preparación con agua del grifo.
4.
Decolore con alcohol- ácido durante 2 minutos o hasta que queden sólo trazas de color rosado.
5.
Lave con agua del grifo
6. Aplique el colorante de contraste AZUL DE METILENO por un minuto. 7.
Lave con agua del grifo.
8.
Deje secar y observe con objetivo de inmersión.
RESULTADO: Bacterias alcohol- ácido resistentes: rojas. Bacterias alcohol- ácido sensibles: azules.
84
CONTROL DE CALIDAD: Utilice una mezcla de bacterias que contengan bacilos alcohol ácido resistentes (Mycobacterium sp.) y cocos alcohol- ácido sensibles (Staphylococcus sp.)
COLORACIÓN DE AZUL DE METILENO PARA MUESTRAS DE HECES. Es una coloración directa simple usada para diferenciar las características morfológicas de microorganismos y glóbulos blancos en materia fecal. Utilizado para diferenciación de glóbulos blancos en muestras de heces el procedimiento puede desarrollarse: Con un montaje húmedo (directo al fresco) o con frotis de heces que contengan leucocitos (el cual ha sido previamente fijado). PROCEDIMIENTOS PARA FROTIS FIJADOS. 1.
Hacer un frotis a partir de una muestra de heces dejar sacar al aire.
2. Fijar con metanol al 95% por 1-2 minutos dejar secar. 3. Cubrir la preparación con azul de metileno por 30-60 segundos. 4.
Lavar con agua. Dejar secar. Observar microscopio con objetivo 100x.
INTERPRETACIÓN.
85
En este caso se usa para diferenciar leucocitos fecales en enfermedades invasivas. Predominio de Neutrófilos: se asume que existe un proceso infeccioso de origen bacteriano. Predominio de Linfocitos: se asume que el proceso infeccioso es de origen viral. Elevado número de Eosinófilos: Se sospecha la presencia de parásitos o una enfermedad crónica.
REPORTE.
Contar 100 células y reportar: porcentaje de linfocitos y porcentaje de PMN.
Si están escasas las células reportar: solo el número de células encontradas sin reportar porcentaje. Ejemplo: 25 PMN, 2 Linfocitos.
Si no se observan células, reportar: 0% de linfocitos, 0% de PMN.
86
Anexo 2. Otras pruebas bacteriologicas PRUEBA DEL CORDÓN. En una lámina colocar unas gotas de desoxicolato de sodio al 0.5% y suspender las colonias bacterianas sospechosas. La mezcla se vuelve sumamente viscosa si es una bacteria del género Vibrio. Esta viscosidad se puede visualizar mejor si se sumerge dentro de la mezcla un asa. Al retirar el asa de la preparación se forma un cordón o hilo de mucosidad entre el asa y la mezcla.
PRUEBA DE LA COAGULASA. La coagulasa es una enzima que tiene la capacidad de convertir el fibrinógeno que está presente en el plasma humano o animal, en fibrina, lo cual se evidencia en el laboratorio por la formación de un coágulo visible. Esta prueba se usa para diferenciar Staphylococcus aureus que siempre produce esta enzima, de otras especies de Staphylococcus que no la producen.
87
La coagulasa está presente en las bacterias en dos formas: a) libre y b) unida a la pared de la bacteria. La coagulasa unidad a la pared se evidencia haciendo la prueba en lámina, y la coagulasa libre se determina haciendo la prueba en tubo. La prueba en lámina es presuntiva y a todos los cultivos que den la prueba débil o negativa se les debe hacer la prueba en tubo, porque algunas cepas de S. aureus sólo producen la coagulasa libre.
MEDIOS Y REACTIVOS. 1.
Plasma de conejo o plasma humano obtenido de sangre fresca estéril, no nitratada.
2.
Cloruro de calcio al 5%: Pese 5.0 gramos de Cloruro de calcio, deposite en un balón aforado de 100 mL y lleve con agua destilada hasta la marca de aforo.
3. Medio de cultivo: Cualquier medio sólido, libre de sal (NaCl) debe usarse para que crezca el microorganismo a probar.
PRUEBA EN LAMINA. 1.
Ponga una gota de solución salina estéril en un portaobjeto limpio.
2. Tome una asada del cultivo a probar. Debe tener 18 horas y haber crecido en un medio libre de sal. Haga con el asa una emulsión homogénea en la gota de solución salina. 3.
Agregue una gota de plasma a la suspensión de bacterias y mezcle.
4.
Observe si hay formación inmediata o no de un precipitado granular de coágulos blancos.
PRUEBA EN TUBO. 1.
Agregue asépticamente 0.5 mL de plasma a un tubo estéril 12 x 75 mm.
88
2.
Añada 0.5 mL de cultivo crecido en caldo infusión de cerebro y corazón o una asada de un cultivo crecido en un medio sólido.
3.
Incube el tubo en un baño María a 35°C.
LECTURA E INTERPRETACIÓN 1.
PRUEBA EN LAMINA:
PRUEBA POSITIVA: Formación de un precipitado granular dentro de un período de tiempo de 5 segundos a 1 minuto. Después de 1 minuto si aparece precipitado, monte la prueba en tubo.
PRUEBA NEGATIVA: Suspensión homogénea. Confirme el resultado con la prueba en tubo. 2.
PRUEBA EN TUBO:
Observe cada 30 minutos y si a las 4 horas está negativa, deje 24 horas en el baño María. PRUEBA POSITIVA: Cualquier indicio de coágulo. PRUEBA NEGATIVA: Suspensión permanece homogénea. CONTROL DE CALIDAD: a. Control de esterilidad del plasma: 24 horas a 35°C. b. Control de coagulación: Agregue una gota de solución de Cloruro de calcio al 5% a 0.5 mL de plasma. El plasma debe coagular en un periodo de 1 minuto.
89
c. Control positivo: S. aureus. d. Control negativo: S. epidermidis.
PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES: 1. Si se usa plasma citrato, agregue 5 unidades de heparina/ mL para eliminar falsos positivos en la prueba de la coagulasa, ya que microorganismos que utilizan citrato causan coagulación del plasma al consumirlo. 2. Si el cultivo a probar tiene más de 24 horas o es escaso se puede obtener una prueba de coagulasa débil.
3. Si una colonia no se suspende en la solución salina en la prueba en lámina, el resultado es imposible de interpretar. 4. No se deben emplear inóculos provenientes de medios con alta concentración de sal, ya que el cultivo autoaglutina en solución salina. 5. Cuando realice la prueba en tubo no agite el tubo para observar la formación de coágulo. Un falso negativo puede ocurrir debido a un rompimiento del coágulo inicial que no se formará de nuevo. 6. Es muy importante observar el tubo cada 30 minutos, ya que existen cepas de S. aureus que producen grandes cantidades de fibrinolisina, por lo que el coágulo se puede lisar antes de 4 horas e interpretar erróneamente el resultado como negativo.
90
7. Algunas cepas producen poca coagulasa, por lo que la formación del coágulo se evidencia hasta las 24 horas de incubación.
PRUEBA DE LA CATALASA. La catalasa, es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas. El peróxido de hidrógeno es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo de los carbohidratos y si se acumula es letal para el microorganismo. La catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente reacción: CATALASA H202
2H2O+O
Esta prueba es de vital importancia en la diferenciación de Streptococcus (catalasa negativa) y de los Staphylococcus (catalasa positiva).
91
REACTIVO Peróxido de hidrógeno al 3%: Se prepara con peróxido de hidrógeno y agua destilada. Este es un reactivo muy inestable que cuando se expone a la luz se descompone fácilmente. Debe almacenarse en refrigeración y en botella color ámbar. Además justo cuando se va a usar debe revisarse que dé bien con los controles de calidad. 1. PRUEBA EN LAMINA. a) Con una aguja bacteriológica o un aplicador estéril, pique el centro de una colonia bien aislada y transfiera el inóculo a un portaobjeto limpio. b) Añada 1 o 2 gotas de peróxido al 3%. c) Observe si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el reactivo. d) Descarte la lámina en un recipiente con desinfectante.
2. MÉTODO EN PLATO O TUBO CON AGAR. a) Añada unas gotas del peróxido de hidrogeno al 15% directamente sobre la superficie donde hay crecimiento. b) Observe si se forman o no burbujas de inmediato.
CONTROL DE CALIDAD.
a) Control positivo: Staphylococcus sp. b) Control negativo: Streptococcus sp. PRECAUCIONES. 1. El orden de la prueba en lámina no debe invertirse cuando se use asa de platino ya que puede dar un resultado falso positivo. El alambre de nihcrome no interfiere.
92
2. La prueba debe realizarse a cultivos de 18- 24 horas; cultivos más viejos pueden perder su actividad de catalasa dando una reacción falsa negativa.
3. El peróxido de hidrógeno es extremadamente cáustico por lo que se debe evitar que toque la piel ya que puede causar quemaduras dolorosas. En caso que ocurran, inunde de inmediato el área afectada con alcohol al 70% para neutralizar la acción. NO DEBE USAR AGUA.
PRUEBA DE OXIDASA. La enzima Oxidasa, conocida también como CITOCROMO O OXIDASA O INDOFENOL OXIDASA. Se encuentra presente en una gran variedad de seres vivientes entre los que incluyen bacterias hasta animales superiores. Su función es la de promover la oxidación del citocromo “c” a expensas del oxígeno molecular. En bacteriología se puede determinar su presencia al hacer reaccionar una población bacteriana con su sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil- pfenilendiamina y el resultado observado es la aparición de color que va del rosado al púrpura. Las siguientes reacciones ilustran lo anteriormente expuesto:
2 citocromos “c” reducidos + 2H* + ½ O2 CITOCROMO.c2 citocromo “c” oxidativos + H2O OXIDASA.
2 citocromos “c” reducidos + REACTIVO
COMPUESTO COLOREADO OXIDACIÓN
93
Esta prueba es sumamente importante en la identificación de bacterias Gram negativas y en la diferenciación de cocos Gram positivos de importancia clínica: Micrococcus (prueba positiva) y Staphylococcus (prueba negativa excepto S. Sciuri).
REACTIVOS.
I.
PARA GRAM NEGATIVOS.
1. REACTIVO DE KOVAC Tetrametil P- fenilendiamina dihidrocloruro....................... 0.1 g Agua destilada................................................................... 10 mL. Agregue agua al tetrametil – p- fenilendiamina y disuélvalo. Si es necesario caliente lentamente para lograr la disolución completa. Este reactivo debe ser incoloro o mostrar un tono rosado sumamente leve. Si presenta otro aspecto, descártelo; es poco estable y se oxida rápidamente, de tal forma que debe prepararse justo antes de usarlo. De los reactivos empleados para detectar OXIDASA, este es el MÁS SENSIBLE. 2. REACTIVO DE GORDON Y McLEOD: Dimetil – p- fenilendiamina monohidrocloruro...................0.1 g Agua destilada...................................................................10 mL Agregue el agua al dimetil –p- fenilendiamina y disuélvalo. Si es necesario, caliente lentamente para lograr la disolución completa. Este reactivo debe presentar un tono lila muy tenue. Si presenta otro aspecto, descártelo. Es más estable que el reactivo de Kovac pero MENOS SENSIBLE. Debe prepararse justo antes de usarlo.
II.
PARA COCOS GRAM POSITIVOS. 94
1. REACTIVO DE FALLER Y SCHLEIFER: Tetrametil – p- fenilendiamina dihidrocloruro...................0.6g Dimetilsulfóxido.................................................................10 mL. Agregue el dimetilsulfóxido al tetramil- p- fenilendiamina y disuélvalo. Este reactivo presenta un tono lila suave, es muy sensible. Almacénelo en botellas color ámbar.
Si el reactivo presenta otro color,
DESCARTELO.
PROCEDIMIENTO I.
PARA GRAM NEGATIVOS
A. TIRAS DE PAPEL A partir de un cultivo de 18-24 horas, tome un inóculo denso con asa de platino o palillo de madera estériles y deposítelo sobre una tirilla de papel filtro impregnada con el reactivo para oxidasa
B. PRUEBA DIRECTA EN PLACA. Inunde las colonias en estudio en la placa con el reactivo para oxidasa.
II.
PARA COCOS GRAM POSITIVOS.
A partir de un agar incubado a 36°C por 18-24 horas en atmósfera aerobia tome una asada del cultivo y espárzala en una tira de papel filtro. Agregue 1 gota del reactivo de Faller y Schleifer.
LECTURA E INTERPRETACIÓN: a) REACTIVO DE KOVAC: Se debe hacer la lectura en un período de hasta 10 segundos.
95
b) REACTIVO DE GORDON Y McLEOD: Se debe de leer en un período de hasta 30 minutos. c) REACTIVO DE FALLER Y SCHLEIFER: Se debe leer en un período de hasta 2 minutos.
PRUEBA POSITIVA: Aparición de color púrpura en el tiempo estipulado PRUEBA NEGATIVA: No aparición de color púrpura en el período señalado.
CONTROL DE CALIDAD: a) Control positivo para: Gram negativos: Aeromonas hydrophila. Pseudomonas aeruginosa. Gram positivos: Micrococcus sp.
b) Control negativo para: Gram negativos: Escherichia coli Gram positivos: Staphylococcus aureus.
PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES: 96
1.
La cristalería empleada para preparar y almacenar los reactivos para oxidasa debe ser lavada escrupulosamente para eliminar restos de materia orgánica, ya que ésta contribuye a oxidar el reactivo.
2.
No realice la prueba de oxidasa a colonias bacterianas crecidas en medios que contengan glucosa, ya que su fermentación inhibe la actividad de la enzima y ocasiona falsos negativos.
3.
La prueba debe realizarse únicamente a colonias provenientes de medios no selectivos y no diferenciales.
4.
Para la prueba no debe utilizarse el asa corriente (NIHCROME) dado que ésta, por las trazas de hierro que deja, puede inducir la oxidación del reactivo y dar falsos positivos.
5. La reacción debe observarse ÚNICAMENTE en la colonia y no alrededor de ésta. 6.
El dimetil- p- fenilendiamina es menos sensible y las colonias viscosas (mucosas) pueden aparecer como oxidasa negativas por la poca penetración del reactivo.
97
Anexo 3. PROCEDIMIENTOS BACTERIOLÓGICOS PARA LA INOCULACIÓN O INTERPRETACIÓN DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS. 1. AGAR HIERRO TRES AZUCARES (TSI). A partir de una colonia pura y bien aislada, tomar una asada, utilizando el asa en punta. Picar el medio hasta el fondo solamente una vez y luego estriar el “Bisel”. Incubar a 36°C. Por 18 a 24 horas. Interpretación de las reacciones en TSI: A- Utilización de los carbohidratos. 1.
Fermentación sólo de la glucosa: Bisel: alcalino (rojo), Fondo: ácido (amarillo).
2.
Fermentación de la glucosa y otro azúcar: Bisel: ácido (amarillo), Fondo: ácido (amarillo).
3.
Ninguno de los carbohidratos es fermentado: Bisel: alcalino (rojo), Fondo: alcalino (rojo).
98
B- Producción de gas. Positivo: Burbujas dentro del medio Rompimiento del medio Desplazamiento del medio hacia arriba. Negativo: No se produce lo anteriormente descrito en el medio.
C- Producción de H2S Positivo: Todo el fondo del tubo se observa negro, ó se produce un precipitado escaso, (se observa un color negro, entre el fondo y el bisel). Negativo: No se observa ningún precipitado negro.
2. LA UTILIZACIÓN DEL CITRATO.
99
Se inocula el medio sólido de Simmons a partir de un cultivo puro o colonia aislada, se estría únicamente el bisel. Incubar por 24-48 horas a 35- 36°C, en algunos casos puede requerirse una incubación de 4 días. INTERPRETACIÓN. Positivo: Crecimiento con viraje azul del indicador (Control: Citrobacter freundii). Negativo: No hay crecimiento ni cambio de color (Control: Escherichia colí ATCC 25922).
3. PRUEBA DE LA UREASA: Inocular el medio de urea (caldo o sólido) a partir de una colonia pura, el más utilizado es el Medio de Christensen, el cual se estría únicamente en el bisel. Incubar a 35°C, leer de 6 - 24 horas y dejar hasta 6 días si es necesario. INTERPRETACIÓN. Positivo: Color rosado intenso en el bisel (Control: Proteus mirabilis). Negativo: No hay cambio de color (amarillo) (Control: E. Colí ATCC 25922).
4. PRUEBA DE LA MOVILIDAD. Deben de inocularse dos tubos de agar movilidad a partir de un cultivo de 18-24 horas, utilizando para ello la aguja bacteriológica e introduciéndola en el centro hasta una profundidad de 1.5 cm. un tubo se incuba a 35°C por 2448 horas y el otro se mantiene durante el mismo período de tiempo a temperatura ambiente, por cuanto existen bacterias que presentan movilidad únicamente a temperatura ambiente. INTERPRETACIÓN
100
Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se observan los tubos inoculados comparándolos con un tubo sin inocular para determinar si la bacteria es móvil. Prueba positiva: Se observará migración de la bacteria a partir de la línea de inóculo que se manifiesta por la aparición de turbidez en el tubo. En bacterias no fermentadoras puede observarse esta misma migración pero a nivel de la superficie del medio. Prueba negativa: La bacteria crecerá solamente a lo largo de la línea de inoculación y el resto del tubo permanece sin turbidez.
CONTROL DE CALIDAD: a) Control de esterilidad: 24 horas a 35°C. b) Control positivo: Escherichia colí y Pseudomonas sp. c) Control negativo: Klebsiella sp.
5. PRUEBA DE INDOL. Inocular el microorganismo en un caldo o medio semisólido que contenga triptófano. Incubar a 36°C por 24 horas. Agregar al medio cultivo 5 gotas del reactivo de Kovac y agitar suavemente. INTERPRETACIÓN Positivo: Color rojo en el anillo de interfase del reactivo con el medio. Negativo: No hay cambio de color y el reactivo queda amarillo Control positivo: E. Colí ATCC 225922. Control negativo: Enterobacter cloacae.
ROJO DE METILO Y VOGES – PROSKAUER
101
Inocular un tubo de caldo RM-VP con un cultivo puro o con una colonia bien aislada. Incubar por 18 a 24 horas a 36°C. INTERPRETACION ROJO DE METILO (RM). A partir del tubo incubado con el microorganismo pasar 2. 5 mL a otro tubo limpio. Agregar a éste 5 gotas del indicador rojo de metilo. Positivo: El indicador permanece rojo. Negativo: El indicador cambia a un color amarillo.
VOGES-PROSKAUER (VP): A los otros 2.5 mL del medio que quedaron del paso anterior, agregarles 6 gotas del reactivo de alfa- naftol ( α - naftol) y luego 2 gotas de KOH al 40%. Agitar fuertemente y luego dejar en reposo por 15 minutos.
Se
sugiere agitar de vez en cuando.
INTERPRETACION Positivo: Color rojo o rosado en el medio. Negativo: El medio no tiene color o es amarillo. Control positivo: Klebsiella pneumoniae. Control negativo: Escherichia Colí ATCC 25922.
102
TABLA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS.
BACTERIA
Proteus
BISEL
FONDO GAS
H2S
CITRATO UREA
INDOL MOVILIDAD
ROJO DE METILO
VOGESPROSKAUER
AóK
A
+
2-4+
+ó-
+
+
+
+
-
K
A
+
4+
+ ó (+)
+
-
+
+
-/+
K
A
+
-
-
+
+
+
-
K
A
-
+
+
+
+
-
K
A
-ó +w +
-ó+ 1/2 +
-
+
-
+
+
+
-
K
A
-
-
+
-
+
+
+
-
K
A
-
+
-
-
+
+
+
-
A
A
-
-
-
+
-
-A
+
-
A
A
-
-
-
+
+ó-
-A
+
-
Pseudomona s aeroginosa Pseudomona flurorecens Pseudomona s multophilia Pseudomona s cepacias
K
K
-
-
+
-
-
+
-
-
K
K
-
-
+
-
-
+
-
-
K
K
-
-
-
-
-
+
-
-
K
K
-
-
+ó-
-
-
+
-
-
Pseudomonas
K
K
-
-
+
-
-
+
-
-
vulgaris Proteus mirabilis Morganella morganii Proteus retgeri Providencia stuartii Providencia alkalifaciens Edwarciella torda Yersinia pseudoteberculosis Yersinia enterocolitica
pseudomollei
103
Pseudomona s mallei Pseudomona s stutzeri
K
K
-
-
+
-
-
-
-
-
K
K
-
-
-
-
-
-
-
-
Pseudomonas
K
K
-
+
-
-
-
+
-
-
K
K
-
-
+ó-
-
-
+ó-
-
-
K
K
-
-
+
-
-
+ó-
-
-
K
K
-
-
+
-
-
+
-
-
putrefaciens Alcaligenes fecales Alcaligenes odorans Alcaligenes Denitrificans
TABLA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS.
BACTERIA
BISEL
Escherichia colí A ó K Escherichia colí K – Alcalescens dispar Shigella K dysenteriae Shigella K flexneri Shigella boydii K Shigella sennei K Salmonella sp. K Salmonella K Typha Salmonella K paratyphi A Salmonella d arizonae Arizona sp. KóA Citrobacter A intermedius Citrobacter KóA freundii Klebsiella A pneumoniae Klebsiella K ozonae Klebsiella K rhinoschleronal is Enterobacter A cloacae Enterobacter A aerogenes Enterobacter K hafnae Enterobacter AóK agglomerans
A A
+ó-
-
-
-
+ +
-ó+ -
ROJO DE METILO + +
A
-
-
-
-
d
-
+
-
A
-
-**
-
-
d
-
+
-
A A A A
d -
-*** D +w
-
-
d -
+ +
+ + + +
-
A
+
-
+
+
-
+
+
-
A
+
+
-
-
-
+
-
-
A A
+ +
2-4+ -
+ +
d
+
+ +
+ +
-
A
+
2-4+
+
(+)
-
+
+
-
A
+
-
+
+
-
-
-
+
A
+
-
D
d
-
-
+
-
A
-
-
-
-
-
-
+
-
A
+
-
+
+
-
+
-
+
A
+
-
+
-
-
+
-
+
A
+
-
+ó-
-
-
+
-
-
A
-ó+
-
+ó-
- ó +s
-ó+
+
-/+
+/-
FONDO
GAS H2S
CITRATO
UREA
INDOL
MOVILIDAD
VOGESPROSKAUER
-
104
NOMENCLATURA. D = Diferentes tipos de bioquímicas. **= Algunas S. Flexneri serotipo 6 producen. ***= Serotipos 13 y 14 son gas+ W = reacción débil. (+) = positivo lento ó tardío. S = débil A – ácido - negativo. Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas fluorecens Pseudomonas multophilia. Pseudomonas cepacia. Pseudomonas pseudomallei Pseudomonas mallei Pseudomonas stutzeri Pseudomonas putrefaciens.
Oxidasa positiva Oxidasa positiva Oxidasa positiva Oxidasa positiva Oxidasa positiva Oxidasa positiva Oxidasa positiva Oxidasa positiva
BIBLIOGRAFIA
105
Microbiologia Médica Jawetz, Brooks, Geo 1997, Manual Moderno, Mexico 15ª Edición. Tecnología y Métodos de Lab. Clínico, González de Butriago, José, 1990 Editorial Salvat, México 1ª Edición. Microbiología e Inmunologia, Levison Warren, Manual
Moderno,
México 2ª Edición, 1998. Microbiología Médica de Divo, Carmona Osvaldo, Editorial McGraw
Hill,
Caracas 5ta. Edición 1997. Microbiología. Brock Thomas, Prentice Hill, México, 4ta Edición 1987. Microbiología Zinsser, Jolik, Walfgang K, Editorial Medica
Panamericana,
Buenos Aires, 20ª Edición 1997. Diagnóstico y Tratamiento para el Laboratorio, Henry- John
Bernard,
Masson S.A., España 9ª edición, 1993. Microbiología y Parasitología, Romero Cabello Raúl y otros,
Medica
Panamericana, México, 2ª edición, 1993. Laboratorio Clínico. Microbiología, Delgado Iribarren, Alberto,
Mc
Graw Hill, Madrid, 1ª edición, 1994. Prevención de enfermedades Nosocomiales OMS, 2003,
Ginebra,
2ª
edición. NAR/aa
106
