UNIVERSIDADE DE FRANCA FERNANDA DINIZ DE SOUSA
RELATÓRIOS AULAS PRÁTICAS
Trabalho Trabalho apresentado a Universidade de Franca, para a matéria de Bacteriologia Geral, de todas as aulas práticas feitas Prof. Dr. arlos !enri"ue G. #artins
FRANCA 2015
P á g i n a $ 2
Sumário COLORAÇÃO DE GRAM................ ........ ................ ................ ................ ............. ......... ........ ........ ........ ........ ...... 5 INTRODUÇÃO...................................................................................5 OBJETIVO.......................................................................................5 MATERIAIS E REAGENTES....................................................................5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL............................................................5 RESULTADO .....................................................................................5 CONCLUSÃO....................................................................................6 COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN ZIEHL-NEEL SEN............... ........ ............... ................ ............. ......... ........ ........ ........ .... 6 INTRODUÇÃO...................................................................................6 OBJETIVO.......................................................................................6 MATERIAIS E REAGENTES....................................................................6 PROCEDIMENTOS..............................................................................6 RESULTADO.....................................................................................7 CONCLUSÃO....................................................................................7 COLORAÇÃO DE PAREDE (MÉTODO ( MÉTODO DE ROBINO! ROBI NO! ........... ....... ........ ........ ........ ........ .... 7 INTRODUÇÃO...................................................................................7 OBJETIVO.......................................................................................7 MATERIAIS E REAGENTES....................................................................7 PROCEDIMENTOS..............................................................................7 RESULTADO....................................................................................." CONCLUSÃO...................................................................................." MÉTODO MÉT ODO DE IMPREGNA IMPR EGNAÇÃO ÇÃO PELA PE LA PRATA (#ONTANA TRIBOM TR IBOMDEAU! DEAU! . ." INTRODUÇÃO..................................................................................." OBJETIVO......................................................................................." MATERIAIS E REAGENTES...................................................................." PROCEDIMENTOS.............................................................................." RESULTADO.....................................................................................$ CONCLUSÃO....................................................................................$ COLORAÇÃO DE ESPOROS (MÉTODO DE IRTZ! I RTZ!................ ........ ................ .............. ...... $ INTRODUÇÃO...................................................................................$ OBJETIVO.......................................................................................$ MATERIAIS E REAGENTES....................................................................$ PROCEDIMENTOS..............................................................................$ RESULTADO...................................................................................%& CONCLUSÃO..................................................................................%& COLORAÇÃO DE C'PSULA (MÉTODO (MÉTO DO DE JH!........ .... ........ ........ ........ ........ ........ ....... ...... ... %&
P á g i n a $ 3
INTROCUÇÃO.................................................................................%& OBJETIVO.....................................................................................%& MATERIAIS E REAGENTES..................................................................%& PROCEDIMENTOS............................................................................%& RESULTADO...................................................................................%& CONCLUSÃO..................................................................................%& INTRODUÇÃO.................................................................................%% OBJETIVO.....................................................................................%% #EZES E URINA........................................................................... %% MATERIAIS E REAGENTES..................................................................%% PROCEDIMENTO..............................................................................%% RESULTADO...................................................................................% CONCLUSÃO..................................................................................% SEMEADURA DE BACTÉRIAS EM DI#ERENTES CONDIÇ)ES DE CULTURA E INCUBAÇÃO. .............................................................. % INTRODUÇÃO.................................................................................% OBJETIVO.....................................................................................% MATERIAIS E REAGENTES..................................................................% PROCEDIMENTOS............................................................................%* RESULTADO...................................................................................%* CONCLUSÃO..................................................................................%* IDENTI#ICAÇÃO BACTERIANA DA #AM+LIA
ENTEROBACTERIACEAE.
.%*
INTRODUÇÃO.................................................................................%* OBJETIVO.....................................................................................%* MATERIAIS E REAGENTES..................................................................%* PROCEDIMENTO..............................................................................%, RESULTADO...................................................................................%, CONCLUSÃO..................................................................................%5 IDENTI#ICAÇÃO DE COCOS GRAM POSITIVO .................................. %5 INTRODUÇÃO.................................................................................%5 OBJETIVO.....................................................................................%5 MATERIAIS E REAGENTES..................................................................%5 PROCEDIMENTO..............................................................................%6 RESULTADO...................................................................................%6 CONCLUSÃO..................................................................................%6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE AGENTES #+SICOS E U+MICOS .................................................................................. %7 INTRODUÇÃO.................................................................................%7 OBJETIVO.....................................................................................%7 MATERIAIS E REAGENTES..................................................................%7
P á g i n a $ 4
PROCEDIMENTO..............................................................................%7 RESULTADO...................................................................................%" CONCLUSÃO..................................................................................%" ANTIBIOGRAMA DISCO DI#USÃO ................................................ %" INTRODUÇÃO.................................................................................%" OBJETIVO.....................................................................................%$ MATERIAIS E REAGENTES..................................................................%$ PROCEDIMENTOS............................................................................%$ RESULTADO...................................................................................%$ CONCLUSÃO..................................................................................& TESTES DE SENSIBILIDADE DOS ANTIMICROBIANOS...................... & INTRODUÇÃO.................................................................................& OBJETIVOS ....................................................................................& MATERIAIS E REAGENTES..................................................................& PROCEDIMENTO..............................................................................% RESULTADOS.................................................................................% CONCLUSÃO..................................................................................% CONJUNÇÃO BACTERIANA ........................................................... % INTRODUÇÃO.................................................................................% OBJETIVO.....................................................................................% MATERIAIS....................................................................................% PROCEDIMENTOS............................................................................ RESULTADO................................................................................... CONCLUSÃO.................................................................................. RE#ER/NCIAS BIBLIOGR'#ICAS ................................................... *
P á g i n a $ 5
Colorações: Coloração de Gram Introdução % colora&'o de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o médico dinamar"u(s !ans ristian )oa"uim Gram. *m +-, Gram observou "ue as bactérias ad"uiriram cores diferentes, "uando tratadas com diferentes corantes. sso permitiu classificá/las em dois grupos distintos0 as "ue ficavam ro1as, "ue foram chamadas de Gram/positivas, e as "ue ficavam vermelhas, chamadas de Gram/negativas. %p2s descri&'o do método, in3meras propostas de modifica&'o foram feitas. 4 método tintorial predominante utili5ado em bacteriologia é o método de Gram. % bacterioscopia, ap2s colora&'o pelo método de Gram com diagn2stico presuntivo, de triagem, ou até mesmo confirmat2rio em alguns casos, constituindo/se uma pe&a importante e fundamental. *ssa técnica é simples, rápida e tem capacidade de resolu&'o, permitindo o correto diagn2stico em cerca de 67 dos pacientes em caráter de pronto atendimento em n8vel local.
Objetivo 9aber identificar se a bactéria é Gram positiva ou Gram negativa, "ual o seu arran:o e a sua forma, a partir do microsc2pio 2ptico.
Materiais e Reagentes
;ioleta ;ugol =lcool/%cetona Fucsina
Procedimento !"erimental → → → → → → → → → →
Fa5er um esfrega&o fino, uma bactéria por lioleta ?corante básico@ A + minuto. *scorrer o e1cesso e cobrir a l
Resultado# Resultado L. casei
Forma Bacilo
Arranjo −
ram Positiva
D!a"n#$%!&o Pr'$(n%!)o
P á g i n a $ * S. aureus E. coli Yersinia sp. B. Megaterium
Neisseria sp. Streprococus mutans
ocos Bacilo Bacilo Bacilo
ocos cocos
acho de uva − −
*streptobacil o Diplococo adeia
Positiva Cegativa Cegativa Positiva
Gonococo #eningococo
Nisseria gonorrhoeae Nisseria meningitidis
Cegativa Positiva
Conclusão % reali5a&'o de identifica&'o de bactérias, através da colora&'o de Gram, permitiu/ se distinguir se era positivo ou negativo, com a:uda pela cor, Gram/negativa, vermelha e Gram/positiva, ro1a. onseguiu/se identificar a sua forma e arran:o.
Coloração de $ie%l&'eelsen Introdução % colora&'o de iehl/Ceelsen baseasse na capacidade de algumas bactérias ?microbactéria e actinomicetes@ resistirem aos métodos comuns de colora&'o devido E composi&'o altamente lip8dica da parede celular. %p2s um processo de colora&'o especial a "uente uma ve5 coradas n'o sofrem a&'o de descorantes fortes como solu&'o de álcool ácido. Desta forma, a fucsina de iehl cora todas as bactérias de vermelhos, e ap2s de descolora&'o com álcool/ácido somente os bacilos álcool/ácido resistentes ?B%%@ conservar'o está cor. para facilitar a visuali5a&'o cora/se o fundo com a5ul metileno, estabelecendoAse contraste n8tido entre elementos celulares e outras bactérias ?a5uis@ e os B%% ?vermelhos@.
Objetivo onseguir identificar as microbactérias, "ue s'o conhecidas como bacilos álcool/ ácido resistente ?B%%@.
Materiais e Reagentes
Placa de Petri com a bactéria ;
Procedimentos → → → →
Fa5er um esfrega&o com Mycobacterium sp. Fi1ar no calor orar com fucsina de iehl concentrada, a"uecendo cuidadosamente a l
P á g i n a $ + → → → →
;avar com água corrente, delicadamente. orar com uma solu&'o dilu8da de a5ul de metileno A 6 segundos ;avar com água corrente e secar. 4bserva em ob:etiva de imers'o.
Resultado ,ICRORANIS,O M. smugmatis
FOR,A Bacilo
ZIE-L.NEELSEN B%%
Conclusão % colora&'o de iehl Ceelsen foi reali5ada com sucesso, :á "ue conseguimos identificar a micobactéria, "ue é forma de bacilos e aparece sempre em rosa.
Coloração de Parede (M)todo de Robino*+ Introdução 4 método de obinoH I #urraJ reputado por seus autores como espec8fico para demonstrar a parede celular de bactérias, fornece contraste n8tido a essa estrutura "uando aplicado a bactérias Gram positivas. Todavia, em se tratando de bactérias Gram negativas, n'o se consegue resultados satisfat2rios por"ue todo o corpo bacteriano se torna corado. KnaJsi empregando um mordente preparado com ácido tit2ria ou >erde #ala"uita, e1ibiram, em bom contraste, a camada superficial.
Objetivo N conseguir corar a parede celular, "ue tem melhor resultado em uma bactéria Gram/Positiva, :á "ue sua parede celular é mais fina "ue a Gram/Cegativa.
Materiais e Reagentes
;ioleta de genciana =gua #icrosc2pio.
Procedimentos →
Fa5er um esfrega&o em l
P á g i n a $ / → → → → → → →
Dei1ar secar #ergulhar a l
Resultado a&%r!a B. megaterium
Forma Bacilo
Arranjo /
Conclusão % colora&'o de parede foi reali5ada com sucesso, pois conseguimos identificar a sua forma, bacilo, "ue é gram/positiva.
M)todo de Im"regnação "ela Prata (,ontana -ribomdeau+ Introdução Desenvolvido em +M6, n'o é um método de colora&'o verdadeiro. Ca realidade, trata/se de uma técnica de impregna&'o pela prata usada para au1iliar a visuali5a&'o de bactérias espiraladas, as "uais, geralmente, s'o muito finas e se coram de forma insuficiente pelo Gram ?e1.0 Treponema pallidum e ;eptospira interrogans@. % partir desta técnica, as espiro"uetas aparecem em cor marrom/ escura ou negra, sobre um fundo amarelo/castanho ou marrom/claro. %s espiro"uetas s'o bactérias presentes na placa bacteriana, "ue s'o facilmente reconhecidas. *las também s'o encontradas no cálculo dentário e nas bolsas periodontais. Podem ser visuali5adas através de vários métodos como o e1ame de campo escuro, colora&'o pelo Giemsa, esfrega&os com tinta da hina, demonstra&'o das espiro"uetas em corte. 9endo "ue na prática iremos utili5ar o método de Fontana/Tribondeau "ue será descrito mais detalhadamente E frente. %s espiro"uetas s'o divididas em duas fam8lias principais0 9pirochaetaceae e uma outra de import
Objetivo onseguir visuali5ar as espiro"uetas e identifica/las.
Materiais e Reagentes
;
P á g i n a $
Procedimentos → → → → → → → → →
om um palito de dente, colher amostras do sulco da gengiva dos dentes posteriores Fa5er um esfrega&o em l
Resultado Treponema sp.................................
espiro"uetas.
Conclusão % impregna&'o pela prata foi reali5ada com sucesso, :á "ue conseguimos identificar as espiro"uetas, visuali5adas na cor marrom/escura.
Coloração de s"oros (M)todo de .irt/+ Introdução % parede dos esporos constitui uma barreira efica5 contra a entrada e sa8da de materiais do esporo, mas por sua impermeabilidade, geralmente é refringente e de dif8cil colora&'o. % e1posi&'o prolongada ao corante verde mala"uita, associado ao a"uecimento, permite a penetra&'o do corante e a colora&'o do esporo por um verde intenso. omo contraste ?contracorante@, utili5a/se a safranina, "ue cora outras estruturas em vermelho, facilitando a diferencia&'o dos esporos. Um endosporo é uma estrutura especial resistente, dormente, formada dentro de uma célula "ue protege uma bactéria das condi&Les ambientais adversas. *mbora os endosporos se:am relativamente incomuns nas células bacterianas, podem ser formados por alguns g(neros de bactérias. 4s endosporos n'o podem ser corados pelos métodos comuns, como a colora&'o simples e a colora&'o de Gram, pois os corantes n'o penetram a parede do endosporo.
Objetivo 4 ob:etivo é conseguir distinguir o "ue s'o os esporos.
Materiais e Reagentes
;
B. megaterium
>erde #ala"uita %l&a de platina Bico de Bunsen Fogo =gua corrente 9afranina #icrosc2pio
P á g i n a $ 10
Procedimentos → → → → → → → →
Fa5er um esfrega&o fino de B. megaterium Dei1ar secar e fi1ar a l
Resultado 4s esporos foram corados de verde e as bactérias de vermelho, e os esporos s'o esféricos.
Conclusão % colora&'o de esporos foi um sucesso, :á "ue conseguiu ver os esporos e conseguir diferencia/los.
Coloração de Cá"sula (M)todo de 01+ Introcução #uitos micro/organismos cont(m um revestimento gelatinoso denominada cápsula. Ca microbiologia médica, a demonstra&'o da presen&a de uma cápsula é um modo de determinar a virul(ncia do organismo, o grau em "ue um pat2geno pode causar doen&a. % colora&'o da cápsula é mais dif8cil "ue outros tipos de procedimentos de colora&'o, pois os materiais capsulares s'o sol3veis em água e podem ser desalo:ados ou removidos durante uma lavagem rigorosa. Para demonstrar a presen&a de cápsulas, um microbiologista pode misturar as bactérias em uma solu&'o contendo uma fina suspens'o coloidal de part8culas coradas ?geralmente com tinta nan"uim ou nigrosina@, para fornecer um fundo contrastante e ent'o corar as bactérias com uma colora&'o simples, como a safranina. Devido E sua composi&'o "u8mica, as cápsulas n'o reagem com a maioria dos corantes, como a safranina, e desse modo aparecem como halos circundando cada célula bacteriana.
Objetivo 4 ob:etivo é conseguir visuali5ar as cápsulas.
Materiais e Reagentes
;
Klebsiella pneumoniae
*osina +7 #icrosc2pio
Procedimentos →
→
olocar + gota de fucsina +7 na l
P á g i n a $ 11 → → →
Fa5er o esfrega&o com au18lio de outra l
Resultado % cápsula é vis8vel na cor rosa e por dentro se v( em amarelo ou transparente.
Conclusão % colora&'o de cápsula foi um sucesso, pois foi fácil visuali5ar a cápsula, consegue se deferenciar.
-)cnica de Isolamento "or sgotamento: Introdução % maioria dos materiais infecciosos, como pus, escarro e urina, contém diversos tipos de bactériasQ da mesma forma "ue amostras de solo, água ou alimento. Ruando esses materiais s'o semeados na superf8cie de meio s2lido, as colOnias formam c2pias e1atas do organismo original. Uma colOnia vis8vel teoricamente vem de um 3nico esporo ou célula vegetativa ou de um grupo dos mesmos microrganismos :untos em agregados ou cadeias. %s colOnias microbianas fre"uentemente t(m apar(ncia diferente, o "ue permite distinguir um microrganismo do outro. %s bactérias devem ser espalhadas de maneira suficientemente ampla na placa para "ue as colOnias possam ser separadas umas das outras.
Objetivo >isuali5ar os crescimentos das bactérias e as divisLes das colOnias.
,e/es e 2rina Materiais e Reagentes
Fe5es Urina *scarro #eios de cultura0 Placa # #! ;*D %9 T9% =cido itrato 99 aldos T9% B! #! >B 9elenito #otilidade
o o o o o o o
o o o o o o
P á g i n a $ 12
%l&a de platina Bico de Bunsen Placa de Petri %gulha de prata
Procedimento → → → → →
Ca placa do meio de cultura de ;*D, se fa5 um risco com urina no meio e depois estreia/se a placa inteira. Cos meios de cultura na placa, fa5/se estrias com urina, fe5es ou escarro. omo a imagem a bai1o0 Co caldo de #otilidade, coloca/se a agulha com fe5es e1atamente no meio do tudo, sem tremer, n'o chegando até o final. Co caldo T9%, fa5/se estrias apenas na parte inclinada do tubo. Cos outros meios, com uma al&ada da amostra, homogene85a/se no caldo.
Resultado #eios0 # A urina A colOnia isolada #! A escarro A isolou ;*D A urina A ficou amarelo, + bactéria %9 A fe5es A isolou itrato A fe5es A n'o aconteceu nada, há presen&a de bactéria T9% A urina A uma colOnia 99 A fe5es A coliforme fecal, isolou em uma colOnia aldos0 T9% A fe5es A bactéria cresceu, tudo inclinado B! A urina A turvou, cresceu #! A fe5es A turvou, cresceu >B A fe5es A turvou, cresceu 9elenito A fe5es A turvou, cresceu #otilidade A fe5es A bactéria cresceu na parte superior.
Conclusão onseguimos visuali5ar as colOnias isoladas nas placas, e o crescimento das bactérias nos dois meios ?ágar e caldo@ com as amostras fornecidas.
Semeadura de 3act)rias em di4erentes condições de cultura e incubação# Introdução Técnica de solamento por esgotamento.
Objetivo >isuali5ar o crescimento das bactérias conforme a sua incuba&'o e o meio.
Materiais e Reagentes
Bactéria0 Yersinia sp %l&a de platina Bico de Bunsen #eios0
P á g i n a $ 13 =gar sangue =gar B! =gar *#B =gar ;*D =gar 99 =gar/=gar =gar #! =gar #itis/9alivarius ncuba&'o0 S aer2bia ?estufa bacteriol2gica@ #icroaerofilia a S %naerobiose ?:arra gerador de anaerobiose@ M a / geladeira Temperatura %mbiente -M aerobiose
o o o o o o o o
o o o o o o
Procedimentos → →
om uma al&ada da bactéria escolhida, fa5/se as estreias, em cada meio de cultura. Depois se dividiu as placas para se incubar.
Resultado Yersinia sp.
#eio0 =gar 9angue resceu em temperatura ambiente #eio0 =gar B! resceu em #icroaerofilia a S e n'o cresceu em M a #eio0 =gar *#B C'o cresceu em %naerobiose e M a #eio0 =gar ;*D resceu em #icroaerofilia a S e temperatura ambiente #eio0 =gar 99 resceu em #icroaerofilia a S #eio0 =gar/=gar C'o cresceu em S %erobiose #eio0 =gar #! resceu em temperatura ambiente e n'o cresceu em %naerobiose #eio0 =gar #itis/9alivarius resceu em S aerobiose
Conclusão % Yersinia sp é uma bactéria "ue cresce em temperaturas mais elevadas, em meio ágar/ágar n'o se cresce bactéria e em alguns meios também n'o cresceu. * a bactéria também n'o se cresce na temperatura bai1a, na geladeira.
3io5uimismo bacteriano: Identi6cação 3acteriana da ,am7lia Enterobacteriaceae
P á g i n a $ 14
Introdução 4 passo final para a identifica&'o de uma bactéria é dado pelo *studo do seu bio"uimismo. Para este estudo, é crucial o isolamento das bactérias em "uest'o, impedindo a contamina&'o para "ue n'o ha:a erro de identifica&'o. Podemos reali5ar uma série de testes, optando por a"uele "ue nos parece mais ade"uado. *nterobacteriaceae é uma fam8lia de bactérias Gram/negativas muito abundante, incluindo uma grande variedade de bactérias patog(nicas.
Objetivo dentifica&'o de bactérias por meio de indicadores de p! e por meio de testes bio"u8micos.
Materiais e Reagentes
Bactéria 6+ 9emeaduras0 Glicose ?l8"uido@ ;actose ?l8"uido@ 9acrose ?l8"uido@ #anitol ?l8"uido@ 9orbitol ?l8"uido@ #altose ?l8"uido@ #alonato de s2dio ?l8"uido@ ndol ?l8"uido@ afinose ?l8"uido@ %donitol ?l8"uido@ ;isina ?l8"uido@ 4rnitina ?l8"uido@ %rginina ?l8"uido@ ontrole de aminoácidos ?l8"uido@ DCase ?placa@ #otilidade ?tubo, s2lido@ itrato ?tubo, s2lido@ Ureia ?tubo, s2lido@ Fenilalanina ?tubo, s2lido@ T9 ?tubo, s2lido@ %l&a de platina %gulha de platina Bico de Bunsen *stante Placa de Petri
o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o
Procedimento → → → → → → →
Cas semeaduras em l8"uido, com uma al&ada da bactéria se mistura com os meios, sempre flambando a al&a ao mudar de meio. Ca placa de DCase, com a al&a, pegar um pouco da bactéria e fa5er um c8rculo no meio da placa. Ca motilidade, com a agulha, introdu5ir no meio n'o encostando no final do tudo, uma linha reta. Co citrato, com a agulha fa5er um risco na parte inclinada Ca ureia, com agulha ou al&a fa5er estreias na parte inclinada Ca fenilalanina, com al&a ou agulha fa5er estreias na parte inclinada. Co T9, com a agulha, introdu5ir no meio n'o encostando no fim do tubo, uma linha, e na parte inclinada uma estria.
P á g i n a $ 15 →
Ca ;isina, 4rnitina, %rginina e no controle, coloca/se um 2leo vegetal estéril.
Resultado #otilidade A positivo itrato A negativo ?o fundo ficou verde em cima ficou a5ul@ T9 A !M9 A negativo Glicose A positivo ;actose e 9acarose A positivo Ureia A positivo ?D@ Fenilalanina ?cloreto férrico@ A negativo %rginina A negativo Glicose A negativo ;actose A negativo 9acarose A negativo #anitol A positivo 9orbitol A positivo #altose A positivo 4rnitina A positivo ndol ?KovacVs@ A positivo ;isina A negativo afinose A negativo %donitol A negativo DCase / negativo #alanato de s2dio A p! neutro
Conclusão %p2s os testes de bio"u8micos, e comparar com a tabela, a bactéria "ue eu escolhi para fa5er, foi Yersinia sp.
8ntibiograma Identi6cação de cocos Gram Positivo Introdução 4 antibiograma é um e1ame de diagn2stico "ue consegue identificar "ual é a bactéria "ue está causando a infec&'o no indiv8duo, indicando também "ual o antibi2tico mais indicado para o seu tratamento. Ruando um paciente tem uma infec&'o causada por bactérias, geralmente é receitado um antibi2tico capa5 de eliminar estas bactérias, mas algumas infec&Les nem sempre s'o causadas por um tipo conhecido de bactérias e, nesse caso, receitar um antibi2tico "ue n'o se:a efica5 contra esses micro/organismos pode piorar a infec&'o. %ntibiograma por difus'o em ágar0 neste procedimento s'o colocados pe"uenos discos de papel "ue cont(m diferentes antibi2ticos na placa onde as bactérias crescem. %p2s algumas horas observa/se se e1istiu crescimento de bactérias em voltas dos discos e na aus(ncia de crescimento bacteriano, descobre/se "ual o antibi2tico mais ade"uado. 4 resultado do antibiograma pode demorar - a dias e é obtido através da análise do efeito dos antibi2ticos no crescimento das bactérias. 4 antibi2tico "ue inibir o crescimento das bactérias é o indicado para tratar a infec&'o, mas caso as bactérias cres&am e os antibi2ticos n'o tenham efeito, o resultado é um antibiograma negativo, sendo necessário utili5ar outras técnicas para identificar a bactéria e combater a infec&'o.
P á g i n a $ 1*
Objetivo N identificar o halo de inibi&'o dos antibi2ticos, saber se é resistente ou n'o. * por meio dos testes Bio"u8micos conseguir identificar a bactéria escolhida.
Materiais e Reagentes
Bactéria 6 %l&a de platina Discos0 Polimi1ina Covabiocina Tubo de ensaio Bico de Bunsen Plasma de coelho Banho #aria *scala de 6, #cFarland 9Hab 9olu&'o salina Placa de #! Tubo com !M4M Palito estéril Placa de DCase Wilol 9acarose Trealose #altose
o o
Procedimento 4 primeiro teste a se fa5er foi o da atalase0 om um palito estéril pegar um pouco do crescimento bacteriano e colocar no tubo com ! M4M. 4bservar forma&'o de bolhas. Po$!%!)o Staphylococcus Cegativo0 Streptococcus 9e o teste de atalase der positivo fa5er0 → 4 segundo teste feito foi o oagular0 %dicionar em um tubo 66µ; de plasma de coelho uma al&ada de crescimento bacteriano olocar em banho/maria a S e observar a forma&'o de coágulo a cada 6 minutos → Depois fe5/se os Discos, polimi1ina e novobiocina. Fa5er um inoculo em solu&'o salina ?escala 6, #cFarland@. 9emear com sHab por toda a placa de #!. %plicar os discos de polimi1ina e novobiocina ncubar a S por M- horas. → %p2s, fe5/se o DCase0 om o au18lio de uma al&a de platina, inocular as colOnias em forma circular central sobre o ágar. ncubar por até SM horas a S. → * o 3ltimo teste a se fa5er foi o do arboidratos0 om au18lio de uma al&a de platina, dissolver as colOnias no caldo de cada carboidrato0 Wilol 9acarose Trealose #altose →
P á g i n a $ 1+ 9e o teste de atalase der negativo fa5er0 → Teste amp0 Fa5er uma estria com Staphylococcus aureus. Fa5er estrias paralelas das bactérias a ser identificada sem encostar na estria de S. aureus . #eio0 =gar 9angue → Cal X7 ?aldo@0 com au18lio da al&a, inocular as colOnias no tubo. ncubar. → Bile *scubina0 *striar as colOnias na superf8cie do ágar. ncubar. → Discos de Bacitracina e 4pto"uina0 Fa5er um inoculo em solu&'o salina ?escala de 6, #cFarland@ semear com sHab por toda a placa de ágar sangue. %plicar o disco de Bacitracina e 4ptativa. ncubar.
Resultado
atalase0 Positivo DCase0 Cegativo #!0 / novobiocina0 6mm / resistente / poli1imina0 +Xmm A "ual"uer halo A inibi&'o. Trealose0 positivo #altose0 positivo 9acarose0 positivo Wilol0 negativo oagulase0 negativo
Conclusão %p2s os resultados e os testes feitos, se compara com a tabela, e a bactéria escolhida foi S. saprophyticus.
8valiação da atividade antimicrobiana de agentes 47sicos e 5u7micos Introdução 4s agentes microbianos podem ser microbicidas, "ue matam os microorganismos, ou microbiostáico, "ue apenas inibem o crescimento destes. 4 critério de morte de um microrganismo em #icrobiologia é baseado em uma 3nica propriedade0 a capacidade de se reprodu5ir. %gentes f8sicos 4 método mais empregado para matar microorganismos é o calor, por ser efica5, barato e prático. 4s microorganismos s'o considerados mortos "uando perdem a capacidade de multiplicar. *les s'o0 calor 3mido, calor seco, pasteuri5a&'o, radia&Les, indicadores biol2gicos, microndas, filtra&'o, press'o osm2tica, desseca&'o. %gentes "u8micos 4s agentes "u8micos s'o apresentados em grupos "ue tenham em comum, ou as fun&Les "u8micas, ou elementos "u8micos, ou mecanismo de a&'o. 9'o eles0 =lcoois, alde8dos e derivados, fen2is e derivados, halog(nicos e derivados, ácidos inorg
Objetivo dentificar o crescimento das bactérias nos agentes f8sicos, e também conseguir identificar o halo dos agentes "u8micos na bactéria escolhida.
Materiais e Reagentes →
Tiras de algod'o vermelha e preta
P á g i n a $ 1/ → → → → → → → → → → → → → → →
Tubos com água peptonada %l&a de platina Bico de Bunsen *stufa - Temperatura %mbiente Pipeta estéril C. albicans A l8"uido B. subtilis l8"uido S. aureus l8"uido !. aeruginosa l8"uido *scala de #cFarland 9Hab Placa de #! C. albicans placa Discos de papel de filtro com 6µ; de0 Prop2lis Periogard Pla1 ;isterine !ipoclorito
Procedimento %gente F8sico Ca tira de algod'o preta se umedece com S. aureus e !. aeruginosa ?M ve5es@ e coloca uma em cada tudo com água peptonada, identificando a bactéria, uma irá para a estufa de - e a outra ficará em temperatura ambiente. Ca tira de algod'o vermelha se umedece com C. albicans e B. subtilis ?M ve5es@ e coloca uma em cada tudo com água peptonada, identificando a bactéria, uma irá para a estufa de - e a outra ficará em temperatura ambiente.
→
→
%gente Ru8mico Turvar a bactéria C. albicans na escala 6, #cFarland. 9emear com sHab na placa de =gar #ueller/!inton, em campo sobrepostos Umedecer os discos de papel de filtro com 6µ; de cada agente "u8mico0 Pr2polis Periogard Pla1 ;isterine !ipoclorito olocar os discos nas placas espa&ados, e identificar o lugar e o agente "u8mico na placa.
→ →
o o o o o
→
Resultado
%gente F8sico
B. S"BT#L#S S. $"%E"S !. $E%"&#N'S$ C. albicans
TE,PERATURA A,IENTE Presente Presente Presente Presente
%gente Ru8mico
ESTUFA DE 45 Presente Presente Presente Presente
P á g i n a $ 1 Fungo0 C. albicans ;isterine A 6mm !ipoclorito A Xmm Pla1 A ++mm Periogard A +-mm Pr2polis A mm
Conclusão %gente F8sicos %s bactérias sobreviveram nas temperaturas e1postas, por mais "ue se:a um mesofilo, sobrevive a mais de -.
%gentes Ru8micos Por ter fatores "ue tenha interfer(ncia como, o tanto de inoculo "ue passou na placa, a concentra&'o dos agentes "u8micos, a validade do produto, pode ter dado algumas diferen&as. 4 !ipoclorito é o "ue age com mais eficácia, o listerine por ser um antisséptico bocal, ele n'o conseguiu ser efica5, pelo fato de C. albicans ser um fungo também encontrado na boca, ele n'o fe5 efeito, mas pode ter tido interfer(ncia por"ue o produto estava vencido.
8ntibiograma 9 isco i4usão Introdução 4 teste de disco/difus'o em ágar foi descrito em +XX, por Bauer e KirbJ. 4 teste fornece resultados "ualitativos. N um dos métodos de suscetibilidade mais simples, confiável e mais utili5ado pelos laborat2rios de microbiologia. 4 seu princ8pio básico é a difus'o do antimicrobiano na superf8cie do ágar, a partir de um disco impregnado com o mesmo antimicrobiano 4 teste é reali5ado dispensando os discos de papel/filtro, impregnados com antimicrobianos em concentra&Les fi1as, sobre a placa de ágar, ap2s a semeadura do in2culo bacteriano com apro1imadamente + a M 1 +6 UFYm;. %ntibiograma por difus'o em agar0 neste procedimento s'o colocados pe"uenos discos de papel "ue cont(m diferentes antibi2ticos na placa onde as bactérias crescem. %p2s algumas horas observa/se se e1istiu crescimento de bactérias em voltas dos discos e na aus(ncia de crescimento bacteriano, descobre/se "ual o antibi2tico mais ade"uado.
Objetivo onseguir identificar o halo dos antibi2ticos e com au18lio de uma tabela, saber se é resistente, intermediário ou sens8vel.
Materiais e Reagentes
%l&a de Platina Bico de Bunsen Bactérias0 o o
Escheria coli ?Gram negativa@ Staphylococcus aureus ?Gram positiva@
=gar #! *scala de #cFarland Discos para E.coli 9ulfa Trimetoprim A 9UT Tetraciclina A T*T
o o
P á g i n a $ 20 efalotina / F; %mpicilina A %#P iproflo1acina A P Gentamicina A G*C Tobramicina / T4B Discos para S. aureus Penincilina A P*C efalotina A F; %micacina A %# lorafenicol A ;4 %mpicilina A %#P 41acilina A 4W%
o o o o o
o o o o o o
Procedimentos →
→
→
Padroni5ado0 #eio de ultura A =gar #! *spessura de - a X mm noculo A +,1+6 UFYml ?compara&'o com a escala de 6, #cFarland@ *m uma solu&'o salina, fa5er um inoculo de E. coli comparando com a escala de #cFarland, com um sHab espalhar por toda a placa de #!, e colocar os discos de antibi2ticos. *m uma solu&'o salina, fa5er um inoculo de S. aureus comparando com escala de #cFarland, com um sHab espalhar por toda a placa de #!, e colocar os discos de antibi2ticos.
Resultado E. coli
P A mm A sens8vel 9UT A 6mm A resistente T4B A Mmm A sens8vel %#P A 6mm A resistente F; A ++mm A resistente G*C A M-mm A sens8vel T*T A MSmm A sens8vel S. aureus
F; A -mm A sens8vel ;4 A M,mm A sens8vel %#P A -Mmm A sens8vel P*C A -Smm A sens8vel %# A M mm A sens8vel 4W% A +mm A sens8vel T*T A 6mm A sens8vel
Conclusão %lguns antibi2ticos para a E. coli s'o resistente, n'o fa5endo efeito, "uando outros s'o sens8veis, fa5endo um efeito melhor. )á no S. aureus os antibi2ticos testados s'o todos sens8veis, tendo uma melhor eficácia.
-estes de Sensibilidade dos antimicrobianos
P á g i n a $ 21
Introdução % reali5a&'o do teste de sensibilidade aos antimicrobianos ?T9%@ é uma das principais tarefas e1ecutadas pelo laborat2rio de microbiologia. %lém de orientar a escolha da terapia antimicrobiana mais ade"uada, o T9% representa uma importante ferramenta no monitoramento da evolu&'o da resist(ncia bacteriana e age também como um método au1iliar na implanta&'o de medidas de controle "ue evitem a dissemina&'o de bactérias multirresistentes. % técnica de microdilui&'o em caldo corresponde E miniaturi5a&'o da técnica de macrodilui&'o. *m ve5 da utili5a&'o de diversos tubos contendo meio de cultura e antimicrobiano, a técnica de microdilui&'o em caldo utili5a placas plásticas estéreis, com X po&os, com o fundo em formato de ZU[, para permitir melhor visuali5a&'o do crescimento bacteriano. Cesta placa, um n3mero variável de antimicrobianos, em torno de +M drogas, é colocado em distintas concentra&Les ?- a dilui&Les logar8tmicas@.
Objetivos Materiais e Reagentes
%l&a de platina Bico de Bunsen Placa de Petri *stante Placa de X po&os aldo #!
E. coli
Gentamicina 9olu&'o salina ml 9olu&'o salina -ml aldo #! ml *scala 6, #cFarland Pipetas automáticas Ponteiras
Procedimento → → → → → → →
→ → → →
noculo 6+ A om uma al&ada de bactéria colocar na solu&'o salina de ml, comparando com a escala de #cFarland. ?+,1+6 UFYml@ noculo 6M A Transferir 6,ml com a pipeta do inoculo 6+ para uma solu&'o salina de -, ml ?+,1+6 S UFYml@ noculo 6 A Transferir + ml com pipeta do inoculo 6M para o caldo #! de ml ?M,1+6X UFYml@ Ruando inocular na microplaca o inoculo estará com 1+6 UFYml no po&o. Ca microplaca, na linha %, nas colunas + a +6 e +M coloca 6 µ; de aldo. Ca linha %+, coloca 6 µ; de Gentamicina, homogeni5a Ca linha %M, coloca 6 µ; de %+, e assim por diante, em cada pocinho da linha %, colocará 6 µ; da coluna anterior. %p2s isso, nas colunas + a +6, da linha %, coloca/se 6 µ; de caldo e M6µ; de inoculo 6. Ca linha ! e coluna +, coloca/se +66µ; de caldo, "ue fa5 o controle do caldo Ca linha !, coluna , coloca/se 6 µ; de caldo e M6µ; inoculo 6. Para controle de cultura de E.coli. Feito tudo isso, se :oga resa5ulina nos po&os.
P á g i n a $ 22
Resultados 4nde fica rosa tem vida, onde fica a5ul n'o tem vida. 4 # deu no po&o, com concentra&'o 6,XµgYml.
Conclusão 4 controle do antibi2tico Gentamicina, ficou a5ul, ent'o indica "ue ele é efica5, e mata a bactéria. 4 controle do caldo ficou a5ul, indicando "ue n'o está infectado. * o controle do inoculo tem "ue ficar rosa indicando vida da bactéria. Cos primeiros po&os ficou a5ul, indicando "ue a bactéria estava morta e do X ao +6 po&o ficou rosa, indicando vida. onclu8mos "ue a concentra&'o do antibi2tico para matar a bactéria tem "ue ser 6,XµgYml.
Conjunção 3acteriana Introdução Ca con:uga&'o bacteriana, peda&os de DC% passam diretamente de uma bactéria doadora, o \macho\, para uma receptora, a \f(mea\. sso acontece através de microsc2picos tubos protéicos, chamados pili, "ue as bactérias \macho\ possuem em sua superf8cie. 4 fragmento de DC% transferido se recombina com o cromossomo da bactéria \f(mea\, produ5indo novas misturas genéticas, "ue ser'o transmitidas Es células/ filhas na pr21ima divis'o celular.
Objetivo 4 ob:etivo dessa prática é ver se teve ou n'o crescimento da bactéria.
Materiais
Tubo de ml de caldo simples Tubo de E. coli ()) Tubo de E. coli K(* M Placas de *#B *streptoncina Kanamicina Placa de *#B Placa de *#B *streptonicina ?M66 µgYml@ Placa de *#B Kanamicina ?M6µgYml@ Pipeta %l&a Bico de Bunsen
Procedimentos →
→
→ →
*m um tubo de ml de caldo simples adicionar 6,+ml de E. coli ()) e 6,ml de E. coli K(*, ap2s - horas semear em uma placa de *#B *streptoncina Kernamicina 9emear as bactérias do estudo nas placas0 Placa de *#B, Placa de *#B *streptonicina ?M66µgYml@, Placa de *#B Kanamicina ?M6µgYml@ e Placa de *#B *streptoncina Kernamicina ada placa estará identificada onde semear a K(* e a ()), divida ao meio. aracter8sticas das Bactérias0
E. coli ())+ o o
Doador esist(ncia a Kanamicina
P á g i n a $ 23 o o
Plasmidial ;actose
E. coli K(*+ o o o o
eceptora esist(ncia a *streptonicina romosonal ;actose A
Resultado *#B Kanamicina *streptonicina ?-h ap2s@ resce apenas a K+M *#B resce as duas, K+M e +66 *#B Kanamicina resce apenas a +66 *#B *streptonicina resce apenas a K+M *#B Kanamicina *streptonicina C'o cresce nenhuma.
Conclusão Ruando semeamos as duas bactérias no tubo e depois de -h na placa B*# Kanamicina *streptonicina, a E. coli ()), "ue sendo uma doadora, doou a resist(ncia a Kanamicina para a E. coli K(*, "ue é uma receptora, fa5endo com "ue ela consiga ficar resistente aos dois antibi2ticos e assim crescendo, :á a +66 n'o consegue crescer pelo fato de "ue sendo resistente a Kanamicina cresceria, mas ela n'o é resistente a *streptonicina, a matando. Ca placa *#B cresce as duas bactérias :á "ue o meio é seletivo e inibem o crescimento de algumas bactérias gram/positiva e os corantes servem como indicadores de diferenciais da fermenta&'o de carboidratos, portanto, servem para diferenciar fermentadores e n'o/fermentadores de lactose. Ca placa *#B Kanamicina, cresce apenas a E. coli ()) por conta dela ser resistente a este antibi2tico, :á a K+M é morta. Ca placa *#B *streptonicina cresce apenas a E.coli K(* por ela ser resistente ao antibi2tico, a +66 acaba morrendo. )á na placa *#B Kanamicina *streptonicina n'o cresce nenhuma por"ue é resistente a um antibi2tico, mas n'o a outro, ent'o acaba morrendo.
Re4er;ncias 3ibliográ6cas http0YYHHH.sobiologia.com.brYconteudosYeinosYbiomonera.php ]Filoneto, # Pilonetto,.>. manual de procedimentos laboratoriais em microbiologia A P4Ps em #icrobiologia. uritiba microscience, +. ]Farmacopéia dos *stados Unidos do Brasil. M^ ed. 9'o Paulo0 9i"ueira. +. http0YYHHH.revistas.usp.brYrfmvuspYarticleYvieHFileYXMYXS http0YYHHH.eps:v.fiocru5.brYuploadYdYcap.pdf http0YYHHH.tuasaude.comYantibiogramaY http0YYHHH.anvisa.gov.brYservicosaudeYcontroleYrede]rmYcursosYatm]racionalYmod uloMYmetodos.htm http0YYHHH.anvisa.gov.brYservicosaudeYcontroleYrede]rmYcursosYboas]praticasYmo duloYmicrodiluicao.htm
