Manual de Procedimientos Bacteriologia CNDR 2004 (2)

Edición 2004 Levantado de Texto: Dr. Sergio López y Sra. Xiomara Aguilar Revisión de texto: Dr. Sergio López, Lic. Victoria Calderón, TM Teresa Videa, Téc. Julissa Ávila, Lic. Javiera Mejía Cuidado de la Edición: Dr. Sergio López Diagramación: Martha Medina Ruiz Diseño de portada: Dr. Sergio López Impresión: Litografía Nicaragüense (LITONIC)

La edición 2004 del Manual de Procedimientos de Bacteriología Médica del CNDR/MINSA fue financiada por el PMSS. Componente “Modernización de Hospitales”

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MARCO LEGAL El presente documento, como Manual de Procedimientos tiene su sustento legal dentro del marco jurídico y regulatorio existente para el Sector Salud, principalmente lo dispuesto en la Constitución Política (Arto.59), Ley No.423 “Ley General de Salud”, su Reglamento y en la Ley Ejecutivo”, y su Reglamento, encaminados a garantizar el derecho a la salud de todos los nicaragüenses. La Ley No. 423 “Ley General de Salud, en su Arto.4 establece: “Corresponde al Ministerio de Salud, como ente rector del Sector, coordinar, organizar, supervisar, inspeccionar, controlar, regular, ordenar y vigilar las acciones en salud, sin perjuicio de las funciones que deba ejercer frente a las instituciones que conforman el sector salud, en concordancia con lo dispuesto en disposiciones legales especiales”. De igual manera, la Ley General de Salud, en su Arto.2 establece que este Ministerio es el órgano competente para aplicar, supervisar, controlar y evaluar el cumplimiento de la presente Ley y su Reglamento; así como elaborar, aprobar, aplicar, supervisar y evaluar normas técnicas, formular políticas, planes, programas, proyectos, manuales e instructivos que sean necesarios para su aplicación. Es responsabilidad de los representantes de establecimientos proveedores de servicios de salud, entre otras consignadas en la Ley General de Salud, y su Reglamento, independientemente de su naturaleza jurídica, garantizar el cumplimiento de los manuales relativos a la salud y estándares de calidad establecidos por el Órgano Rector de la Salud.

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REPÚBLICA DE NICARAGUA MINISTERIO DE SALUD Dr. José Antonio Alvarado Correa Ministro de Salud Lic. Margarita Gurdián Vice Ministra de Salud Dr. Enrique Alvarado Abaunza Secretario General Dr. Alcides González Mairena Director General Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia Equipo Técnico de Bacteriología del CNDR Dr. Sergio R. López Cruz Jefe de Departamento y Coordinador del Equipo de Bacteriología Lic. Victoria Calderón Analista del Departamento de Bacteriología Lic. Juan Carlos Matute Ex-analista del Departamento de Bacteriología TM Teresa Videa Analista del Departamento de Bacteriología Lic. Anielka Baltodano Ex-analista del Departamento de Bacteriología Téc. Julissa Ávila Analista del Departamento de Bacteriología Lic. Javiera Mejía Analista del Departamento de Bacteriología

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Elaborado por el Equipo Técnico Científico del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia (CNDR) del Ministerio de Salud de Nicaragua: Dr. Sergio R. López:

Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17

Lic. Victoria Calderón:

Capítulos 2, 6, 13, 17

Lic. Juan Carlos Matute:

Capítulos 3, 7, 14, 15, 16, 17

TM. Teresa Videa:

Capítulos 5, 12, 16, 17

Lic. Anielka Baltodano:

Capítulos 6, 12, 16, 17

Téc. Julissa Ávila:

Capítulos 7, 9, 11, 16, 17

Lic. Javiera Mejía:

Capítulos 6, 8, 10, 12, 17

El presente documento constituye un esfuerzo del Equipo Técnico Científico del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia del Ministerio de Salud, reservándose dicho Ministerio, todos los derechos de autor conforme lo dispuesto en la legislación civil de la materia. El presente Manual de Procedimientos de Bacteriología Médica, edición 2004, no puede reproducirse o transmitirse por método o forma alguna, sea electrónico o mecánico, incluyendo copias fotostáticas, cintas magnetofónicas, acumulación de información con memoria ni através de ninguna otra forma, sin autorización por escrito del Ministerio de Salud de Nicaragua. www.minsa.gob.ni Complejo Nacional de Salud Dra. Concepción Palacios. PBX (505) 289-4700. Apartado Postal: 107. Managua.

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Indice Página Presentación ........................................................................................ ix Prólogo .............................................................................................................................................................. xi Capítulo 1.

Conceptos fundamentales para comprender la enfermedad infecciosa ................. 1

Capítulo 2.

Control de calidad en bacteriología ................................................................................. 5

Capítulo 3.

Procedimientos para la tinción de Gram ....................................................................... 15

Capítulo 4.

Procedimientos para la identificación de enterobacterias ....................................... 19

Capítulo 5.

Procedimientos para el aislamiento de enterobacterias y otras bacterias menos frecuentes en el urocultivo ...............................................35

Capítulo 6.

Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas ..........................................................................................................43

Capítulo 7.

Capítulo 8.

6.1

Procedimientos para la identificación de Pseudomonas aeruginosa ..................47

6.2

Procedimientos para la identificación de Acinetobacter spp ............................ 61

6.3

Procedimientos para la identificación de Staphylococcus aureus ....................73

6.4

Procedimientos para la identificación de Enterococcus spp ..............................79

Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo .....................89 7.1

Procedimientos para la identificación de Haemophilus influenzae ...................93

7.2

Procedimientos para la identificación de Streptococcus pneumoniae ........... 107

7.3

Procedimientos para la identificación de Neisseria meningitidis .................... 115

7.4

Procedimientos para la identificación de Listeria monocytogenes ................. 123

Procedimientos para bacterias aisladas en hemocultivos ....................................... 133 8.1

Capítulo 9.

Procedimientos para la identificación de Streptococcus grupo viridans ............................................................................... 137

Procedimientos para bacterias aisladas en exudado ótico .................................... 147

Capítulo 10. Procedimientos para bacterias aisladas en exudado faríngeo .............................. 151 10.1 Procedimientos para la identificación de Streptococcus pyogenes (Grupo A) y otros ß-Hemolíticos ............................... 153 Capítulo 11. Procedimientos para la identificación de Bordetella pertussis ............................. 165 Capítulo 12. Procedimientos para bacterias aisladas en coprocultivo ......................................... 173 12.1 Procedimientos para la identificación de Shigella spp ...................................... 177 12.2 Procedimientos para la identificación de Salmonella spp ................................. 195 12.3 Procedimientos para la identificación de Eschericha coli 0157:H7 ............... 213 vii

Capítulo 13. Procedimientos para la identificación de Vibrio cholerae .................................... 225 Capítulo 14. Procedimientos para la identificación de microorganismos aislados en exudado vaginal ........................................................................................... 245 14.1 Procedimientos para la identificación de Trichomonas vaginalis .................... 249 14.2 Procedimientos para la identificación de Gardnerella vaginalis ...................... 251 14.3 Procedimientos para la identificación de Mobiluncus spp ............................... 255 14.4 Procedimientos para la identificación de Candida spp ..................................... 257 14.5 Procedimientos para la identificación de otras levaduras ............................... 259 Capítulo 15. Procedimientos para la identificación de Neisseria gonorrhoeae ........................ 263 Capítulo 16. Susceptibilidad antimicrobiana: Procedimientos para la sensibilidad por el método de difusión en Agar............................................................................. 273 16.1 Detección de betalactamasas en Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus spp y Enterococcus spp. Método cromogénico .............................................................................................. 283 16.2 Métodos para la detección de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) en bacilos gramnegativos ....................................................... 287 16.3 Determinación de Cloranfenicol Acetil Transferasa (CAT) ............................ 293 16.4 Lista oficial de discos de susceptibilidad y tablas de discos con antimicrobianos que deben emplearse según bacterias ............................ 297 Capítulo 17. Fundamentos fisiológicos y bioquímicos de las pruebas......................................... 305

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REPÚBLICA DE NICARAGUA MINISTERIO DE SALUD CENTRO NACIONAL DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA

PRESENTACIÓN El propósito de esta nueva edición del Manual de Procedimientos de Bacteriología Médica sigue siendo como en las anteriores ediciones, poner a la disposición de todos los Especialistas de Laboratorio que laboran en esta área de la ciencia, los últimos conocimientos y metodologías en bacteriología en forma sencilla y didáctica, tomando en cuenta las disposiciones normadas por los organismos internacionales para este tipo de textos. No se puede hablar de Bacteriología sin recordar algo de la historia de esta disciplina científica. Si bien es cierto que la humanidad ya utilizaba los microorganismos desde épocas muy remotas para elaborar pan, cerveza, quesos y vinos, lo hacían por intuición y sin conocerlos verdaderamente. Fue necesario el desarrollo de la microscopia que se inició en el siglo XVII, para que en verdad la bacteriología emergiera como conocimiento real de los microorganismos. Sin duda, Pasteur y Koch son los padres de esta ciencia y a partir de ellos se inicia un desarrollo sostenido a lo largo de los años hasta culminar con los últimos avances alcanzados que han llegado al surgimiento de ramas cada vez más vigorosas y especializadas como la Virología, la Inmunología, la Biología Molecular con sus aplicaciones biotecnológicas no sólo médicas, sino en la agricultura, la ganadería y la industria. Han pasado varios años desde la última edición que hiciera el Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia (CNDR) del MINSA de un Manual de Procedimientos de Bacteriología y por eso el Ministerio de Salud ha apoyado al equipo de científicos del CNDR en la elaboración del presente Manual. Estos procedimientos de laboratorio están basados en las normativas de la Ley General de Salud y deben de servir para que todos los que laboran en bacteriología en el país tengan una guía clara y precisa de los procedimientos más frecuentemente utilizados. Felicitamos al equipo de trabajo del CNDR del Ministerio de Salud, que luego de varios años de esfuerzo han logrado concretar la edición de este Manual. Con la firme convicción de que este Manual servirá para mejorar la calidad de la atención a nuestros conciudadanos, les saludo.

José Antonio Alvarado C. Ministro de Salud

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Prólogo El Manual de Procedimientos de Bacteriología Médica ha tenido una transformación total en relación a la Tercera Edición. El Manual dejó de ser de Normas para transformarse en uno de Procedimientos. La razón es que esto permite una mejor utilización como herramienta de docencia sin soslayar los exhaustivos pasos para realizar los procedimientos o técnicas que se requieren en la identificación de las bacterias y su respectiva sensibilidad a los antimicrobianos. El principal eje del Manual es la identificación de bacterias que están asociadas a los problemas infecciosos bacterianos más comunes en los hospitales y la comunidad. Para ello se están siguiendo los métodos recomendados por las instituciones que funcionan como centros subregionales para el control de calidad de las subredes latinoamericanas que vigilan la resistencia a los antimicrobianos, de las cuales es miembro el CNDR/Nicaragua: Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (INEI) de Argentina, Instituto Nacional de Salud (INS) de Colombia y National Laboratory for Enteric Pathogens (NLEP) del Canadian Science Centre for Human and Animal Health, Canadá. El formato de identificación que se incorporó fue el de las Normas ISO 17025, aunque el propósito no fue mas que acercar esta Cuarta Edición a una posible edición futura siguiendo meticulosamente los parámetros que dichas normas demandan. El capítulo 2 que aborda de manera suscinta pero profunda el control de calidad en bacteriología es nuevo. El capítulo 4, sobre los procedimientos para la identificación de enterobacterias ha sido reelaborado totalmente en base a facilitar la identificación de las mismas utilizando diagramas de flujo y no tablas. Esto requirió un largo período de prueba en el Departamento de Bacteriología hasta garantizar la certeza y facilidad de uso. El tema de los procedimientos para la sensibilidad antimicrobiana se aborda por primera vez de manera exhaustiva y profunda, incluyendo pruebas especiales como la detección de betalactamasas, betalactamasas de espectro extendido y cloranfenicol acetiltransferasas. La guía para el uso de discos de sensibilidad según bacterias fue revisada, ampliada y enriquecida con todas las notas que indican su valor predictivo, así como sus límites, según las normas NCCLS 2004. Todo esto en vista de la vigencia del grave problema de la resistencia a los antimicrobianos a nivel mundial. Por último, para poder garantizar el empleo de este Manual, fue requerido que la Lista Básica de Insumos de Bacteriología del MINSA fuera ampliada, tanto en medios de cultivo, reactivos y discos de sensibilidad, después de una exitosa coordinación con la Dirección de Normación de Insumos Médicos. Deseamos agradecer el formidable y paciente trabajo para la presente edición realizada por la señora Xiomara Aguilar, quien hizo posible una mejor presentación del Manual.

Dr. Sergio López Coordinador de la Cuarta Edición xi

CAPÍTULO 1.

Conceptos fundamentales para comprender la enfermedad infecciosa I. INFECCIÓN: Es el establecimiento de la interacción entre el huésped y el agente (microorganismo). Debido a que sólo requiere la presencia del microorganismo en el huésped, la interacción huésped-agente ocurre frecuentemente. Cuando el microorganismo entra y se instala en el huésped, su siguiente fase es la proliferación. Esto no implica necesariamente daño al huésped ni reacción del mismo.

1. COLONIZACIÓN: Es la instalación y proliferación del agente en el huésped. No implica ningún tipo de interacción. Cuando nace un niño, a las pocas horas le han colonizado varios microorganismos en su piel, intestino y garganta. A partir de ese momento se considera que existe una infección, es decir, el establecimiento de la interacción es de comensalismo y en el mismo, no hay daño o injuria contra el huésped.

II. ENFERMEDAD INFECCIOSA: Cuando hay manifestaciones clínicas como resultado de la injuria al huésped por parte de microorganismos. El carácter de la interacción ha variado: el microorganismo está produciendo daño.

III. PATOGENICIDAD: Es la capacidad de los microorganismos de producir daño. Como no todos tienen la misma capacidad, la magnitud que existe para producir ese daño es la manera de determinar si es más patógeno o menos patógeno.

IV. VIRULENCIA: Es la magnitud de patogenicidad que tienen los microorganismos. La virulencia se determina por la capacidad de invadir tejidos (invasividad) o producir toxinas (toxigenicidad).

1. INVASIVIDAD: Capacidad de expandirse y dañar tejidos. Algunos microorganismos son virulentos por su invasividad: En la faringoamigdalitis bacteriana el Streptococcus pyogenes se expande por la faringe y destruye el tejido debido principalmente a la hialuronidasa. Las manifestaciones clínicas se deben a la invasividad. Capítulo 1: Conceptos fundamentales para comprender la enfermedad infecciosa

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PROCEDIMIENTOS

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

2. TOXIGENICIDAD: Capacidad de producir sustancias que causan las manifestaciones clínicas más importantes. Algunos microorganismos son virulentos por su toxigenicidad:

2.1. Vibrio cholerae 01: Coloniza temporalmente el intestino delgado y produce una exotoxina. Las manifestaciones clínicas se deben a la toxina. En los dos ejemplos anteriores ha habido una infección, pero como los microorganismos han producido daño, se ha producido una enfermedad infecciosa. En ambos casos los microorganismos son patógenos y su virulencia la han manifestado de dos formas distintas. Algunos microorganismos son más patógenos que otros:

2.2. Shigella dysenteriae 1: Se necesita alrededor de 200 bacterias para desencadenar disentería. Hay invasión al tejido intestinal (a veces perforación). Elabora una exotoxina que produce diarrea y luego deshidratación.

2.3. Vibrio cholerae 01: Se necesitan alrededor de 100 millones de bacterias para desencadenar la diarrea. No hay invasión a los tejidos. Elabora una exotoxina que produce diarrea y luego deshidratación.

2.4. Shigella dysenteriae 1: Es más patógena que Vibrio cholerae 01 por que con menores cantidades y más mecanismos virulentos produce mayores daños a un individuo. Cualquier miembro de la microbiota local puede producir enfermedad si previamente se le abre una puerta de entrada a los tejidos, ya que ellos por sí mismos no tienen capacidad para lograrlo. El agente causal que con más frecuencia se asocia a la endocarditis bacteriana es Streptococcus viridans, un miembro de la microbiota local de boca y faringe. Esta enfermedad ocurre en personas con daño en las válvulas cardíacas, después de extracciones dentales o lavados vigorosos de dientes que abren la puerta de entrada al estreptococo. En este o cualquier otro caso, a los microorganismos de la microbiota local que producen enfermedad se les denomina OPORTUNISTAS. Un microorganismo oportunista no es patógeno en tanto es miembro de la microbiota local, pero se convierte en patógeno cuando con mecanismos ajenos a ellos penetran e invaden tejidos cercanos o lejanos. Los mecanismos o puertas que facilitan esta entrada son varios, pero he aquí algunos ejemplos: heridas, traumatismos, enfermedades sistémicas como diabetes, administración prolongada de antimicrobianos, o por infecciones virales previas.

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Capítulo 1: Conceptos fundamentales para comprender la enfermedad infecciosa

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PROCEDIMIENTOS

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Aquí una pequeña lista de enfermedades producidas por oportunistas: a. b. c. d. e.

Sinusitis Otitis media y externa Infección urinaria Neumonía Peritonitis aguda por traumatismos

En cambio, cualquier microorganismo que no es parte de la microbiota local pero que necesita al humano como huésped para perpetuar el ciclo de la infección (ejemplos: gonococos, shigellas, estreptococos beta hemolíticos del grupo A) son patógenos estrictos ya que cuentan con mecanismos genéticos propios para desencadenar la enfermedad. Algunas veces estos microorganismos no la producen y se pueden aislar en personas sin sintomatología. A estas personas se les denomina portadores, pero de igual manera, en algunos casos se les prescriben medicamentos para erradicar a los microorganismos. Aquí una pequeña lista de enfermedades producidas por patógenos estrictos. a. b. c. d. e.

Fiebre Tifoidea Faringoamigdalitis Bacteriana Shigellosis Enfermedad de Lyme Gonorrea

ENFERMEDAD

MICROORGANISMO

OPORTUNISTA

PATÓGENO

VIRULENTO INVASIVO

Endocarditis

VIRULENTO TOXIGENICO

Streptococcus viridans

SI

SI (*)

SI

NO

Streptococcus pyogenes

NO

SI

SI

NO

Shigellosis

Shigella spp

NO

SI

SI

SI

Cólera

Vribrio cholerae 01 y 0139

NO

SI

NO

SI

SI

SI (*)

SI

NO

Faringoamigdalitis

Otitis Externa

Pseudomonas aeruginosa

* Sólo en condiciones especiales.

V. BIBLIOGRAFÍA: 1. Hoeprich PD. Host-Parasite Relationschips and the patogenesis of infecious Disease in Infectious Diseases, Chap 4, Paul D. Hoeprich editor, Fifth edition, 1994, JB Lippicott Co, Philadelphia. 2. Patogenia de la infección bacteriana en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks, editor, capítulo 9, 16ª edición (de la 21a edición en inglés) 1998, editorial El Manual Moderno S.A. de C.V. México D.F. Capítulo 1: Conceptos fundamentales para comprender la enfermedad infecciosa

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Capítulo 2: Control de Calidad en Bacteriología

CAPÍTULO 2.

Control de Calidad en Bacteriología En bacteriología se tiene en cuenta dos conceptos fundamentales, para medir el control de calidad.

I. EXACTITUD: Es la correspondencia entre los resultados de los análisis y los valores reales medidos a través de un control. Los controles utilizados son cepas estables con respecto a su bioquímica y sensibilidad. Estas cepas se conocen como ATCC (American Type Culture Collection)

II. PRECISIÓN: Es la dispersión de datos obtenidos, para una muestra procesada varias veces. Se debe tener en cuenta que para poder medir la precisión se realiza por medio de la Reproducibilidad, es decir una misma muestra se siembra periódicamente, los resultados deben ser iguales o similares todo el tiempo.


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PROCEDIMIENTOS

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1. MEDICIÓN DE LA EXACTITUD Y PRECISIÓN DE LA SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA: Ejemplo 1 con el antimicrobiano amicacina 30µg y la cepa de Escherichia coli ATCC 25922 (rango NCCLS de 19-26 mm). Gráfica No.1

2. EXPLICACIÓN DE CÓMO INTERPRETAR LOS VALORES DE LAS GRÁFICAS DE LOS EJEMPLOS DE EXACTITUD Y PRECISIÓN: 2.1. Las líneas rojas muestran los puntos de corte superior de 26 mm, e inferior de 19 mm (rango de referencia) de las normas NCCLS. 2.2.

Observamos que la curva azul es nuestro control de calidad, con un valor inicial que está dentro del rango de las normas NCCLS.

Gráfica No. 1. BUENA EXACTITUD Y MALA PRECISIÓN: Es notorio que en los controles semanales (curva azul) hubo buena exactitud, ya que todas las lecturas estuvieron dentro de los rangos, pero no hubo precisión ya que todos los puntos cayeron dispersos del punto inicial (23mm).

30 25

mm

20 15 10 5 0 1

2

3

4

5

6

7

SEMANAS

6


8

9

10

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Ejemplo 2: con el antimicrobiano Sulfametoxazol – Trimetoprim 23.75/1.25µg y la cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 (rango NCCLS de 24 - 32 mm). Gráfica No. 2.

Gráfica No. 2. BUENA PRECISIÓN Y MALA EXACTITUD: En esta segunda gráfica se observa que la lectura del primer control está dentro del rango esperado. A partir de la segunda semana se observa que los resultados están fuera de rango (mala exactitud) pero con valores muy similares (buena precisión).

35 30

mm

25 20 15 10 5 0 1

2

3

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6 7 SEMANAS

8

9

10

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PROCEDIMIENTOS

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Ejemplo 3: con el antimicrobiano ciprofloxacina 5µg, y la cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 (rango NCCLS de 22 - 30 mm). Gráfica No. 3.

Gráfica No. 3. BUENA PRECISIÓN Y BUENA EXACTITUD: En esta tercera gráfica se observa que no hubo resultados fuera de rango y que los mismos tienen valores parecidos a los del punto de corte inicial (26mm), por lo tanto, en esta gráfica los resultados son exactos y precisos.

35 30

mm

25 20 15 10 5 0 1

2

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SEMANAS

8


8

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Ejemplo 4: con el antimicrobiano eritromicina 15µg y la cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 (rango NCCLS de 22 - 30 mm). Gráfica No. 4.

Gráfica No. 4. BUENA EXACTITUD Y MALA PRECISIÓN: En esta gráfica se observa que los resultados semanales están alejados del punto de corte inicial (27mm) pero ninguno de ellos está fuera del punto de corte (buena exactitud). Sin embargo, los valores obtenidos difieren del punto de corte inicial y entre si (mala precisión).

35 30

mm

25 20 15 10 5 0 1

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3. TIPO DE ERROR: La determinación del tipo de error se aplica tanto a los resultados de la bioquímica con los cuales se llega a la conclusión diagnóstica de género y especie, como a los resultados de la sensibilidad antimicrobiana en relación a la interpretación (sensible, intermedio, resistente).

3.1. Error menor (em): 3.1.1. En relación al género y especie: Cuando se reporta el género sin especie (información incompleta) 3.1.2. En relación a la sensibilidad antimicrobiana: Cuando el resultado obtenido es sensible en relación a una cepa control o de referencia que con valor intermedio, cuando el valor obtenido es intermedio y el de la cepa de referencia es sensible, o cuando el valor obtenido es resistente y el de la cepa de referencia es intermedio o cuando el valor obtenido es intermedio y el de la cepa de referencia es resistente.

3.2. Error mayor (ema): 3.2.1. En relación al género y especie: Cuando se reporta el género correcto con especie incorrecta 3.2.2. En relación a la sensibilidad antimicrobiana: Cuando el resultado obtenido es resistente en relación a una cepa control o de referencia que es sensible.

3.3. Error muy mayor o grave (emm): 3.3.1. En relación al género y especie: Cuando se reporta género incorrecto. En este caso, la especie no tiene ninguna trascendencia. 3.3.2. En relación a la sensibilidad antimicrobiana: Cuando el resultado obtenido es sensible en relación a una cepa control o de referencia que es resistente

III. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FIABILIDAD Y LA REPRODUCIBILIDAD DE LOS RESULTADOS: 1. FUENTES DE ERROR:

1.1. Personal: El rendimiento del auxiliar o técnico de laboratorio depende directamente de la calidad de su formación y adiestramiento, de su experiencia personal, de sus condiciones de empleo y de la actitud que asuma frente a los obstáculos.

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1.2. Factores ambientales: Los resultados pueden verse afectados por la falta de espacio, iluminación o ventilación en el lugar de trabajo, las temperaturas extremas, el ruido excesivo o la inseguridad de las condiciones de trabajo.

1.3. Muestras: La procedencia de la muestra, el método de toma de la muestra y el momento de la obtención escapan a menudo al control directo del laboratorio, pero ejercen una influencia directa en la capacidad de éste para obtener resultados fiables. Otros factores que el laboratorio puede controlar y que afectan a la calidad del trabajo son el transporte, la identificación, el almacenamiento y la preparación (procesamiento) de las muestras. Por consiguiente, el laboratorio debe participar en la formación de los que las toman y transportan. Hay que dar al personal clínico y de enfermería instrucciones por escrito, que se deben revisar cada cierto tiempo con ayuda de los interesados.

1.4. Materiales de laboratorio: La calidad de los resultados puede verse afectada por la utilización de insumos de mala calidad o variaciones entre los lotes. La falta de disponibilidad de los mismos incidirá en diagnósticos incompletos o incapacidad de identificación de otros géneros bacterianos. Igual sucede con los reactivos, colorantes y medios de cultivo.

1.5. Método de prueba: Algunos métodos son más sensibles y específicos que otros. Por ejemplo, el hemocultivo para aislar neumococos en caso de neumonías bacterianas tienen una sensibilidad del 8% en relación a la punción pulmonar que es mayor del 80%. Pero esto puede ocurrir en la fase previa al diagnóstico: un pH de un Mueller Hinton tomado con un pHmetro tiene una mayor exactitud que uno tomado con una cinta y por lo tanto se pueden esperar menos errores en el primer caso.

1.6. Equipos: La falta de equipo o el empleo de instrumentos de mala calidad o el mal cuidado dará resultados poco fiables.

1.7. Examen y lectura: La lectura apresurada de los resultados o el examen de un número insuficiente de campos microscópicos pueden ocasionar errores. Por ejemplo, una lectura poco cuidadosa del Gram de un sedimento de LCR puede llevar a la conclusión de ausencia de bacterias o a la conclusión de un grupo distinto al agente causal si la tinción está mal hecha.

1.8. Notificación: La transcripción poco cuidadosa de los resultados da lugar a errores que pueden hacer que un paciente deje de recibir el tratamiento requerido o reciba uno que no es el apropiado. Los resultados de buena calidad pero notificados fuera de tiempo son tan dañinos como si el análisis no se hubiera practicado.


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2. CONTROL DE CALIDAD DE LOS EQUIPOS:

2.1. Autoclave: 2.2.1. Limpiar y cambiar el agua cada mes. Utilice agua destilada. 2.2.2. Comprobar y ajustar el nivel del agua antes de cada período de trabajo. 2.2.3. Registrar el tiempo y la temperatura o presión en cada periodo de trabajo. 2.2.4. Registrar el funcionamiento con ampollas de esporas de Bacillus stearothermophilus una vez por semana.

2.2. Horno para esterilizar cristalería: 2.2.1. Limpiar el interior. 2.2.2. Registrar el tiempo y la temperatura de cada periodo de trabajo.

2.3. Incubadora: 2.3.1. Limpiar la superficie interna de las paredes y las parrillas cada mes. 2.3.2. Registrar la temperatura al comienzo de cada jornada de trabajo y al final la jornada (límite, 35oC +/- 2).

2.4. Refrigerador: 2.4.1. Limpiar y descongelar cada 2 meses y después de cualquier interrupción del suministro eléctrico. 2.4.2. Registrar la temperatura dos veces al día (2-8oC).

2.5. Microscopio: 2.5.1. Limpiar los lentes con un paño o papel especial al final de cada jornada de trabajo. 2.5.2. Limpiar y lubricar la platina mecánica cada semana. 2.5.3. Cubrirlo con la funda guardapolvo cuando no se use. 2.5.4. Comprobar cada mes la alineación del condensador.

2.6. Baño de María: 2.6.1. Limpiar la superficie interna de las paredes y cambiar el agua cada mes. 2.6.2. Verificar el nivel del agua a diario y registrar la temperatura en cada jornada de trabajo.

2.7. Centrifugadora: 2.7.1. Limpiar la superficie interna de las paredes con solución antiséptica cada semana o en caso de rotura de los tubos que contienen las muestras. Nota: Para todos los equipos se debe dar mantenimiento cada 6 meses.

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IV. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: 1. ALMACENAMIENTO Y VENCIMIENTO DE LOS MEDIOS PREPARADOS: Ver en la tabla No. 1 la referencia de almacenamiento y vencimiento, para cada medio.

TABLA No. 1 MEDIOS

REFRIGERADOR 4 oc SIN BOLSA PLÁSTICA

REFRIGERADOR 4 oc CON BOLSA PLÁSTICA

Agar Sangre

15 días

50 días

Agar Chocolate

15 días

60 días

Agar MacConkey

15 días

70 días

6 días

10 días

Agar SS

2. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS PREPARADOS:

2.1. Control del pH: Cuando el medio se prepara correctamente a partir de polvo deshidratado no es necesario comprobar sistemáticamente el pH. Si el medio se elabora con sus ingredientes básicos, habrá que dejarlo enfriar antes de hacer esta comprobación. En el caso de los medios sólidos, la comprobación deberá hacerse con un electrodo de superficie o tras maceración en agua destilada. Si el pH difiere en mas de 0,2 unidades del valor específico, ajústese con ácido o álcali o prepárese un nuevo lote.

2.2. Control de Esterilidad: Compruébese sistemáticamente la esterilidad de los medios a los que, después de pasar por el autoclave, se les agrega sangre u otros componentes. Tómese un 3-5 % de cada lote e incúbese a 35 o C durante dos dias. Refrigérese el resto. Si se observan mas de dos colonias por placa, deséchese todo el lote.

2.3. Control de crecimiento: A cada lote preparado se le debe de hacer control utilizando cepas de referencia (ATCC).

2.4. Control de Caducidad: Cada lote debe marcarse con la fecha de preparación. El límite de utilización varía de acuerdo con el tipo de medio.


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PROCEDIMIENTOS

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V. BIBLIOGRAFÍA: 1. Ferraro MJ, Wikler MA, Craig WA and others. Performance Standards for Antimicrobial Disks Susceptibility Test; Approved Standard-Eighth Edition. National Comittee for Clinical Laboratory Standards, Document M2-A8, Volumen 23 No.1, 2004. Pensylvania, USA. 2. Gabastou J.M. Sistema de Garantía de Calidad: Conceptos Generales para los Laboratorios de Salud Pública en la Región Américas. Organización Panamericana de la Salud (OPS), Organización Mundial de la Salud (OMS), (Borrador), Washington, D.C. 2001. 3. Manual de Control de Calidad del Laboratorio Clínico. Capítulos I y VII, Instituto de Salud Pública de Chile, Departamento Laboratorios de Salud, Ministerio de Salud, 1998, Santiago de Chile.

14


CAPÍTULO 3.

Procedimiento para la tinción de Gram I. ALCANCE: Todos los laboratorios de la Red y Centro de Referencia.

II. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: La tinción de Gram es la prueba más simple utilizada en el laboratorio de microbiología. Es el procedimiento diferencial más comúnmente usado para el examen directo de gran variedad de géneros bacterianos. Fue concebido por Hans Christian Joachim Gram en el siglo IX y se mantiene hasta el momento sin modificaciones sustanciales. Divide a las bacterias en dos grupos: Microorganismos grampositivos que retienen el colorante primario cristal violeta y se observan de color azul oscuro o púrpura y microorganismos gramnegativos que pueden ser decolorados, esto es que pierden el colorante primario. Subsecuentemente toman el colorante de contraste safranina y aparecen de color rojo o rosa. Este espectro de coloración incluye a casi todas las bacterias y a otros géneros que incluyen hongos y parásitos. Los géneros bacterianos Treponema, y Mycobacterium no se tiñen bien y otros como Micoplasma, Chlamydia o Rickettsia son muy pequeños y requieren otros colorantes para poder ser visualizados al microscopio óptico. La tinción de Gram también es útil para la diferenciación de células epiteliales y leucocitos. No se ha dilucidado completamente el modo de acción de esta tinción, sin embargo se cree que los microorganismos grampositivos retienen el cristal violeta debido a la gran cantidad de ácido teicóico y la disminución de la permeabilidad de la pared celular para solventes orgánicos. Por el contrario, la pared celular de los gramnegativos contienen mas cantidad de lípidos y por lo tanto al ser disueltos por los solventes orgánicos (alconol-acetona o alcohol) el cristal violeta no puede ser retenido en el citoplasma, el cual escapa por los virtuales espacios dejados por los lípidos disueltos. La tinción de Gram de exudados puede dar al médico información preliminar acerca del o los microorganismos causales de la infección y servirle de base para el inicio de o los antimicrobianos apropiados en tanto obtiene el resultado del cultivo. Los problemas con la tinción de Gram generalmente resultan por errores de preparación de la lámina, frotis muy gruesos, calor excesivo cuando se fija la preparación, inapropiada decoloración e inexperiencia. Un exceso de decoloración ocasionará que las bacterias grampositivas aparezcan gramnegativas, mientras que con insuficiente decoloración ocurrirá el fenómeno inverso. La tinción de Gram puede hacerse a todo tipo de muestras clínicas que tengan indicación comprobada. Por ejemplo, no tienen ningún soporte los Gram de exudados faríngeos para la comprobación de Capítulo 3: Procedimientos para la tinción de Gram

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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


faringoamigdalitis por Streptococcus pero sí para un exudado de herida. Por lo demás, es útil para conocer inicialmente el posible género bacteriano en las UFCs de cultivos iniciales o comprobar el crecimiento y posibles géneros bacterianos obtenidos de caldos, como el hemocultivo.

II. IDENTIFICACIÓN: 1. EQUIPOS INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:

1.1. Equipos: 1.1.1 Microscopio con objetivo de inmersión 100x y ocular de 10x.

1.2. Materiales y reactivos 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 1.2.5 1.2.6 1.2.7 1.2.8 1.2.9 1.2.10 1.2.11 1.2.12 1.2.13

Láminas portaobjetos Mechero tipo Bunsen Marcadores indelebles Reloj de mesa Palillos de madera Bandeja de tinción Cristal violeta Lugol. Alcohol 70 o o alcohol acetona (1:1) Safranina o fucsina acuosa Agua de chorro Aceite de inmersión Solución salina al 0.85% estéril

1.3. Cepas para control de calidad: 1.3.1 Eschericha coli ATCC 25922 1.3.2 Staphylococcus aureus ATCC 25923

III. PROCEDIMIENTO: 1. PREPARACIÓN DEL FROTIS: 1.1.

Colocar una pequeña gota de solución salina en el centro de la lámina. Si son varias muestras, divida la lámina portaobjetos en su parte posterior en 6 y o más cuadrantes y coloque una pequeña gota de solución salina en cada uno de ellos, según la cantidad de muestras que teñirá. Las gotas pequeñas hacen que el secado sea rápido. En caso de muestras obtenidas de caldos, no se requiere la solución salina.

1.2.

Tomar la muestra con asa recta (una UFC) o redonda si se trata de caldos de cultivo y mezclarla con la gota de solución salina. Al mismo tiempo que se hace la mezcla, se dispersa en un área de aproximadamente 1cm por lado. El grosor de la muestra deber ser tal que permita la lectura de letras pequeñas a través del frotis.

16

Capítulo 3: Procedimientos para la tinción de Gram

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


1.3.

Ponga la lámina sobre una superficie plana y espere a que se seque a temperatura ambiente.

1.4.

Rotular la lámina adecuadamente. Si tiene mas de un Gram en la misma lámina cerciórese que con la rotulación le será posible evitar equivocaciones acerca de la proveniencia de la muestra.

1.5.

Una vez que el frotis esté seco, fijar la muestra pasándola rápidamente dos veces por encima de la flama del mechero. Evite el sobrecalentamiento ya que la pared celular se destruye y las bacterias grampositivas se observarían como gramnegativas. Para saber la temperatura adecuada coloque inmediatamente la lámina flameada sobre el dorso de una mano. En estos casos, la temperatura se debe tolerar sin hacer ningún esfuerzo de resistencia al calor.

1.6.

Dejar que el frotis se enfríe.

2. TINCIÓN: 2.1.

Cubrir el frotis ya fijado y frío con cristal violeta, dejar el colorante por un minuto.

2.2.

Enjuagar, dejando resbalar el agua con un chorro suave. Escurrir muy bien.

2.3.

Cubrir con lugol y dejar por un minuto.

2.4.

Repita el numeral 2.2

2.5.

Aplicar 2 ó 3 gotas de alcohol acetona (1:1) o alcohol 70o y balancear la lámina de tal manera que se pueda observar la decolaración. El tiempo adecuado es aquel en que las partes mas gruesas han dejado de decolorar al realizar el balanceo.

2.6.

Inmediatamente repita el numeral 2.2

2.7.

Cubrir el frotis con safranina o fucsina acuosa durante 30 segundos.

2.8.

Repita el numeral 2.2

2.9.

Dejar secar a temperatura ambiente.

2.10. Examinar en el microscopio con lente de inmersión, empleando aceite de inmersión.

3. RECOMENDACIONES: 3.1.

Empezar a colorear el frotis cuando la lámina portaobjetos esté bien fría ya que si se colorea caliente se precipitan los colorantes.

3.2.

Si la muestra que se va a colorear contiene mucha sangre, el frotis debe hemolizarse con agua ya que esta destruye los eritrocitos y permite observar las bacterias. Proceda así:

3.2.1 Dejar secar el frotis, fijar con calor, cubrir el frotis completamente con agua por un minuto y luego proceder con la tinción normalmente. 3.3.

La decoloración es crucial y debe ser muy breve en frotis delgados y mas prolongada en frotis gruesos. También cuando se ocupa alcohol-acetona el tiempo de decoloración es menor que cuando se decolora con alcohol 70 o.

3.3.

El frotis puede secarse dentro de la incubadora a 35oC, flamear levemente si es urgente o secarlo con aire expulsado de un pera de hule o un secador de manos.


17

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


4. RESULTADOS: Bacterias grampositivas: Se observan al microscopio de color azul oscuro o púrpura. Bacterias gramnegativas: Se observan al microscopio de color rojo o rosado. Nota: Las células epiteliales y los leucocitos deben observarse completamente de color rojo. La presencia de partes violeta indican que la preparación del frotis estaba muy gruesa o el tiempo de decoloración ha sido muy corto. En todo caso, valore repetir la muestra.

5. CONTROL DE CALIDAD: 5.1.

Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Bacilos gramnegativos: se observan de color rojo o rosado intenso.

5.2.

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Cocos grampositivos: se observan de color azul a púrpura.

6. INFORME: 6.1.

Mencionar primero las bacterias observadas y la agrupación seguido de la cantidad (escasos, regular cantidad o abundantes).

6.2.

Reportar los leucocitos en la muestra, su clase y cantidad. También reportar si se observan bacterias en el citoplasma de los leucocitos.

6.3.

Indicar siempre la presencia y cantidad de levaduras con o sin seudohifas, así como la presencia de micelio de hongos.

Ejemplos: 6.3.1 Diplococos gramnegativos abundantes extra celulares e intracelulares. Polimorfonucleares regular cantidad. 6.3.2 Cocos grampositivos en cadenas cortas, abundantes. 6.3.1 Cocobacilos pleomórficos gramnegativos escasos. Polimorfonucleares escasos. 6.3.2 Levaduras con seudohifas abundantes. Polimorfonucleares abundantes.

VI. BIBLIOGRAFÍA: 1. Principios del Diagnóstico Microbiológico en Medicina en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks editor, 16ª edición (de la 21ª edición en inglés), capítulo 47, 1999, editorial El Manual Moderno, México, Bogotá.

18


CAPÍTULO 4.

Procedimientos para la identificación de enterobacterias Rutinariamente se utilizan tablas de identificación de enterobacterias en las que todas ellas aparecen en una sola tabla o el mismo género, pero con sus diferentes especies en otras. En ambos casos, la búsqueda se hace prolongada y engorrosa. Para facilitar la rápida identificación se han diseñado 4 diagramas de flujo, tomando en consideración la totalidad de información del capítulo de enterobacteriaceae del Manual of Clinical Microbiology (Farmer III J.J. Enterobacteriaceae: Introduction and Identification en: Manual of Clinical Microbiology. Patrick R. Murray Editor. 7 th. Ed., 1999, chap. 27, American Society for Microbiology, Washington, D.C. ) Para poder hacer uso de estos diagramas es necesario tener en cuenta algunas consideraciones: 1.

Es necesario que al momento de hacer la lectura del plato donde ha sido sembrada la muestra, la UFC seleccionada para ser sembrada en TSI y LIA, sea marcada. Esto se hace trazando un círculo en la parte posterior del plato, alrededor de la UFC y agregándole un número o letra si de ese mismo plato van a identificarse otras UFC. La utilidad de este procedimiento se explica en el paso No. 3.

2.

Se requiere que la cepa que se estudia haya sido sembrada en TSI y LIA simultáneamente. Estos diagramas no tienen aplicación si la cepa sólo ha sido sembrada en TSI. El objetivo de LIA es precisamente adelantar información acerca de si las enterobacterias poseen o no descarboxilasa o desaminasa de la lisina.

3.

La bacteria no se podrá localizar en los diagramas si la cepa estudiada está contaminada con otras bacterias o si no es una enterobacteria. Esto último puede descartarse haciendo la prueba de la oxidasa. De esta manera se puede establecer la diferencia con otros bacilos gramnegativos anaerobios facultativos.

4.

Las lecturas en TSI y LIA son válidas si el período de incubación es de 18 a 24 horas. Mayores tiempos pueden dar lecturas falsas.

5.

Los diagramas de flujo han sido numeradas del 1 al 4: Diagrama de Flujo

No. 1:

Enterobacterias que desaminan la lisina.

Diagrama de Flujo

No. 2:

Enterobacterias que producen H2S

Diagramas de Flujo Nos. 3A/3B:

Enterobacterias que fermentan la lactosa.

Diagramas de Flujo Nos. 4A/4B:

Enterobacterias que no fermentan la lactosa.

Capítulo 4: Procedimientos para la identificación de enterobacterias

19

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Lo primero es seleccionar el diagrama de flujo que nos servirá para identificar la bacteria. Para eso siga minuciosamente los siguientes pasos:

PASO 1: Observe cuidadosamente los resultados de las bioquímicas tanto en TSI como en LIA. Inicialmente observe el tubo de LIA y pregúntese: La bacteria ¿desaminó la lisina? (color rojo en la parte inclinada). Si la respuesta es sí, busque el género y especie en el diagrama No. 1. Si la bacteria también produjo H2S y desaminó la lisina, la característica predominante para seleccionar el diagrama es la de haber desaminado la lisina Si la respuesta es no, siga el paso 2.

PASO 2: Observe los tubos de TSI y LIA y pregúntese: ¿Se produjo H2S? (color Negro en la parte profunda de TSI, el LIA o ambos). Si la respuesta es sí, busque el género y especie en el diagrama No. 2. Si la respuesta es no, siga el paso 3.

PASO 3: Observe el tubo de TSI y pregúntese: Fermentó la lactosa? (color amarillo en la parte inclinada).

Para responder esta pregunta hay que tomar ciertas precauciones: 1.

Recuerde que el medio de TSI tiene 3 azúcares: lactosa, sacarosa y glucosa.

2.

La glucosa se fermenta en la parte profunda.

3.

La lactosa y sacarosa se fermentan en la parte inclinada. Así que, el color amarillo en la parte inclinada puede ser por fermentación de la lactosa o de la sacarosa. ¿Cómo establecer la diferencia? Revise el plato donde sembró la muestra (McConkey, SS agar). Observe atentamente la UFC que marcó y sembró en TSI y LIA. Si la UFC es fermentadora de lactosa (rosado en McConkey y SS agar, oscura pero diferentes tonos en EMB, amarilla en Tergitol 7), el color amarillo del TSI en la parte inclinada se debe a la fermentación de la lactosa. Si la bacteria es no fermentadora (lactosa negativa), y el TSI viró amarillo en la parte inclinada, la reacción es por fermentación de la sacarosa, lo cual es una valiosa información en el caso de algunas enterobacterias. Como puede notarse, algunas enterobacterias están clasificadas tanto en el diagrama 3 como en el 4, ya que los porcentajes de fermentación de la lactosa varían entre el 45 al 80%.

20


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Si la respuesta es sí, busque el género y la especie en los diagramas Nos. 3A o 3B según las variaciones de las reacciones en TSI y LIA. Si la respuesta es no, se asume que la enterobacteria es no fermentadora de la lactosa y en ese caso deben utilizarse los diagramas Nos. 4A y B.

NOTAS: Se sabe que hasta un 6% de las E. coli producen H2S en pocas cantidades. En ese caso, pueden confundirse con una Salmonella. Si usted tiene una bacteria cuyo crecimiento en TSI es A/AG+ y en LIA K/Kg+ y no pudo identificarla en la tabla 2, considere que puede tener más de una bacteria en sus tubos de TSI y LIA. En ese caso reaisle con un inóculo tomado del plato original. Algunas bacterias fermentan lentamente la lactosa o la sacarosa y la parte inclinada se observa amarilla en la porción inferior y roja en la porción superior (por ejemplo: Klebsiella spp). En este caso, la bacteria se toma como fermentadora de lactosa o de sacarosa, según el caso. Debe insistirse que el tiempo de incubación no debe exceder las 24 horas, pues con mayor tiempo las bacterias que fermentaron la lactosa van muriendo y este proceso se acompaña de alcalinización (viraje a color rojo de la parte inclinada). Una vez seleccionada el diagrama, note que en la parte inferior se anotan las posibles reacciones que se pueden obtener en el TSI y LIA. Si en el diagrama seleccionado no aparecen las reacciones que Ud. obtuvo, considere la posibilidad de contaminación. En tal caso reaisle una UFC del plato original. Si las reacciones son similares a la primera vez, envíe la cepa al CNDR. En la parte superior de la primera hoja de cada diagrama se indica toda la bioquímica que simultáneamente debe hacerse para esa cepa. Es vital que se realicen todas las bioquímicas que ahí están escritas, pues la falta de una de ellas puede ser que no le permita discriminar entre los diferentes géneros o especies. Una vez realizada la bioquímica, proceda a leer los resultados según el esquema que se presenta en cada diagrama de flujo. Esto significa que para cada diagrama, la bioquímica clave o “llave de entrada” de identificación varía: Diagrama de flujo No. 1:

La bioquímica llave es la producción de H2S en TSI o LIA.

Diagrama de flujo No. 2:

La bioquímica llave es la descarboxilación (+ o -) de lisina en LIA.

Diagrama de flujo No. 3A: La bioquímica llave es la descarboxilación de lisina en LIA. Diagrama de flujo No. 3B: La bioquímica llave es la no descarboxilación de lisina en LIA. Diagrama de flujo No. 4A: La bioquímica llave es la descarboxilación de lisina en LIA. Diagrama de flujo No. 4B: La bioquímica llave es la no descarboxilación de lisina en LIA A partir de ahí, los géneros y especies se van agrupando en dependencia de bioquímicas específicas que siguen un riguroso orden. No siempre es necesario leer todas las reacciones bioquímicas para llegar a una conclusión de género y especie. Sin embargo, sí es necesario realizarlas todas, ya que de antemano no sabrá si se requerirá de todas ellas para tener una conclusión diagnóstica.


21

22


K/A+

2.

Citrato Trealosa

4. 5.

R/A+

R/A

LIA 4.

3.

K/A

K/Ag+

R/A

R/Ag+

NOTA:1. La producción de gas es variable y la cantidad puede ser escasa (g) o abundante (G). 2. La producción de H2S puede ser escasa ( + ) o abundante ( = ).

K/A+

1.

Adonitol

3.

DE

TSI

Urea

2.

PROCEDIMIENTOS

Reacciones esperadas en TSI/LIA

Mio

DE

1.

Bioquímica que debe realizarse para la identificación de bacterias que Desaminan la Lisina (Lisinadesaminasas) (Diagrama de Flujo No. 1)

MANUAL BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

+

Indol –

M. morganii P. mirabilis

M. morganii

+

Ornitina –

M. morganii P. vulgaris P. mirabilis P. penneri

P. mirabilis

–

P. stuartii

P. rettgeri

P. penneri

Indol

P. vulgaris

+

P. vulgaris P. penneri

+

H2S

–

P. stuartii P. rettgeri

Ornitina + Indol –

M. morganii

t Ornitina – Indol +

M. morganii P. penneri P. stuartii P. rettgeri

Urea

P. penneri

Ornitina – Indol –

+ –

M. morganii P. penneri P. stuartii P. rettgeri P. alcalifaciens P. rustigianii

LISINA DESAMINASAS

DIAGRAMA DE FLUJO No. 1

Adonitol + –

P. alcalifaciens

P. stuartii

Adonitol + –

P. alcalifaciens P. rustigianii P. stuartii

Trealosa + –

P. rustigianii P. stuartii

P. rustigianii

24

Citrato Malonato Trealosa Ramnosa Rojo de Metilo

2. 3. 4. 5. 6.


4. K/A +g

2.K/A+g K/A+

K/K+g

K/A+g

2.

La producción de H2S puede ser escasa (+) o abundante ( = ).

NOTA:1. La producción de gas es variable y la cantidad puede ser escasa (g) o abundante (G).

3. A/A +g

1.K/A+g K/A

DE

LIA

PROCEDIMIENTOS

TSI

DE


Mio

1.

(Diagrama de Flujo No. 2)

productoras de Sulfuro de Hidrógeno

Bioquímica que debe realizarse para la identificación de bacterias MANUAL BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004

Salmonella spp

E. tarda

Ornitina + Indol +

S. Choleraesuis

Trealosa + –

S. Choleraesuis Salmonella spp

Ornitina + Indol –

E. tarda S. Choleraesuis S. Typhi Salmonella spp

S. Typhi

Ornitina – Indol –

DIAGRAMA DE FLUJO No. 2

Lisina

B. aquatica

–

L. richardii

Ornitina + Citrato +

C. freundii

L. richardii B. aquatica

Citrato + –

Lactosa Ramnosa + Rojo de Metilo + –

L. grimontii

+

PRODUCTORAS DE H 2S

S. Paratyphi A

Ornitina + Citrato –

Ornitina –

C. freundii

C. freundii S. Paratyphi A

Movilidad + Indol –

C. freundii C. diversus C. amalonaticus S. Parathyphi A L. grimontii L. richardii B. aquatica

C. diversus

Malonato + –

C. amalonaticus

C. diversus C. amalonaticus

Movilidad + Indol + Ornitina +

26

NOTA:

Urea Citrato Malonato Vogues Proskauer Dulcitol Salicina Sacarosa

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.


A/A

2.

K/K

K/Kg

1. La producción de gas es variable y la cantidad puede ser escasa (g) o abundante (G).

A/Ag

1.

LIA

DE

TSI

PROCEDIMIENTOS


Mio

DE

1.

(Diagrama de Flujo No. 3 A)

Fermentadoras de Lactosa (Lactosa Positiva)

Bioquímica que debe realizarse para la identificación de bacterias


E. gergoviiae

+

VP

–

–

E. aerogenes

S. fonticola

E. gergoviae S. fonticola

Urea

E. aerogenes S. odorifera 1

+

VP

S. odorifera 1

–

E. aerogenes S. odorifera 1 S. fonticola

Gas de glucosa + –

aerogenes gergoviae odorifera fonticola

+

E. E. S. S.

Indol – Ornitina +

K. oxytoca

Dulcitol + –

S. fonticola

Indol + Ornitina –

+

VP

–

S. odorifera 1

E. K. K. S.

K. ascorbata K. cryocrescens

S. odorifera 1 K. cryocrescens

Citrato + –

K. cryocrescens

S. odorífera 1

– –

–

S. odorifera

Sacarosa + –

S. rubidea S. odorifera 2

Urea

Enviar al CNDR

S. rubidea

+

K. pneumoniae S. rubidea S. odorífera 2

K. pneumoniae

E. coli K. cryocrescens

E. coli

Indol Ornitina


Malonato + –


K. cryocrescens

coli ascorbata kryocrescens odorifera bio 1

Indol + Ornitina +

Gas de Glucosa + –

Malonato + –

K. ascorbata K. cryocrescens S. odorifera 1

Kluyvera spp

Lisina +

E. coli

E. coli S. odorifera 2

-

S. odorífera 2

+

Urea

E. coli K. oxitoca S. odorifera bio 2

S. odorifera 1 S. fonticola

LACTOSA POSITIVAS

DIAGRAMA DE FLUJO No. 3 A

Salicina +

28

NOTA:

Citrato Malonato Vogues Proskauer Arginina Sorbitol Adonitol Sacarosa Arabinosa Ramnosa Determinación de pigmento amarillo en Mueller Hinton o Agar Nutritivo

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.


A/Ag

K/Ag


1.

DE

LIA

PROCEDIMIENTOS

TSI

DE


Mio

1.

(Diagrama de Flujo No. 3 B)

Fermentadoras de Lactosa (Lactosa Positiva)


E. cloacae

L. adecarboxilata

*24 horas en MH, AN o BHI

E. sakasakii

+

Adonitol

–

Arginina Sorbitol

+

P. agglomerans L. adecarboxilata

Indol + Ornitina –

E. cloacae E. sakasakii

Indol – Ornitina +

–

P. agglomerans

–

Lisina

–

+

K. cryocrescens

–

Pigmento Amarillo*

+

S. rubidea

–

Pigmento Amarillo *

P. agglomerans S. rubidea

Ornitina

Indol

– –

P. agglomerans (85%) S. plymutica

E. americana

C. lapagei

Malonato + –

E. americana C. lapagei

Arabinosa + –

P. agglomerans E. americana C. lapagei

P. agglomerans

Ramnosa + –

–

Sacarosa

P. agglomerans S. plymutica

+

P. agglomerans E. americana C. lapagei S. rubidea S. plymutica

Malonato + –

S. rubidea S. plymutica P. agglomerans

P. agglomerans

E. hermanii K. criocrescens

Citrato + –

E. hermanii K. cryocrescens

VP

E. hermanii

K. cryocrescens

E. sakasakii

+

E. sakasakii E. hermanii K. cryocrescens

Indol + Ornitina +

LACTOSA POSITIVAS

DIAGRAMA DE FLUJO No 3 B

30

NOTA:

DE

Bioquímica que debe realizarse para la identificación de bacterias (Diagrama de Flujo No. 4 A)

Indol (MIO) Ornitina (MIO) Sacarosa Citrato

2. 3. 4. 5.


K/K K/Kg

2. K/Ag 3. A/Ag


K/Kg

1. K/Ag

LIA

DE

TSI

PROCEDIMIENTOS


Arabinosa

1.

No fermentadoras de Lactosa (Lactosa Negativa)


–

Arabinosa +

marcescens liquefaciens odorifera bio 1 alvei fergusonii vulneris

S. odorifera

S. H. E. E. S.

H. alvei

+ –

Indol

liquefaciens alvei fergusonii vulneris odorifera bio 1

E. fergusonii

Sacarosa Citrato + –

E. fergusonii S. odorifera bio 1

S. marcescens

S. S. S. H. E. E.

Lisina +

Ornitina + –

Sacarosa – +

S. liquefaciens S. odorífera bio 1

E. vulneris

liquefaciens alvei vulneris odorifera bio 1

S. liquefaciens S. odorífera bio 1 H. alvei

S. H. E. S.

S. liquefaciens

S. odorifera bio 1

LACTOSA NEGATIVAS

DIAGRAMA DE FLUJO No 4 A

Citrato + –

32

NOTA:

Indol (Mio) Sacarosa Citrato Urea Ramnosa Sorbitol

2. 3. 4. 5. 6. 7.


K/A A/Ag

2. 3.

K/Ag

K/A

K/Ag


K/Ag

1.

LIA

DE

TSI

PROCEDIMIENTOS


Arabinosa

DE

1.

(Diagrama de Flujo No. 4 B)

No fermentadoras de Lactosa (Lactosa Negativa)


K. rhinoscleromatis

T. ptyseos

Arabinosa + –

S. plymutica

S. plymutica K. rhinoscleromatis

Ramnosa + –

– – – – –

S. plymutica T ptyseos K. rhinoscleromatis

Movilidad Indol Ornitina Urea Citrato

–

Sacarosa Sorbitol + –

– –

S. plymutica

Ornitina + –

– Ramnosa +

+ Sacarosa

–

E. vulneris

Y. enterocolitica

Ornitina + –

Shigella spp

S. plymuthica

Serología

LACTOSA NEGATIVAS

DIAGRAMA DE FLUJO No 4 B

E. vulneris S. plymutica

Y. enterocolitica S. plymutica

Movilidad + –

E. vulneris E. hermannii Y. enterocolitica Shigella spp S. plymutica

Citrato

Urea

E. hermanii

E. hermannii E. vulneris S. plymutica

C. lapagei

C. lapagei C. neteri

Ornitina + –

plymutica davisae neteri lapagei

C. neteri

C. davisae

S. C. C. C.

Urea – Citrato +

S. plymutica Shigella spp Y. enterocolitica T. ptyseos C. davisae C. neteri C. lapagei E. hermannii E. vulneris K. rhinoscleromatis

Lisina

CAPÍTULO 5.

Procedimiento para el aislamiento de enterobacterias y otras bacterias menos frecuentes en el urocultivo I. TOMA DE LA MUESTRA: Para un cultivo de orina apropiado es esencial la recolección apropiada de la muestra. Las recomendaciones que deben cumplirse son las siguientes: El paciente no debe estar tomando, ni haber tomado antimicrobianos tres días antes de recolectar la muestra para el cultivo. Recolectar la primera orina de la mañana, como se describe a continuación: 1.

Lavar los genitales externos con abundante agua y jabón (no secarse).

2.

La muestra de orina se toma “a medio chorro”: Indicar al paciente que orine aproximadamente la mitad de lo que calcule tener en su vejiga.

3.

Parar la micción.

4.

Orinar entre 50-100 mL en un frasco estéril, teniendo cuidado de que los genitales no toquen el borde del mismo.

5.

Cerrar el frasco herméticamente.

6.

Las muestras deben refrigerarse de 4 o a 8 oC hasta el momento de realizar el cultivo. No deben procesarse muestras que no se refrigeraron y tienen media hora o más a temperatura ambiente. Si esto último sucede, la muestra debe repetirse.

7.

Si es un recién nacido, además de las instrucciones anteriores, la muestra se recogerá en bolsa estéril colectora de orina. Estas bolsas son exclusivas para tomas de muestras de orinas y se adquieren en las farmacias.

II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: 1. TRANSPORTE AL LABORATORIO CUANDO LA MUESTRA PROVIENE DE UN PACIENTE NO HOSPITALIZADO: Cuando el tiempo entre la toma de la muestra y el transporte al laboratorio se calcula que durará más de media hora, la muestra debe ser transportada en refrigeración. Para ello, el frasco con la muestra debe ser colocada en un contenedor plástico con tapadera y luego llenado hasta la mitad con hielo picado o con refrigerantes si fuera posible.

Capítulo 5: Procedimiento para el aislamiento de enterobacterias y otras bacterias

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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


2. TRANSPORTE AL LABORATORIO CUANDO LA MUESTRA PROVIENE DE UN PACIENTE HOSPITALIZADO: En estos casos las muestras deben ser transportadas sin refrigeración.

II. PROCESAMIENTO PREVIO DE LA MUESTRA: Una vez que la muestra llega al laboratorio debe ser guardada inmediatamente en refrigeración hasta el momento de la siembra. Ninguna muestra debe quedar a temperatura ambiente. Recuerde que en el caso de las enterobacterias, se reproducen logarítmicamente aproximadamente cada 20 minutos, lo cual alterará el conteo de UFCs.

1. MEDIOS DE CULTIVO REQUERIDOS: 1.1. Agar Sangre de Carnero 1.2. Agar Mac Conkey

III. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: 1. TOMA DE LA MUESTRA: 1.1. Equipo: Ninguno 2. MATERIALES Y REACTIVOS: 2.1. Frasco estéril, boca ancha, con tapa de rosca. 2.2. Bolsas recolectoras estériles, en casos de que la muestra sea de un infante. 3. MEDIOS DE CULTIVO: Ninguno. 4. TRANSPORTE: 4.1. Equipo: Ninguno. 4.2. Materiales y reactivos: 4.2.1 Contenedor plástico con tapa y hielo picado o refrigerantes. 4.3. Medios de cultivo: Ninguno. 5. PROCESAMIENTO: 5.1. Equipo: Ninguno. 5.2. Materiales y reactivos: Ninguno. 5.1. Medios de cultivo: 5.3.1 Agar Sangre de Carnero 5.3.2 Agar Mac Conkey

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DE

PROCEDIMIENTOS

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V. ALCANCE Depende del nivel de complejidad de la bacteria aislada. Para determinar el alcance en relación de la identificación debe revisarse el capítulo correspondiente.

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: La orina excretada en el riñón es estéril, salvo que dicho órgano esté infectado. La orina sin contaminar de la vejiga también es normalmente estéril, sin embargo, en la uretra existe una microbiota normal, de modo que la orina expulsada en forma normal contiene una pequeña cantidad de bacterias. Debido a esto es necesario distinguir los microorganismos contaminantes de los de importancia etiológica. Sólo el examen cuantitativo de la orina puede producir resultados significativos en cuanto a esta diferencia. El urocultivo se realiza para demostrar la presencia de un número significativo de bacterias, que usualmente se limitan a unos pocos microorganismos de crecimiento rápido. Las principales bacterias que afectan el sistema urinario son las enterobacterias y dentro de ellas Escherichia coli es la más frecuente. En mujeres no embarazadas las más frecuentes son E. coli y Staphylococcus saprophyticus. Sin tomar en cuenta la edad, sexo ni patologías primarias, se pueden aislar otras enterobacterias y gramnegativos, así como otros grampositivos, sobre todo en instituciones donde las infecciones urinarias asociadas a catéter constituyen la primera causa de infecciones intrahospitalarias. El examen microscópico de la orina es una práctica previa al cultivo que puede revelar importante información a la hora de hacer una interpretación o tomar la decisión de concluir el diagnóstico, sin embargo no se describe en el presente manual debido a que en los laboratorios de bacteriología del país, este análisis le corresponde al laboratorio clínico.

VII. IDENTIFICACIÓN: 1. EQUIPO, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIÓN:

1.1. Equipo: 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4

Microscopio Mechero de Bunsen Incubadora Refrigeradora

1.2. Materiales y reactivos: 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 1.2.5 1.2.6 1.2.6 1.2.7

Asas bacteriológicas redondas y rectas Asas redondas calibradas (0.001 mL) Guantes descartables Láminas portaobjeto Láminas cubreobjeto Colorantes para tinción de Gram Reactivo de Kovac ó Erlich Reactivo de alfanaftol Capítulo 5: Procedimiento para el aislamiento de enterobacterias y otras bacterias

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


1.2.8 Reactivo de KOH al 40% 1.2.9 Reactivo de cloruro férrico 1.2.10 Reactivo de ácido clorhídrico 0.1 N

1.3. Medios de cultivo: Ver procesamiento. 1.4. Pruebas para la identificación: Ver apartado correspondiente según la bacteria aislada. 2. PROCEDIMIENTO PARA LA SIEMBRA: 2.1.

Agitar manualmente el frasco de orina por unos segundos, hasta obtener una solución homogénea.

2.2.

Con el asa de platino calibrada de 0.001 ml , inocular la muestra en los medios de Agar Sangre de Carnero y Agar MacConkey, depositando el inóculo en el centro del plato, extendiéndolo hacia arriba y hacia abajo, sin esterilizar el asa. Luego estriar en tres direcciones: vertical, horizontal y transversalmente en toda la superficie del plato.

2.3.

Incubar los medios de cultivo por 24 hrs. de 35-37 0C.

3. LECTURA DE LOS PLATOS: Deben tomarse en cuenta varios parámetros. En los siguientes casos debe tomarse el urocultivo como positivo y debe hacerse la identificación del o los microorganismos y su respectivo antibiograma. 3.1.

Todo cultivo puro (un solo tipo de bacteria) con recuento mayor de 20,000 UFC x mL (unidades formadoras de colonias por mililitro de orina).

3.2.

Una muestra se manda a repetir: 3.2.1 Todo cultivo en el que el recuento sea mayor de 20,000 UFC x mL con más de una bacteria. 3.2.2 En caso que el recuento sea menor de 20,000 UFC X mL con una o más bacterias.

4. PROCEDIMIENTO PARA CALCULAR EL TOTAL DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS QUE SE VAN A REPORTAR AL MÉDICO: 4.1.

Realizar la lectura, contando el total de UFCs y multiplicarlas por el factor de dilución correspondiente con el asa utilizada (las asas de platino utilizadas están calibradas para tomar un volumen de 0.001 mL, o sea la milésima parte de 1 mL, por lo tanto el factor de dilución es 1000). Este dato es muy importante y debe ser reportado en el resultado final que se envía al médico. A continuación algunos ejemplos, utilizando asa de 0.001 mL. 4.1.1 Ejemplo 1. Si usted cuenta 50 Unidades Formadoras de Colonia (UFCs), multiplique 50 x 1,000 y esto da como resultado 50,000 UFC por mililitro de orina (mL).

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


4.1.2 Ejemplo 2. Si usted cuenta 75 UFC, multiplique 75 x 1,000 y esto da como resultado 75,000 UFC x mL de orina. 4.1.3 Ejemplo 3. Si el crecimiento es excesivo y no se puede contar, considere que hay más de 100 UFCs y reporte el recuento como mayor de 100,000 UFC x mL de orina.

5. SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS:

5.1. Antimicrobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: Ver capítulo 16. 5.2. Antimicrobianos a utilizar por el método de concentración Mínima Inhibitoria (en caso de Streptococcus viridans): 5.2.1 Penicilina.

6. REPORTE:

6.1. Negativo: No hubo crecimiento bacteriano. 6.2. Positivo: 6.2.1 Todo cultivo puro (un solo tipo de bacteria) con recuento mayor de 20,000 UFC x mL debe reportarse el género y especie, con su respectivo antibiograma. Por ejemplo: 6.2.1.1. Escherichia coli, 30 mil UFC x mL de orina. 6.2.2 Cultivos con 2 o más bacterias en las que el recuento total sobrepasa los 100,000 UFC, pero individualmente cada una tiene un recuento mayor de 20,000 UFC. 6.2.2.1. Escherichia coli >100,000 UFC x mL de orina. 6.2.2.2. Enterobacter cloacae 40 mil UFC x mL de orina

6.3. Repetir muestra: 6.3.1. Todo cultivo en el que el recuento sea mayor de 20,000 UFC x mL con más de una bacteria con género o especie diferentes. Si en el segundo cultivo se aíslan las mismas bacterias y en cantidades similares al primer cultivo, se reportan los géneros y especies aisladas con sus respectivos recuentos y antibiogramas. 6.3.2. En caso que el recuento sea menor de 20,000 UFC x mL. El hecho de que haya menos de 20,000 UFC x mL (en especial de varios tipos de bacterias) como sucede a menudo, sugiere que los microorganismos provienen de la microbiota normal o son contaminantes. Si en el segundo cultivo se aísla la misma bacteria y en cantidad similar al primer cultivo, se reporta el género y especie aislado con su respectivo antibiograma.


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


FLUJOGRAMA PARA REALIZAR UN UROCULTIVO

MUESTRA SIEMBRA

AGAR SANGRE DE CARNERO

Grampositivos: S. saprophyticcus, aureus, Streptococcus beta hemolíticos

AGAR Mac Conkey

COLONIAS LACTOSA (+) ó (-)

PRUEBAS PRESUNTIVAS Dependiendo de los resultados

TSI Y LIA Dependiendo de las reacciones

PRUEBAS CONFIRMATIVAS

BIOQUÍMICA COMPLEMENTARIA

ANTIBIOGRAMA

ANTIBIOGRAMA

Nota: Para realizar la identificación de grampositivos y gramnegativos, consultar en este manual los capítulos correspondientes a cada microorganismo aislado.

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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


VIII. BIBLIOGRAFÍA: 1. López SR, Reyes C J, González MA, Centeno R.: Normas Técnicas para el Urocultivo en Normas Técnicas de Bacteriología, capítulo V, 3ª ed. 1996, DANIDA/MINSA, Editorial Imprimatur, Managua, Nicaragua. 2. Tórrez MF. Urocultivo en Manual Práctico de Bacteriología Médica, Cap. 3, 1ª ed., 1996, Editorial Serviprensa, C.A., Guatemala. 3. Introducción a la Microbiología en Diagnóstico Microbiológico. Texto Atlas a color, Elmer W. Koneman editor, Cap. 3, 5ª ed. 1999, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 4. Principios del diagnóstico microbiológico en medicina en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg Geo. F. Brooks editor, Cap. 47, Editorial El Manual Moderno, 16ª edición, (traducción de la 21ª edición en inglés). México D.F. 1998. 5. Principios del diagnóstico microbiológico en medina en: Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks editor, Cap. 47, Editorial El Manual Moderno 16ª edición (traducción de la 21ª edición en inglés). México, D.F. 1998.


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CAPÍTULO 6.

Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

I. TOMA DE LA MUESTRA: 1. RECOMENDACIONES A LOS PACIENTES: No haber recibido tratamiento local o sistémico con antimicrobianos 3 días antes de la toma de muestra.

2. TIPO DE MUESTRA: Exudados o pus obtenidos de heridas infectadas, furúnculos y abscesos de tejidos u órganos.

3. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA: 3.1.

Retirar la costra o pústulas en la piel con un bisturí y pinzas estériles, previa limpieza con agua destilada o solución salina estéril, para remover ésta con mayor facilidad.

3.2.

En heridas, primero se debe realizar una limpieza en la superficie con el propósito de remover la suciedad o tejido muerto.

3.3.

Si en el interior de la herida hay pus, debe removerse haciendo uso de hisopos o torundas de gasa estériles. El pus no es un material apropiado para el cultivo por contener células vegetativas bacterianas muertas o predominantemente semidestruidas.

3.4.

Una vez removido el pus, la muestra debe tomarse con un hisopo estéril, frotando vigorosa pero gentilmente las paredes de la herida, o cavidad.

3.5.

Abscesos cerrados superficiales: en estos casos el médico debe drenar el absceso y eliminar el pus. La muestra para cultivo de bacterias se toma de las paredes de la cavidad, como se describe en el numeral 3.3.

3.6.

Abscesos cerrados profundos, órganos o tejidos internos, ojos (humor acuoso o vítreo), oído medio y otros: La muestra debe ser tomada exclusivamente por el médico. Si no es posible tome la muestra como en el numeral 3.3, el pus debe aspirarse por medio de una jeringa estéril de 3 o 5 mL. La cantidad de la muestra depende de la naturaleza de la lesión, pero no es necesario tomar más de 1mL.

Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

43

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: 1.

Para los numerales 3.4 y 3.5 los hisopos deben introducirse en el medio de transporte de Stuart, teniendo cuidado que el hisopo quede completamente introducido en el medio.

2.

En el tubo o jeringa con la muestra deben anotarse el código de la muestra, fecha y hora en que fue tomada.

3.

Todas las muestras deben acompañarse con una hoja que contenga como mínimo la siguiente información: 3.1. Institución 3.2. Sala 3.3. Número de expediente 3.4. Nombre del paciente 3.5. Edad 3.6. Sexo

3.7.

Resumen de historia clínica. Si existe un Comité de Infecciones Intrahospitalarias (CIIH) que requiera información adicional sobre los casos de infección, debe elaborarse una hoja con los datos que el CIIH determine.

4.

Transportar la muestra contenida en el medio de transporte a temperatura ambiente.

5.

Si la muestra obtenida está contenida en una jeringa (numeral 3.6), debe transportarse con refrigerante. Esto tiene el propósito que las enzimas líticas y autolíticas contenidas en el pus disminuyan su acción destructiva contra las bacterias.

III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: 1.

Rotular un plato de Agar Sangre de Carnero (ASC) y otro con Agar Mac Conkey (MacC).

2.

Con unas pinzas previamente flameadas en el mechero, extraiga el hisopo del medio de transporte.

3.

Haga un inóculo en una de las orillas del medio de ASC y luego en MacC. El inóculo debe ser hecho friccionando el hisopo en forma circular sobre un área de aproximadamente 1 cm de diámetro. Con el mismo hisopo haga un frotis para tinción de Gram.

4.

Si la muestra fue transportada en una jeringa, deposite una gota sobre una de las orillas de los medios de ASC y MacC. Haga un frotis para tinción de Gram.

5.

Dejar los inóculos durante un tiempo aproximado de 5 minutos para que el agar absorba el exceso de líquido y luego estríe en la forma convencional.

6.

Incubar de 35 a 37 oC durante 18 a 24 horas. El ASC se incuba en atmósfera de CO 2 (método de la jarra si no tiene incubadora con CO 2).

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


IV. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: 1. TOMA DE MUESTRA: 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6.

Jeringa estéril 3-5 mL Bisturí estéril Agua destilada estéril Solución salina estéril Hisopo de algodón estéril Solución antiséptica

2. TRANSPORTE DE LA MUESTRA 2.1. 2.2.

Tubos conteniendo medio de transporte de Stuart. Jeringas estériles descartables de 3 ó 5mL.

3. PROCESAMIENTO:

3.1. Equipos: 3.1.1. 3.1.2. 3.1.3. 3.1.4. 3.1.5. 3.1.6. 3.1.7. 3.1.8.

Incubadora a 35-37oC Incubadora con CO 2 a 35-37 oC Refrigeradora a 6-8oC Jarra con vela de parafina blanca (si no tiene incubadora con CO 2) Refrigeradora a 6-8oC Mechero Bunsen Reloj de mesa Microscopio con objetivo de 40X y 100X.

3.2. Materiales: 3.2.1. 3.2.2. 3.2.3. 3.2.4. 3.2.5. 3.2.6.

Marcadores indelebles Asas bacteriológicas rectas y redondas Reloj de mesa Guantes descartables Gradilla Contenedores con cloro al 0.5% para desechar material contaminante

3.3. Reactivos: Colorantes y reactivos para la tinción de Gram. 3.4. Medios de Cultivo: 3.4.1. Agar Sangre de Carnero al 5% (ASC) 3.4.2. Agar MacConkey (MacC)


45

6.1

I.

Procedimientos para la identificación de Pseudomonas aeruginosa

TOMA DE LA MUESTRA: ver capítulo 6.

II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: ver capítulo 6. III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: ver capítulo 6. IV. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: ver capítulo 6. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS BACILOS GRAMNEGATIVOS NO FERMENTADORES Los bacilos gram negativos no fermentadores son un grupo de bacterias aerobias no esporuladas que o bien no utilizan hidratos de carbono como fuente de energía o los degradan a través de vías metabólicas diferentes de la fermentación. Estas 1. 2. 3.

vías de degradación de la glucosa son tres: Vía de Embden- Meyerhof -Parnas (EMP) Vía de Entner- Doudoroff (ED) Vía de la hexosa monofosfato de Warburg Dickens (HMP)

La vía de EMP o vía glucolítica o anaerobia, la utilizan las bacterias anaerobias y hasta cierto punto también las anaerobias facultativas. Muchas bacterias incluidas todas las bacterias de la familia Enterobacteriaceae fermentan la glucosa a través de la vía EMP para formar ácido pirúvico, producto intermediario de la fermentación de carbohidratos. Los géneros de bacilos gramnegativos no fermentadores que se describen en este capitulo utilizan las vías de ED y HMP. La vía de ED es denominada vía aerobia debido a que necesita oxigeno para que haya glucólisis es decir, degradación de la glucosa. Los bacilos gramnegativos fermentadores oxidativos utilizan vías alternativas a la vía de EMP a través de las cuales la glucosa es oxidada. El termino oxidación significa la forma en que el ácido pirúvico transfiere sus iones hidrógeno. Al carecer de las enzimas deshidrogenasa necesarias para oxidar el ácido pirúvico a ácido láctico y otros ácidos mixtos, las bacterias oxidativas transfieren los iones hidrógeno del ácido pirúvico al ciclo de Krebs, donde se une al oxígeno para formar agua. Debido que el producto final es agua, las bacterias oxidativas no forman gas a partir de carbohidratos. Los medios bioquímicos usados para las bacterias fermentativas no pueden ser aplicados a las bacterias oxidativas, ya que Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


producen ácidos débiles insuficientes para hacer virar el indicador de pH y debido a esto, Hugh y Leifson fueron los primeros en diseñar un medio OF (oxidativo-fermentativo) que se adapta a las propiedades de los bacilos gramnegativos no fermentadores. (ver tabla 1).

TABLA No. 1: METABOLISMO DE LA GLUCOSA EN EL MEDIO DE OF METABOLISMO DE LA GLUCOSA

OXIDASA

TIPO DE REACCIÓN

FAMILIA / GÉNERO / ESPECIE

FERMENTATIVA

Negativa

Positiva

I

II

OXIDATIVA

Negativa

III

Positiva

IV

INACTIVA

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Negativa

V

Positiva

VI

Enterobacteriaceae Chromobacterium violaceum Aeromonas (hydrophila,salmonicida) Plesiomonas shigelloides Vibrio cholerae Actinobacillus (lignieresi, suis) Chromobacterium violaceum Pasteurella (aerogenes, haemolytica, pneumotropica) Kingella kingae Acinetobacter baumannii Acinetobacter haemolyticus Stenotrophomonas maltophila Pseudomonas (luteola, oryzihabitans) Pseudomonas (aeruginosa,fluorescens, putida) Pseudomonas (stutzeri, mendocina) Burkholderia (pseudomallei, cepacia) Achromobacter xylosoxidans Chryseobacterium gleum Empedobacter brevis Acinetobacter lwoffii Acinetobacter junnii Acinetobacter johnsonii Alcaligenes faecalis Pseudomonas (alcaligenes, pseudoalcaligenes) Comamonas (acidovorans, testosteroni) Bordetella bronchiseptica Myroides odoratus Moraxella (osloensis, atlantae) Oligella urethralis Psychrobacter phenylpyruvicus


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


La vía de HMP de Warburg Dickens es en realidad un híbrido o mezcla de las vías EMP y ED. Las bacterias no sacarolíticas como algunos géneros de bacilos no fermentadores que no utilizan hidratos de carbono, son inertes en el medio OF, el cual conserva su pH alcalino después de la incubación. Las bacterias anaerobias facultativas pueden utilizar las dos vías EMP y ED indistintamente dependiendo de las condiciones ambientales en que se desarrollen.

V. ALCANCE: Laboratorios de la Red: Numerales del 1.4.1 al 1.4.8 y del 1.4.10 al 1.4.16 con respecto a pruebas de identificación.

CNDR: Numerales del 1.4.1 al 1.4.16 con respecto a pruebas de identificación.

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: El género Pseudomonas está constituido por bacilos gram negativos aerobios que no forman esporas y son rectos o ligeramente curvos, miden de 1.5 a 5 µm de largo y 0.5 a 1.0 µm de ancho. Las Pseudomonas spp son móviles debido a la presencia de uno o más flagelos polares. Los aislamientos obtenidos de muestras clínicas son oxidasa y catalasa positiva y crecen en Agar MacConkey como UFCs no fermentadoras de lactosa. La mayoría de las especies degradan la glucosa oxidativamente y reducen nitratos a gas nitrógeno. Las colonias son usualmente extendidas y planas, tienen bordes irregulares y un brillo metálico característico, el cual es frecuentemente asociado con la autólisis de las colonias. Existen otras variantes de colonias incluyendo formas lisas, gelatinosas y mucoides. Pseudomonas aeruginosa produce varios pigmentos solubles en agua, como el pigmento verde amarillento fluorescente llamado pioverdina (también producida por P. fluorescens y P. putida). Cuando la pioverdina se combina con un pigmento azul hidrosoluble, pigmento fenazina, se produce piocianina, un color azul turqueza-verde brillante característico de P. aeruginosa. Unas pocas cepas de Pseudomonas aeruginosa pueden producir pigmentos de otros colores como piorubrina (rojo) o piomelanina ( marrón a negro). Pseudomonas aeruginosa puede ser identificada sobre la base de la prueba de oxidasa, TSI, crecimiento a 42oC y producción de pigmentos ya sea fluorescente, azul verde, rojo o café en Agar Mueller Hinton. Algunas cepas de Pseudomonas aeruginosa producen solo pioverdina (verde amarillo fluorescente) característica que comparte con P. fluorescens y P. putida pero la habilidad de P. aeruginosa de crecer a 42oC la distingue de las otras dos especies. P. fluorescens puede ser diferenciada de P. putida basándose en su habilidad de degradar la gelatina. (ver tabla No. 2).


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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


TABLA 2. BIOQUÍMICA DIFERENCIAL DEL GRUPO FLUORESCENTE

AP (pyocianina) AF (pyoverdina) Reducción de nitratos Gas de nitratos (desnitrificación) Crecimiento a 42 C o

Gelatina

Pseudomonas aeruginosa + + (65)* + (98) + (93) + (100) V (82)

Pseudomonas fluorescens –

Pseudomonas putida –

+

(96)

+

(93)

V

(19)

–

(0)

–

(3)

–

(0)

–

(0)

–

(0)

+

(100)

–

(0)

* Porcentajes. El género Pseudomonas pertenece a la familia Pseudomonadaceae. Se han creado dos esquemas para clasificarlos. Un esquema popularizado por Gilardi se basa en las características fenotípicas y las divide en los grupos:

1. GRUPO FLUORESCENTE: 1.1. Pseudomonas aeruginosa 1.2. Pseudomonas fluorescens 1.3. Pseudomonas putida 2. GRUPO STUTZERI: 2.1. Pseudomonas stutzeri 2.2. Pseudomonas mendocina 2.3. CDC grupo Vb-3 3. GRUPO ALCALÍGENES: 3.1. Pseudomonas alcaligenes 3.2. Pseudomonas pseudoalcaligenes 3.3. Pseudomonas spp. CDC Grupo I 4. HOMOLOGÍA DE ÁCIDOS NUCLEICOS DESCONOCIDA (OXIDASA NEGATIVA): 4.1. Pseudomonas luteola 4.2. Pseudomonas oryzihabitans Pseudomonas aeruginosa es la especie que con mayor frecuencia se recupera de muestras clínicas. Las infecciones se observan habitualmente en los sitios en los que tiende a acumularse humedad: quemaduras, heridas cutáneas exudativas, oído externo. También producen infecciones del tracto urinario, tracto respiratorio, fibrosis quística, infecciones oculares, endocarditis e infecciones óseas por diseminación hemática. Por otro lado, se asocian a infecciones del torrente sanguíneo asociada al empleo de dispositivos intravasculares como catéteres permanentes.

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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


VII. IDENTIFICACION: 1. EQUIPO, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACION:

1.1. Equipo: 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3. 1.1.4. 1.1.5.

Incubadora de 35 oC a 37 oC Incubadora de 42oC Microscopio con objetivo de 40x Mechero tipo Bunsen Reloj de mesa

1.2. Materiales y Reactivos: Materiales: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6. 1.2.7.

Guantes descartables no estériles Láminas portaobjetos Asas bacteriológicas con punta redonda y recta Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de material pequeño Marcadores indelebles Lámpara de Wood (luz ultravioleta) de onda larga (400nm) Palillos de madera

Reactivos: 1.2.8. 1.2.9. 1.2.10. 1.2.11. 1.2.12. 1.2.13.

Solución A: Alfa naftilamina Solución B: Ácido sulfanílico Solución Salina estéril al 0.85% Polvo de Cinc Tiras de oxidasa Aceite mineral inerte estéril

1.3. Medios de Cultivo: 1.3.1 Agar MacConkey

1.4. Pruebas para Identificación: 1.4.1 1.4.2 1.4.3 1.4.4 1.4.5 1.4.6 1.4.7 1.4.8 1.4.9

TSI LIA Prueba de la oxidasa Prueba de movilidad al fresco Prueba de reducción de nitratos Prueba de producción de gas a partir de nitratos Determinacion de la piocianina en Agar P Determinacion de la pioverdina en Agar F Hidrólisis de gelatina Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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MANUAL

1.4.10 1.4.11 1.4.12 1.4.13

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Dihidrolisis de arginina Degradación de Glucosa OF (oxidación–fermentación) Crecimiento en Agar Cetrimida Crecimiento en agar MacConkey a 42 oC

1.5. Cepas para control de calidad: 1.5.1 1.5.2 1.5.3 1.5.4

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Enterococcus faecalis ATCC 29212

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS: 1.6 Antimicrobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: Ver capítulo 16. 1.7 Antimicrobianos a utilizar para la Concentracion Minima Inhibitoria: Ninguno.

1.8 Pruebas Especiales: Ninguna.

2

CRECIMIENTO EN Mac CONKEY

2.1. Fundamento del medio de cultivo: ver capítulo 17. 2.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 2.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Pseudomonas spp carece de las enzimas galactósidopermeasa y galactosidasa, por lo que no tienen la capacidad de fermentar la lactosa. Por lo tanto, las UFC aparecen incoloras o transparentes, con un brillo metálico característico, planas, de bordes irregulares, con olor característico a uvas o a tamal pizque.

2.4. Resultado: Crecimiento de colonias incoloras, transparentes, con un brillo metálico característico, planas, de bordes irregulares, con olor característico a uvas o a tamal pizque, después de 24 horas de incubación.

2.5. Control de calidad: 2.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Crecimiento de colonias incoloras o transparentes, con un brillo metálico característico, planas, de bordes irregulares, con olor característico a uvas o a tamal pizque. 2.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Crecimiento de colonias rosadas, convexas, umbilicadas con tamaños entre 2-4 mm. 52


MANUAL

3

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


PRUEBA DE TSI (TRIPLE SUGAR IRON AGAR):

3.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 3.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 3.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Pseudomonas spp carecen de la enzima glucosa 6 fosfatos deshidrogenasa, por lo que no tienen la capacidad de fermentar la glucosa. No poseen la enzima invertasa por lo tanto no pueden fermentar la sacarosa. No poseen la enzima hidrogenasa fórmica por lo que no producen gas a partir de la glucosa.

3.4. Resultado: Características del crecimiento: K /K (alcalino / alcalino = rojo / rojo)

3.5. Control de calidad: 3.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: No fermentan la lactosa / No fermentan la glucosa. No hay producción de gas: K/K (alcalino /alcalino = rojo / rojo). 3.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Fermentan la lactosa / Fermentan la glucosa, con producción de abundante gas: A/A G (ácido /ácido gas abundante = amarillo / amarillo, gas).

4

PRUEBA DE LIA (LISINE IRON AGAR):

4.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 4.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 4.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Las especies de Pseudomona spp no poseen la enzima lisina descarboxilasa por lo tanto no descarboxilan la lisina. Tampoco poseen la enzima lisina desaminasa por lo que no desaminan la lisina.

4.4. Resultado: Características del crecimiento: K /K (alcalino / alcalino = violeta / violeta)

4.5. Control de calidad: 4.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: No desaminan la lisina / No descarboxilan la lisina ni fermentan la glucosa: K/K (alcalino/ alcalino = violeta / violeta). 4.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: No desaminan la lisina / Descarboxilan la lisina: K/K (alcalino alcalino = violeta / violeta).


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


5. PRUEBA DE LA OXIDASA:

5.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 5.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 5.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Las especies de Pseudomonas poseen la enzima citocromooxidasa (excepto luteola y orizyhabitans).

5.4. Resultado: Presencia de indofenoloxidasa positiva: Hay viraje de color a púrpura intenso en los primeros 10 segundos.

5.5. Control de calidad: 5.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Oxidasa positiva: hay viraje de color a púrpura intenso en los primeros 10 segundos. 5.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Oxidasa negativa: No hay viraje de color en los primeros 10 segundos. Se observa de color amarillo.

6. PRUEBA DE MOVILIDAD AL FRESCO:

6.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 6.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 6.3. Fundamento fisiológico de la bacteria: Pseudomonas aeruginosa posee 1 flagelo polar que le confiere gran movilidad sin dirección fija.

6.4. Resultado: Movilidad positiva: Se observa al microscopio bacilos con movimientos en diferentes direcciones y desplazamientos repentinos a larga distancia.

6.5. Control de calidad: 6.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Movilidad positiva: Se observan bacilos con movimientos en diferentes direcciones y desplazamientos repentinos a larga distancia. 6.5.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Resultado: Movilidad negativa: Se observan bacilos sin movimientos. Existe movimiento giratorio (movimiento Browniano) que no debe confundirse con movimiento bacteriano.

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


7. PRUEBA DE REDUCCIÓN DE NITRATOS:

7.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 7.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 7.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Pseudomonas aeruginosa tiene la capacidad de reducir nitratos a nitritos y de producir gas nitrógeno derivado de los nitratos. Usualmente en las bacterias que convierten los nitratos a nitritos pero no a otro productos como el gas nitrógeno, los nitritos suelen detectarse al agregar en partes iguales el reactivo A (alfa naftilamina) y B (ácido sulfanílico). Cuando los nitritos están presentes se da un viraje del caldo a un color rojo intenso en los primeros 30 minutos de la reacción. Sin embargo, en bacterias como el caso de Pseudomonas aeruginosa que convierten los nitratos a nitritos pero que también producen gas de nitrógeno en gran cantidad, la detección de los nitritos después de agregar los reactivos no es observable. Esto se puede comprobar fácilmente al agregar aproximadamente 20 mg de cinc. Cuando los nitratos no fueron convertidos a nitritos, el cinc hace la conversión y el viraje a color rojo intenso se hace presente. Sin embargo, en el caso de las Pseudomonas aeruginosa este viraje no se presenta, lo que comprueba la conversión. La producción de gas nitrógeno es detectada por la presencia de burbujas en la parte superior del tubo de Durham.

7.4. Resultado: Reducción de nitratos a nitratos positiva: Hay viraje a color rojo después de agregar los reactivos de prueba. Producción de gas nitrógeno positiva: Hay burbujas de gas en el tubo de Durham.

7.5. Control de calidad: 7.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Reducción de nitratos a nitritos positiva. No hay viraje de color, después de agregar los reactivos de prueba, ni al agregar 20 mg de polvo de cinc. Producción de gas nitrógeno a partir de nitratos positiva: se observan burbujas de gas en la parte superior del tubo de Durham invertido. 7.5.2. Enterococcus faaecalis ATCC 29212 Resultado: Reducción de nitratos a nitritos negativa. No hay viraje de color después de agregar los reactivos de prueba. Confirmación: Luego de la adición de aproximadamente 20 mg de cinc el caldo vira a color rojo después de 5 a 10 minutos. Producción de gas nitrógeno a partir de nitratos negativa: No hay burbujas de gas en el tubo de Durham. Todo el tubo aparece lleno del caldo.


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DE

PROCEDIMIENTOS

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8. DETERMINACION DE PIOCIANINA EN AGAR P:

8.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 8.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 8.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Pseudomonas aeruginosa tiene la habilidad de producir el pigmento piocianina, el cual es un pigmento azul verde o azul turquesa no fluorescente bajo luz ultravioleta, soluble en agua y que se puede observar a simple vista.

8.4. Resultado: Producción del pigmento piocianina positiva: Se observa un pigmento azul-verde o azul turquesa sobre el crecimiento bacteriano.

8.5. Control de calidad: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Producción de piocianina positiva: se observa un pigmento verde azulado o azul turquesa sobre el crecimiento bacteriano. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Producción de piocianina negativa: Se observa crecimiento sin pigmento.

9. DETERMINACIÓN DE PIOVERDINA EN AGAR F:

9.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 9.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 9.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Pseudomonas aeruginosa produce pioverdina, un pigmento orgánico luminiscente que con la luz ultravioleta de onda larga emite una fluorescencia verde amarillenta intensa.

9.4. Resultado: Resultado: Producción de pioverdina positiva: Bajo luz ultravioleta se observa fluorescencia verde amarillenta intensa en toda la zona de crecimiento.

9.5. Control de calidad: 9.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Producción de pioverdina positiva: bajo luz ultravioleta se observa fluorescencia verde amarillenta intensa en toda la zona de crecimiento. 9.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Producción de pioverdina negativa: bajo luz ultravioleta no hay fluorescencia en la zona de crecimiento. 56


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DE

PROCEDIMIENTOS

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10.HIDRÓLISIS DE GELATINA:

10.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 10.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 10.3. Fundamento bioquímico de la bacteria:

El 82% de Pseudomonas aeruginosa posee enzimas gelatinolíticas (gelatinasas) que hidrolizan la gelatina provocando la licuefacción del medio sólido de gelatina.

10.4. Resultado: Hidrólisis de la gelatina variable: Puede observarse o no un halo opaco alrededor del crecimiento de la colonia.

10.5. Control de Calidad: 10.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Hidrólisis de gelatina positiva: Se observa un halo opaco alrededor del crecimiento de la colonia. 10.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Hidrólisis de gelatina negativa: Se observa crecimiento bacteriano sin halo opaco alrededor.

11.DIHIDRÓLISIS DE ARGININA:


Pseudomonas aeruginosa posee la enzima deshidrogenasa y por consiguiente la arginina es convertida a citrulina y ornitina para formar putrescina, la cual acentúa el pH alcalino.

11.4. Resultado: Dihidrólisis de arginina positiva: No hay viraje de color. El caldo se observa con un púrpura más acentuado.

11.5. Control de Calidad: 11.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Hidrólisis de arginina positiva: No hay viraje de color. El caldo se observa con un púrpura mas intenso. 11.5.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Resultado: Hidrólisis de arginina negativa: Hay viraje de color a amarillo por la fermentación de la glucosa.


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PROCEDIMIENTOS

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12.GLUCOSA OF (OXIDACIÓN–FERMENTACIÓN):

12.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 12.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 12.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Pseudomonas aeruginosa oxida la glucosa, por lo que produce ácido solo en aerobiosis. Esta reacción se observa en la parte superior del tubo que no lleva aceite mineral, con viraje al color amarillo. No hay reacción en el tubo con aceite mineral (anaerobiosis).

12.4. Resultado: Oxidación de la glucosa positiva: Hay viraje de color a amarillo en la parte superior del tubo que no lleva aceite mineral (ver tabla No. 1). En el tubo con aceite mineral (reacción en anaerobiosis) no hay cambios y por lo tanto, no hay viraje de color.

12.5. Control de Calidad: 12.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Oxidación de la glucosa positiva. Se observa viraje de color al amarillo en la parte superior del tubo sin aceite mineral (reacción en aerobiosis). No hay actividad en el tubo con aceite mineral (reacción en anaerobiosis). No hay viraje de color. 12.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Oxidación de la glucosa negativa. Fermentación de la glucosa positiva. Hay viraje de color a lo largo de los dos tubos (aerobiosis y anaerobiosis).

13.CRECIMIENTO EN AGAR CETRIMIDA:

13.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 13.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 13.3. Fundamento fisiológico de la bacteria: Pseudomonas aeruginosa tiene la capacidad de crecer en presencia de cetrimida (bromuro de cetil trimetil amonio), un agente que actúa como detergente, disminuyendo la tensión superficial en el medio. Como resultado, muchas bacterias son inhibidas por esta acción a excepción de Pseudomonas aeruginosa. La presencia de cloruro de magnesio y sulfato de potasio estimulan la formación del pigmento azul verde o azul turquesa no fluorescente piocianina y el pigmento verde-amarillo fluorescente de pioverdina que puede ser detectado bajo luz ultravioleta de onda larga (400nm).

13.4. Resultado: Crecimiento en cetrimida positivo: Hay crecimiento de colonias en las que se observa pigmentación azul turquesa (piocianina) y verde amarillo fluorescente (pioverdina) detectado bajo luz ultravioleta.

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13.5. Control de calidad: 13.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Crecimiento en cetrimida positivo: hay buen crecimiento con pigmento azul verdoso y verde amarillento fluorescente que detecta la fluoresceína o pioverdina en presencia de luz ultravioleta.. 13.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Crecimiento en cetrimida negativo. No hay crecimiento ni pigmentos.

14.CRECIMIENTO EN AGAR Mac CONKEY A 42ºC

14.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 14.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 14.3. Fundamento fisiológico de la bacteria: Peudomonas aeruginosa es tolerante a la temperatura de 42oC en agar Mac Conkey, lo que la distingue de las especies P. fluorescens y P. putida del grupo fluorescente.

14.4. Resultado: Crecimiento en agar MacConkey a 42 oC positivo: hay crecimiento bacteriano.

14.5. Control de calidad: 14.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Crecimiento en Mac Conkey a 42oC positivo: hay crecimiento bacteriano de UFCs características. 14.5.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Crecimiento en Mac Conkey a 42 oC negativo: no hay crecimiento bacteriano.


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P. aeruginosa

–

+ Gas de nitrógeno – Reducción de nitratos a nitritos –

+ Crecimiento a 42 o C – P. fluorescens P. putida

P. stutzeri P. mendocina

DE

+ Pigmentos verdes brillante en Cetrimida o Agar P y F – + Gelatina – + Arginina –

P. stutzeri P. mendocina P. putida

PROCEDIMIENTOS

P. aeruginosa P. fluorescens P. putida

P. aeruginosa P. fluorescens

P. pseudoalcaligenes P. alcaligenes Pseudomonas spp. CDC grupo 1

P. luteola P. orizyhabitans

DE

Glucosa OF

P. luteola P. stutzeri P. alcaligenes P. orizyhabitans P. mendocina Pseudomonas spp. CDC P. putida P. pseudoalcaligenes grupo 1

+ OXIDASA -

1. DIAGRAMA DE FLUJO PARA NO FERMENTADORES MOVILIDAD POSITIVA


6.2

Procedimientos para la identificación de Acinetobacter spp

I. ALCANCE: Laboratorios de la Red: Numerales del 1.4.1 al 1.4.11 con respecto a pruebas de identificación. CNDR: Numerales del 1.4.1 al 1.4.12 con respecto a pruebas de identificación.

II. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: El género Acinetobacter esta constituido por cocobacilos gramnegativos frecuentemente agrupados en pares, estrictamente aerobios, que miden de 1 a 1.5 µm de largo por 1.5 a 2.5 µm de ancho. Carecen de la enzima indofenoloxidasa, inmóviles, y no poseen las enzimas para convertir los nitratos a nitritos. En fase estacionaria de crecimiento y en agares no selectivos predominan formas cocobacilares. Las colonias son lisas, opacas y ligeramente pequeñas. Muchas cepas en Agar Mac Conkey aparecen ligeramente rosadas. El género fue originalmente ubicado en la familia Neisseriaceae pero actualmente esta ubicado en la familia Moraxellaceae. Estudios basados en hibridación del DNA los han clasificado en 21 genomaespecies, de los cuales solo 7 han sido nombrados y de estos, las especies mas frecuentemente aisladas son: Acinetobacter baumannii, seguido por Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter haemolyticus, Acinetobacater johnsonii y Acinetobacter junnii. Las especies de Acinetobacter están ampliamente distribuidas en la naturaleza y en el ambiente hospitalario. Son el segundo aislamiento más común luego de Pseudomonas aeruginosa. Son capaces de sobrevivir en la mayoría de superficies secas y húmedas y también pueden estar presentes transitoriamente en la piel humana. Acinetobacter spp son generalmente considerados como no patogénicos pero pueden causar infecciones en individuos debilitados. La mayoría de las infecciones adquiridas en los hospitales afectan el tracto respiratorio, urinario y heridas. Ya sea de estos sitios o por su crecimiento en dispositivos como catéteres, las infecciones pueden progresar a infecciones del torrente sanguíneo. La facilidad de estos microorganismos para adquirir resistencia a múltiples antimicrobianos y su alta capacidad de sobrevivir en muchas superficies ha conducido a su incremento en infecciones hospitalarias.


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


III. IDENTIFICACION: 1. EQUIPO, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIÓN:

1.1. Equipo: 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3. 1.1.4. 1.1.5.

Incubadora de 35 oC a 37 oC Incubadora de 42oC Microscopio con objetivo de 40x Mechero tipo Bunsen Reloj de mesa

1.2. Materiales y Reactivos: Materiales: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6.

Guantes descartables no estériles Asas bacteriológicas con punta redonda y recta Láminas portaobjetos Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de material pequeño Marcadores indelebles Palillos de madera

Reactivos: 1.2.7. 1.2.8. 1.2.9. 1.2.10. 1.2.11. 1.2.12.

Solución A: Alfa Naftilamina Solución B: Ácido Sulfanílico Solución Salina estéril al 0.85% Polvo de Cinc Tiras de oxidasa Aceite mineral inerte estéril

1.3. Medios de Cultivo: 1.3.1. Agar Mac Conkey

1.4. Pruebas para Identificación: 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3. 1.4.4. 1.4.5. 1.4.6. 1.4.7. 1.4.8.

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Triple Sugar Iron Agar Lisine Iron Agar Oxidasa Movilidad Reducción de nitratos Crecimiento en agar Mac Conkey a 42 oC Glucosa OF (oxidación–fermentación) Utilización del malonato


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


1.4.9. Dihidrolisis de arginina 1.4.10. Utilización del citrato 1.4.11. Hidrólisis de gelatina

1.5 Cepas para control de calidad: 1.5.1 1.5.2 1.5.3 1.5.4

Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS: 1.6. Antimicrobianos a utilizar por el metodo de Kirby y Bauer: ver capítulo 16. 1.7. Antimicrobianos a utilizar para la Concentracion Minima Inhibitoria: Ninguno

1.8. Pruebas Especiales: Ninguna

2. CRECIMIENTO EN AGAR Mac CONKEY:

2.1. Fundamento del medio de cultivo: ver capítulo 17. 2.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 2.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Acinetobacter spp carecen de las enzimas galactósidopermeasa y galactosidasa, por lo que no tienen la capacidad de fermentar la lactosa y las colonias aparecen lisas, opacas y pequeñas. Algunas cepas de Acinetobacter baumannii tienen aspecto ligeramente rosado.

2.4. Resultado: Crecimiento en agar Mac Conkey: UFCs lisas, opacas, pequeñas y ligeramente rosadas después de 24 horas de incubación. Acinetobacter johnsonii crece con dificultad en agar Mac Conkey.

2.5. Control de calidad: 2.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Crecimiento de colonias incoloras o transparentes, con un brillo metálico característico, planas, de bordes irregulares, con olor característico a uvas o a tamal pizque. 2.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Crecimiento de colonias rosadas, convexas, umbilicadas con tamaños entre 2-4 mm. Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


3. PRUEBA DE TSI (TRIPLE SUGAR IRON):

3.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 3.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 3.3. Fundamento bioquimico de la bacteria: Acinetobacter spp carecen de la enzima glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, por lo que no tienen la capacidad de fermentar la glucosa. No poseen la enzima invertasa por lo tanto no pueden fermentar la sacarosa. No poseen la enzima hidrogenasa fórmica por lo que no producen gas a partir de la glucosa.

3.4. Resultado: Características del crecimiento: K /K (alcalino / alcalino = rojo / rojo)

3.5. Control de calidad: 3.5.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Fermentan la lactosa / Fermentan la glucosa, con producción de abundante gas: A/A G (ácido /ácido gas abundante = amarillo / amarillo, gas) 3.5.2. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: No fermentan la lactosa / No fermentan la glucosa. No hay producción de gas: K/K (alcalino /alcalino = rojo / rojo).

4. PRUEBA DE LIA (LISINE IRON AGAR):

4.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 4.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 4.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Acinetobacter spp no poseen la enzima lisinadescarboxilasa por lo tanto no descarboxilan la lisina. Tampoco poseen la enzima lisinadesaminasa por lo que no desaminan la lisina.

4.4. Resultado: Características del crecimiento: K /K (alcalino / alcalino = violeta / violeta)

4.5. Control de calidad: 4.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: No desaminan la lisina / No descarboxilan la lisina ni fermentan la glucosa: K/K (alcalino/ alcalino = violeta / violeta) 4.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: No desaminan la lisina / Descarboxilan la lisina: K/K (alcalino alcalino = violeta / violeta)

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


5. PRUEBA DE OXIDASA:

5.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 5.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 5.3. Fundamento bioquímica de la bacteria: Todas las especies de Acinetobacter no poseen la enzima citocromooxidasa por lo que no hay viraje de color en la tira reactiva dentro de los 10 segundos de reacción.

5.4. Resultado: Presencia de indofenoloxidasa negativa: Hay viraje de color al púrpura intenso en los primeros 10 segundos.

5.5. Control de calidad: 5.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Oxidasa positiva: hay viraje de color al púrpura intenso en los primeros 10 segundos. 5.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Oxidasa negativa: No hay viraje de color en los primeros 10 segundos. Se observa de color amarillo.

6. MOVILIDAD AL FRESCO:

6.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 6.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 6.3. Fundamento fisiológico de la bacteria: Todas las especies de Acinetobacter no poseen flagelos por lo que se observa al microscopio, cocobacilos inmóviles.

6.4. Resultado: Movilidad negativa: Se observa al microscopio cocobacilos inmóviles.



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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


7. REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS:

7.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 7.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 7.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Todas las especies del genero Acinetobacter carecen de la capacidad de reducir los nitratos a nitritos y a otros productos, por lo que no hay viraje de color después de agregar los reactivos de prueba ni producción de gas en el tubo de Durham.

7.4. Resultado: Reducción de nitratos a nitritos negativa: No hay viraje de color dentro de los primeros 10 minutos después de agregar los reactivos de prueba. Al agregar 20 mg de polvo de cinc hay viraje de color a rosado intenso en los primeros 5 a 10 minutos (reacción verdaderamente negativa). Producción de gas nitrógeno negativa: No hay burbujas de gas en el tubo de Durham.

7.5. Control de calidad: 7.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Reducción de nitratos a nitritos positiva. No hay viraje de color, después de agregar los reactivos de prueba, ni al agregar 20 mg de polvo de cinc. Producción de gas de nitrógeno a partir de nitratos positiva: se observan burbujas de gas en la parte superior del tubo de Durham. 7.5.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Reducción de Nitratos a nitritos negativa. No hay viraje de color después de agregar los reactivos de prueba. Confirmación: Luego de la adición de aproximadamente 20 mg de cinc el caldo vira a color rojo después de 5 a 10 minutos. Producción de gas nitrógeno a partir de nitratos negativa: No hay burbujas de gas en el tubo de Durham. Todo el tubo aparece lleno con el caldo.

8. CRECIMIENTO EN AGAR MacCONKEY A 42ºC:

8.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 8.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 8.3. Fundamento de la bacteria: De las dos especies de Acinetobacter más comunes en infecciones hospitalarias, Acinetobacter baumannii crece a 42º C. Acinetobacter lwoffi carece de la habilidad de crecer a 42 oC.

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PROCEDIMIENTOS

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8.4. Resultado: Crecimiento a 42 oC positivo: Acinetobacter baumannii , Acinetobacter junnii. Desarrollo de colonias opacas, pequeñas y ligeramente rosadas. Crecimiento a 42o negativo: Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter haemolyticus y Acinetobacter johnsonii

8.5. Control de calidad: 8.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Crecimiento en MacConkey a 42oC positivo: hay crecimiento bacteriano.de UFCs características. 8.5.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Crecimiento en MacConkey a 42 oC negativo: no hay crecimiento bacteriano.

9. GLUCOSA OF (OXIDACIÓN–FERMENTACIÓN):

9.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 9.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 9.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: La especie Acinetobacter baumannii oxida la glucosa en el medio de OF y como resultado, hay acidificación en la parte superior del tubo que no está recubierto con aceite mineral (aerobiosis). Acinetobacter junnii, A. johnsonii y A. iwoffii no son oxidativos para la glucosa, por lo que las tres especies son inactivas en este medio, tanto en el tubo con aerobiosis como en el de anaerobiosis (recubierto con aceite mineral). A. haemolyticus puede o no oxidar la glucosa.

9.4. Resultado: Oxidación de la glucosa: Viraje de color al amarillo en la parte superior del tubo incubado en aerobiosis (sin aceite mineral): Acinetobacter baumannii y A. haemolyticus. Oxidación de la glucosa variable: Puede o no haber oxidación de la glucosa: A. haemolyticus Inactivo (no hay oxidación de la glucosa): No hay viraje de color en el tubo incubado en anaerobiosis (con aceite mineral). Viraje de color al azul en la parte superior del tubo incubado en aerobiosis (sin aceite mineral): Acinetobacter junnii, A. johnsonii y A. lwoffii.

9.5. Control de calidad: 9.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Oxidación de la glucosa positiva. Se observa viraje de color a amarillo en el tercio superior del tubo incubado en aerobiosis (sin aceite mineral). En el tubo con aceite mineral (reacción en anaerobiosis) no hay cambios y por lo tanto, no hay viraje de color.


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


9.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Fermentación de la glucosa positiva en aerobiosis y anaerobiosis. Hay viraje de color al amarillo en los dos tubos.

10.UTILIZACIÓN DEL MALONATO:


Acinetobacter baumannii y A. johnsonii utilizan el malonato como única fuente de carbono, a diferencia de Acinetobacter haemolyticus, A. junnii y A. lwoffii que no lo utilizan.

10.4. Resultado: 10.4.1. Utilización del malonato como única fuente de carbono positiva: Hay viraje de color al azul: Acinetobacter baumannii y A. johnsonii. 10.4.2. Utilización del malonato como única fuente de carbono negativa: No hay viraje de color: Acinetobacter haemolyticus, A. junnii y A. lwoffii.

10.5. Control de calidad: 10.5.1. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Resultado: Malonato positivo. Hay viraje de color al azul. 10.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Malonato negativo. No hay viraje de color. El caldo se observa de color verde.

11.DIHIDRÓLISIS DE ARGININA.

11.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 11.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 11.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Acinetobacter baumannii, A. haemolyticus y A. junnii poseen la enzima deshidrogenasa y por consiguiente la arginina es convertida a citrulina y ornitina para luego formar putrescina. Este compuesto es alcalino, lo cual intensifica el color púrpura del medio. Acinetobacter lwoffii no hidroliza la arginina y Acinetobacter johnsonii da reacciones variables.

11.4. Resultado: 11.4.1. Hidrólisis de la arginina positiva: Intensificación del color púrpura en el medio: Acinetobacter baumannii, A. haemolyticus y A. junnii.

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


11.4.2. Hidrólisis de la arginina negativa: Viraje de color del púrpura a amarillo: Arginina: Positiva. El caldo se observa de color púrpura. 11.4.3. Hidrólisis de la arginina variable: Intensificación del color púrpura o viraje de color a amarillo: Acinetobacter johnsonii.

11.5. Control de calidad: 11.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Hidrólisis de arginina positiva. El caldo se observa turbio y de color púrpura. 11.5.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Resultado: Hidrólisis de arginina negativa: Hay viraje de color a amarillo por la fermentación de la glucosa.

12.UTILIZACIÓN DEL CITRATO:

12.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 12.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 12.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Acinetobacter baumannii, A. haemolyticus y A. johnsonii utilizan el citrato como única fuente de carbono. Acinetobacter iwoffii no lo utiliza y Acinetobacter junnii puede o no utilizarlo.

12.4. Resultado: Utilización del citrato positiva: Hay viraje de color a azul y crecimiento en la superficie del medio: Acinetobacter baumannii, A. haemolyticus y A. johnsonii. Utilización del citrato negativa. No hay viraje de color ni crecimiento en la superficie del medio. El medio se observa de color verde: Acinetobacter iwoffii . Utilización del citrato variable: Puede o no haber viraje de color y crecimiento en la superficie del medio. El medio se puede observar de color azul o verde: Acinetobacter junnii.

12.5. Control de calidad: 12.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Utilización del citrato positivo: Hay viraje de color a azul y crecimiento en la superficie del medio. 12.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Utilización del citrato negativo. No hay viraje de color ni crecimiento en la superficie del medio. El medio se observa de color verde.


69

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


13.HIDRÓLISIS DE GELATINA:

13.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 13.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 13.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: A excepción de Acinetobacter haemolyticus que hidroliza la gelatina, las especies de Acinetobacter baumannii, A. junnii, A. johnsonii y A. iwoffii no poseen la enzimas gelatinaza que hidrolizan la gelatina y por lo tanto no se producirá licuefacción del medio.

13.4. Resultado: 13.5.1. Hidrólisis de la gelatina positiva: Se observa un halo opaco alrededor del inóculo: Acinetobacter haemolyticus 13.5.2. Hidrólisis de la gelatina negativa. No se observa un halo opaco alrededor del inóculo: Acinetobacter baumannii, A. junnii, A. johnsonii y A. lwoffii:

13.5. Control de calidad: 13.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 13.5.2. Resultado: Hidrólisis de la gelatina positiva. Se observa un halo opaco alrededor del inóculo. 13.5.3. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Hidrólisis de la gelatina negativa. No se observa un halo opaco alrededor del inóculo.

Tabla No 1. Pruebas para diferenciar especies de Acinetobacter spp 37 o C Acinetobacter baumannii

42 o C

+ (100)** + (100)

Reducción de nitratos

Glucosa Arginina Gelatina OF

Citrato Malonato

–

Oxidativo (95)

+ (98)

– ( 0)

+ (100)

+ (98)

Acinetobacter haemolyticus*

+ (100)

– ( 0)

–

Variable

+ (96) (52)

+ (96)

+ (91)

– ( 0)

Acinetobacter junii

+ (100)

+ (90)

–

– ( 0)

+ (95)

– ( 0)

+ ó-(82)

– ( 0)

Acinetobacter johnsonii

– ( 0)

– ( 0)

–

– ( 0)

+ ó – (35)

– ( 0)

+(100)

+ ó – (13)

Acinetobacter iwoffii

+(100)

– ( 0)

–

– ( 6)

– ( 0)

– ( 0)

– ( 0)

– ( 0)

* A. haemolyticus: hemolisa la sangre de carnero. ** Porcentajes. 70


o

o

A. junnii A. baumannii

A. baumennii

– GLUCOSA OF + – MALONATO + A. junnii

A. haemolyticus

– ARGININA + – CITRATO + – GELATINA +

A. Iwoffii A. haemolyticus

A. Iwoffi

A. johnsonnii

En MacConkey

– CRECIMIENTO A 37 C +

en MacConkey

– CRECIMIENTO A 42 C +

A. johnsonii, A. Iwoffii A. haemolyticus

B. gladioli

F. oryzihabitans B. gladioli

–

F. oryzihabitans

MALTOSA OF +

P. luteola

– ESCULINA +

– REDUCCION NITRATOS A NITRITOS+

–

DNAsa + + MANITOL OF

C. luteola S. maltophila

S. maltophila

–

DE

Group NO-1

Pseudomonas luteola Flaviomonas oryzihabitans Stenotrophomonas maltophila Burkholderia gladioli

Acinetobacter baumannii A. lwoffii, A. haemolyticus A. junii, A. johnsonni Group NO-1

PROCEDIMIENTOS

A. baumennii, A. Iwoffii A. haemolyticus, A. junnii, A. johnsonnii

POSITIVA

DE

NEGATIVA

MOTILIDAD

OXIDASA NEGATIVA

DIAGRAMA DE FLUJO PARA LA IDENTIFICACION DE NO FERMENTADORES OXIDASA NEGATIVA MANUAL BACTERIOLOGÍA MÉDICA EDICIÓN 2004


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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


IV. BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA: 1. Kiska DL and Gilligan PH. Pseudomonas in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray editor in chief. Chap 33, 7th edition, ASM, Washington, 1999. 2. Schereckenberger PC and Von Graevenitz A. Acinetobacter in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray editor in chief. Chap 35, 7th edition, ASM, Washington, 1999. 3. Bacilos Gramnegativos No Fermentadores en: Diagnóstico Microbiológico. Elmer W. Koneman, Stephen D. Allen, William M. Janda, Paul C. Schereckenberger y Washington C. Winn, Capítulo 5. 5ª Edición, 1996. Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 4. Pseudomonas, Acinetobacter en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks editor, 16ª edición (de la 21ª edición en inglés), capítulo 17, 1999, Editorial El Manual Moderno, México, Bogotá. 5. Pseudomonas y Acinetobacter en Manual de Procedimientos para el diagnóstico de bacilos gramnegativos no fermentadores. Servicio de Bacteriología Especial del Departamento de Bacteriología del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas. Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud. Ministerio de Salud, Argentina / Organización Panamericana de la Salud, Organización Mundial de la Salud. Sin fecha. 6. Le Minor L, Claude R. Milieux de Culture , Reactifs, Milieux de Diagnostic en Méthodes de laboratoire pour l’identification des enterobactéries. Deuxieme partie: Notes techniques. Editeur: Institut Pasteur. 1ª ed. 1993. Paris, France. 7. Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiology in Difco Manual. Difco Laboratories. Tenth edition, 1984, Detroit, Michigan, USA. 8. Manual of BBL Products and Laboratory Procedures. Power David editor. Sixth edition. 1998. Cockeysville, Maryland.

72


6.3 Procedimientos para la identificación de Staphylococcus aureus

I. TOMA DE LA MUESTRA: Ver toma de muestra de exudado de heridas. II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: Ver transporte de exudado de heridas. III. PROCESAMIENTO PREVIO DE LA MUESTRA: Ninguno. IV. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS: Ver equipo, materiales y reactivos en exudado de heridas.

V. ALCANCE: Laboratorios de la Red: numerales del 1.4.1 al 1.4.4 con respecto a pruebas de identificación. CNDR: numerales del 1.4.1 al 1.4.4 con respecto a pruebas de identificación

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: Los estafilococos son células esféricas de alrededor de 1µm de diámetro, gram positivas generalmente agrupadas en racimos. En cultivos líquidos se observan además cocos aislados, en pares, tétradas y cadenas. Son microorganismos no móviles y no forman esporas. Los estafilococos crecen con facilidad en la mayor parte de los medios de cultivos y son activos desde el punto de vista metabólico, fermentan muchos carbohidratos y producen pigmentos que varían desde el color blanco hasta el amarillo intenso bajo condiciones aerobias o microaerófilas. Crecen con mayor rapidez a 37oC, pero forman mejor el pigmento a temperatura entre 20o-25oC. Las colonias desarrolladas en medios sólidos son redondas, lisas, elevadas y resplandecientes. S. aureus forma colonias de color gris a amarillo dorado intenso. Las colonias de S. epidermidis tienen tonos de grises a blancas. Los estafilococos producen catalasa , lo que los distingue de los estreptococos. Los estafilococos patógenos generalmente son hemolíticos y coagulan el plasma. Algunos son miembros de la microbiota normal de la piel y mucosas de los humanos, en tanto que otros producen supuración, formación de abscesos, diversas infecciones piógenas e incluso septicemia mortal. Un tipo común de envenenamiento por alimentos es causado por una enterotoxina termoestable producida por algunas cepas de estafilococo. El género Staphylococcus tiene por lo menos 20 especies. Staphylococcus aureus es un microorganismo patógeno de gran importancia para el ser humano por ser el causante de muchas infecciones graves. Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

73

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Entre el 20 al 40 % de los adultos suelen portarlo en las narinas, también se le encuentra en otros sitios como pliegues cutáneos, periné, axilas y vagina. Aunque este microorganismo suele formar parte de la microbiota humana normal, puede producir infecciones oportunistas en huéspedes susceptibles. Los estafilococos coagulasa negativos también constituyen parte de la microbiota humana normal. Staphylococcus epidermidis es el microorganismo recuperado con mayor frecuencia: entre el 50% y 80% de los aislamientos de esta especie se incluyen, endocarditis originada en válvulas cardiacas naturales y protésicas, infecciones producidas por catéteres intravenosos, infecciones de sistemas para derivaciones del LCR, peritonitis asociada con catéteres para diálisis peritoneal, bacteriemia, osteomielitis, infecciones de heridas, infecciones de injertos vasculares, infecciones de prótesis articulares e infecciones de las vías urinarias. Staphylococcus saprophyticus es la segunda causa de infección del tracto urinario en mujeres jóvenes no embarazadas.

VII. IDENTIFICACIÓN: 1. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIÓN:

1.1. Equipos: 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3. 1.1.4.

Incubadora Microscopio con objetivo de 100 X y 10 X Mechero tipo Bunsen Reloj de mesa

1.2. Materiales y Reactivos: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6. 1.2.7. 1.2.8. 1.2.9.

Guantes descartables no estériles Marcadores indelebles Asas bacteriológicas con punta redonda y recta Tubos de ensayo de vidrio 12 x 75 y de plástico 15 x 100 Contenedores con cloro al 0.5 % para descarte de materiales no reusables Láminas portaobjetos. Solución salina al 0.85 % Peroxido de Hidrógeno al 3 % (H2O2) Colorantes para tinción de Gram: Cristal violeta, Lugol, Safranina y Alcohol etílico al 95% (o Alcohol-Acetona 1:1)

1.2.10. Plasma diluido con solución salina 1:5

1.3. Medios de cultivo: Ver medios de cultivo en exudados de heridas. 1.4. Pruebas para Identificación: 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3. 1.4.4. 74

Presencia de b-hemólisis y características macroscópicas Gram Catalasa Coagulasa Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


1.5. Cepas para control de calidad: 1.5.1 Escherichia coli ATCC 25922 1.5.2 Staphylococcus aureus ATCC 25923 1.5.3 Streptococcus pyogenes ATCC 19615

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS: 1.6. Antimicrobianos a utilizar por el metodo de Kirby y Bauer: ver capítulo 16. 1.7. Antimicrobianos a utilizar para la Concentración Mínima inhibitoria: Antimicrobianos en polvo (de preferencia altamente purificados) 1.7.1 Vancomicina 1.7.2 Penicilina

1.8. Pruebas Especiales: Ninguna. 2. CARACTERÍSTICAS DE LAS UFC EN AGAR SANGRE DE CARNERO: Staphylococcus aureus posee la enzima hemolisina, por lo tanto hemolisa la sangre en el medio de Agar Sangre de Carnero. El cultivo en ASC presenta colonias de color gris a amarillo dorado intenso de 1 a 2 mm de diámetro con zonas de b-hemólisis alrededor de la colonia.

3. COLORACIÓN DE GRAM DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS A PARTIR DEL AGAR SANGRE DE CARNERO: Permite observar la tinción, agrupación y morfología microscópica característica.

3.1. Procedimiento para la preparación del frotis: ver capítulo 3. 3.2. Procedimiento para la tinción del frotis de Gram: ver capítulo 3. 3.3. Resultado: Cocos grampositivos en racimos predominantemente, diplos, tétradas y cadenas cortas.

3.4. Control de Calidad a la Prueba de Gram: 3.4.1. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Predominantemente cocos grampositivos en racimos, diplococos, tétradas y cadenas cortas. 3.4.2. Escherichia coli ATCC 25922. Resultado: Bacilos gramnegativos

4. PRUEBA DE CATALASA:

4.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

75

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


4.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 4.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Staphylococcus aureus posee la enzima catalasa, por lo tanto da reacción positiva que se caracteriza por la formación inmediata e intensa de burbujas al aplicar peróxido de hidrógeno al 3%.

4.4. Resultado: Prueba de catalasa positiva: producción inmediata e intensa de burbujas.

4.5. Control de calidad: 4.5.1. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Producción inmediata e intensa de burbujas. 4.5.2. Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Resultado: No hay producción de burbujas.

PRUEBAS CONFIRMATIVAS 5. PRUEBA DE COAGULASA:

5.1. Fundamento de la prueba: Es una sustancia similar a la trombina presente en los cultivos capaz de convertir el fibrinógeno en fibrina, lo que da como resultado la formación de un coágulo visible.

5.2. Preparación del plasma diluido 1:5 En un tubo estéril de plástico 15 x 100 se agrega 1mL de plasma oxalatado o citratado y 4 mL de solución salina 0.85 %. Este plasma diluido al 1:5 se mantiene en congelación en viales estériles de 1mL en pequeños lotes listos para su uso a 4oC.

5.3. Procedimiento: En un tubo de 10 x 75 se agrega 0.5 – 1mL de plasma diluido. Se inocula de 1 a 2 UFC sospechosas de Staphylococcus aureus. Se incuba a una temperatura de 35 – 37 oC por un tiempo de 1 a 4 horas.

5.4. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Staphylococcus aureus produce coagulasa, proteina de tipo enzimático que coagula el plasma oxalatado o citratado en presencia de un factor contenido en muchos sueros.

5.5. Resultado: Positivo: Formación de coágulo.

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


5.6. Control de calidad: 5.6.1. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Formación de coágulo en menos de 4 horas. 5.6.2. Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Resultado: No hay formación de coágulo en 4 horas. En la tabla No. 1 se presentan la pruebas requeridas para diferenciar Staphylococcus epidermidis y saprophyticus de otros estafilococos coagulasa negativos, dos de los estafilococos mas frecuentes aislados en los cultivos. La identificación de otras especies es compleja y poco útil, a menos que se trate de infecciones intrahospitalarias. Por tal razón, a parte de las especies aureus, epidermidis y saprophyticus, los otros estafilococos deben informarse como Staphylococcus spp. o Staphylococcus coagulasa negativa.

Tabla No. 2 Pruebas bioquímicas para diferenciar Staphylococcus epidermidis de otras especies Especies

Catalasa

Ornitina

Urea

Manosa

Xilosa

Sacarosa

Trealosa

Maltosa

Lactosa Reducción e

Nitratos

S. epidermidis

+

v1

+

+1

–

+

–

+

v

+

S. saprophyticus

+

–

+

–

v

+

+

+

v

–

S. warneri

+

–

+

–

–

+

+

+1

v

v

S. hominis

+

–

+

–

–

+1

v

+

v

v

S. simulans

+

–

+

v

–

+

v

+1

+

+

S. xylosus

+

–

+

+

+

+

+

+

v

v

S. lugdunensis

+

+

v

+

–

+

+

+

+

+

v1, 11 – 89 % de las cepas son positivas, con reacción lenta; +1, > 90% de las positivas con reacción lenta; v, 11– 89 % cepas positivas.

6. INFORME: Resultado positivo:

Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus spp o coagulasa negativa

Resultado negativo: No hubo crecimiento bacteriano.


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


VIII. BIBLIOGRAFÍA: 1. Estafilococos en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. George F. Brooks editor, Cap. 14, 16ª edición (de la 21 edición en inglés), 1998, Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V. México D.F. 2. Identificación de Staphylococcus aureus en: Diagnóstico Microbiológico. Elmer W. Koneman, Stephen D. Allen, William M. Janda, Paul C. Schereckenberger y Washington C. Winn, Cap. 11. 5ª ed., 1996, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 3. Kloos WE and Bannerman TL. Staphylococcus and Micrococcus in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray ed in chief, chap16, ASM Press, 7 th ed., 1999,Washington D.C.

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6.4 Procedimientos para la identificación de Enterococcus spp

I. TOMA DE LA MUESTRA: Ver toma de muestra en heridas y abscesos. II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: Ver Transporte de la muestra en heridas y abscesos. III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: Ver Procesamiento de la muestra en heridas y abscesos. IV. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: Ver equipos, instrumentos y reactivos en heridas y abscesos. V. ALCANCE: Laboratorios de la Red: numerales del 1.4.1 al 1.4.3 con respecto a pruebas de identificación. CNDR: numerales del 1.4.1 al 1.4.6.2 con respecto a pruebas de identificación.

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: El género Enterococcus spp incluye los Enterococcus clasificados previamente dentro de los estreptococos del grupo D. Son cocos son grampositivos esféricos u ovoides y se disponen en cadenas, las colonias miden de 0.5 a 1mm de diámetro, son lisas, de bordes definidos y producen hemólisis alfa o ninguna. Existen 18 especies de enterococos ordenadas en 4 grupos (I, II, III, IV). Enterococcus faecalis (pertenece al grupo II) es la especie más común, y causa del 85 al 90% de las infecciones enterococicas, mientras que Enterococcus faecium (pertenece al grupo II) causa del 5 al 10% de las infecciones. Estas dos especies son las mas frecuentemente aisladas. Estos microorganismos son parte de la microbiota del sistema gastrointestinal, vagina y uretra. Los Enterococcus se asocian a las causas más frecuentes de infecciones nosocomiales, en particular en unidades de cuidados intensivos. Suelen transmitirse de un paciente a otro a través de las manos del personal hospitalario. En los pacientes, los sitios más comunes de infección son las vías urinarias, heridas, vías biliares y sangre, han sido asociados a cistitis, pielonefritis, prostatitis, abscesos perinefríticos y endocarditis. En neonatos están asociados a meningitis y bacteremias. Son agentes cada vez más importantes como causa de enfermedad humana, principalmente debido a su resistencia a agentes antimicrobianos a los cuales son en general sensible los estreptococos. Enterococcus faecium suele ser mucho más resistentes a los antimicrobianos que Enterococcus faecalis.


79

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Pruebas realizadas in vitro con Enterococcus spp han demostrado que estos microorganismos presentan CIM para Penicilina 10 a 100 veces mayores que los demás estreptococos. Debido a su resistencia a la penicilina y cefalosporinas de diversas generaciones, a la adquisición de resistencia de alto nivel a los aminoglucosidos y, en la actualidad, a la reciente aparición de resistencia a la vancomicina, estas bacterias con frecuencia están involucradas en sobreinfecciones graves en pacientes que están en tratamiento con estos antimicrobianos. Los Enterococcus spp se diferencian de los estreptococos por su capacidad de desarrollarse a 10 oC y 45oC, crecer en concentraciones de cloruro de sodio al 6,5%, por su tolerancia a altas concentraciones de bilis y por producir la enzima pirrolidonil arilamidasa ( pirrolidonasa o PYR por sus siglas en inglés). Mas del 90% de las cepas poseen el antígeno para el grupo D de Lancefield.

VII. IDENTIFICACIÓN: 1. EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIÓN:

1.1. Equipos: Ver equipos en heridas y abscesos. 1.2. Materiales y reactivos: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4 1.2.5. 1.2.6. 1.2.7. 1.2.8. 1.2.9. 1.2.10. 1.2.11. 1.2.12. 1.2.13. 1.2.14. 1.2.15. 1.2.16. 1.2.17. 1.2.18. 1.2.19. 1.2.20.

Guantes descartables Gradillas Rotador Contenedores con cloro del 5 al 10% para desechar material contaminante Marcadores indelebles Asas bacteriológicas rectas y redondas Palillos de madera Tubos para coagulasa de 13 x 75 Pinzas estériles Láminas portaobjetos Solución salina al 0.85% Colorantes para tinción de Gram Peroxido de hidrógeno (H2O2)al 30% Discos de optoquina de 6mm Desoxicolato de Sodio al 10% Discos de bilis esculina Láminas (dispositivos) comerciales para prueba de PYR. Caldo nutritivo con 6.5% de NaCl Arabinosa Sorbitol

1.3. Medios de cultivo:

Ver medios de cultivo en heridas y absceso. 80


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


1.4.

Pruebas para la identificación:

1.4.1. 1.4.2. 1.4.3.

Coloración de Gram de las colonias. Prueba de catalasa Pruebas para diferenciar Streptococcus pneumoniae de Enterococcus spp y Streptococcus grupo viridans: Prueba de optoquina Prueba de solubilidad en bilis Pruebas para diferenciar Enterococcus spp de Streptococcus grupo viridans: Prueba de bilis esculina. Prueba de PYR. Prueba de crecimiento en caldo nutritivo al 6.5%. Serología con antisuero Grupo D. Prueba para diferenciar la especies de Enterocococcus spp. Prueba de fermentación de la arabinosa. Prueba de fermentación del sorbitol.

1.4.3.1. 1.4.3.2. 1.4.4. 1.4.4.1. 1.4.4.2. 1.4.4.3. 1.4.5. 1.4.6. 1.4.6.1. 1.4.6.2.

1.5. Cepas para control de calidad: 1.5.1 1.5.2 1.5.3 1.5.4

Escherichia coli ATCC 25922 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Streptococcus viridans INS 003

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS: 1.6. Antimicrobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: Ver capítulo 16. 1.7. Antimicrobianos a utilizar por el método de Concentración Inhibitoria Mínima (CIM/MIC): Ninguno. 1.8. Pruebas especiales para sensibilidad a los antimicrobianos: Ninguna. 2. CRECIMIENTO EN AGAR SANGRE DE CARNERO (ASC):

2.1. Fundamento del medio: ver capítulo 17. 2.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 2.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria ante el medio: Las dos especies que más frecuentemente se aíslan de muestras clínicas carecen o tienen hemolisinas S, las cuales son responsables de la hemólisis alfa de los eritrocitos, al realizar una estría profunda en el medio, observándose un color verde musgo dentro de esta. Las UFCs miden entre 0,5 a 1mm de diámetro, lisas, bordes definidos, ligeramente convexas, grisáceas. Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


2.4. Resultado: Colonias 0.5-1mm de diámetro, grisáceas, bordes definidos, ligeramente convexas, con zona de alfa hemólisis en estría profunda.

2.5. Control de calidad: Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Crecimiento en el medio y no se observa hemólisis verde alrededor de la colonia únicamente en la estría profunda .

3. COLORACIÓN DE GRAM DE LAS UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFCs):

3.1. Fundamento de la tinción: ver capítulo de tinción de Gram. 3.2. Procedimiento: ver capítulo de tinción de Gram. 3.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: Los Enterococcus spp son cocos redondos o ligeramente elongados que se agrupan predominantemente en cadenas y se observan como grampositivos.

3.4. Resultado: Se observa cocos gram positivos esféricos u ovoides dispuestos en cadenas.

3.5. Control de calidad: Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Se observa cocos grampositivos esféricos u ovoides dispuestos en cadenas.


4.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 4.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 4.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Los Enterococcus spp carecen de la enzima catalasa, por lo tanto no catalizan el H2O2 en oxígeno y agua. Eventualmente se observan cepas que dan reacciones débiles

4.4. Resultado: Negativo: No hay producción de burbujas.

4.5. Control de Calidad de la prueba: Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Negativo: No hay producción de burbujas. Pruebas para diferenciar Streptococcus pneumoniae de Enterococcus spp y Streptococcus grupo viridans (Ver diagrama de flujo después de la prueba de arabinosa): 82


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


5. PRUEBA DE OPTOQUINA:

5.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 5.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 5.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: La sensibilidad a la optoquina (clorhidrato de etil hidrocupreína) se utiliza para diferenciar Streptococcus pneumoniae, Streptococcus grupo viridans y Enterococcus spp. Los Enterococcus spp son resistentes a la optoquina. Cuando se colocan discos de optoquina de 6mm, el diámetro del halo de inhibición del crecimiento es menor de 14 mm.

5.4. Resultado: Negativo: El halo de inhibición con discos de 6mm es menor de 14mm.

5.5. Control de Calidad de la prueba: 5.5.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Negativo. El halo de inhibición con discos de 6mm es menor de 14mm. 5.5.2. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Resultado: Positivo. El halo de inhibición con discos de 6mm es mayor de 14 mm.

6. PRUEBA DE SOLUBILIDAD EN BILIS:

6.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 6.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 6.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Los Enterococcus spp carecen de las enzimas autolíticas (autolisinas) que son las que actúan con el reactivo para acelerar la reacción lítica natural. Por lo tanto, al agregarle el reactivo desoxicololato de Sodio al 0.5% no se activa la autólisis.

6.4. Resultado: Negativo: Se observa turbidez en el tubo.

6.5. Control de Calidad de la prueba: 6.5.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Negativo. Se observa turbidez en el tubo. 6.5.2. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Resultado: Positivo. El tubo se observa transparente. Pruebas para diferenciar Enterococcus spp del Streptococcus grupo viridans (Ver diagrama de flujo después de la prueba de arabinosa). Capítulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comúnmente en exudados de heridas

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


7. PRUEBA DE BILIS ESCULINA:

7.1. Fundamento de la Prueba: ver capítulo 17. 7.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 7.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Los Enterococcus spp son tolerantes a las altas concentraciones de bilis, por lo tanto hidrolizan la esculina presente en el disco.

7.4. Resultado: Positiva: Se observa ennegrecimiento del disco.

7.5. Control de calidad: 7.5.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Positiva. Se observa ennegrecimiento del disco. 7.5.2. Streptococcus grupo viridans INS 003 Resultado: Negativa: Se observa el disco color amarillo.

8. PRUEBA DE TOLERANCIA A LA SAL: La prueba de tolerancia a la sal en concentraciones de 6.5% de NaCl diferencia las especies de Enterococcus spp de los Streptococcus del grupo D no enterococos (Streptococcus bovis).

8.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 8.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 8.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Los Enterococccus spp son halo tolerantes a concentraciones de cloruro de sodio al al 6.5%.

8.4. Resultado: Positivo: Turbidez en el caldo por crecimiento de la bacteria.

8.5. Control de calidad: 8.5.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Positivo.Turbidez en el caldo por crecimiento de la bacteria. 8.5.2. Streptococcus grupo viridans INS 003 Resultado: Negativo. No se observa turbidez en el caldo por ausencia de crecimiento de la bacteria.

9. PRUEBA DE PYR (DETERMINACIÓN DE LA ENZIMA PIRROLIDONIL ARILAMIDASA):

9.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 9.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 84


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


9.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria:

Los Enterococcus spp poseen la enzima pirrolidonilopeptidasa, por lo tanto hidroliza el sustrato y libera la b-naftilamida.

9.4. Resultado: Positivo: Desarrollo de un color rojo cereza oscuro

9.5. Control de calidad: 9.5.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Positivo. Desarrollo de un color rojo cereza oscuro 9.5.2. Streptococcus grupo viridans INS 003 Resultado: Negativo. Se observa un color amarillo o naranja (color del reactivo).

10.SEROLOGÍA:

10.1. Fundamento de la Prueba: ver capítulo 10.1. 10.2. Fundamentos inmunológicos de la prueba: ver capítulo 10.1 10.3. Procedimiento: Ver descripción del método como se describe en el capítulo de Streptococcus β hemolíticos numerales 7.3.1.1 al 7.3.1.8 y 7.3.2.1 al 7.3.2.8

10.4. Fundamentos inmunológicos de la bacteria: A diferencia de los demás estreptococos cuyos antígenos están constituidos por polisacáridos (en base a un carbohidrato específico), el Grupo D es la única excepción pues su antígeno está constituido por ácido glicerolteicóico.

10.5. Resultado: Positivo: Se observa aglutinación.

DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DE ENTEROCOCCUS SPP. 11.FERMENTACIÓN DE ARABINOSA:

11.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 11.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 11.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las cepas de Enterococcus faecium fermentan la arabinosa. Las cepas de Enterococcus faecalis no la fermentan.


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


11.4. Resultado: Positiva. Viraje del color del medio de violeta a amarillo (Enterococcus faecium). Negativo. No hay viraje del color, se observa violeta (Enterococcus faecalis).

11.5. Control de calidad: 11.5.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Negativa. No hay viraje de color. El medio se observa de color violeta. 11.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Positiva. Hay viraje de color del violeta al amarillo.

12.FERMENTACIÓN DE SORBITOL:

12.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 12.2. 12.2 Procedimiento: ver capítulo 17. 12.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las cepas de Enterococcus faecalis fermentan el sorbitol. Las cepas de Enterococcus faecium no lo fermentan.

12.4. Resultado: Positiva. Viraje del color del medio de violeta a amarillo (Enterococcus faecalis). Negativo. No hay viraje del color, el medio se observa violeta (Enterococcus faecium).

12.5. Control de calidad: Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Positiva. Viraje del color del medio de violeta a amarillo.

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PROCEDIMIENTOS

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FLUJOGRAMA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE STREPTOCOCCUS

Y

ENTEROCOCCUS

ASC Alfa hemolíticas Gram: Cocos Gram + en cadenas Catalasa: negativa

OPTOQUINA Discos 6 mm: ≥ 14mm Discos 10 mm: ≥ 16mm

POSITIVO

RESULTADO DUDOSO

S. pneumoniae

SOLUBILIDAD EN BILIS (Desoxicolato de Na al 10%)

NEGATIVA

BILIS ESCULINA CALDO NUTRITIVO 6,5% NaCl PYR

BILIS ESCULINA + PYR: – CALDO NUTRITIVO 6,5% NaCl:

POSITIVO

NEGATIVO

Enterococcus spp

Streptococcus grupo viridans

Arabinosa + Sorbitol –

Arabinosa – Sorbitol +

Enterococcus faecium

Enterococcus faecalis

POSITIVA

–

S. pneumoniae

Streptococcus bovis


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PROCEDIMIENTOS

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TABLA DE DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DE Enterococcus spp Pruebas

Enterococcus faecalis

Enterococcus faecium

Frecuencia en humanos

90%

5-10%

Hemólisis*

alfa

alfa

Desarrollo NaCl 6.5%

+

+

Bilis esculina

+

+

PYR

+

+

Sorbitol

+

–

Arabinosa

–

+

+ : >90% son positivos – : <10% son positivos * : Se observa hemólisis alfa al realizar estría profunda en Agar Tripticasa Soya con sangre de carnero al 5%

INFORME DE RESULTADO: Negativo: No hubo crecimiento bacteriano. Positivo: Género y especie con su respectivo antibiograma

VIII. BIBLIOGRAFÍA: 1. Facklam R R, Sahm DF and Martins L., Enterococcus in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray Editor in chief. Chap 18, 7th ed. 1999, ASM, Washington. 2. Reyes Cerros J. y López Cruz S.R, Normas Técnicas de Piel, Heridas y Abscesos en Normas Técnicas de Bacteriología, Cap. X. 3ª. ed., 1996, Ministerio de Salud. Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia CNDR. Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional DANIDA, Editorial Imprimatur, Managua, Nicaragua. 3. Mejía Sandino M J. Exudado Faríngeo II en Manual de Bacteriología Médica 3ª ed. 2001, Ministerio de Salud. Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia CNDR. Proyecto de Fortalecimiento de Laboratorios Post Huracán MITCH, AID/CDC/APHL/CNDR, Managua, Nicaragua. 4. Los cocos grampositivos Parte II en Diagnóstico Microbiológico. Elmer W. Koneman editor, Capítulo 12, 5ª ed., 1996. Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 5. Estreptococos en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks Editor, Cap. 15, 16ª ed. (de la 21ª edición en inglés) 1998, Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V. México D.F.

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CAPÍTULO 7.

Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo I. TOMA DE LA MUESTRA: Las muestras de líquido cefaloraquídeo (LCR) deben ser tomadas únicamente por el médico, antes de la administración de antimicrobianos.

II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: El líquido cefalorraquídeo (LCR) debe ser transportado al laboratorio INMEDIATAMENTE, bajo condiciones de temperatura ambiente. Haemophilus influenzae y Neisseria meningitidis son muy susceptibles a las temperaturas extremasy a la desecación, por lo tanto las muestras clínicas deben ser enviadas al laboratorio sin refrigerar. Cuando el LCR no puede se transportado inmediatamente al laboratorio, la muestra debe ser inoculada en Agar Sangre de Carnero (ASC). En cuanto a las condiciones de incubación bajo estas circunstancias, es más importante colocar los platos inoculados en un ambiente de CO 2 que tratar de conseguir temperaturas de incubación entre 35 o - 37oC. Bajo esas condiciones, los meningococos se mantienen vivos por encima de las 5 horas, sin que su viabilidad se vea seriamente afectada. Si las muestras deben ser transportadas a través de largas distancias, el medio inoculado (ASC) debe ser previamente incubado durante 18-24 horas. Bajo esas condiciones el transporte no debe durar más de 48 horas.

III. PROCESAMIENTO DEL LÍQUIDO CEFALORAQUÍDEO: En adultos deben colectarse de 5-10mL de LCR en dos tubos estériles 13 x 100mm con tapón de rosca. En niños, la cantidad colectada debe ser de 2-3 mL. El transporte de la muestra debe realizarse inmediatamente y su procesamiento debe tener máxima prioridad sobre cualquier otro tipo de análisis. Las muestras deben ser transportadas a temperatura ambiente, porque Haemophilus influenzae y N. meningitidis, suelen ser muy susceptibles a temperaturas extremas y desecación. Tubo No. 1: Realizar química del LCR: Glucosa, proteínas y recuento total de leucocitos. Tubo No. 2: La muestra debe centrifugarse a 2000 g x 15 minutos. Remover el sobrenadante utilizando una pipeta de Pasteur con un bulbo de hule (nunca succione con la boca) y transferir a otro tubo para pruebas serológicas adicionales (en caso que se disponga de ellas). Si hay seguridad que estas no se realizarán, descartar el tubo en un contenedor conteniendo cloro para posterior eliminación por medio Capítulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo

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PROCEDIMIENTOS

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de autoclave. Del sedimento debe realizarse un frotis y teñirlo por el método de Gram para determinar el recuento diferencial de leucocitos y la presencia de bacterias, de la siguiente manera: Utilizando un aza redonda, extienda una gota del sedimento sobre la superficie de una lámina portaobjetos nueva. El grosor debe ser tal que se pueda ver o leer a través de ella. Tome en cuenta que cuando la extensión tiene un diámetro muy corto, los leucocitos polimorfonucleares suelen observarse muy compactados y la visibilidad de los diplococos intracelulares se dificulta. 1. Deje secar. 2. Fije al calor. 3. Coloree con Gram: 4. 30 segundos con cristal violeta 5. 30 segundos con lugol 6. Decolore con alcohol acetona o alcohol 70 o 7. Un minuto con safranina 8. Observe al microscopio con un objetivo de inmersión (100x) y reporte la tinción y morfología bacteriana.

Luego, con el resto del sedimento realice la siembra de la siguiente manera: Ponga unas gotas en Agar Chocolate enriquecido con factores (ACh) y Agar Sangre de Carnero (ASC). Deje secar un poco y estríe por agotamiento. Incúbelo a 35-37 oC, con ambiente de humead y CO 2 durante 18-24 horas.

El ambiente húmedo puede lograrse de varias maneras: Si se trata de un incubador de CO 2 colocando un recipiente con agua en la bandeja inferior. Si es una jarra de vidrio para usar el método de la vela, colocando en el fondo de la jarra, toallas de papel ligeramente empapadas de agua. Estas toallas deben ser reemplazadas al mínimo semanalmente para evitar la contaminación, sobre todo con hongos. Si se trata del método de una bolsa de plástico con cierre tipo zipper, en las cuales se utilizan tabletas generadoras de CO2, se consigue poniendo unas pocas gotas de solución salina estéril en la superficie del medio de cultivo.

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Capítulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo

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PROCEDIMIENTOS

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DIAGRAMA DE FLUJO PARA CULTIVO DE LCR

LCR TOMADO POR MÉDICO NIÑOS: 2-3 mL ADULTOS: 5-10 ML

CENTRIFUGACIÓN 2000 g x 15 MINUTOS

GLUCOSA, PROTEINAS

SEDIMENTO

GRAM: BACTERIAS % PMNs

CULTIVO: ACh ASC

H. influenzae b

S. pneumoniae

N. meningitidis

Enterobacterias y No Fermentadores Grampositivos Sensibilidad Kirby y Bauer ENVIAR AL CNDR


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PROCEDIMIENTOS

DE


IV. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS: 1. TOMA DE LA MUESTRA:

1.1. Equipo:

Ninguno.

1.2. Materiales y Reactivos: Dos tubos estériles 13 x 100 mm con tapón de rosca.

1.3. Medios de cultivo: Ninguno. 2. TRANSPORTE:

2.1. Equipo: Ninguno. 2.2. Materiales y Reactivos: Un contenedor irrompible para el traslado de las muestras.

2.3. Medios de cultivo: Ninguno. 3. PROCESAMIENTO:

3.1. Equipo: 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5

Centrífuga que alcance 2000 g Incubadora de CO2 Microscopio con objetivo de 100x y ocular de 10x Mechero tipo Bunsen Reloj de mesa

3.2. Materiales y Reactivos 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 3.2.6

Guantes descartables no estériles. Láminas portaobjetos. Asas bacteriológicas con punta redonda y recta. Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de materiales no reusables. Jarra de vidrio y velas de cera blanca (si no cuenta con incubadora de CO 2). Colorantes para tinción de Gram: cristal violeta, lugol, alcohol acetona (1:1) o alcohol 70 o, fucsina acuosa o safranina. 3.2.7 Marcadores indelebles.

3.3. Medios de cultivo: 3.1.1 Agar Chocolate (suplementado). 3.1.2 Agar Sangre de Carnero.

92


7.1

Procedimientos para la identificación de Haemophilus influenzae

I. ALCANCE: Laboratorios de la Red: Numerales del 1.4.1 al 1.4.6 con respecto a pruebas de identificación. CNDR: Numerales del 1.4.1 al 1.4.15 con respecto a pruebas de identificación.

II. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: Está constituido por bacilos o cocobacilos gramnegativos, generalmente menores de 1 µm de ancho y de longitud variable; a veces forman filamentos largos con marcado pleomorfismo. Son inmóviles, no esporulados, aerobios y anaerobios facultativos. Se desarrollan a una temperatura óptima de 35-37oC en atmósfera con CO 2 al 5%. Son organismos quimiorganotróficos exigentes: requieren del factor X (hemina), que es un pigmento que contiene hierro y suministra los compuestos tetrapirrólicos necesarios para la síntesis de citocromos y enzimas y del factor V (NAD), que es una coenzima que participa en las reacciones de óxido reducción del metabolismo, esta coenzima es termolábil y normalmente es producida por varias especies bacterianas, levaduras, tejidos animales y vegetales. Hay otros factores nutricionales que estimulan el crecimiento del Haemophilus, tales como el ácido pantotéico, la tiamina, el uracilo, la purina y la cisteína. Haemophilus influenzae está clasificado en 8 biotipos cuya caracterización tiene utilidad epidemiológica, ya que se ha demostrado que el biotipo de una cepa está relacionado con la fuente de aislamiento. La cápsula de Haemophilus influenzae juega un papel importante en la virulencia. De acuerdo a los antígenos que la constituyen existen 6 grupos o serotipos, denominándolos con las letras a, b, c, d, e y f. Estos antígenos son de naturaleza polisacárida y son serológicamente específicos; algunos aislamientos no poseen cápsulas, por lo que no pueden serotipificarse y se les denomina no tipificables (NT). La cápsula de H. influenzae serotipo b está constituida por el polisacárido polirribosil-ribitol-fosfato (PRP), el cual se ha considerado como un elemento importante en la patogenicidad de la bacteria. H. influenzae serotipo b es el que más frecuentemente se asocia a meningitis, especialmente en niños menores de 5 años de edad. Sin embargo, los serotipos a, e y f, también pueden producir meningitis. En todos los aislamientos de H. influenzae debe determinarse el serotipo. Adicionalmente, debido a la frecuencia de cepas resistentes a los antibióticos betalactámicos, hay que determinar la sensibilidad del aislamiento y la producción de beta lactamasa. Todo estos datos deben ser informados al médico que está a cargo del tratamiento y control del caso para que pueda establecer la mejor conducta terapéutica. Estos mismos datos deben tenerse disponibles para poder analizar la prevalencia de los aislamientos que circulan en una población, con fines epidemiológicos. Capítulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo

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III. IDENTIFICACIÓN: 1. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIÓN:

1.1. Equipo: 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4

Incubadora de CO2 Microscopio con objetivo de 100x y ocular de 10x Mechero tipo Bunsen Reloj de mesa

1.2. Materiales y Reactivos: 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 1.2.5 1.2.6 1.2.7 1.2.8 1.2.9 1.2.10 1.2.11 1.2.12 1.2.13 1.2.14 1.2.15 1.2.16 1.2.17 1.2.18 1.2.19 1.2.20 1.2.21 1.2.22

Guantes descartables no estériles Láminas portaobjetos Asas bacteriológicas con punta redonda y recta Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de materiales no reusables Jarra de vidrio y velas de cera blanca (si no cuenta con incubadora de CO 2) Marcadores indelebles Lámpara de Wood Cristal violeta Lugol Alcohol al 70% o alcohol acetona (1:1) Fucsina acuosa o safranina Dihidrocloruro de Tetrametilparafenilendiamina al 1% Peróxido de Hidrógeno al 30% Factores X y V Tripticasa Soya Agar Ácido delta aminolevulínico Na2HPO4 KH2PO4 Aceite mineral inerte estéril Suero para aglutinación de H. influenzae tipo b ONPG Caldo Púrpura de bromocresol enriquecido, que contenga una concentración al 1% de los diferentes carbohidratos 1.2.23 Tiras de acetato de Plomo

1.3. Medios de cultivo: Ver medios de cultivo en procesamiento del LCR.

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DE

PROCEDIMIENTOS

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1.4. Pruebas para Identificación: 1.4.1 1.4.2

Observar Morfología macroscópica y condiciones de cultivo Coloración de Gram de la colonia

1.4.3 1.4.4 1.4.5 1.4.6 1.4.7 1.4.8 1.4.9 1.4.10 1.4.11 1.4.12 1.4.13 1.4.14

Prueba de la oxidasa Prueba de la catalasa Satelitismo a colonias de Stphylococcus aureus Determinación del requerimiento de factores X y V Prueba de síntesis de porfirinas Serotipificación. (Aglutinación en lámina). Diferenciación de especies de Haemophilus dependientes de NAD y/o de hemina. Hemólisis Fermentación de carbohidratos Prueba de ONPG Producción de H2S Dependencia de CO2

1.5 Cepas para control de calidad: 1.5.1. Staphylococcus aureus ATCC 25923 1.5.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212 1.5.3. Haemophilus influenzae ATCC 10211 1.5.4. Haemophilus influenzae ATCC 49247 1.5.5. Haemophilus parainfluenzae ATCC 7901 1.5.6. Haemophilus haemolyticus INS 001 1.5.7. Haemophilus paraphrophilus ATCC 49146 1.5.7. Haemophilus aphrophilus INS 002

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS: 1.6 Antimicrobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: Ver capítulo 16. 1.7 Antimicrobianos a utilizar para la Concentración Mínima Inhibitoria: Antimicrobianos en polvo (de preferencia altamente purificados). 1.7.1. Ampicilina 1.7.2. Cloranfenicol.

1.8 Pruebas Especiales: 1.8.1. Betalactamasa 1.8.2. Cloranfenicol acetil transferasa (CAT)


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PROCEDIMIENTOS

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2. CARACTERÍSTICAS DE LAS UFC EN AGAR CHOCOLATE: Colonias pequeñas, redondas, convexas, con iridiscencia, que miden aproximadamente 1-1.5 mm de diámetro. 3. COLORACIÓN DE GRAM DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS A PARTIR DEL AGAR CHOCOLATE: Permite observar la tinción, agrupación y morfología microscópica característica.

3.1. Procedimiento para la preparación del frotis: Utilizando un asa recta, tome del Agar Chocolate una UFC y emulsiónela en una gota de solucion salina estéril sobre un portaobjetos limpio, dispersándola en una area de 1x1cm. El grosor de la muestra debe ser tal que se debe leer a través de ella. Deje secar a temperatura ambiente y luego flamee rápidamente en el mechero para fijar.

3.2. Procedimiento para la tinción del frotis: ver capítulo 17. 3.3. Resultado: Cocobacilos gramnegativos pleomórficos.

3.4. Control de calidad: 3.4.1 Haemophilus influenzae ATCC 10211 Resultado: Cocobacilos gramnegaivos pleomórficos. 3.4.2 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Cocos grampositivos en racimos. NOTA: La coloración de Gram a partir de cultivos de más de 48 horas es difícil de interpretar.


4.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 4.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 4.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Haemophilus influenzae posee la enzima citocromo oxidasa. Por lo tanto da reacción positiva, que se caracteriza por la aparición de un color púrpura en la tira reactiva.

4.4. Resultado: Oxidasa positiva: se observa un color púrpura en la tira reactiva. NOTA: Para Haemophilus influenzae siempre utilice el sustrato Dihidrocloruro Tetrametil-parafenilendiamina al 1%.

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PROCEDIMIENTOS

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4.5. Control de calidad: 4.5.1 Haemophilus influenzae ATCC 10211. Resultado: Oxidasa positiva: Se observa un color púrpura en la tira reactiva. 4.5.2 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Oxidasa negativa: Se observa un color amarillo pálido en la tira reactiva.


5.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 5.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 5.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Haemophilus influenzae posee la enzima catalasa, por lo tanto da reacción positiva, que se caracteriza por la formación inmediata y moderada de burbujas.

5.4. Resultado: Prueba de catalasa positiva: producción inmediata y moderada de burbujas.

5.5. Control de calidad: 5.5.1 Staphylococcus aureus. ATCC 25923 Resultado: Catalasa positiva: producción inmediata e intensa de burbujas. 5.5.2 Haemophilus paraphrophilus ATCC 49146. Resultado: Catalasa netativa: no hay producción de burbujas.

6. PRUEBA PRESUNTIVA DE SATELITISMO (Para género): Esta prueba se ha dejado de utilizar para la identificación de las especies de Haemophilus, debido a que tambien es positiva para otros microorganismos como Pastereulla, Corynebacterium y Actinobaillus. 7. PRUEBA DE REQUERIMIENTO DE FACTORES X y V:

7.1. Fundamento de la prueba: Existen nutrimentos esenciales para algunas de las especies de Haemophilus, conocidos como factores X (hemina) y V (nicotinamida adenina dinucleótido). Estos factores son agregados a algunos medios para estimular su crecimiento o si la bacteria ya ha sido aislada, pueden utilizarse para determinar la especie en relación a su utilización para el crecimiento. El método mas habitual para determinar estos requisitos de desarrollo es el que emplea tiras o discos de papel filtro impregnadas de factor X y V. Estos factores deben colocarse en un medio que no los contenga.


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7.2. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: Haemophilus influenzae requiere de los factores X (hemina) y V (NAD) para su desarrollo, por lo tanto se va a observar crecimiento entre las dos tiras o discos.

7.3. Procedimiento: 7.3.1 A partir de un aislamiento puro obtenido en Agar Chocolate, realice una siembra masiva en un plato con Agar Tripticasa Soya (serciórese que no contenga levadura). Evite el contacto del asa con el agar chocolate, para no arrastrar los factores contenidos en el medio. 7.3.2 Coloque los discos o tiras X y V sobre la superficie del agar en el área de inoculación, a una distancia de 1 cm entre ellos. 7.3.3 Incube el plato a 35 oC en ambiente con CO 2 al 5% durante 18 a 24 horas.

7.4. Resultado Prueba de requerimiento de factores positiva: se observa crecimiento entre las dos tiras o discos.

7.5. Control de Calidad: 7.5.1 Haemophilus influenzae ATCC 10211. Resultado: Se observa crecimiento entre las dos tiras o discos. 7.5.2 Haemophilus paraphrophilus ATCC 49146. Resultado: Se observa crecimiento solo alrededor del factor V.

8. PRUEBA DE SÍNTESIS DE PORFIRINAS:

8.1. Fundamentos de la prueba: 8.2. Procedimiento: 8.2.1 Resuspenda una asada del microorganismo en 0.5 mL del substrato enzimático. Espere 10 minutos. 8.2.2 Incube la mezcla a 35 oC y lea a las 18 horas. 8.2.3 Adicione dos gotas de reactivo de Kovac, agite la mezcla enérgicamente. 8.2.4 Examine el tubo con la lámpara de Wood y observe si hay presencia de fluorescencia roja.

8.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: 8.4.1 Síntesis de Porfirina: Haemophilus influenzae no posee las enzimas que intervienen en la síntesis de las protoporfirinas a partir del ácido delta-minolevulínico, en consecuencia no habrá detección de porfirinas.

8.4. Resultado: Tras agregar el reactivo de Kovac, la aparición de un color rojo indica la presencia de porfobilinógeno. En el caso de H. influenzae no se observa ningún viraje de color. Al utilizar la lámpara de Wood, no se observa fluorescencia rojo naranja. 98


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8.5. Control de Calidad para la Prueba de Porfirinas: 8.5.1 Haemophilus influenzae ATCC 10211 Resultado: Requiere factores X y V no hay viraje de color. No hay fluorescencia rojo naranja al observar con la lámpara de Wood. 8.5.2 Haemophilus paraphrophilus ATCC 49146. Resultado: No requiere factor X de forma exógena. Hay fluorescencia rojo naranja al observar con la lámpara de Wood.

TABLA No. 1 DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA Y BIOTIPIFICACION DE Haemophilus influenzae Biotipo

Indol

Urea

Ornitina Porfirinas Glucosa Sacarosa Lactosa

I + + + II + + – III – + – IV – + + V + – + VI – – + VII + – – VIII – – – Haemophilus parainfluenzae I – – + II – + + III – + – IV + + + V No es claro si este biotipo existe. Aislamientos negativos para indol, VI + – + VII + + – VIII + – –

Xilosa

– – – – – – – –

+ + + + + + + +

– – – – – – – –

– – – – – – – –

+ + +* + + + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

– – – –

– – – –

urea y ornitina pueden ser H. segnis + + + – + + + – + + + –

– – –

*H. aegyptius es similar a H. influenzae Biotipo III pero no fermenta la xilosa. Se pueden diferenciar por el estudio de las proteínas de la membrana externa.

9. SEROTIPIFICACION :

9.1. Fundamento de la prueba: La presencia de antígenos específicos en la cápsula o pared celular es utilizada como base para la caracterización serológica de algunos géneros y especies bacterianas. En algunos casos el antígeno está ubicado en el LPS de la pared y están conformados por carbohidratos. Pequeñas variaciones de los azúcares dan como resultado variaciones en la especificidad del antígeno. En algunos casos el antígeno está ubicado en la cápsula. En ambos casos y cuando la naturaleza del antígeno es altamente específica, es utilizada para clasificar a la bacteria en serogrupos, serotipos o tipos. Capítulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo

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PROCEDIMIENTOS

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9.2. Fundamentos antigénicos de la bacteria: La cápsula de Haemophilus influenzae juega un papel importante en la virulencia. De acuerdo a los antígenos que la constituyen existen 6 grupos o serotipos, denominándolos con las letras a, b, c, d, e y f. Estos antígenos son de naturaleza polisacárida y son serológicamente específicos. El serotipo mas comúnmente aislado en casos de enfermedad invasiva es el b. Algunos aislamientos no poseen cápsulas, por lo que no pueden serotipificarse y se les denomina no tipificables (NT). Estos últimos suelen pertenecer a la microbiota normal.

9.3. Procedimiento: 9.3.1 9.3.2 9.3.3 9.3.4 9.3.5

Con la bacteria a identificar haga una suspensión densa (tubo No. 3 de la escala de McFarland) en solución salina al 0.85%. Coloque una gota sobre una lámina de aglutinación o un portaobjetos y agregue una gota de antisuero polivalente de H. influenzae. Agite con un palillo de madera y observe la formación de grumos bacterianos en un lapso de 1 minuto. Simultáneamente, se debe trabajar con un control positivo y uno negativo. Si la reacción con el polivalente es positiva, continúe con el monovalente anti-b y después con los otros antisueros (anti a,c,d,e,f).

NOTA: Recuerde que si se demora mucho la lectura, la placa puede secarse y dar falsos positivos. Un exceso en uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) puede dar un resultado falso negativo.

9.4. Resultado: Serología positiva: se observa una reacción fuerte en la cual todas las células están aglutinadas. Serología negativa: no se observa reacción, las células no están aglutinadas.

9.5. Control de calidad: 9.5.1 Haemophilus influenzae ATCC 10211 Resultado: Se observa una reacción fuerte en la cual todas las células están aglutinadas. 9.5.2 Haemophilus influenzae ATCC 49247 Resultado: No se observa reacción, las células no están aglutinadas.

10.PRUEBA DE ß-HEMOLISIS EN AGAR SANGRE DE CONEJO O CABALLO AL 3%:

10.1. Fundamento de la prueba: La producción de la beta hemólisis se observa fácilmente en agar sangre de caballo o de conejo al 3%. Los eritrocitos de conejo y de caballo no liberan la enzima DNAasa dentro del medio, como lo hacen los eritrocitos de carnero y debido a esto permiten el crecimiento de la mayoría de las especies de Haemophilus. 100


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


10.2. Procedimiento: 10.2.1 Siembre por agotamiento, sobre el agar sangre de caballo al 3% el microorganismo que va a estudiar, de tal manera que queden colonias aisladas. 10.2.2 Incube durante 18-24 horas a 35 oC en una atmósfera con CO 2 al 5%.

10.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: H. influenzae no produce hemolisinas. Para otras especies ver tabla No.2.

10.4. Resultado: β hemolisis negativa: no se observa zonas de beta-hemólisis alrededor de la colonia.

10.5. Control de Calidad para la Prueba de Hemólisis en Agar Sangre de Conejo o de Caballo al 3%. 10.5.1 Haemophilus influenzae ATCC 10211 Resultado: No se observa zonas de β hemólisis alrededor de la colonia. 10.5.2 Haemophilus haemolyticus INS 001 Resultado: Se observa zonas de β hemólisis alrededor de la colonia.

11.PRUEBA DE FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS: GLUCOSA, SACAROSA, LACTOSA, XILOSA, RIBOSA Y MANOSA:

11.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 11.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 11.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Haemophilus influenzae tiene la capacidad de fermentar la glucosa y la ribosa. La xilosa es fermentada solamente por el biotipo IV. La sacarosa, lactosa y manosa no son fermentados por ningún biotipo. Un color amarillo indica una reacción positiva.

11.4. Resultado Prueba de carbohidratos positiva: se observa viraje de color del violeta al amarillo. Prueba de carbohidratos negativa: no se observa viraje de color. El medio conserva su color violeta.

11.5. Control de calidad: 11.5.1 Haemophilus influenzae ATCC 10211 Resultado: Fermenta la glucosa y ribosa: vira de color del violeta al amarillo. No fermenta la xilosa, sacarosa, lactosa ni manosa: no hay viraje de color. El caldo se observa de color violeta. 11.5.2 Haemophilus parainfluenzae ATCC 7901 Resultado: Fermenta la glucosa, sacarosa y manosa: vira de color del violeta al amarillo. Capítulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo

101

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PROCEDIMIENTOS

DE


No fermenta la lactosa, xilosa y ribosa: el medio no vira de color. El caldo se observa de color violeta.

12.PRUEBA DE ONPG:

12.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 12.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 12.3. Fundamento de la bacteria: Haemophilus influenzae no posee la enzima ß-galactosidasa. Por lo tanto la prueba es negativa, no habiendo viraje de color.

12.4. Resultado: Prueba de ONPG negativa: no hay viraje de color. Se observa transparente.

12.5. Control de calidad: 12.5.1 Haemophilus influenzae ATCC 10211 Resultado: No hay viraje del color se observa transparente. 12.5.2 Haemophilus aphrophilus INS 002 Resultado: Se observa viraje al color amarillo.

13.PRUEBA DE PRODUCCIÓN DE H2S:

13.1. Fundamento de la prueba: Los radicales sulfuros contenidos en algunos aminoácidos producidos por la proteólisis de las proteínas pueden ser rotos por las enzimas de ciertas especies de microorganismos, dando como resultado la producción de H2S que al reaccionar con el acetato de plomo produce sulfito de acetato, un precipitado negro que puede ser detectado por el desarrollo de un color café oscuro sobre la tira reactiva. El propósito de esta prueba es diferenciar H. influenzae de otras especies. Ver tabla No. 2.

13.2. Procedimiento: 13.2.1 De un cultivo de 24 horas inocule un plato de agar chocolate y distribuya el microorganismo en tres direcciones, por toda la superficie del medio. 13.2.2 Coloque la tira reactiva, que contiene el acetato de plomo, sobre el inóculo. 13.2.3 Incube a 35 oC por 24-48 horas.

13.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria:

Haemophilus influenzae no produce radicales sulfuro por lo tanto, no produce un precipitado negro (H2S) al tener contacto con el acetato de plomo. Nota: Ocasionalmente algunas cepas producen radicales sulfuro. Ver tabla No. 2.

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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


13.4. Resultado: 13.4.1 Producción de H2S positiva: se observa un oscurecimiento de la tira reactiva. 13.4.2 Producción de H2S negativa: no se observa cambio de color en la tira reactiva.

13.5. Control de calidad: 13.5.1 Haemophilus aphrophilus INS 002 Resultado: no se observa oscurecimiento en la tira reactiva. 13.5.2 Haemophilus parainfluenzae ATCC 7901 Resultado: Se observa un oscurecimiento de la tira reactiva.

14.PRUEBA DE DEPENDENCIA DE CO2 :

14.1. Fundamento de la prueba: Algunas especies bacterianas no pueden crecer en ausencia de bajas concentraciones (5-10%) de CO2. Esta característica se utiliza para su identificación y diferenciación entre especies del mismo género.

14.2. Procedimiento: 14.2.1. Prepare una suspensión del microorganismo en solución salina al 0.85% con una turbidez similar al tubo 0.5 de la escala de McFarland. 14.2.1. Inocule dos platos de Agar Chocolate con 1µL de la suspensión. 14.2.1. Incube una en una atmósfera con CO 2 al 5% y la otra en aerobiosis, las dos con ambiente húmedo.

14.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: Haemophilus ifluenzae no es dependiente de CO 2 pero su crecimiento es realzado por éste. Algunas especies del género son dependientes (ver tabla No. 2) lo cual permite diferenciarlas. Debido a que la humedad juega un papel importante es necesario que los platos con el agar sean incubadas en presencia de ésta.

14.4. Resultado: Dependencia de CO 2 negativa: H. influenzae crece tanto en el plato de Agar Chocolate incubado con ambiente de CO 2 al 5% como sin él. NOTA: Esta lectura debe confirmarse por coloración de Gram de la colonia, donde los microorganismos cultivados en aerobiosis aparecerán atípicos comparados con los del cultivo en atmósfera de 5% de CO2.

14.5. Control de calidad: 14.5.1 Haemophilus influenzae ATCC 10211 Resultado: Crece con y sin 5% de CO 2 14.5.2 Haemophilus aphrophilus INS 002 Resultado: Se observa crecimiento solamente con CO 2 Capítulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Tabla 2. Especies de Haemophilus dependientes de NAD y/o hemina Especies de Haemophilus PRUEBA

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

NAD Dependiente Porfirinas Indol Urea Ornitina β Hemólisis CAMP Glucosa ácido Glucosa gas Sacarosa Lactosa Xilosa Ribosa Manosa ONPG Oxidasa Catalasa H2S CO2 dependientes

+ – V V V – – + – – – +* + – – +** + –** –

+ – – + – – – (+) – – – – (+) – – + + – –

+ – V + – + – + V – – V + – – + + + –

– – – – – (v) – (v) – – – – – – + – – –

+ + V V V – – + (v) + – – – + V + V + –

+ + – + V + – + (v) + – – – – –* + +* + –

+ + – – – – – W – W – – – – V – V – –

+ + – – – – – + + + + – + + + + – + +

– W – – – – – + + + + – + + + – – – +

– + – – – – – + V – – V / /

V = variable * = Biotipo IV 1. 2. 3. 4. 5.

** = ocasionalmente ( ) = reacción tardía

Haemophilus influenzae (ver cuadro 2 biotipos) Haemophilus aegyptius Haemophilus haemolyticus Haemophilus ducreyi Haemophilus parainfluenzae

W = reacción débil / = No hay datos 6. 7. 8. 9. 10.

Haemophilus parahemolyticus Haemophilus segnis Haemophilus paraphrophilus Haemophilus aphrophilus Actinobacillus (Haemophilus) actynomycetemcomitans

INFORME DE LOS RESULTADOS FINALES: Positivo: Se aisló Haemophilus influenzae serotipo__. Negativo: No se aisló Haemophilus influenzae.

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V + + +

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


DIAGRAMA DE FLUJO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE Haemophilus influenzae

Agar chocolate: Colonias convexas redondas pequeñas con iridiscencia

Gram: cocobacilo gramnegativo Oxidasa: Positiva Catalasa: Positiva Requerimiento de factores X y V: (+)

Porfirinas

Serología

Biotipo

Cloranfenicol acetil-transferasa

Betalactamasa

Susceptibilidad Antimicrobiana


105

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


IV. BIBLIOGRAFÍA: 1. Manual de Haemophilus influenzae, Grupo de Microbiología, Instituto Nacional de Salud, Colombia, Organización Panamericana de la Salud OPS. Taller Sobre la Identificación Bioquímica y Serológica de Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae, Managua, Nicaragua, marzo 2 al 6 de 1998. 2. Haemophilus, Bordetella y Brucella en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. George F. Brooks editor, Cap. 19, 16ª edición (de la 21ª edición en inglés), 1998, Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V. México D.F. 3. Haemophilus en Diagnóstico Microbiológico. Elmer W. Koneman editor, Cap. 7, 5ª edición, 1996, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 4. Campos JM. Haemophilus in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray ed in chief, chap 39, ASM Press, 7th ed, Washington D.C., 1999. 5. López Cruz SR. Normas Técnicas para el Diagnóstico de Meningitis Bacteriana en Normas Técnicas de Bacteriología, capítulo XIII. Sergio R. López, Justo Reyes Cerros, Alcides González Mairena, Rosibel Centeno, 3ª edición, 1996, Ministerio de Salud, Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia CNDR, Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional DANIDA, Editorial Imprimatur, Managua, Nicaragua. 6. López Cruz SR. En cooperación con Eyda de Campollo (LNS Guatemala). Manual de Procedimientos para el Diagnóstico de Meningitis Bacteriana. Organización Panamericana de la Salud, Organización Mundial de la Salud, Asociación de Laboratorios de Salud Pública, PHAO/WHO/ APHL, 2002.

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7.2

I.

Procedimientos para la identificación de Streptococcus pneumoniae

ALCANCE:

Laboratorios de la red: Numerales del 1.4.1 al 1.4.5 con respecto a la identificación. CNDR: Numerales del 1.4.1 al 1.4.6 con respecto a la identificación.

II. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: Streptococcus pneumoniae pertenece al género Streptococcus de la familia Streptococcaceae. El género Streptococcus está conformado por cocos grampositivos, aneaerobios facultativos, catalasa negativa y citocromo-oxidasa negativa. Los neumococos son bacterias grampositivas, encapsuladas, con morfología de diplococos lanceolados, con 0.5 a 1.25 µm de diámetro, agrupados en pares o en cadenas cortas (división en un plano), inmóviles, no formadores de esporas; típicamente crecen de modo difuso en caldo con suero y requieren medios complejos para su desarrollo. El cultivo en agar sangre bovina presenta colonias lisas, pequeñas, brillantes circundadas por halo verde de alfahemólisis. Son anaerobios facultativos y algunos aislamientos clínicos son exigentes en CO2. El neumococo pierde su viabilidad a 60oC por 30 minutos, se lisa fácilmente, es soluble en bilis y sensible a la optoquina. Las colonias de S. pneumoniae en medio de cultivo sólido, exhiben una zona de depresión central causada por una autolisis parcial. Con el envejecimiento del cultivo, ocurre una rápida perdida de viabilidad de estas bacterias cuando crecen en ausencia de catalasa y peroxidasa, debido a la acumulación de peróxido de hidrógeno. La pared celular consiste de un esqueleto de péptido-glucano, típico de las bacterias grampositivas. En este esqueleto se anclan el polisacárido capsular, el polisacárido C de la pared celular y las proteínas.

Polisacárido capsular: El polisacárido capsular (PS) es un determinante esencial para la antigenicidad del neumococo y todo el sistema de la clasificación en serotipos se basa en su diversidad antigénetica. Es el responsable de la diferenciación de ésta única especie en 90 serotipos. El PS fue descrito como el primer antígeno, no proteico, inductor de anticuerpos en humanos. La cápsula se sintetiza rápida y extensivamente durante la fase logarítmica del crecimiento bacteriano. En casos de enfermedad neumocócica, el antígeno PS puede ser detectado en el suero y orina de los pacientes afectados. La cápsula consiste en polímeros de alto peso molecular conformados por unidades repetitivas de oligosacáridos, ligados por enlaces covalentes a la pared celular. El polisacárido se denomina substancia Capítulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo

107

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


soluble específica (soluble specific substance, SSS). La cápsula es considerada el principal factor de virulencia de esta bacteria, debido a su resistencia a la fagocitosis.

Polisacárido de la Pared Celular: El polisacárido de la pared bacteriana, denominado también polisacárido C (C'PS) es un complejo de ácido teicoico, principal componente de la pared celular del neumococo. Está ligado covalentemente al péptidoglucano a través de residuos de ácido murámico. La cantidad de éste antígeno varía de cepa a cepa, pero es igual en casi todos los tipos de neumococo (antígeno común).

Antígeno De Forssman: Está formado de ácido lipoteicóico y ácido teicóico, similar al polisacárido C de la pared celular y está ligado covalentemente a lípidos. El antígeno de Forssman (F) se encuentra uniformemente distribuido en la membrana plasmática y también está localizado en las moléculas de LPS expuestas en la superficie. Las partes lipídicas de este antígeno están ancladas en la doble capa de lípidos de la membrana plasmática del neumococo. La presencia de este antígeno inhibe fuertemente a la autolisina neumocócica y también regula la actividad de la enzima mureína hidrolasa, que tiene actividad en la lisis bacteriana. Todos los neumococos son susceptibles a la lísis, durante la fase estacionaria del crecimiento y es durante esta fase que el antígeno regulador resulta en la degradación de la pared celular bacteriana. Los estudios de inmunización de ratones con el antígeno de Forssman no han demostrado protección contra la infección neumocócica. La principal enzima autolítica es la N-acetil-murámico-alanina-amidasa (autolisina), la cual rompe la unión entre el ácido murámico y la alanina del mucopéptido de la pared celular, durante la fase estacionaria del crecimiento de la bacteria. La lísis del neumococo por sales biliares ocurre a través de la activación de ésta enzima.


1.1. Equipos: 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4

Incubadora de CO2 Microscopio con objetivo de 100x y ocular de 10x Mechero tipo Bunsen Reloj de mesa

1.2. Materiales y Reactivos: 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 1.2.5 108

Guantes descartables no estériles Hisopos estériles Láminas portaobjetos Asas bacteriológicas con punta redonda y recta Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de materiales no reusables Capítulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo

MANUAL

1.2.6 1.2.7 1.2.8 1.2.9 1.2.10 1.2.11 1.2.12 1.2.13 1.2.14 1.2.15 1.2.16 1.2.17

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Jarra de vidrio y velas de cera blanca (si no cuenta con incubadora de CO 2) Marcadores indelebles Tubos 12 x 75 Cristal violeta Lugol Alcohol al 70 o o alcohol acetona (1:1) Fucsina acuosa o safranina. Solución salina 0.85% Discos de otoquina (hidrocloruro de etilhidrocupreína) Desoxicolato de sodio al 10%. Sueros para tipificar. Azul de metileno acuoso al 1%

1.3. Medios de cultivo: Ver medios de cultivo en procesamiento del LCR. 1.4. Pruebas para la identificación: 1.4.1 1.4.2 1.4.3 1.4.4 1.4.5 1.4.6

Observar alfa hemolisis y morfología macroscópica. Gram Catalasa Susceptibilidad a la optoquina. Solubilidad en bilis. Serotipificación.

1.5. Cepas para control de calidad: 1.5.1. Staphylococcus aureus ATCC 25923 1.5.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212 1.5.3. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS: 1.6. Antimicrobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: ver capítulo 16. 1.7. Antimicrobianos a utilizar para la Concentración Mínima inhibitoria: Antimicrobianos en polvo (de preferencia altamente purificados): 1.7.1. Penicilina 1.7.2. Ceftriaxona

2. CARACTERÍSTICAS DE LAS UFCS EN ASC: El cultivo en agar sangre de carnero presenta colonias lisas, pequeñas, redondas, brillantes, al principio cupuliformes, que desarrollan más tarde una meseta central con bordes elevados, circundadas por un halo verde de alfahemólisis. Capítulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo

109

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


3. COLORACIÓN DE GRAM DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS A PARTIR DEL AGAR SANGRE. Permite observar la tinción, agrupación y morfología, microscópica característica.

3.1. Procedimiento para la preparación del frotis: ver capítulo 3. 3.2. Procedimiento para la tinción de Gram: ver capítulo 3. 3.3. Resultado: Diplococos lanceolados grampositivos formando cadenas cortas.

3.4. Control de Calidad para la prueba de Gram 3.4.1. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Resultado: Se observa diplococos lanceolados grampositivos formando cadenas cortas. 3.4.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Se observa bacilos cortos gramnegativos. NOTA: La coloración de Gram a partir de cultivos de más de 48 horas es difícil de interpretar.


4.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 4.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 4.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Streptococcus pneumoniae no posee la enzima catalasa, por lo tanto la prueba es negativa y no se formarán burbujas.

4.4. Resultado: Catalasa negativa: no se observa producción de burbujas.

4.5. Control de calidad: 4.5.1. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Resultado: No hay producción de burbujas. 4.5.1. Staphylococcus aureus. ATCC 25923 Resultado: Producción inmediata e intensa de burbujas.

5. PRUEBA DE LA SUSCEPTIBILIDAD A LA OPTOQUINA:

5.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 5.2. Procedimiento: ver capítulo 17.

110


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


5.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Streptococcus pneumoniae es susceptible a optoquina en bajas concentraciones.

5.4. Resultado: Optoquina positiva: zonas de inhibición mayores o iguales a 14mm son interpretadas como susceptibles. Optoquina negativa: zonas de inhibición menores de 14mm son interpretados como no susceptibles.

5.5. Control de calidad: 5.5.1. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Resultado: Zonas de inhibición mayores o iguales a 14 mm son interpretadas como susceptibles. 5.5.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Zonas de inhibición menores de 14mm son interpretados como no susceptibles.


6.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 6.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 6.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: Streptococcu pneumoniae produce enzimas autolíticas que son las responsables de la característica umbilicada de la colonia en cultivos viejos. La principal enzima autolítica es la N-acetil-murámicoalanina amidasa (autolisina), la cual rompe la unión entre el ácido murámico y la alanina del mucopéptido de la pared celular, durante la fase estacionaria del crecimiento. La lisis del neumococo por sales biliares ocurre a través de la activación de ésta enzima. La adición de la solución de sales de bilis a la suspensión de Streptococcus pneumoniae, acelera el proceso de lisis, proceso asociado con la disminución de la tensión superficial entre el medio y la membrana celular bacteriana.

6.4. Resultado: Solubilidad en bilis positiva: se observa claridad o transparencia en el tubo. Compare con el control positivo. El control negativo deberá permanecer turbio.

6.5. Control de calidad para la prueba de solubilidad en Bilis: 6.5.1. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Resultado: Solubilidad en bilis positiva: se observa claridad o transparencia en el tubo. 6.5.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Solubilidad en bilis negativa: se observa turbidez en el tubo


111

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


7. SEROLOGÍA:

7.1. Fundamento de la prueba: La presencia de antígenos específicos en la cápsula o pared celular es utilizada como base para la caracterización serológica de algunos géneros y especies bacterianas. En algunos casos el antígeno está ubicado en el LPS de la pared y están conformados por carbohidratos. Pequeñas variaciones de los azúcares dan como resultado variaciones en la especificidad del antígeno. En algunos casos el antígeno está ubicado en la cápsula. En ambos casos y cuando la naturaleza del antígeno es altamente específica, es utilizada para clasificar a la bacteria en serogrupos, serotipos o tipos.

7.2. Procedimiento: 7.2.1.

Rotule un tubo de 12 x 75 mm con el número del aislamiento y coloque 0.5 mL de solución salina estéril.

7.2.2.

Con un hisopo estéril, tome de 3 a 5 colonias aisladas y realice una emulsión en el tubo con solución salina. La suspensión debe tener una apariencia ligeramente turbia, es decir, debe ser menor que el estándar 0.5 de la escala de MacFarland .

7.2.3.

Marque una lámina portaobjetos con el número del aislamiento.

7.2.4.

Tome el hisopo húmedo y frótelo firmemente contra la lámina portaobjetos.

7.2.5.

Realice dos extendidos de forma circular a cada extremo de la lámina (el diámetro del extendido debe ser de aproximadamente 1 cm).

7.2.6.

Deje secar los extendidos al aire. No los fije.

7.2.7.

Con un asa pequeña estéril remueva y tome una asada del antisuero, colóquela sobre el extendido y mezcle bien.

7.2.8.

Con una asa pequeña estéril tome una gota de solución acuosa de azul de metileno al 1%, y colóquela sobre el antisuero en la lámina portaobjetos.

7.2.9.

Coloque un cubreobjetos y presione suavemente para permitir que el colorante se extienda.

7.2.10. Coloque una gota de aceite de inmersión sobre el cubreobjetos. 7.2.11. Examine con el objetivo de 100x . NOTA: El orden en el cual los antisueros son probados se basa en la frecuencia con que aparecen los diferentes serotipos de Streptococcus pneumoniae.

7.3. Fundamentos antigénicos de la bacteria: La pared celular consiste de un esqueleto de péptido-glucano, típico de las bacterias grampositivas. En este esqueleto se anclan el polisacárido capsular, el polisacárido C de la pared celular y las proteínas. El polisacárido capsular (PS) es un determinante esencial para la antigenicidad del neumococo y todo el sistema de la clasificación en serotipos se basa en su diversidad antigénica. Es la responsable de la diferenciación de ésta única especie en 90 serotipos. La determinación del serotipo es fundamental para estudios epidemiológicos que permiten contribuir a los esfuerzos por lograr una vacuna polivalente única que cubra el continente americano.

112


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


7.4. Resultado: Positiva: se observa hinchazón de la cápsula (reacción de qellung) y aglutinación de las células. Negativa: no se observa hinchazón de la cápsula, ni aglutinación de las células.

7.5. Control de calidad de la prueba de Serología: 7.5.1. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Resultado: Se observa hinchazón de la cápsula y aglutinación de las células. 7.5.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: No se observa hinchazón de la cápsula, ni aglutinación de las células.

INFORME DE LOS RESULTADOS FINALES: Positivo: Se aisló Streptococcus pneumoniae. Negativo: No se aisló Streptococcus pneumoniae. Nota: Todos los neumococos aislados de casos invasivos (LCR, hemocultivo, derrame pleural) deben ser enviados al CNDR para confirmación bioquímica, pruebas especiales de sensibilidad y determinación del serotipo.

DIAGRAMA DE FLUJO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE Streptococcus pneumoniae Agar Sangre de Carnero: Colonias pequeñas grisáceas, mucoides, alfa hemolíticas

Frotis: diplococos lanceolaos grampositivos

Catalasa: Negativa

Optoquina: Positiva

Solubilidad en Bilis: Positiva

Serología

Susceptibilidad antimicrobiana


113

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


IV. BIBLIOGRAFÍA: 1.

Manual de Streptococcus pneumoniae, Grupo de Microbiología, Instituto Nacional de Salud, Colombia, Organización Panamericana de la Salud, OPS. Taller Sobre la Identificación Bioquímica y Serológica de Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae, Managua, Nicaragua, marzo 2 al 6 de 1998.

2.

Estreptococos en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. George F. Brooks editor, cap. 15, 16ª edición (de la 21ª edición en inglés), 1998, editorial El Manual Moderno S.A. de C.V. México D.F.

3.

Los Cocos Grampositivos en Diagnóstico Microbiológico. Elmer W. Koneman editor, Cap.12, 5ª edición, 1996, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.

4.

López Cruz SR. Normas Técnicas para el Diagnóstico de Meningitis Bacteriana en Normas Técnicas de Bacteriología, capítulo XIII. Sergio R. López, Justo Reyes Cerros, Alcides González Mairena, Rosibel Centeno, 3ª edición, 1996, Ministerio de Salud, Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia CNDR, Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional, DANIDA, Editorial Imprimatur, Managua, Nicaragua.

5.

López Cruz SR. En cooperación con Eyda de Campollo (LNS Guatemala). Manual de Procedimientos para el Diagnóstico de Meningitis Bacteriana. Organización Panamericana de la Salud, Organización Mundial de la Salud, Asociación de Laboratorios de Salud Pública, PHAO/WHO/ APHL, 2002.

114


7.3

Procedimientos para la identificación de Neisseria meningitidis

I. ALCANCE: Laboratorios de la red: Numerales del 1.4.1 al 1.4.4 con respecto a la identificación. CNDR: Numerales del 1.4.1 al 1.4.6 con respecto a la identificación.

II. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: Neisseria meningitidis son diplococos gramnegativos cuya apariencia es similar a riñones o granos de café, con los lados adyacentes planos o cóncavos. Miden de 0,6 a 1,5 µm, en dependiencia del medio de cultivo y el tiempo de incubación. Son inmóviles, no esporulados, aerobios y se desarrollan óptimamente a temperaturas entre 35 a 37 oC. Su crecimiento se realza cuando se incuba bajo una atmósfera con CO 2 y humedad. N. meningitidis es oxidasa y catalasa positiva. Suelen producir ácido de algunos carbohidratos por la vía de oxidación, no por vía de la fermentación.


1.1. Equipos: 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3. 1.1.4.

Incubadora de CO2 Microscopio con objetivo de 1000 y ocular de 10x Mechero tipo Bunsen Reloj de mesa

1.2. Materiales y Reactivos: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6. 1.2.7. 1.2.8. 1.2.9.

Guantes descartables no estériles Láminas portaobjetos Asas bacteriológicas con punta redonda y recta Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de materiales pequeños Jarra de vidrio y velas de cera blanca (si no cuenta con incubadora de CO 2) Marcadores indelebles. Cristal violeta Lugol Alcohol al 70% o alcohol acetona Capítulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo

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MANUAL

1.2.10. 1.2.11. 1.2.12. 1.2.13. 1.2.14. 1.2.15. 1.2.16.

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Fucsina acuosa o safranina Solución salina 0,85% Tiras de oxidasa Peróxido de Hidrógeno al 30% Base para los azúcares: Cisteína Triptona Agar CTA Glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa Suero para aglutinacion grupos A, B, C, D, W135, X, Y, Z y Z1 .

1.3 Medios de cultivo: Ver medios de cultivo en procesamiento del LCR. 1.4. Pruebas para la Identificación: 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3. 1.4.4. 1.4.5. 1.4.6.

Observar morfología macroscópica y condiciones de cultivo. Gram Oxidasa Catalasa Producción de ácidos a partir de glucosa, maltosa, sacarosa y sactosa. Serotipoficación.

1.5. Cepas para control de calidad: 1.5.1 1.5.2 1.5.3 1.5.4 1.5.5

Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Neisseria meningitidis ATCC 13102

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS: 1.6 Antimicrobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: Ninguna. 1.7. Antimicrobianos a utilizar para la Concentración Mínima inhibitoria: Antimicrobianos en polvo altamente purificados: 1.7.1 Penicilina.

1.8. Pruebas Especiales: 1.8.1. Betalactamasa

2. CARACTERÍSTICAS DE LAS UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFCs) EN AGAR CHOCOLATE O AGAR SANGRE: Son ligeramente café grisáseas, convexas, traslúcidas, elevadas, lisas y mucoides, miden de 1-3 mm de diámetro. 116


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


3. COLORACIÓN DE GRAM DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS A PARTIR DEL AGAR CHOCOLATE O AGAR SANGRE: Permite observar tinción, agrupación y morfolología microscópica.

3.1. Procedimiento para la preparación del frotis: ver capítulo 3. 3.2. Procedimiento para la tinción del frotis: ver capítulo 3. 3.3. Resultado: Diplococos arriñonados Gram negativos.

3.4. Control de calidad: 3.4.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Bacilos gramnegativos cortos 3.4.2. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Cocos grampositivos en racimos


4.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 4.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 4.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: Nesseria meningitidis posee la enzima citocromo oxidasa la cual se detecta al colocar un inóculo en una tira que contenga el reactivo para-dimetilendiamina o tetra-para-difenilendiamina, que se caracteriza por la aparición de un color púrpura en la tira reactiva.

4.4. Resultado: Oxidasa positiva: se observa un color púrpura en la tira reactiva.

4.5. Control de calidad: 4.5.1. Pseudomonasa aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Presencia de la enzima citocromooxidasa: se observa un color púrpura en la tira reactiva. 4.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Ausencia de la enzima citocromooxidasa: se observa un color amarillo palido en la tira reactiva.


5.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 5.2. Procedimiento: ver capítulo 17. Capítulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo

117

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PROCEDIMIENTOS

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5.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Neisseria meningitidis posee la enzima catalasa, por lo tanto da reacción positiva cuando se mezcla con peróxido de hidrógeno, la cual se caracteriza por la formación inmediata y moderada de burbujas.

5.4. Resultado: Catalasa positiva: producción inmediata y moderada de búrbujas.

5.5. Control de calidad: 5.5.1. Staphylococcus aureus. ATCC 25923 Resultado: Producción inmediata e intensa de burbujas. 5.5.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: No hay producción de burbujas.

6. PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS A PARTIR DE GLUCOSA, MALTOSA, SACAROSA, Y LACTOSA:

6.1. Fundamento de la prueba: Tradicionalmente la producción de ácido de carbohidratos ha sido determinada usando la basede Cistina Tripticasa Agar (CTA) con los carbohidratos en un porcentaje al 1%. El azúcar por esta vía es convertido en productos intermedios como el ácido pirúvico. Al carecer de las enzimas deshidrogenasas, las bacterias con enzimas oxidativas transfieren iones de hidrógenos disponibles, del acido pirúvico al ciclo de Krebs, los que se unen con oxígeno para formar agua. El acido pirúvico es transformado en ácido láctico y otros ácidos mixtos. Estos ácidos que se producen por vía oxidativa en los tubos de CTA son extremadamente débiles, por lo tanto, deben utilizarse sistemas de pruebas con detectores más sensibles. Por el momento las pruebas de detección de ácidos con sistemas más sensibles, aunque existen, no están extendidos comercialmente, por lo cual, se tendrá que seguir empleando el CTA.

6.2. Procedimiento: 6.2.1. Marque 4 tubos de CTA con las iniciales G (glucosa), M (maltosa), S (sacarosa) y L (lactosa). 6.2.2. De un cultivo de 24 horas y empleando un asa redonda, tome varias UFC, de tal manera que quede bien cargada. 6.2.3. Introduzca varias veces el asa en el tubo de CTA, de tal manera que el inóculo quede esparcido ampliamente. 6.2.4. Repita el procedimiento anterior en los restantes 3 tubos de CTA. 6.2.5. Introduzca un disco de glucosa en el primer tubo y repita el procedimiento en los restantes 3 tubos con discos de maltosa, sacarosa y lactosa. 6.2.6. Cierre herméticamente con tapones de rosca e incube entre 35 o-37 oC en aerobiosis, durante 18-24 horas. 118


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PROCEDIMIENTOS

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6.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las pruebas confirmativas son necesarias para distinguir entre varias especies del género Neisseria. Las especies de Neisseria se pueden diferenciar entre sí por los patrones de acidificación de 4 azúcares: Glucosa Maltosa Lactosa Sacarosa Neisseria meningitidis oxida la glucosa y maltosa pero no la lactosa ni la sacarosa. La oxidación se detecta en el tubo de CTA por un cambio de color hacia el amarillo en la parte más superficial del tubo. Los tubos, previos a su inoculación, son de color rosado intenso a rojo.

6.4. Resultado: Producción de ácidos a partir de glucosa y maltosa positiva: hay viraje en el color del rosado al amarillo. Producción de ácidos a partir de sacarosa y lactosa negativa: no hay viraje en el color, se observa de color rosado.

6.5 Control de calidad: 6.5.1. Nesisseria meningitidis ATCC 13102 Resultado: Oxidación de la glucosa y maltosa positiva: viraje de color del rosado al amarillo, en el tercio superior del tubo. Oxidación de la sacarosa y lactosa negativa: no hay viraje de color.

7. SEROTIPIFICACIÓN:

7.1. Fundamento de la prueba: La presencia de antígenos específicos en la cápsula o pared celular es utilizada como base para la caracterización serológica de algunos géneros y especies bacterianas. En algunos casos el antígeno está ubicado en el LPS de la pared y están conformados por carbohidratos. Pequeñas variaciones de los azúcarres dan como resultado variaciones en la especificidad del antígeno. En algunos casos el antígeno está ubicado en la cápsula. En ambos casos y cuando la naturaleza del antígeno es altamente específica, es utilizada para clasificar a la bacteria en serogrupos o serotipos.

7.2. Procedimiento: 7.2.1. Tome una de las dos partes de un plato Petri descartable (100 mm). Utilizando un marcador fino indeleble dibuje varios cuadrantes, de tal manera que obtenga rectángulos de aproximadamente 2.5 x 1cm. 7.2.2. En la cara interna del plato que dibujó y guiándose por los rectángulos dibujados, coloque una gota del suero A, B, o C. Se sugiere empezar con el suero que más comunmente da reacciones positivas en su laboratorio. En Nicaragua, el serogrupo circulante interepidémico es el B. Capítulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo

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PROCEDIMIENTOS

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7.2.3. Utilizando un palillo de madera, tome un inóculo del plato de ACh (una UFC suele ser suficiente) y frótela gentilmente frente a la gota del suero, a manera de descargar el inóculo en la superficie de un área muy pequeña (no mayor que la gota). 7.2.4. Utilizando el mismo palillo mezcle la gota de suero y el inóculo con movimientos hacia delante y hacia atrás, siguiendo el sentido del rectángulo. 7.2.5. Descarte el palillo en un contenedor conteniendo cloro al 0.5%. 7.2.6. Mueva el plato con movimientos que sigan el sentido del rectángulo al mismo tiempo que observa con una luz indirecta durante un máximo de un minuto. 7.2.7. Observe si hay aglutinación. Si no hay, repita el procedimiento anterior con cada uno de los sueros hasta encontrar el serogrupo correspondiente. NOTA: La aglutinación fuerte y rápida suele presentarse antes de transcurrido un minuto. Recuerde que si demora mucho la lectura, la placa puede secarse y dar falsos positivos. Un exceso de uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) puede dar un resultado falso negativo. Tome en cuenta que la identificación serológica de Neisseria meningitidis es una prueba presuntiva y es insuficiente sin las pruebas confirmativas. Otras especies de Neisseria pueden dar reacciones cruzadas con N. meningitidis. Los serogrupos A y C pueden dar reacciones cruzadas debido a la presencia de polisacáridos capsulares comunes. Por esta razón, las pruebas confirmativas deben preceder a la serotipificación.

7.3. Fundamentos antigénicos de la bacteria: Existen 13 serogrupos de N. meningitidis, clasificados en base a los polisacáridos de la cápsula o a los antígenos de la membrana externa. Estos serogrupos se denominan con las letras mayúscualas del alfabeto y números arábigos en algunos de ellos: A, B, C, D, 29E, H, I, J, K, L, W135, X, Y y Z. Los serogrupos más frecuentes implicados en brotes o epidemias son el A, B, C, Y y W135. Los serogrupos A y C están asociados a enfermedad meningocóccica de tipo epidémico, en tanto que el B se asocia más a casos de enfermedad infecciosa esporádica interepidémica, ocasionalmente en brotes muy localizados.

7.4. Resultado: Serología positiva: se observa aglutinación rápida y completa. Serología negativa: no se observa aglutinación.

7.5. Control de calidad: 7.5.1. Nesisseria meningitidis ATCC 13102 Resultado: Aglutinación positiva con suero C. 7.5.2. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: No se observa aglutinación con suero C

INFORME DE LOS RESULTADOS FINALES: Positivo: Se aisló Neisseria meningitidis C. Negativo: No se aisló Neisseria meningitis C. 120


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PROCEDIMIENTOS

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DIAGRAMA DE FLUJO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE Neisseria meningitidis

Agar Chocolate: Colonias mucoides, traslúcidas, no pigmentadas, no hemolíticas

Frotis: Diplococos Gram negativos arriñonados

Oxidasa: positiva

Betalactamasa

Catalasa: positiva

Cistina Tripticasa Agar

Serología

Susceptibilidad por MIC

Producción de ácidos

Glucosa

Maltosa

Lactosa

Sacarosa

Amarillo

Amarillo

Rosado intenso

Rosado intenso


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PROCEDIMIENTOS

DE


IV. BIBLIOGRAFÍA: 1. López Cruz SR. Normas Técnicas para el Diagnóstico de Meningitis Bacteriana en Normas Técnicas de Bacteriología, capítulo XIII. Sergio R. López, Justo Reyes Cerros, Alcides González Mairena, Rosibel Centeno, 3ª edición, 1996, Ministerio de Salud, Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia CNDR, Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional, DANIDA, Editorial Imprimatur, Managua, Nicaragua. 2. Especies de Neisseria y Moraxella catarrahalis en Diagnóstico Microbiológico. Elmer W. Koneman editor Cap. 10, 5 a edición, 1996, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 3. Neisserias en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. George F. Brooks editor, Cap. 21, 16ª edición (de la 21ª edición en inglés), 1998, Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V. México D.F. 4. Haemophilus en Diagnóstico Microbiológico. Elmer W. Koneman editor, Cap. 7, 5ª edición, 1996, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 5. Knapp JS, Koumans EH. Neisseria and Branhamella in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray ed in chief, chap 38, ASM Press, 7th ed, Washington D.C., 1999. 6. López Cruz SR. En cooperación con Eyda de Campollo (LNS Guatemala). Manual de Procedimientos para el Diagnóstico de Meningitis Bacteriana. Organización Panamericana de la Salud, Organización Mundial de la Salud, Asociación de Laboratorios de Salud Pública, PHAO/WHO/APHL, 2002.

122


7.4

Procedimienos para la identificación de Listeria monocytogenes

I. TOMA DE MUESTRA Ver toma de muestra del LCR

II. TRANSPORTE Si la muestra no puede ser sembrada inmediatamente, almacenar o transportar la muestra a 4oC, por un período de 24 a 48 horas.

III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA Ver inicio del capítulo 7.

IV. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS Ver inicio de capítulo 7.

V. ALCANCE: Laboratorios de la Red: Del. 1.4.15 con respecto a las pruebas de identificación. CNDR: Del 1.4.15 con respecto a las pruebas de identificación.

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS El género Listeria comprende un grupo de pequeños bacilos o coco bacilos grampositivos no esporulados, móviles por flagelos perítricos cuando es cultivada entre 20 y 25oC. Debido a su forma variable, los miembros de este genero se confunden usualmente con Corynebacterium, Lactobacillus, Streptocuccus y Enterococcus. Listeria se puede diferenciar de los últimos tres géneros por su producción de catalasa y su movilidad lo diferencia de Corynebacterium. El género Listeria comprende las siguientes especies: L. monocytogenes, L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri, y L. welshimeri, de las cuales, solamente Listeria monocytogenes es patógena para los humanos. Esta especie ha sido aislada se una gran variedad de fuentes del ambiente y animales. En la cadena de transmisión los productos alimenticios provenientes de animales ingresan al tracto digestivo y posteriormente invade a tejidos como el sistema nervioso central. Listeria monocytogenes un bacilo grampositivo no esporulado, corto, cuyas células miden entre 0.4 a 0.5mm x 1.0 a 2.0mm. Es un poco más pequeño que otras especies de bacilos grampositivos aerobios. Capítulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo

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PROCEDIMIENTOS

DE


Son cocobacilos y ocasionalmente pueden verse como diplobacilos, cadenas cortas y en ocaciones formando empalizadas similares a difteroides. Cuando se examinan frotis de líquido cefalorraquídeo es importante tomar en cuenta a L. monocytogenes, importante agente causal de meningitis bacteriana aunque menos frecuente que N. meningitidis, Streptococcus ß hemolíticos del grupo B y H. influenzae. En placas de Agar Sangre de Carnero, incubadas a 35oC durante 24 horas en ambiente de CO2 al 5% se observan colonias pequeñas, translúcidas y grises. La mayoría de las cepas producen un estrecho halo de beta hemólisis que habitualmente no se extiende más allá del borde de la colonia. La hemolisina es el principal factor de virulencia de Listeria monocytogenes.

VII. IDENTIFICACIÓN: 1.

EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIÓN:

1.1. Equipos: 1.1.1. Mechero tipo Bunsen 1.1.2. Incubadora 1.1.3. Microscopio con objetivo de inmersión 100x y ocular de 10x

1.2. Materiales y Reactivos: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6. 1.2.7. 1.2.8. 1.2.9. 1.2.10. 1.2.11. 1.2.12. 1.2.13. 1.2.14. 1.2.15. 1.2.16. 1.2.17. 1.2.18. 1.2.19.

124

Asas bacteriológicas con punta recta y redonda Gradilla Guantes descartables no estériles Láminas portaobjetos Jarra de vidrio y velas de cera blanca (si no se cuenta con incubadora de CO 2) Colorantes de Gram Aceite de inmersión Peroxido de hidrógeno al 30% Azúcares: lactosa, ramnosa, xilosa, manitol TSI Esculina Caldo Vogues-Proskauer (VP) Caldo de nitratos NO3NO2 Reactivo A (á-Naftilamina, ácido acético 5N) Reactivo B (Ácido sulfanílico, ácido acético 5N) Oxidasa Urea Mio Citrato


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PROCEDIMIENTOS

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1.3. Medios de cultivo: 1.3.1. Caldo tripticasa soya o caldo triptosa 1.3.2. Agar Sangre de Carnero

1.4 Pruebas para identificación: 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3. 1.4.4. 1.4.5. 1.4.6.

Desarrollo a 4oC Morfología de las colonias Gram Catalasa CAMP Test Fermentación de glucosa y lactosa en TSI

1.4.7. Producción de H2S en TSI 1.4.8. Fermentación de ramnosa, xilosa y manitol: 1.4.9. 1.4.10. 1.4.11. 1.4.12. 1.4.13. 1.4.14. 1.4.15.

Hidrólisis de Esculina Vogues-Proskauer (VP) Reducción de nitratos Oxidasa Ureasa Producción de indol Crecimiento en citrato

1.5. Cepas para control de calidad: 1.5.1. Listeria monocytogenes B-1-1999

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS: 1.6 Antimicrobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: Ninguno. La sensibilidad debe realizarse por el método de Concentración Inhibitoria Mínima.

2. DESARROLLO A 4oC: Fundamento: Debido a que L. monocytogenes puede ser difícil de aislar a 35oC desde hace mucho tiempo se recomienda utilizar la capacidad de Listeria de desarrollarse a 4oC para su aislamiento cuando, por ejemplo, las muestras del LCR han resultado negativas para las bacterias mas comunes y las pruebas presuntivas soportan la posibilidad de meningitis bacteriana.

2.1. Procedimiento: 2.1.1. Mezclar una parte de la muestra con nueve partes de caldo tripticasa soya (o caldo triptosa en su defecto).


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PROCEDIMIENTOS

DE


2.1.2. Mantener la mezcla muestra-caldo a 4 oC durante varios días a dos meses. 2.1.3. Subcultivar la mezcla en agar sangre de carnero semanalmente, hasta lograr la recuperación del microorganismo. 2.1.4. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: Listeria monocytogenes tiene la capacidad de desarrollarse a 4oC.

2.3. Resultado: Crecimiento y recuperación del microorganismo a partir del caldo incubado a 4 oC.

3. CARACTERÍSTICAS DE LAS UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC): Colonias pequeñas, translúcidas y grises. En Agar Sangre de Carnero se observan con un halo de b hemólisis que habitualmente no se extiende mas allá del borde de la colonia. Listeria monocytogenes no forma colonias blancas como lo hacen otros bacilos grampositivos.

4. GRAM:

4.1. Fundamento: ver capítulo 3. 4.2. Procedimiento: ver capítulo 3. 4.3. Fundamentos estructurales de la bacteria: La tinción de Gram permite observar las características tintoriales de Listeria monocytogenes así como su agrupación y morfología microscópica.

4.4. Resultado: Bacilos o cocobacilos cortos grampositivos dispuestos en empalizadas, diplobacilos o cadenas cortas.

4.5. Control de calidad: Listeria monocytogenes B-1-1999 Resultado: Cocobacilos grampositivos agrupados en empalizadas, diplobacilos y cadenas cortas.

5. CATALASA:

5.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 5.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 5.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: 5.5.1. Listeria monocytogenes posee la enzima catalasa, por lo tanto descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.

5.4. Resultado: Catalasa positiva: producción rápida y moderada de burbujas. 126


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


5.5. Control de calidad: 5.5.1. Listeria monocytogenes B-1-1999. Resultado: Catalasa positiva: producción moderada de burbujas.

6. CAMP Test (Christie, Atkins, Munch-Peterson):

6.1. Principio de la prueba: ver capítulo 17. 6.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 6.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: La actividad hemolítica de Listeria monocytogenes es potenciada por la β lisina del Staphylococcus aureus y por lo tanto produce una reacción positiva para la prueba de CAMP según como se aprecia en al figura No. 1.

zona de betahemólisiss L. monocytogenes

S. aureus

L. ivanovii

6.1. Resultado: Formación de un halo rectangular de hemólisis acentuada en la parte cercana al inóculo de Staphylococcus aureus

6.2. Control de calidad: 6.5.1. Listeria monocytogenes B-1-1999 Resultado: Prueba de CAMP positiva.

7. FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN TSI:

7.1. Principio de la prueba: ver capítulo 17. 7.2. Procedimiento: ver capítulo 17. Capítulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo

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PROCEDIMIENTOS

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7.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Listeria monocytogenes posee las enzimas galactosidasa y galactósido permeasa que fermentan la lactosa, la enzima invertasa que fermenta la sacarosa y la enzima glucosa 6 fosfato deshidrogenasa que fermenta la glucosa. No produce gas porque carece de la enzima deshidrogenasa fórmica. También carece de las enzimas tiosulfato reductasa y cisteína disulfurasa por lo tanto no produce sulfuro de hidrógeno.

7.4. Resultados: 7.4.1. Fermentación de lactosa y glucosa: A/A (amarillo / amarillo sin gas y sin H2S).

7.5. Control de calidad: 7.5.1.Listeria monocytogenes B-1-1999 Resultado: Fermentación de lactosa y glucosa: A/A.

3. FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS: MANITOL, RAMNOSA Y XILOSA:

8.1. Principio de la prueba: ver capítulo 17. 8.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 8.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria:

Listeria monocytogenes fermenta la ramnosa pero no la xilosa ni el manitol.

8.4. Resultados: 8.4.1. Fermentación de la ramnosa positiva: viraje de color del caldo, del violeta al amarillo. 8.4.2. Fermentación de la xilosa y el manitol negativos: no hay viraje de color del caldo. Queda de color violeta.

8.5. Control de calidad: Listeria monocytogenes B-1-1999 Resultado: Fermentación de ramnosa positiva: viraje de color de violeta a amarillo. Fermentación de la xilosa y manitol negativa: no hay viraje de color. El caldo queda de color violeta

9. HIDRÓLISIS DE LA ESCULINA:

9.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 9.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 9.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Listeria monocytogenes hidrolisa la esculina en glucosa y esculetina.

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PROCEDIMIENTOS

DE


9.4. Resultados: Hidrólisis de la esculina positiva: el medio inicialmente de color ligeramente ámbar se torna de color negro.

9.5. Control de calidad: 9.5.1. Listeria monocytogenes B-1-1999 Resultado: Hidrólisis de la esculina positiva: viraje de color del ámbar al negro.

10.VOGUES-PROSKAUER (VP):

10.1. Principio de la prueba: ver capítulo 17. 10.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 10.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Listeria monocytogenes produce acetilmetilcarbinol como producto metabólico final de la glucosa y forma cantidades pequeñas de ácidos mixtos.

10.4. Resultados: Producción de acetilmetilcarbinol positiva: formación de un anillo de color zapote en la superficie del caldo al agregar el hidróxido de potasio y alfanaftol.

10.5. Control de calidad de la prueba: 10.5.1. Listeria monocytogenes B-1-1999 Resultado: Producción de acetilmetilcarbinol positiva: aparece un anillo color zapote al agregar el reactivo.

11.REDUCCIÓN DE NITRATOS:

11.1. Principio de la prueba: ver capítulo 17. 11.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 11.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Listeria monocytogenes no tiene la capacidad de obtener energía de las moléculas de nitratos, por lo tanto, no los reduce a nitritos.

11.4. Resultados: Reducción de nitratos negativa: el caldo no vira de color al agregar los reactivos A y B en los primeros 30 segundos.

11.5. Control de calidad: 11.5.1. Listeria monocytogenes B-1-1999 Resultado: No hay producción de nitritos: el caldo no varía de color al agregarle los reactivos. Capítulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo

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PROCEDIMIENTOS

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12.OXIDASA:

12.1. Fundamento: ver capítulo 17. 12.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 12.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Listeria monocytogenes no posee la enzima citocromo oxidasa, por lo tanto da reacción negativa, que se caracteriza por la ausencia de viraje de color en la tira reactiva.

12.4. Resultado: Oxidasa negativa: no hay viraje de color en la tira reactiva

12.5. Control de calidad: 12.5.1. Listeria monocytogenes

B-1-1999

Resultado: Oxidasa negativa: no hay viraje de color en la tira reactiva.

13. UREASA:

13.1. Principio de la prueba: ver capítulo 17. 13.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 13.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Listeria monocytogenes carece de la enzima ureasa por lo tanto, no hidrolizan la urea.

13.4. Resultado: Hidrólisis de la urea negativa: no hay viraje del color. El medio conserva su color original.

13.5. Control de calidad: 13.5.1. Listeria monocytogenes B-1-1999. Resultado: Hidrólisis de la urea negativa: no hay viraje de color.

14.INDOL:

14.1. Principio de la prueba: ver capítulo 17. 14.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 14.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria:

Listeria monocytogenes carece de la enzima triptofanasa, por lo tanto no produce indol.

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PROCEDIMIENTOS

DE

DE


14.4. Resultado: Producción de indol negativo: ausencia de anillo rojo en la superficie del medio (MIO) al adicionar el reactivo de Kovacs.

14.5. Control de calidad: 14.5.1. Listeria monocytogenes B-1-1999 Resultado: Producción de indol negativa: no hay viraje de color al agregar el reactivo.

15.CITRATO:

15.1. Principio de la prueba: ver capítulo 17. 15.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 15.3. Fundamento de la bacteria: Listeria monocytogenes no utilizan el citrato como única fuente de carbono.

15.4. Resultados: Utilización del citrato negativa: no hay viraje de color, ni crecimiento en el medio.

15.5. Control de calidad: 15.5.1. Listeria monocytogenes B-1-1999 Resultado: Utilización del citrato negativa: no hay viraje de color ni crecimiento en el medio.

TABLA DE DIFERENCIACIÓN DE ESPECIES DE LISTERIA Especie L. L. L. L. L.

monocytogenes grayi innocua ivanovii seeligeri

CAMP Hemólisis

Test

+

+

– –

– – –

Manitol –

+

++ +

+

– – –

–

–

–

L. welshimeri

Reducción de nitratos

Fermentación Ramnosa + V V

Xilosa

– –

+ +

ND

V

+

ND

– – –

–

V – –

V: variable ND: no determinado

VIII. BIBLIOGRAFÍA: 1. Bille J, Rocourt J and Swaminathan B. Listeria, Erysipelothrix, and Kurthia in Manual of Clinical Microbiology. Patrick R. Murray ed in chief, chap 22, 7th ed, 1999, ASM Press, Washington, D.C. Capítulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del líquido cefalorraquídeo

131

CAPÍTULO 8.

Procedimientos para bacterias aisladas en hemocultivos I. TOMA DE LA MUESTRA: 1. INDICACIONES: Se realiza hemocultivos en caso que se sospeche de: 1.1. Fiebre Tifoidea y Paratifoidea y sospecha de salmonelosis 1.2. Meningococcemia. 1.3. Infección del torrente sanguíneo por anaerobios. 1.4. Infección del torrente sanguíneo por gramnegativos y/o grampositivos. 1.5. Endocarditis bacteriana. 1.6. Leptospirosis 2. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA: 2.1

La sangre para hemocultivos se obtiene de los pacientes durante el período febril y antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos. En casos de fracaso terapéutico en los cuales aún no se ha corroborado el diagnóstico microbiológico, el tratamiento con antimicrobianos debe suspenderse durante 72 horas bajo supervisión médica. En estos casos se requiere una estrecha colaboración entre el laboratorista y el médico quien es el que debe evaluar los riesgos / beneficios de suspender la terapia para el aislamiento bacteriano en casos de fracaso de la terapia antibacteriana. El número de muestras a tomar y el momento de hacerlo depende de la naturaleza de la patología. En casos de fiebre tifoidea o de salmonelosis invasivas, los índices de aislamiento son óptimos en la primera y segunda semanas. Si se trata de endocarditis bacteriana, la toma de tres muestras separadas el primer día de ingreso, detecta el 90% de los agentes infecciosos. Existen otras variaciones y el criterio del cardiólogo debe ser tomado en cuenta para determinar la frecuencia y el momento de la toma.

2.2.

Lavarse las manos y usar guantes estériles. Para extraer la muestra realizar limpieza y antisepsia de la piel primero con alcohol iodado al 2% y seguidamente con alcohol al 70%.

2.3.

Extraer la sangre con jeringa estéril de manera que obtengamos una relación 1/10 entre la sangre y el medio de cultivo. En adultos 4-5-7 mL de sangre en frascos de 40-50-70mL respectivamente. En niños 2-2.5mL de sangre en frascos de 20-25mL respectivamente. Para neonatos existe una presentación de caldo con 9mL al cual se adiciona 1 mL de sangre. Antes de emplear un frasco para hemocultivo debe verificarse cuidadosamente si el volumen del caldo es para adulto o niños. En algunos de estos medios no se requiere la utilización de jeringa y la Capítulo 8: Procedimientos para bacterias aisladas en hemocultivos

133

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PROCEDIMIENTOS

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toma de muestra se realiza colocando directamente el frasco a través de un sistema vacum (al vacío). La pérdida de relación entre el volumen de sangre y el caldo de cultivo puede hacer que, en caso que la cantidad de sangre sea mayor, la muestra se coagule y en caso que sea menor, que el SPS y factores líticos de la misma sangre destruyan a las bacterias. 2.4.

Si la muestra es extraída con jeringa, inocularla inmediatamente en el frasco de hemocultivo, limpiando previamente la tapa de goma con alcohol iodado al 2% y luego mezclándola suavemente.

3. REQUERIMIENTOS QUE DEBE LLENAR UN MEDIO DE CULTIVO PARA SER CONSIDERADO COMO MEDIO DE HEMOCULTIVO: 3.1. Debe ser un caldo constituido por tripticasa soya o infusión de cerebro corazón de buey (BHI), contener el anticoagulante SPS del 0,025 al 0,05% (polianetol sulfonato de sodio polianiónico) y contener un 5% de CO2. Su interior debe estar al vacío para facilitar la entrada de la sangre. Su diseño, preferiblemente debe facilitar la toma de la muestra directamente a través de un dispositivo de vacum (vacío). Los frascos con caldos de BHI o tripticasa soya que se elaboran en los laboratorios y que no contienen los demás factores no deben ser considerados como medios de hemocultivo. En estos casos usualmente crecen bacilos gramnegativos pero no los microorganismos nutricionalmente exigentes como Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae. 3.2.

Para aislamiento de Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Enterobacterias, bacilos gramnegativos no fermentadores, Streptococcus spp y Staphylococcus spp, el frasco de hemocultivo debe contener: 3.2.1. Caldo BHI o TSA 3.2.2 CO2 3.2.3. Anticoagulante SPS (polianetol sulfonato de sodio polianionico) al 0.025%- 0.05%.

3.3. Para el aislamiento de Neisseria meningitidis, el frasco de hemocultivo debe contener: 3.3.1. Caldo BHI o TSA 3.3.1. CO2

Figura 1. Frascos de Hemocultivos

134

Capítulo 8: Procedimientos para bacterias aisladas en hemocultivos

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PROCEDIMIENTOS

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La sangre debe transportase en frascos de hemocultivos a temperatura ambiente procurando que no pase de 2 horas.

III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: 1.

Incubar el frasco inoculado a una temperatura de 35-37 oC por 7 días.

2.

Los subcultivos se realizan en ASC o Agar Chocolate (ACh) la sospecha de diagnóstico clínico, con la siguiente frecuencia: I) a las18-24horas II) a las 48horas y III) a los 7 días de incubación. El procedimiento es el siguiente:

2.1.

2.1 Con guantes descartables, limpiar la tapa de goma del frasco de hemocultivo con alcohol iodado al 2%, extraer aproximadamente 1 mL y depositar entre 6 a 8 gotas en el medio de cultivo (Ver Figura 2).

Figura 2: Inoculación del medio Agar Sangre de Carnero del frasco de hemocultivo.

2.1.

Dejar secar la muestra durante 10 minutos e incubar de 35 a 37 oC en atmósfera de CO 2.

2.2.

Revisar el cultivo a las 24 y 48 horas. Si no hay crecimiento descartar el plato. Si hay crecimiento realizar un Gram y reaislarlo en el medio de cultivo apropiado según la morfología del Gram.

NOTA: Observar diariamente el frasco. Cuando hay turbidez y no se ha indicado el subcultivo (según el numeral 2), primero debe obtenerse una muestra por punción del frasco, realizarle un Gram y subcultivar sólo en caso que se observaran bacterias. El medio de cultivo a utilizar en el subcultivo depende de la tinción y morfología observada en el Gram.

IV. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: 1. TOMA DE MUESTRA: 1.1. Jeringa estéril 1.2. Alcohol Iodado al 2% 1.3. Alcohol al 70% 1.4. Torniquete 1.5. Frasco para hemocultivo 1.6. Guantes estériles Capítulo 8: Procedimientos para bacterias aisladas en hemocultivos

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PROCEDIMIENTOS

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2. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: 2.1. Contenedor de plástico para transportar la muestra Nota: El contenedor debe ser resistente a álcalis, ácidos y debe ser reesterilizable por medio de autoclave. 3. PROCESAMIENTO:

3.1. Equipos: 3.1.1. 3.1.2. 3.1.3. 3.1.4. 3.1.5. 3.1.6. 3.1.7.

Incubadora a 35-37oC Incubadora con CO2 Jarra con vela de parafina blanca (si no cuenta con incubadora con CO 2). Refrigeradora a 4-8oC Mechero Bunsen Reloj de mesa Microscopio con objetivos de 40X y 100X

3.2. Materiales: 3.2.1. 3.2.2. 3.2.3. 3.2.4. 3.2.5. 3.2.6. 3.2.7. 3.2.8.

Jeringa estériles Marcadores indelebles Asas bacteriológicas rectas y redondas Reloj de mesa Guantes descartables Gradillas Láminas de vidrio Contenedores con cloro al 10% para desechar material contaminante

3.3. Reactivos: Colorantes y reactivos para la tinción de Gram.

3.4. Medios de Cultivo: 3.4.1. Agar Sangre de Carnero al 5% (ASC) 3.4.2. Agar Chocolate (ACh) PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACION DE Haemophilus influenzae: Ver capítulo 7. PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACION DE Streptococcus pneumoniae: Ver capítulo 7. PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACION DE Neisseria meningitidis: Ver capítulo 7. PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS: Ver capítulo 4. PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACION DE BACILOS GRAMNEGATIVOS NO FERMENTADORES: Ver capítulo 3 . 136


8.1. Procedimientos para la identificación de los Streptococcus grupo viridans

I. TOMA DE LA MUESTRA: Ver toma de muestra en hemocultivo.

II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: Ver Transporte de la muestra en hemocultivo.

III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: Ver procedimiento en hemocultivo.

IV. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS: Ver equipos, materiales y reactivos en hemocultivo.

V. ALCANCE: Laboratorios de la Red: numerales del 1.4.1 al 1.4.7 con respecto a pruebas de identificación. CNDR: numerales del 1.4.1 al 1.4.8 con respecto a pruebas de identificación.

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: Los estreptococos son microorganismos esféricos u ovoides, con una disposición característica en forma de cadenas. La mayoría de los estreptococos crecen en medios sólidos formando colonias discoidales generalmente de 1 a 2 mm de diámetro. Las variantes de una misma cepa de estreptococo pueden dar lugar a colonias con diferencias morfológicas. Son anaerobios facultativos. Streptococcus grupo viridans, incluyen a varias especies de estreptococos alfa hemolíticos y no hemolíticos que por su relación filogenética han sido organizados en 5 grupos: Grupo I o mitis: Son alfahemolíticos e incluye las especies mitis, sanguis, parasanguis, gordanii, crista, ovalis y pneumoniae. De este grupo, los Streptocococcus mitis, sanguis, gordanii y oralis se han aislado en pacientes con endocarditis bacteriana subaguda. La especie oralis también se ha aislado en pacientes con neutropenia. Grupo II o Anginosus: Son beta, alfa o no presentan hemólisis (gama hemólisis) e incluye a las especies anginosus, constellatus e intermedius. Las tres especies se han aislado de pacientes con infecciones en genitales y abscesos en boca. Capítulo 8: Procedimientos para bacterias aisladas en hemocultivos

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PROCEDIMIENTOS

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Grupo III o mutans: Son beta, alfa o gama hemolíticos e incluyen a las especies mutans, sobrinus, cricetus, rattus, downei y macacae. Las especies mutans y sobrinus están asociados a caries dental y las especies downei y macacae se han aislado en monos. Grupo IV o salivarius: Son alfa o no hemolíticus e incluye a las especies salivarius, vestibularis y thermophilus. La especie salivarius es parte de la microbiota de la boca y se ha aislado en infecciones del torrente sanguíneo de pacientes neutropénicos. Grupo V o bovis: Son alfa o gama hemolíticos e incluye las especies bovis, alactolyticus y equinus. La especies bovis se ha aislado en pacientes con endocarditis y cáncer del cólon. La identificación de las especies del grupo viridans debe ser realizada únicamente cuando los aislamientos provienen de infecciones serias: endocarditis, abscesos, pacientes con cáncer o con procesos neutropénicos. No son solubles en bilis y su desarrollo no es inhibido por los discos de optoquina. Son las especies que más prevalecen como parte de la microbiota normal del sistema respiratorio superior, boca y sistema urogenital. En casos de traumatismos pueden llegar a la sangre. Del 30 al 40% de las endocarditis bacterianas están asociadas a Streptococcus grupo viridans en pacientes con lesiones valvulares o prótesis cardíacas. Los Streptococcus grupo viridans también se pueden aislar en raras ocasiones de otras infecciones graves, como meningitis y neumonías, en particular en huésped comprometidos.

VII. IDENTIFICACIÓN: 1. EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIÓN:

1.1. Equipos: Ver equipos en heridas y abscesos.

1.2. Materiales y reactivos: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6. 1.2.7. 1.2.8. 1.2.9. 1.2.10. 1.2.11. 1.2.12.

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Guantes descartables Gradillas Contenedores con cloro del 5 al 10% para desechar material contaminante Marcadores indelebles Asas bacteriológicas rectas y redondas Palillos de madera Tubos para coagulasa de 45 x 75 Pinzas estériles Láminas portaobjetos Solución salina al 0.85% Colorantes y reactivos para la tinción de Gram Peroxido de hidrógeno (H2O2) al 30%


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1.2.13. 1.2.14. 1.2.15. 1.2.16. 1.2.17. 1.2.18. 1.2.19.

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PROCEDIMIENTOS

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Discos de optoquina de 6mm Desoxicolato de sodio al 10% Discos de bilis esculina de 6mm Dispositivos para prueba de PYR. Caldo nutritivo al 6.5% de NaCl Arabinosa Sorbitol

1.3. Medios de cultivo: 1.3.1. Agar Sangre de Carnero (ASC).

1.4. Pruebas para la identificación: 1.4.1. Coloración de Gram de las colonias 1.4.2. Prueba de catalasa 1.4.3. Pruebas para diferenciar Streptococcus pneumoniae de Enterococcus spp y Streptococcus grupo viridans: 1.4.3.1. Prueba de optoquina 1.4.3.2. Prueba de solubilidad en bilis 1.4.4. Pruebas para diferenciar Enterococcus spp de Streptococcus grupo viridans 1.4.4.1. Prueba de bilis esculina. 1.4.4.2. Prueba de PYR. 1.4.4.3. Prueba de crecimiento en caldo nutritivo al 6,5%.

1.5. Cepas para control de calidad: 1.5.1. 1.5.2. 1.5.3. 1.5.4.

Enterococcus faecalis ATCC 29212 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Streptococcus bovis OPS 29 Streptococcus viridans INS 003

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS: 1.6. Antimicrobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: ver capítulo 6. 1.7. Antimicrobianos a utilizar por el método de Concentración Inhibitoria Minima (CIM/MIC): 1.7.1. Penicilina.

1.8. Pruebas especiales de sensibilidad antimicrobiana: Ninguna.


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PROCEDIMIENTOS

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2. CRECIMIENTO EN AGAR SANGRE DE CARNERO (ASC):

2.1. Fundamento del medio: ver capítulo 17. 2.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 2.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria ante el medio: Algunas cepas del grupo viridans producen una alfa hemólisis, (lisis parcial de los eritrocitos de carnero). Otras cepas del mismo grupo carecen de hemolisina S (producen una gamma hemólisis) por lo tanto no producen hemólisis en el medio.

2.4. Resultado: 2.4.1. Morfología de las colonias: Las colonias del grupo de Streptococcus grupo viridans tienen diferente morfología dependiendo de las especies a que pertenecen. 2.4.2. Hemólisis: 2.4.2.1. Alfa hemólisis: Positiva. Se observa hemólisis parcial. Zona de color verde musgo alrededor de las UFCs. 2.4.2.2. Gama hemólisis: Positiva. No se observa zona de hemólisis alrededor de las UFCs.

2.5. Control de calidad: 2.5.1. Streptococcus grupo viridans INS 003 Resultado: Hemólisis alfa positiva. Se observa halo de color verde musgo alrededor de las UFCs.

3. COLORACIÓN DE GRAM DE LAS UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFCs):

3.1. Fundamento de la tinción: ver capítulo 3. 3.2. Procedimiento: ver capítulo 3. 3.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: Los Streptococcus grupo viridans son cocos grampositivos que retienen el colorante de violeta de genciana, por lo que se observan de color violeta oscuro. Dependiendo de la especie se observarán cadenas cortas o largas con cocos en sueltos o pares, esféricos y ovoides.

3.4. Resultado: Se observa cocos grampositivos esféricos u ovoides dispuestos en cadenas.

3.5. Control de calidad: 3.5.1. Streptococcus grupo viridans INS 003 Resultado: Se observan cocos grampositivos (violeta oscuro) esféricos u ovoides dispuestos en cadenas.

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PROCEDIMIENTOS

DE



4.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 4.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 4.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Los Streptococcus grupo viridans carecen de la enzima catalasa, por lo tanto no catalizan el H2O2 en oxígeno y agua.


4.5. Control de Calidad de la prueba: 4.5.1. Streptococcus grupo viridans INS 003 Resultado: Negativo. No hay producción de burbujas.

PRUEBAS PARA DIFERENCIAR: Streprtococcus pneumoniae de Enterococcus y Streptococcus grupo viridans:

spp

5. PRUEBA DE OPTOQUINA:

5.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 5.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 5.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: La sensibilidad a la optoquina (clorhidrato de etil hidrocupreína) se utiliza para diferenciar Streptococcus pneumoniae de Enterococcus spp y Streptococcus grupo viridans. Los Streptococcus del grupo viridans son resistentes a la optoquina. Cuando se colocan discos de optoquina de 6mm, el diámetro del halo de inhibición del crecimiento es menor de 14 mm.

5.4. Resultado: Negativo: El halo de inhibición con discos de 6mm es menor de 14mm.

5.5. Control de Calidad de la prueba: 5.5.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Negativo. El halo de inhibición con discos de 6mm es menor de 14mm. 5.5.2. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619. 5.5.3. Resultado: Positivo. El halo de inhibición con discos de 6mm es mayor de 14 mm


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PROCEDIMIENTOS

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6.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 6.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 6.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Los Streptococcus del grupo viridans carecen de las enzimas autolíticas (autolisinas) que son las que actúan con el reactivo para acelerar la reacción lítica natural. Por lo tanto, al agregarle el reactivo desoxicololato de sodio al 0.5% no se activa autólisis.

6.4. Resultado: Negativo: Se observa turbidez en el tubo.

6.5. Control de Calidad de la prueba: 6.5.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Negativo. Se observa turbidez en el tubo. 6.5.2. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Resultado: Positivo. El tubo se observa transparente.

PRUEBAS PARA DIFERENCIAR: Enterococcus spp de Streptococcus grupo viridans (Ver diagrama de flujo después de la prueba de PYR). 7. PRUEBA DE BILIS ESCULINA:

7.1. Fundamento de la Prueba: Se basa en la capacidad que tienen ciertas bacterias, en particular los Estreptococosdel grupo D y especies de Enterococcus spp, de tolerar grandes concentraciones de bilis (40%). Para detectar esta alta tolerancia se agrega esculina, la cual es hidrolizada si la bacteria se desarrolla. La hidrólisis de la esculina, da como resultado la formación de glucosa y un compuesto denominado esculetina. Esta a su vez reacciona con los iones férricos para formar un complejo negro.

7.2. Procedimiento: 7.2.1. Rotular un tubo para coagulasa 7.2.2. Agregar 100mL de agua destilada estéril. 7.2.3. Tomar 2 ó 3 colonias de un cultivo fresco y hacer una suspensión homogénea. 7.2.4. Con una pinza estéril colocar el disco de bilis esculina dentro del tubo que contiene la suspensión. 7.2.5. Incubar a una temperatura de 35-37 oC durante 4 horas. 7.2.6. Realizar la lectura.

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PROCEDIMIENTOS

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7.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Algunos Streptococcus del grupo viridans solo aproximadamente el 3% tienen la capacidad de hidrolizar la esculina en presencia de bilis.

7.4. Resultado: Hidrólisis de la esculina Negativa: Se observa color amarillo (color del disco)

7.5. Control de calidad: 7.5.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Positiva. Se observa ennegrecimiento del disco. 7.5.2. Streptococcus grupo viridans NS 003 Resultado: Negativa: Se observa color amarillo el disco.

8. PRUEBA DE TOLERANCIA AL CLORURO DE SODIO 6,5%: La prueba de tolerancia a la sal en concentraciones de 6.5% de NaCl diferencia las especies de los Streptococcus del grupo viridans (principalmente del grupo V bovis en el que se incluye a Streptococcus bovis ) de Enterococcus spp.

8.1. Fundamento de la prueba: Se basa en la capacidad de algunas bacterias de desarrollarse en presencia de cantidades variadas de cloruro de sodio (NaCl). Es una propiedad que ha sido utilizada para caracterizar varios géneros y especies bacterianas, incluyendo los Streptococcus del grupo viridans. En este caso se utiliza la concentración de cloruro de sodio al 6,5%.

8.2 Procedimiento: 8.2.1. Rotular el tubo que contiene caldo nutritivo con 6.5% de cloruro de sodio. 8.2.2. Tomar 2 ó 3 colonias de un cultivo puro de 24 horas de incubación. Hacer una suspensión homogénea. Si el caldo se inocula con cantidad excesiva de bacterias, él inoculo puede ser reportado como si desarrollara crecimiento, lo cual sería un resultado falso positivo. 8.2.3. Incubar a una temperatura de 35-37 oC durante 24 horas. 8.2.4. Realizar la lectura.

8.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: Los Streptococcus grupo viridans no son halo tolerantes por lo que carecen de la capacidad de desarrollarse en concentraciones de 6.5% de cloruro de sodio.

8.4. Resultado: No hay turbidez en el caldo. Capítulo 8: Procedimientos para bacterias aisladas en hemocultivos

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PROCEDIMIENTOS

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8.5. Control de calidad: 8.5.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Positivo.Turbidez en el caldo por crecimiento de la bacteria. 8.5.2. Streptococcus grupo viridans INS 003 Resultado: Negativo.No se observa turbidez en el caldo por ausencia de crecimiento de la bacteria.


9.1. Fundamento de la prueba: La prueba de PYR se utiliza como prueba rápida para la diferenciación presuntiva de los Streptococcus grupo viridans (Streptococcus bovis) de los Enterococcus spp. El sustrato utilizado es la L-pirrolidonilo-b-naftilamida (PYR por sus siglas en inglés). Este compuesto es hidrolizado por la enzima pirrolidonilopeptidasa. La hidrólisis del sustrato por esta enzima libera bnaftilamida libre, que se detecta al agregar el reactivo p-dimetil-dimetil-aminocinamaldehido. Si la hidrólisis se llevó a cabo, se forma un compuesto de color rojo cereza oscuro.

9.2. Procedimiento: 9.2.1. Con un palillo descartable tomar 2 ó 3 colonias del cultivo puro de 24 horas de incubación y realizar un frotis en la superficie del cuadrante de la lámina que ha elegido para el caso. La lámina contiene cuatro cuadrantes para trabajar. 9.2.2. Agregar una gota del reactivo p-dimetil-dimetil-aminocinamaldehido . 9.2.3. Realizar la lectura inmediatamente. Si no hay desarrollo de color realizar la segunda lectura al minuto de haber agregado el reactivo.

9.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Los Streptococcus grupo viridans carecen de la enzima pirrolidonilopeptidasa, por lo tanto no hidroliza el sustrato.

9.4. Resultado: Positivo: Se observa un color amarillo o naranja (color del reactivo).

9.5. Control de calidad: 9.5.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Positivo. Desarrollo de un color rojo cereza oscuro 9.5.2. Streptococcus grupo viridans INS 003 Resultado: Negativo. Se observa un color amarillo o naranja (color del reactivo).

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PROCEDIMIENTOS

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10.FERMENTACIÓN DE MANITOL:

10.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 10.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 10.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Ninguna de las especies de importancia clínica tienen enzimas para fermentar el manitol. La especie mutans es capaz de hacerlo pero está fuera del alcance de este manual abarcar el tema de la caries dental. Sin embargo, entre la especie bovis es utilizada para diferenciar los tipos I del II.

10.4. Resultado: Positiva: Tipo I. Fermenta el manitol. Viraje del color del medio de violeta a amarillo, por fermentación del carbohidrato. Negativa: Tipo II. No fermenta el manitol. No hay viraje de color. El caldo se observa de color violeta.

10.5. Control de calidad: 10.5.1. Streptococcus bovis OPS 29 Resultado: Positiva. Viraje del color del medio de violeta a amarillo

10.6. Informe de resultado: Negativo: No hubo crecimiento bacteriano. Positivo: Posibilidad 1: Streptococcus grupo viridans con su respectivo antibiograma. Posibilidad 2: Streptococcus bovis con su respectivo antibiograma.


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PROCEDIMIENTOS

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DE


FLUJOGRAMA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE STREPTOCOCCUS Y ENTEROCOCCUS ASC Alfa hemolíticas Gram: Cocos Gram + en cadenas Catalasa: negativa

OPTOQUINA Discos 6 mm: ≥ 14mm Discos 10 mm: ≥ 16mm

POSITIVO

RESULTADO DUDOSO

S. pneumoniae

SOLUBILIDAD EN BILIS (Desoxicolato de Na al 10%)

NEGATIVA

BILIS ESCULINA CALDO NUTRITIVO 6,5% NaCl PYR

POSITIVA

BILIS ESCULINA + PYR: – CALDO NUTRITIVO 6,5% NaCl:

POSITIVO

NEGATIVO

Streptococcus bovis

Enterococcus spp

Streptococcus grupo viridans

MANITOL

POSITIVO

NEGATIVO

Tipo I

Tipo II

–

S. pneumoniae

VIII. BIBLIOGRAFÍA: 1. Rouff KL, Whiley RA and Beighton D. Streptococcus in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray editor in chief. Chap 17, 7th edition, ASM, Washington, 1999. 2. Reyes Cerros J. y González Mairena A., Normas Técnicas para Hemocultivo en: Normas Técnicas de Bacteriología, Cap. XI. Ministerio de Salud. Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia CNDR. 3ª ed., 1996, Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional, DANIDA, Editorial Imprimatur, Managua, Nicaragua. 3. Mejía Sandino MJ. Exudado Faringeo II en Manual de Bacteriología Médica 3ª ed. 2001, Ministerio de Salud. Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia CNDR. Proyecto de Fortalecimiento de Laboratorios Post Huracán MITCH, AID/CDC/APHL/CNDR. Managua, Nicaragua. 4. Los cocos grampositivos Parte II: Estreptococos, Enterococos y Bacterias Similares a Estreptococos en Diagnóstico Microbiológico. Elmer W. Koneman editor, capítulo 12, 5ª edición, 1996. Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 5. Estreptococos spp en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks editor, Cap. 14, 16ª ed. (21ª edición en inglés) 1998, Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V. México D.F. 146


CAPÍTULO 9.

Procedimientos para bacterias aisladas en exudado ótico I. TOMA DE LA MUESTRA: Para tomar una muestra de exudado ótico se recomienda no haber recibido tratamiento local ni sistémico con antimicrobianos 3 días antes de la toma de la muestra.

1. OTITIS EXTERNA: Hacer una ligera tracción hacia arriba y atrás del pabellón de la oreja e introducir un hisopo de algodón estéril rotándolo suavemente. Tome dos muestras. Una muestra servirá para realizar un frotis y posterior tinción de Gram y la otra para el cultivo. En caso no de sembrar la muestra inmediatamente introduzca el hisopo en un medio de transporte de Stuart y transpórtela a temperatura ambiente. Tome una nueva muestra con otro hisopo y realice un frotis en una lámina portaobjetos.

2. OTITIS MEDIA: El oído medio es estéril. Cuando ocurre una infección a este nivel, la muestra debe ser tomada por el médico, pues requiere de la punción del tímpano (miringostomía). Cualquier germen aislado de esta muestra debe ser completamente identificado y reportado. El tipo de microorganismo varía con la edad, pero usualmente se encuentran los siguientes.

3.1. Streptococcus pneumoniae: Causa el 50% de todas las infecciones a cualquier edad.

3.2. Haemophilus influenzae: Es el microorganismo más frecuentemente aislado en niños: 30% de todas las causas.

3.3. Streptococcus pyogenes: 10-15% de todas las causas.

3.4. Enterobacterias

y Staphylococcus:

Principales causas en recién nacidos.

Capítulo 9: Procedimientos para bacterias aisladas en exudado ótico

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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE



En caso de otitis externa, el hisopo debe introducirse en el medio de transporte de Stuart, teniendo cuidado que todo el hisopo quede en contacto con el agar.

2.

En caso de muestras de oído medio, la siguiente información debe ser anotada en la jeringa: código de la muestra, fecha y hora en que fue tomada.

3.

Todas las muestras deben acompañarse con una hoja que contenga como mínimo la siguiente información: 3.1.

Institución

3.2.

Sala

3.3.

Número de expediente

3.4.

Nombre del paciente

3.5.

Edad

3.6.

Sexo

3.7.

Resúmen de historia clínica. Si existe un Comité de Infecciones Intrahospitalarias (CIIH) que requiera información adicional sobre los casos de infección, debe elaborarse una hoja con los datos que el CIIH determine.

4.

Transportar la muestra contenida en el medio de transporte a temperatura ambiente.

5.

Si la muestra obtenida está contenida en una jeringa, debe transportarse a temperatura ambiente.

III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: 1. OTITIS EXTERNA: 1.1. Con uno de los dos hisopos con los cuales tomó la muestra, realice un frotis de 1.5 x 2 cm en una lámina portaobjetos nueva, con un grosor tal que sea posible leer a través de él. Coloree el frotis con tinción de Gram. 1.2.

Con el otro hisopo, ya sea que provenga de un medio de transporte o sea directamente del paciente, siembre la muestra en los medios de Agar Sangre de Carnero y Agar Mac Conkey.

2. OTITIS MEDIA: 2.1. Del contenido de la jeringa, ponga una pequeña cantidad (menos de una gota) en el centro de una lámina portaobjetos y realice un frotis como se indica en el numeral 1 de otitis externa. 2.2.

148

Con el contenido de la jeringa realice un inóculo cerca de la orilla de los platos de Agar Sangre de Carnero y Agar Mac Conkey. Estríe en la forma convencional.


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


IV. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: 1. TOMA DE LA MUESTRA:

1.1. Otitis media: 1.1.1. Jeringa estéril descartable de 3mL

1.2. Otitis externa: 1.2.1 Hisopos estériles

2. TRANSPORTE: 2.1. Medio de transporte de Stuart 3. PROCESAMIENTO:

3.1. Equipos: 3.1.1. 3.1.2. 3.1.3. 3.1.4.

Incubadora de CO 2 (o jarra con vela en caso de carecer de incubadora de CO 2 ) Microscopio con objetivo de 100x y ocular de 10x Mechero tipo Bunsen Reloj de mesa

3.2. Materiales y Reactivos: 3.2.1. 3.2.2. 3.2.3. 3.2.4. 3.2.5. 3.2.6.

Guantes descartables no estériles Asas bacteriológicas con punta redonda y recta Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de materiales descartables Láminas portaobjetos Solución salina estéril al 0.85% Colorantes para tinción de Gram: Cristal violeta, lugol, alcohol 70 o o alcohol-acetona (1:1), fucsina acuosa o safranina.

3.3. Medios de cultivo: 3.3.1. Agar Sangre 3.3.2. Agar Mac Conkey 3.3.3. Agar Chocolate (*) 3.3.4. Agar Sabouraud con Cloranfenicol (**) (*) Sólo en caso de cultivo de oído medio. (**) Sólo si observa levaduras sin seudohifas en el frotis.

V. IDENTIFICACIÓN: NOTA: Los equipos, materiales, pruebas bioquímicas y reactivos a utilizar para la identificación bacteriana están descritos en el capítulo correspondiente a cada bacteria. Capítulo 9: Procedimientos para bacterias aisladas en exudado ótico

149

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DE

PROCEDIMIENTOS

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Haemophilus influenzae: ver capítulo 7. Streptococcus pyogenes: Staphylococcus spp: Enterobacterias:

ver capítulo 10.

ver capítulo 6.

ver capítulo 4.

Bacilos No Fermentadores:

ver capítulo 6.

Candida spp: ver capítulo 14 sección de Exudado Vaginal.

1. INFORME FINAL DE LOS RESULTADOS: Positivo: Nombre del microorganismo. Negativo: Microbiota Normal.

VI. BIBLIOGRAFÍA: 1. Reyes Cerros J. Normas Técnicas para Exudado Ótico en Normas Técnicas de Bacteriología, capítulo VIII. Sergio R. López, Justo Reyes Cerros, Alcides González Mairena, Rosibel Centeno, 3ª edición, 1996, Ministerio de Salud, Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia CNDR, Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional, DANIDA, Editorial Imprimatur, Managua, Nicaragua.

150


CAPÍTULO 10.

Procedimientos para bacterias aisladas en exudado faríngeo I. TOMA DE LA MUESTRA: 1. RECOMENDACIONES A LOS PACIENTES: No haber recibido tratamiento antimicrobiano sistémico 3 días antes de la toma de muestra.

2. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE EXUDADO FARÍNGEO: 2.1. Incline ligeramente la cabeza del paciente hacia atrás e ilumine bien la garganta. 2.2. Presione la lengua hacia abajo con depresor de madera de modo que pueda observarse la parte posterior de la garganta. 2.3. Luego frote el hisopo de algodón estéril de arriba abajo contra ambas amígdalas, contra la parte posterior de la faringe y contra cualquier mancha blanca que se encuentre alrededor de las amígdalas. 2.4. Introduzca el hisopo en el medio de transporte de Stuart.

II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: El medio de transporte conteniendo la muestra debe ser trasladado al laboratorio a temperatura ambiente (sin refrigerantes).

III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: Se recomienda la Sangre de Carnero como sangre de elección para detectar Streptococcus ß-hemolíticos. No debe utilizarse sangre humana porque ésta puede contener anticuerpos específicos antiestreptococo, antimicrobianos. Por otro lado, contiene un factor antiestreptolisina S que puede inhibir la hemólisis. Este factor no tiene relación con el contacto previo a Streptococcus. Las bolsas colectoras de sangre humana contienen citrato como anticoagulante, el cual inhibe el crecimiento bacteriano. 1.

Rotular el plato de Agar Sangre de Carnero (ASC).

2.

Tomar el hisopo que contiene la muestra e inocular cerca de una sexta parte del plato de forma redonda. Se hace girar el hisopo sobre la superficie del agar de modo que toda la superficie del hisopo entre en contacto con el agar.

3.

Deje secar el inóculo durante 5 minutos. Capítulo 10: Procedimientos para bacterias aisladas en exudado faríngeo

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4. 5.

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PROCEDIMIENTOS

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Estríe los medios de la forma convencional. Ver capítulo 17. Utilizando un asa redonda realizar de 3 a 4 estrías a profundidad para observar la beta hemólisis con mayor facilidad, para ello se introduce el asa hasta el fondo del plato en forma perpendicular a la superficie. Incubar de 35-37 oC durante 18 a 24 horas en ambiente 5% de CO 2 utilizando el método de la jarra con una vela de parafina blanca o incubadora con CO 2.

6.

IV. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: 1. TOMA DE MUESTRA:

1.1. Hisopos estériles. 1.2. Depresor de madera. 1.3. Lámpara de baterías o de cuello de ganso. 2. TRANSPORTE DE LA MUESTRA:

2.1. Tubos conteniendo medio de transporte de Stuart 3. PROCESAMIENTO:

3.1. Equipos: 3.1.1. 3.1.2. 3.1.3. 3.1.4. 3.1.5. 3.1.6. 3.1.7. 3.1.8.

Incubadora a 35-37oC Incubadora con CO2 Jarra con vela de parafina blanca (si no cuenta con incubadora CO 2). Refrigeradora a 6-8oC Mechero tipo Bunsen Reloj de mesa Microscopio con objetivo de 40X y 100X Rotador

3.2. Materiales: 3.2.1. 3.2.2. 3.2.3. 3.2.4. 3.2.5. 3.2.6. 3.2.7. 3.2.8.

Palillos de madera Marcadores indelebles Asas bacteriológicas rectas y redondas Guantes descartables y mascarillas Gradillas Láminas de vidrio Pinzas Contenedores con cloro al 5% para desechar material contaminante.

3.3. Reactivos: Ninguno. 3.4. Medios de Cultivo:

3.4.1. Agar Sangre de Carnero al 5% (ASC). 152

Capítulo 10: Procedimientos para bacterias aisladas en exudado faríngeo

10.1. Procedimiento para la identificación de Streptococcus pyogenes (Grupo A) y otros ß-Hemolíticos I. TOMA DE LA MUESTRA: Ver toma de muestra.

II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: Ver Transporte en exudado.

III. PROCESAMIENTO

DE LA MUESTRA:

Ver Procesamiento.

IV. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS: Ver en exudado faríngeo.

V. ALCANCE: Laboratorios de la Red: numerales del 1.3.1 al 1.3.4 con respecto a pruebas de identificación. CNDR: numerales del 1.3.1 al 1.3.5 con respecto a pruebas de identificación.

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: Los Streptococcus pertenecen a la familia Streptococcaceae. Estos microorganismos son cocos grampositivos, catalasa negativa, que tienden a desarrollarse en pares y cadenas. Los Streptococcus son anaerobios facultativos. Los Streptococcus de importancia médica son homo fermentadores, lo que significa que el único producto de fermentación de la glucosa es el ácido láctico, son oxidasa negativa. Producen gran variedad de substancias y enzimas extracelulares. Su capacidad para efectuar diferentes grados de hemólisis constituye una base importante para su clasificación. La clasificación de los Streptococcus se fundamenta en la presencia de características fisiológicas e inmunológicas en base a un esquema desarrollado por Rebecca Lancefield. En este esquema, los Streptococcus han sido diferenciados en dos grandes grupos y 20 especies (A-H y K-V). La base de la clasificación la constituyen los polisacáridos de la pared celular en la que un carbohidrato específico designa a un grupo. La excepción la constituye el grupo D, cuyo antígeno está conformado por un ácido glicerolteicóico. Estos carbohidratos mas el ácido glicerolteicóico tienen propiedades antigénicas capaces de estimular la formación de anticuerpos que tienen utilidad diagnóstica. Capítulo 10: Procedimientos para bacterias aisladas en exudado faríngeo

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PROCEDIMIENTOS

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Los antígenos pueden ser extraídos por métodos químicos (ácido clorhídrico o nítrico, formaldehído) o por métodos físicos (calor y presión altas), los cuales son puestos en evidencia por medio de anticuerpos precipitantes o aglutinantes. Los sistemas de diagnóstico comercial se basan principalmente en la utilización de anticuerpos aglutinantes ligados a partículas de látex. Entre las enzimas más importantes que elaboran los Streptococcus ß-hemolíticos están: Desoxirribonucleasa (DNasa). La producen los grupos A, B, C y G. El grupo A produce más de 4 tipos de esta enzima (también conocidas con las siglas A, B, C y D, de las cuales la B es la más común). Durante infecciones de piel y faringe se desarrollan anticuerpos antiDNasa B. La glomerulonefritis que se desarrolla después de impétigo por Streptococcus pyogenes se acompaña de elevación de estos anticuerpos. Exotoxinas. El grupo A producen al menos 3 exotoxinas con actividad eritrogénica (también conocidas por las siglas A, B, C). La A está conformada por un complejo de proteína con ácido hialurónico. Antes del advenimiento de los antimicrobianos era común observar la fiebre escarlata, cuyo rash se debía a estas toxinas. También están asociadas a la virulencia y participan en la génesis de la fiebre, daño al tejido cardíaco, bloqueo temprano de la respuesta inmune secundaria y realzan la susceptibilidad al choque por endotoxina. Hemolisinas. La estreptolisina O induce la respuesta de anticuerpos conocidos como antiestreptolisinas O (ASO), los cuales se utilizan, entre otros, para determinar procesos recientes o antiguos de infección a Streptococcus pyogenes. La estreptolosina S produce la hemólisis en los medios de cultivo que brinda las bases para la clasificación de los Streptococcus como alfa o beta hemolíticos. La hemólisis que se observa realzada en las estrías profundas es producida tanto por las estreptolisinas O (que actúan en ausencia de oxígeno) como de las estreptolisinas S (que actúan mejor en presencia de oxígeno). Hialuronidasa. Producida por los Streptococcus ß-hemolíticos.Su virulencia está estrechamente asociada a esta enzima, la cual ayuda a la rápida expansión de los Streptococcus en los tejidos con presencia de ácido hialurónico. Después de infecciones de piel, faringe y desarrollo de fiebre reumática se detectan anticuerpos antihialuronidasa. Estreptoquinasa. Producida por los grupos A, C y G. Existen varios tipos de la cual la 5K-A es la más común. Estas enzimas han sido utilizadas con fines terapéuticos por sus acciones fibrionolíticas sobre adhesiones pleurales y oclusiones arteriales. La relación entre los grupos de Streptococcus y diferentes patologías es una información vital para determinar qué especie o qué grupo puede esperarse que se desarrolle en un cultivo según el tejido, órgano o sistema de donde proviene la muestra. Esta relación es la siguiente: Streptococcus beta hemolítico del grupo A (Streptococcus pyogenes). Está asociada a faringoamigdalitis. El propósito de realizar el cultivo de exudado faríngeo es la búsqueda de esta bacteria en vista que dependiendo de cada país, entre un 7-10% está asociada a fiebre reumática y glomerulonefritis. Este grupo también está asociado a abscesos amigdalinos, angina de Ludwing y en los portadores de toxinas eritrogénicas, a escarlatina. Streptococcus beta hemolítico grupos B (Streptococcus agalactiae) Contiene antígeno del grupo B (compuesto por un polímero de ramnosa-glucosamina). 154


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DE

PROCEDIMIENTOS

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Los Streptococcus ß-hemolíticos del grupo B son parte de la microbiota normal de la faringe y vagina. Muy raramente están asociados a faringitis de importancia clínica, por lo que no debe reportarse a menos que existan brotes epidémicos. Cuando se aisla de la vagina en mujeres embarazadas y en el último trimestre, debe reportarse. En recién nacidos prematuros, en niños a término con historia de sufrimiento fetal y en inmunocomprometidos, suelen desarrollarse infecciones pulmonares, cardíacas, sepsis y meningitis por Streptococcus beta hemolítico grupos B adquiridos en la vagina durante el parto. Streptococcus ß-hemolítico grupos C y D: Streptococcus grupo C (Streptococcus equisimilis, Streptococcus zooepidemicus y Streptococcus equi ) y Streptococcus grupo G (Streptococcus bovis y Streptococcus equinus). Los grupo C y G son comensales de la nasofaringe, pero ambos pueden producir faringitis epidémicas. Ambos grupos elevan las ASLO. No deben reportarse de rutina sino cuando se asocian a brotes epidémicos. Streptococcus grupo F (Streptococcus milleri) : Puede ser causa de: infecciones supurativas graves, como celulitis, absceso de tejido profundo, bacteremia, osteomielitis y endocarditis.


1.1. Equipo: Ver equipos en exudado faríngeo. 1.2. Materiales y reactivos: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6. 1.2.7. 1.2.8. 1.2.9. 1.2.10. 1.2.11. 1.2.12. 1.2.13. 1.2.14. 1.2.15. 1.2.16.

Guantes descartables Gradillas Contenedores con cloro para desechar material contaminante Marcadores indelebles Asas bacteriológicas rectas y redondas Palillos de madera Tubos para coagulasa Pinza estéril. Solución salina al 0.85% Colorantes para tinción de gram Peroxido de Hidrógeno (H2O2)al 30%. Paquete comercial conteniendo frascos con anticuerpos para la detección de antígenos de grupo, según la clasificación de Lancefield. Discos de bacitracina de 0.04U Pipeta semiautomática 200-1000 µL Puntas estériles para las pipeta de 200-1000 µL Viales estériles de 1mL Capítulo 10: Procedimientos para bacterias aisladas en exudado faríngeo

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PROCEDIMIENTOS

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1.3. Prueba para identificación: 1.3.1. 1.3.2. 1.3.3. 1.3.4. 1.3.5.

Coloración de gram de las colonias Prueba de catalasa Prueba de Sensibilidad a bacitracina Prueba de CAMP Prueba confirmativa: Serología


Staphylococcus aureus ATCC 25923 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Streptococcus agalactia ATCC 1073 Streptococcus pyogenes ATCC 19615

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS: 1.5. Antimicrobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: Ver capítulo 16. 1.6. Antimicrobianos a utilizar por el método de Concentración Mínima Inhibitoria: Ninguno.

1.7. Pruebas especiales de sensibilidad antimicrobiana: Ninguna. NOTA: La sensibilidad antimicrobiana para Streptococcus del grupo A se hace por razones de vigilancia epidemiológica. Hasta el momento no se han reportado cepas resistentes a la penicilina en ninguna parte del mundo y este hecho debe ser conocido por el médico tratante. El reporte de otros antimicrobianos se justifica en caso de alergia a la penicilina.

2. CRECIMIENTO EN AGAR SANGRE DE CARNERO (ASC):

2.1. Fundamento del medio: ver capítulo 17. 2.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 2.3. Fundamento fisiológico de la bacteria ante el medio de cultivo: Los Streptococcus ß-hemolíticos producen estreptolosina S, la cual es responsable de la intensa reacción hemolítica que se observa principalmente en los grupos A y B. La hemólisis que se observa realzada en las estrías profundas es producida tanto por las estreptolisinas O (que actúan en ausencia de oxígeno) como de las estreptolisinas S (que actúan mejor en presencia de oxígeno). Suelen observarse UFCs de 1mm o menos, mates y grisáceas. Las del grupo A tienen las características de ser quebradizas, lo que dificulta tomarlas con un asa recta.

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PROCEDIMIENTOS

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2.4. Resultado: El grupo A suele tener > 0,5mm de diámetro, redondas, bordes bien definidos y aspecto opaco. Al manipularla la colonia es quebradiza. La beta hemólisis se observa como un halo transparente alrededor de la colonia. En el área donde se realiza la estría por punción, la hemólisis se observa más intensa en la profundidad del agar. La morfología e intensidad de hemólisis varía con los grupos C y G. Con el grupo C las UFCs suelen ser más pequeñas y la zona de beta hemólisis es de menor intensidad.

2.5. Control de calidad de la hemólisis: 2.5.1. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Hemólisis positiva. Se observa un halo transparente alrededor de las UFCs. 2.5.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Hemólisis Negativa. No hay halo transparente alrededor de la colonia.

3. COLORACIÓN DE GRAM DE LAS UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFCS):

3.1. Fundamento de la tinción: ver capítulo 3. 3.2. Procedimiento: ver capítulo 3. 3.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: Los Streptococcus se agrupan predominantemente en cadenas cortas y largas. Suelen observarse cocos sueltos o en pares, esféricos.

3.4. Resultado: Se observa cocos grampositivos agrupados predominantemente en cadenas.

3.5. Control de calidad: 3.5.1. Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Resultado: Se observa cocos grampositivos dispuestos en cadenas.


4.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 3. 4.2. Procedimiento: ver capítulo 3. 4.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Los Estreptococcus ß-hemolíticos de los grupos A, B, C, D, F y G carecen de la enzima catalasa, por lo tanto no catalizan el H2O2 en oxígeno y agua.



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PROCEDIMIENTOS

DE


4.5. Control de Calidad de la prueba: 4.5.1. Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Resultado:Negativo: No hay producción de burbujas. 4.5.2. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Positivo. Se producen abundantes burbujas y de forma inmediata.

PRUEBA PRESUNTIVA PARA Streptococcus

ß-hemolíticos del grupo A :

5. PRUEBA DE BACITRACINA:

5.1. Fundamento de la prueba: Los Streptococcus beta-hemolíticos del grupo A son susceptibles a bajas concentraciones del antibiótico polipeptídico bacitracina. Proporciona un método sencillo y económico para la identificación presuntiva de este grupo de estreptococo.

5.2. Procedimiento: 5.2.1. Con una asa recta tomar de 1 UFC del plato de ASC. 5.2.2. Descargar el inóculo en el centro de un plato de ASC. 5.2.3. Con una asa redonda estriar el inóculo sobre un área circular que abarque 2/3 del plato. Estriar en tres direcciones. 5.2.4. Con una pinza previamente flameada, colocar un disco de bacitracina de 0,04 unidades (Taxo A 0,04 U). Asegurar que el disco esté adherido a la superficie del agar presionando suavemente sobre el mismo. 5.2.5. Incubar de 35-37 oC durante 18-24 horas.

5.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Los Streptococcus ß-hemolíticos del grupo A son susceptibles a bajas concentraciones de bacitracina.

5.4. Resultado: Cualquier halo de inhibición, sin importar su diámetro, indica sensibilidad a la bacitracina.

5.5. Control de calidad: 5.5.1. Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Resultado: Sensible (S): Se observa un halo de inhibición. 5.5.2. Streptococcus agalactiae ATCC 1073 Resultado: Resistente (R): No hay halo de inhibición. Se observa crecimiento hasta los bordes del disco.

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PROCEDIMIENTOS

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Figura 1. Prueba de Bacitracina.

Limitaciones de la prueba: Esta prueba solo debe realizarse a Streptococcus β-hemolíticos, ya que muchos Streptococcus alfa hemolíticos (incluyendo neumococos) son susceptibles a bajas concentraciones de bacitracina. NOTA: Cuando la prueba de bacitracina es sensible se informa: Streptococcus β-hemolítico presuntivamente del grupo A. Requiere confirmación. Si el informe se escribe haciendo uso del programa WHONET, escribir una nota (en observaciones) que indique: Diagnóstico presuntivo.

PRUEBA PRESUNTIVA PARA Estreptococcus β-hemolíticos del grupo B: 1. PRUEBA DE CAMP:

6.1. Fundamento de la prueba: La actividad hemolítica de la β-hemolisina producida por la mayoría de las cepas de Staphylococcus aureus es intensificada por una proteína extracelular producida por los Streptococcus del grupo B. La interacción entre la β-hemólisis del Staphylococcus aureus y el Streptococcus agalactiae (grupo B) es sinérgica y el resultado se manifiesta como una zona de hemólisis en forma de punta de flecha (ver figura.2) . La prueba de CAMP no es confirmativa debido a que con otras bacterias se ha observado el mismo fenómeno (por ejemplo: Listeria monocytogenes, Listeria seeligeri, Corynebacterium afermentans, Corynebacterium auris, Corynebacterium coyleae, Corynebacterium falsenii, Corynebacterium imitans, Corynebacterium striatum, Turicella otitidis, Arcanobacterium haemolyticum son CAMP positivas).

6.2. Procedimiento: 6.2.1. Con una cepa fresca de Staphylococcus aureus ATCC 25923 haga una estría recta en un plato de ASC, de manera que abarque de un lado al opuesto, pasando por el centro (imaginando un reloj, sería como trazar una línea entre las 12 y las 6 pasando por el centro). Capítulo 10: Procedimientos para bacterias aisladas en exudado faríngeo

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PROCEDIMIENTOS

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6.2.2. Con la cepa sospechosa de ser Streptococcus grupo B realizar una estría en línea recta de tal manera que forme un ángulo recto con respecto a la estría del Staphylococcus aureus. (en el reloj, sería como trazar una línea de las 9 al centro). 6.2.3. Repetir el mismo procedimiento del lado opuesto, utilizando 2 cepas. Un control positivo con un Streptococcus β-hemolítico del grupo B (Streptococcus agalactiae) previamente identificado y que debe ser mantenido como una cepa control. La otra cepa debe ser un control negativo, realizada con un Streptococcus β-hemolítico del grupo A (Streptococcus pyogenes). 6.2.4. Incubar a 35-37 oC durante 18-24 horas. 6.2.5. Lectura: el control con Streptococcus agalactiae da una imagen similar a una flecha. La punta de la flecha es una zona de hemólisis intensa. El control negativo no da la imagen de flecha, solamente se observa hemólisis alrededor de la estría del inóculo realizado. Si la cepa en estudio da una imagen similar al control positivo (Streptococcus agalactiae) se considera CAMP positiva y por lo tanto, presuntivamente como Streptococcus â- hemolítico del grupo B.

6.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: Las hemolisinas S de los Streptococcus del grupo B actúan sinérgicamente con las hemolisinas del Staphylococcus aureus, lo cual da como resultado una intensificación de la zona de hemólisis. La forma en punta de flecha se logra por la disposición espacial de ambas estrías.

6.4. Resultado: Positivo: Se observa beta hemólisis en forma de punta de flecha

6.5. Control de calidad: 6.5.1. Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Resultado: Negativo: No se observa beta hemólisis en forma de punta de flecha. 6.5.2. Streptococcus agalactiae ATCC 1073 Resultado: Positivo: Se observa beta hemólisis en forma de punta de flecha.

Figura 2. Prueba de CAMP Test

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PROCEDIMIENTOS

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Limitaciones de la prueba: Esta prueba no debe de incubarse en atmósfera con CO 2 ya que algunos Streptococcus del grupo A pueden resultar positivos. NOTA: Cuando la prueba de CAMP es positiva se informa : Streptococcus β-hemolítico presuntivamente del grupo B. Requiere confirmación. Si el informe se escribe haciendo uso del programa WHONET, escribir una nota (en observaciones) que indique: Diagnóstico presuntivo.

1. PRUEBA DE CONFIRMACIÓN POR MEDIO DE LA DETECCIÓN DEL ANTÍGENO DE LA PARED CELULAR:

7.1. Fundamento de la Prueba: ver capítulo 17. 7.2. Fundamento inmunológico de la bacteria: La clasificación de los Streptococcus se fundamenta en la presencia de características fisiológicas e inmunológicas en base a un esquema desarrollado por Rebecca Lancefield. En este esquema, los Streptococcus han sido diferenciados en dos grandes grupos y 20 especies (A-H y K-V). La base de la clasificación la constituyen los polisacáridos de la pared celular en la que un carbohidrato específico designa a un grupo. La excepción la constituye el grupo D, cuyo antígeno está conformado por un ácido glicerolteicóico. Estos carbohidratos más el ácido glicerolteicóico tienen propiedades antigénicas capaces de estimular la formación de anticuerpos que tienen utilidad diagnóstica.

7.3. Procedimiento: 7.3.1. Procedimiento de la extracción del antígeno por medio de calor y presión utilizando el autoclave. 7.3.1.1. Sembrar el cultivo puro del estreptococo en estudio en 10 ml de BHI (Infusión Cerebro Corazón). 7.3.1.2. Incubar a 35-37 oC durante 18-24 horas. 7.3.1.3. Verificar la pureza del cultivo con frotis y coloración de Gram. 7.3.1.4. Centrifugar el cultivo del caldo a 3,500 rpm durante 10 minutos. Decantar el sobrenadante en un contenedor con cloro al 10%. 7.3.1.5. Agregar 0,5mL de solución salina (0,85%) al sedimento. 7.3.1.6. Agitar vigorosamente y llevar al autoclave a 1,08 kg/cm 2 BAR de presión (15 lb/pg2 PSI), 121 oC durante 10 minutos. 7.3.1.7. Centrifugar a 3,500 rpm durante 10 minutos. 7.3.1.8. Extraer el sobrenadante con una pipeta semiautomática de 200-1000 µL y ponerlo en un vial estéril de 1mL. NOTA: Los kits comerciales traen enzimas de extracción del antígeno, el procedimiento de la extracción depende de la casa comercial. En el prospecto describe la forma de realizar el procedimiento. En caso que este reactivo se termine se realiza el método de autoclave antes descrito. Capítulo 10: Procedimientos para bacterias aisladas en exudado faríngeo

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7.3.2.

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PROCEDIMIENTOS

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Aglutinación con látex: La prueba de aglutinación con látex se basa en el empleo de anticuerpos altamente específicos contra el conjunto de antígenos de grupo según la clasificación de Lancefield. Estos anticuerpos están adsorbidos a partículas de poliestireno (látex) con el propósito que la reacción sea claramente visible.

7.3.2.1. Dejar los reactivos a temperatura ambiente. 7.3.2.2. Mezclar vigorosamente para conseguir una suspensión homogénea. 7.3.2.3. Depositar 1 gota del antígeno que sirve como control positivo en el área indicada en la tarjeta disponible para realizar la reacción. Repetir el procedimiento con el control negativo. 7.3.2.4. Añadir 1 gota del látex con el anticuerpo a cada uno de los controles. 7.3.2.5. Mezclar empleando el palillo que usualmente traen los paquetes comerciales. Descartar el palillo en el contenedor con cloro al 5%. 7.3.2.6. Rotar la muestra manualmente o con un rotador de 300rpm, durante 1 minuto. 7.3.2.7. Leer los resultados. Se debe observar una franca y rápida aglutinación en el círculo del control positivo y una suspensión lechosa homogénea en el círculo del control negativo. 7.3.2.8. Poner una gota del antígeno de la muestra en estudio en uno de los círculos disponibles en la tarjeta. Agregar una gota del anticuerpo antigrupo, según los resultados obtenidos con la prueba positiva: Si la prueba de bacitracina fue positiva utilice el antisuero del grupo A, si la prueba de CAMP fue positiva emplee el antisuero del grupo B. Si ninguna de las dos pruebas fuera positiva continúe con los antisueros de los grupos C y G o según el origen de la muestra y la frecuencia de los grupos aislados en su laboratorio. Si bioquímicamente se trata de un Streptococcus bovis emplee el antisuero del grupo D. En todos los casos proceda como se indica en los numerales del 7.3.2.5 al 7.3.2.7. Una lectura positiva evidencia aglutinación similar al control positivo o en caso contrario, la reacción es similar al control negativo. Nota: cuando la reacción de aglutinación es débil y de lenta aparición debe continuarse con los antisueros de los otros grupos hasta identificar la reacción más intensa y rápida. Descartar la tarjeta en el contenedor con cloro al 5%.

7.4. Resultados: Positiva: Hay aglutinación homogénea, clara y rápida con el antisuero específico de grupo. Se informa según el grupo identificado, por ejemplo: Streptococcus pyogenes (si el suero con el que aglutinó fue el del grupo A) o Streptococcus β-hemolítico del Grupo A. Negativa: No hay aglutinación o es muy débil y de aparición lenta. Se informa como microbiota normal. Sensibilidad a los antimicrobianos: No debe reportarse la sensibilidad al Streptococcus pyogenes (grupo A). La sensibilidad se realiza con fines de vigilancia epidemiológica. Hasta el año 2002 no se han reportado Streptococcus pyogenes resistentes a la penicilina. Sin embargo los resultados deben informarse al médico a solicitud de éste cuando la razón esté justificada como en el caso de pacientes alérgicos a la penicilina que requieren otros antimicrobianos como segunda elección. 162


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PROCEDIMIENTOS

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VIII. BIBLIOGRAFÍA: 1. Ayoub EM, Ferreri P. Group A Streptococal Diseases in Infectious Diseases, chap. 30. Paul D. Hoeprich editor, 5 th ed, JB Lippincott Co. Philadelphia, 1994. 2. Rouff KL, Whiley RA and Beighton D. Streptococcus in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray editor in Chief. Chap 17, 7th edition 1999, ASM, Washington. 3. López Cruz SR, Centeno R y Reyes Cerros J.: Normas Técnicas para Exudados Faríngeos en: Normas Técnicas de Bacteriología, Cap. XII. Ministerio de Salud. Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia CNDR. 3ª ed., 1996, Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional, DANIDA, Editorial Imprimatur, Managua, Nicaragua. 4. Mejía Sandino MJ. Exudado Faríngeo II en Manual de Bacteriología Médica 3ª ed., 2001, Ministerio de Salud. Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia CNDR. Proyecto de Fortalecimiento de Laboratorios Post Huracán MITCH, AID/CDC/APHL/CNDR. Managua, Nicaragua. 5. Los cocos Grampositivos Parte II en Diagnóstico Microbiológico. Elmer W. Koneman editor, Cap. 12, 5ª ed., 1996. Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 6. Streptococcus spp en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelgerg. Geo F. Brooks, editor, Cap. 15, 16ª ed. (de la 21ª edición en inglés) 1998, Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V. México D.F. 7. Facklam RR. Streptococcus en Manual de Procedimiento para el Aislamiento e Identificación de Streptococcus, Cap. II, Reimpreso de Prevención y Control de la Fiebre Reumática en la Comunidad. Organización Panamericana de la Salud OPS, Publicación Científica No. 399, 1980.


163

CAPÍTULO 11.

Procedimientos para la identificación de Bordetella pertussis I. TOMA DE LA MUESTRA: La muestra para aislar Bordetella pertussis es el exudado paranasal y se recomienda no administrar tratamiento sistémico 3 días antes a la toma de muestra. Bordetella pertussis se adhiere a las células cilíndricas del tejido nasal, por lo que preferentemente crece y reside en la nasofaringe. Por otro lado, la microbiota de la faringe es mayor y variada que la de las narinas, por lo que las muestras tomadas en ese sitio dificultan mas su aislamiento. Bordetella pertussis es sensible a los ácidos grasos contenidos en hisopos de algodón, de tal manera que deben emplearse los de alginato de calcio o dacrón. Los hisopos deben estar envueltos en un palillo flexible ( no utilizar aplicadores de madera, ante el peligro que se rompan con los movimientos defensivos del paciente). 1.

Inclinar la cabeza del paciente hacia atrás.

2.

Introducir un hisopo aproximadamente 2-3 cms en la narina correspondiente.

3.

Presionar y rotar en la parte anterior de la nasofaringe durante un período no mayor de 30 segundos. Utilizar un segundo hisopo para la otra narina.

4.

Introducir los hisopos en el medio de transporte de Charcoal.

II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: Cuando el tiempo de transporte es entre dos a 24 horas, las muestras deben ser transportadas en el medio de Charcoal a temperatura ambiente. Las muestras no deben refrigerarse.

III. PROCESAMIENTO DEL EXUDADO PARANASAL: 1.

Con un marcador indeleble trazar una línea a la parte posterior del plato de agar Charcoal Sangre de Caballo (CSC) de tal forma que lo divida en dos partes iguales. Sembrar la muestra de cada hisopo en el extremo de cada sección dividida y luego estriarla en la forma habitual.

2.

Incubarla a 35-37oC por 7 días en cámara húmeda ( colocar un recipiente grande lleno de agua dentro de la incubadora, de lo contrario puede presentar problemas en el crecimiento o introduzca los platos en una jarra con un recipiente pequeño conteniendo agua). El crecimiento se puede observar después de las primeras cuarenta y ocho horas de incubación pero puede tardar 7 dias.

Capítulo 11: Procedimientos para la identificación de Bordetella pertussis

165

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


IV. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS: 1. TOMA DE LA MUESTRA: 1.1. Hisopos de alginato de calcio. 2. TRANSPORTE: 2.1. Un contenedor irrompible para el traslado de las muestras. 3. PROCESAMIENTO: No hay procesamiento previo a la siembra.

V. ALCANCE: Laboratorios de la Red: el aislamiento de Bordetella pertussis es un procedimiento del Centro de Referencia. CNDR: Numerales del 1.4.1 al 1.4.8 con respecto a la identificación.

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: El género Bordetella abarca seis especies: B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica, B. avium, B. hinzii y B holmesii, (anteriormente grupo CDC NO-2). Son cocobacilos gramnegativos pequeños en los aislamientos primarios. En los subcultivos las bacterias por lo general son más pleomórficas. Bordetella pertussis es un cocobacilo pequeño de tinción pálida, catalasa y oxidasa positiva, aerobia estricto, que se desarrolla óptimamente a 35-37 oC, entre 3 y 4 días de incubación, no utiliza carbohidratos y es inactiva en la mayoría de las pruebas bioquímicas. Su aislamiento requiere el empleo de medios enriquecidos como Charcoal Sangre de Caballo (CSC). En este medio las colonias pueden ser ligeramente ß-hemolíticas, sobre todo en las áreas más confluyentes de desarrollo, después de una incubación prolongada. En los aislamientos frescos desarrollan colonias lisas y brillantes con un perfil alto y en forma de cúpula, similares a pequeñas gotas de mercurio que miden de 1-2 mm de diámetro. El resto de las especie del género Bordetella son menos exigentes y se desarrollan en los medios de rutina, como Agar Sangre de Carnero y Agar McConkey.

VII. IDENTIFICACIÓN: 1. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIÓN:

1.1. Equipos: 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3. 1.1.4. 166

Incubadora Microscopio con objetivo de 100x y ocular de 10x Mechero tipo Bunsen Reloj de mesa


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


1.2. Materiales y reactivos: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6. 1.2.7. 1.2.8. 1.2.9. 1.2.10. 1.2.11. 1.2.12. 1.2.13. 1.2.14. 1.2.15. 1.2.16. 1.2.17.

Guantes descartables no estériles Láminas portaobjetos Asas bacteriológicas con punta redonda y recta Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de materiales descartables Jarra de vidrio Marcadores indelebles Solución salina estéril al 0.85% Cristal violeta Lugol Alcohol 70 o o alcohol acetona (1:1) Fucsina acuosa o safranina. Dihidrocloruro de tetrametil-para-fenilendiamina MIO Urea Caldo para NO3NO2 Reactivo A (a-Naftilamina, ácido acético 5N) Reactivo B (Ácido sulfanílico, ácido acético 5N)

1.3. Medios de cultivo: 1.3.1. 1.3.2.

Agar Mac Conkey (como prueba de crecimiento) Agar Sangre de Carnero (como prueba de crecimiento)

1.4. Pruebas para la identificación: 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3. 1.4.4. 1.4.5. 1.4.6. 1.4.7. 1.4.8.

Morfología macroscópica Coloración de Gram de la colonia Prueba de la oxidasa Movilidad a 37oC (MIO) Hidrólisis de la Urea Reducción de Nitratos Crecimiento en Agar Mac Conkey Crecimiento en Agar Sangre

1.5 Cepas para control de calidad: 1.5.1 1.5.2 1.5.3 1.5.4

Bordetella pertussis ATCC 10536 Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Bordetella parapertussis ATCC 15311


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PROCEDIMIENTOS

DE


1.6 Sensibilidad a los antimicrobianos: No hay puntos de corte para difusión en agar por lo que debe realizarse por CIM.

2. CARACTERÍSTICAS DE LAS UFCs EN AGAR CHARCOAL SANGRE DE CABALLO (CSC): Colonias lisas y brillantes con un perfil alto y en forma de cúpula, similares a pequeñas gotas de mercurio que miden de 1-2 mm de diámetro.

3. COLORACIÓN DE GRAM DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS A PARTIR DEL AGAR CHARCOAL SANGRE DE CABALLO (CSC): Permite observar la tinción, agrupación y morfología microscópica característica.

3.1 Procedimiento para la preparación del frotis: 3.1.1.

Utilizando un asa recta, tome del Agar Charcoal una UFC y emulsiónela en una pequeña gota de solución salina estéril sobre un portaobjetos limpio. Dispérsela en un área de 1 cm por lado. El grosor de la muestra debe ser tal que se debe leer a través de ella.

3.1.2.

Déjela secar a temperatura ambiente y luego fíjela pasándola rápidamente sobre el mechero.

3.2. Procedimiento para la tinción de Gram: ver capítulo 3. 3.3. Resultado: Se observan cocobacilos gramnegativos cuya característica más notable es que se tiñen débilmente. No hay una agrupación característica.

3.4. Control de calidad: 3.4.1. Bordetella pertussis ATCC 10536 Resultado: Se observan cocobacilos gramnegativos, débilmente teñidos. 3.4.2. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Se observa cocos grampositivos en racimos. NOTA: La coloración de Gram a partir de cultivos de más de 48 horas es difícil de interpretar.


4.1. Fundamento de la prueba: Ver capítulo 17. 4.2. Procedimiento: Ver capítulo 17. 4.3. Fundamento de la bacteria: Bordetella pertussis posee la enzima citocromooxidasa. Por lo tanto da reacción positiva, que se caracteriza por la aparición de un color púrpura en la tira reactiva. 168


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PROCEDIMIENTOS

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4.4. Resultado: Oxidasa positiva: se observa un color púrpura en la tira reactiva.

4.5. Control de calidad: 4.5.1. Bordetella pertussis ATCC 10536 Resultado: Se observa un color púrpura en la tira reactiva. 4.5.2. Bordetella parapertussis ATCC 15311 Resultado: No se observa viraje de color en la tira reactiva.

5. PRUEBA DE MOVILIDAD A 37oC:

5.1. Fundamento de la Prueba: ver capítulo de 17. 5.2. Procedimiento: ver capítulo de 17. 5.3. Fundamento de la bacteria: Bordetella pertussis no posee flagelos, por lo tanto es inmóvil.

5.4. Resultado: Movilidad negativa: se observa crecimiento solamente a lo largo de la punción del inóculo.

5.5. Control de calidad: 5.5.1. Bordetella pertussis ATCC 10536. Resultado: Se observa crecimiento solamente a lo largo de la punción del inóculo. 5.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Se observa crecimiento difuso en todo el medio.

6. PRUEBA DE UREA:

6.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 6.2. Procedimiento: Ver capítulo 17. 6.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Bordetella pertussis carece de la enzima ureasa por lo tanto no hidroliza la urea.

6.4. Resultado: Hidrólisis de urea negativa, no hay viraje en el color, el medio se observa ligeramente amarillo.

6.5. Control de calidad: 6.5.1. Bortedella pertussis ATCC 10536 Capítulo 11: Procedimientos para la identificación de Bordetella pertussis

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PROCEDIMIENTOS

DE


Resultado: No hay viraje de color. El medio conserva su color original. 6.5.2. Bordetella parapertussis ATCC 15311 Resultado: Hay viraje de color del amarillo al rosado púrpura.

7. PRUEBA DE REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS:

7.1. Fundamento de la prueba: Ver capítulo 17. 7.2. Procedimiento: Ver capítulo 17. 7.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Bordetella pertussis no tiene la capacidad de reducir los nitratos a nitritos y a otros productos de reducción, por lo tanto la prueba es negativa.

7.4. Resultado: Reducción de nitratos negativa: no hay viraje de color al agregar los reactivos A y B

7.5. Control de calidad: 7.5.1. Bortedella pertussis ATCC 10536 . Resultado: No hay reducción de nitratos a nitritos: no hay viraje de color. El medio conserva su color original después de agregar los reactivos. 7.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Hay reducción de nitratos a nitritos: hay viraje de color del amarillo al rosado púrpura después de agregar los reactivos.

8. PRUEBA DE CRECIMIENTO EN AGAR Mac CONKEY:

8.1. Fundamento de la prueba: Ver capítulo 17. 8.2. Procedimiento: Ver capítulo 17. 8.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: Bordetella pertussis no tiene la capacidad para desarrollarse en Agar Mac Conkey, por lo tanto la prueba es negativa.

8.4. Resultado: Crecimiento en Agar Mac Conkey negativo.

8.5. Control de calidad: 8.5.1 Bordetella pertussis ATCC 10536. Resultado: No hay crecimiento bacteriano.

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PROCEDIMIENTOS

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8.5.1 Escherichia coli ATCC 25922. Resultado: Crecimiento de UFCs rosadas características.

9. PRUEBA DE CRECIMIENTO EN AGAR SANGRE:

9.1. Fundamento del medio: Ver capítulo 17. 9.2. Procedimiento: Ver capítulo 17. 9.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: Bordetella pertussis no tiene la capacidad para desarrollarse en Agar Sangre, por lo tanto la prueba es negativa.

9.4. Resultado: Crecimiento en Agar Sangre de Carnero negativa: no se observa crecimiento bacteriano. 9.4.1 Bordetella pertussis ATCC 10536 Resultado: No hay crecimiento bacteriano. 9.4.1 Bordetella parapertussis ATCC 15311 Resultado: Se observa crecimiento bacteriano.

Tabla No. 1 CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO BORDETELLA PRUEBA

Bordetella pertussis

Bordetella parapertussis

Bordetella bronchiseptica

Oxidasa

+

–

+

Movilidad 37oC

–

–

+

Hidrólisis de Urea

–

+ (24h)

+ (4h)

Reducción de Nitratos

–

–

+

Desarrollo en Mac Conkey

–

V

+

Desarrollo en Sangre

–

+

+

V: Variable.

V. INFORME DE LOS RESULTADOS FINALES: Positivo: Se aisló Bordetella pertussis. Negativo: No se aisló Bordetella pertussis.


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


DIAGRAMA DE FLUJO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE Bordetella pertussis

Agar Charcoal Sangre de Caballo (CSC): Colonias lisas y brillantes similares a pequeñas gotas de mercurio.

Frotis: cocobacilos gramnegativos débilmente teñidos

Oxidasa: positiva

Movilidad 37ºC: negativa

Reducción de Nitratos: negativa

Hidrólisis de Urea: negativa

Desarrollo en Agar Mac Conkey: negativo

Desarrollo en Agar Sangre: negativo

VIII. BIBLIOGRAFÍA: 1. López Cruz SR. Normas Técnicas para el diagnóstico de Bordetella pertussis en Normas Técnicas de Bacteriología CapítuloXIII. Sergio R. López, Justo Reyes Cerros, Alcides González Mairena, Rosibel Centeno, 3ª edición, 1996, Ministerio de Salud, Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia CNDR, Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional DANIDA, Editorial Imprimatur, Managua, Nicaragua. 2. Bacilos Gramnegativos Exigentes en Diagnóstico Microbiológico, Elmer W. Koneman editor, Cap. 8, 5ª edición, 1996, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 3. Haemophilus, Bordetella, y Brucella en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. George F. Brooks editor, Cap. 19, 16ª edición (de la 21 edición en inglés), 1998, Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V. México, D.F. 4. Hoppe JE. Bordetella in Manual of Clinical Microbiology. Patrick R. Murray ed in chief, chap 40, 7th ed, 1999, ASM Press, Washington, D.C.

186 172


CAPÍTULO 12.

Procedimientos para las bacterias aisladas en el coprocultivo I. TOMA DE LA MUESTRA: 1. RECOMENDACIONES A LOS PACIENTES:

1.1. Recolectar la muestra en un frasco limpio de boca ancha en cantidad aproximada de 5g. 1.2. Cerrar herméticamente el frasco. 1.3. No haber ingerido tratamiento antimicrobiano 3 días antes. 2. TIPO DE MUESTRA:

2.1. Heces fecales recién evacuadas: Para la obtención de las heces debe utilizarse un frasco estéril boca ancha con tapa de rosca, y recoger una cantidad aproximada de 5g, luego se lleva la muestra al laboratorio lo mas pronto posible. La muestra recogida debe ser procesada lo antes posible y no dejar transcurrir más de dos horas después de haber sido obtenida. Si transcurren más de dos horas para la siembra, se almacena la muestra a temperatura de 4 oC.

2.2. Hisopado rectal: El Hisopado rectal tiene dos indicaciones: 1) Procesamiento inmediato de una muestra sin la posibilidad de obtener heces frescas en ese momento, 2) estudios en pacientes portadores. Tomar la muestra con el hisopo estéril, humedecer un extremo del hisopo con un líquido estéril, no bacteriostático o introducirse ligeramente en el medio de transporte, si es que éste va ha utilizarse (no deben usarse lubricantes) y una vez insertado en el esfínter rectal, se hará girar antes de retirarlo. El número de hisopo dependerá del tipo de investigación que se vaya a realizar.

II. TRANSPORTE

DE LA MUESTRA:

La muestra recolectada en un frasco estéril, debe transportarse al laboratorio de ser posible, en un ambiente frío. Si la muestra demora más de 2 horas en llegar al laboratorio, debe transferirse a un medio como el Stuart o Cary Blair y transportarla a temperatura ambiente. Cuando la muestra es transportada en los medios de Stuart o Cary Blair se deben introducir 2 hisopos en el medio, uno para procesamiento de Capítulo 12: Procedimientos para bacterias aisladas en el coprocultivo

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PROCEDIMIENTOS

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cólera si se realizara en el laboratorio y el otro para búsqueda de Salmonellas spp , Shigellas spp y Escherichia coli 0157 : H7. En caso de hisopado rectal el hisopo se colocará en un tubo vacío estéril con tapa si se va a procesar en término de 2 horas, de lo contrario se introduce el hisopo en el medio de transporte.

III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: 1. SI SE TRABAJA LA MUESTRA A PARTIR DE HECES FRESCAS:

1.1. Tomar un hisopo e introducirlo en la muestra teniendo cuidado de mezclarla homo-

géneamente, luego sembrarla directamente en el medio de Agar MacConkey (MacC), Agar Salmonella Shigella (SS) y Caldo Selenito (CS), tomando en cuenta que debe:

1.1.1. Inocular la muestra con un lado del hisopo en MacC. 1.1.2. Inocular el lado opuesto del hisopo en Agar SS. 1.1.3. Introducir y dejar el hisopo en el Caldo Selenito. La razón de sembrar la muestra primero en Agar MacConkey, se debe a que este medio tiene menos inhibidores que el Agar SS.

1.2. Dejar secar el inóculo en los medios mencionados aproximadamente 5 minutos y estriar el medio en la forma usual. (Ver procedimiento en capítulo 17).

1.3. Incubar los medios a temperatura de 35-37oC durante 18 a 24 horas, excepto el Caldo Selenito cuyo tiempo de incubación debe ser de 6 a 12 horas.

1.4. Realizar un subcultivo de caldo Selenito a Agar SS e incubar de 35 a 37oC durante 18 a 24 horas. 2. SI SE TRABAJA LA MUESTRA A PARTIR DEL MEDIO DE TRANSPORTE: Debe contener dos hisopos. Utilice un hisopo para cólera y el segundo hisopo utilícelo para búsqueda de Salmonella spp, Shigella spp y Escherichia coli o 157:H7. Realizar el procedimiento antes descrito.

3. SI LA MUESTRA ES DE UN HISOPADO RECTAL: Inocularla en los medios antes mencionados y realizar el mismo procedimiento anterior.

IV. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: 1. TOMA DE MUESTRA: 1.1. 1.2. 1.3.

174

Frasco estéril, de boca ancha y tapa de rosca. Hisopos estériles. Guantes.

Capítulo 12: Procedimientos para bacterias aisladas en el coprocultivo

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


2. TRANSPORTE DE LA MUESTRA:

2.1. Tubos conteniendo medio de transporte de Stuart o Cary Blair . 2.2. Termo con refrigerante. 3. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:

3.1. Equipos: 3.1.1. 3.1.2. 3.1.3. 3.1.4. 3.1.5. 3.1.6.

Incubadora a 35-37 o C Refrigeradora a 6-8 o C Baño de María Mechero Bunsen Reloj de mesa Guantes

3.2. Materiales: 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4

Hisopos estériles Marcadores indelebles Asas bacteriológicas rectas y redondas Contenedores con cloro al 0.5% para desechar material contaminante.

3.3. Medios de Cultivo: 3.3.1. Agar Salmonella Shigella (ASS) 3.3.2. Agar MacConkey (MacC) 3.3.3. Caldo Selenito (CS)


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12.1 Procedimientos para la identificación de Shigella spp

V. ALCANCE: Laboratorios de la Red: Numerales del 1.4.1 al 1.4.5 y 1.4.10 con respecto a pruebas de identificación. CNDR:

Numerales del 1.4.1 al 1.4.11 con respecto a pruebas de identificación.

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: El género Shigella pertenece a la Tribu Escherichiae de la Familia Enterobacteriaceae y como tales son bacilos gram negativos que fermentan la glucosa, no fermentan la lactosa excepto Shigella sonnei que lo hace lentamente; son anaerobios facultativos no esporulados, no presentan cápsula y son inmóviles ya que no poseen flagelos. Son bacterias de crecimiento rápido en medios de baja selectividad como Agar MacConkey y en medios altamente selectivos como Agar Salmonella Shigella excepto algunas cepas de Shigella dysenteriae serotipo 1 que pueden ser inhibidas en su crecimiento. Proliferan bien en medios de enriquecimiento altamente inhibidores como selenito. El género Shigella está constituido por cuatro especies dysenteriae (serogrupo A), flexneri (serogrupo B), boydii (serogrupo C) y sonnei (serogrupo D). Dentro de la especie dysenteriae, se agrupan 13 serotipos del 1 al 13, con mayor importancia clínica el serotipo 1 causante de disentería bacilar. Esta especie tiene la particularidad de no fermentar el manitol y además: 1. Ausencia de catalasa, contraria a las demás Enterobacterias. 2. Posee una enzima ß-galactosidasa muy activa (prueba de ONPG rápidamente positiva, en menos de una hora). Shigella dysenteriae 6 a diferencia de S. dysenteriae 1 es ONPG lenta (18 horas). Dentro de la especie flexneri se agrupan 6 serotipos del 1 al 6. Asimismo dentro de los serotipos 2 y 3 se agrupan subtipos a y b que son variaciones menores ligadas a conversión bacteriofágica (se refiere a fagos, cierto tipo de virus que infectan bacterias y que son útiles para clasificarlas) realizada sólo en laboratorios especializados. El serotipo de Shigella flexneri 6 posee variedades bioquímicas que producen poco gas a partir de la glucosa en el sitio de inoculación del agar inclinado Triple Sugar Agar o Kligler Iron Agar. Estas variedades son: Boyd 88, Manchester y Newcastle.


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Dentro de la especie boydii, se agrupan 18 serotipos del 1 al 18. El serotipo de Shigella boydii 14 tiene la particularidad de producir poco gas en el sitio de inoculación. El serotipo 9 es ONPG positiva. Algunas cepas del serotipo 10 poseen un antígeno de superficie que enmascara al antígeno O, el cual debe ser eliminado calentando el cultivo a 100 oC según se describe más adelante. Dentro de la especie sonnei existen dos tipos de cepas con características geno y fenotípicas que sirven como orientación diagnóstica: 1. Colonias de fase I son lisas, de contorno circular y convexo. Los antígenos de fase I son aglutinables por antisueros para antígeno de fase I. 2. Colonias de fase II son rugosas, de contornos irregulares. Los antígenos de fase II son aglutinables por antisueros para antígeno de fase II. Esta disociación ha permitido descubrir la función de un plásmido, en el poder invasivo o patógeno de las shigellas: 1. Las colonias fase I poseen un plásmido que confiere características invasivas o virulentas. 2. Las colonias fase II han perdido ese plásmido, no son invasivas o avirulentas. La pérdida del plásmido no sólo significa un cambio en el aspecto de la colonia, también en la especificidad antigénica y en el potencial patógeno. La shigellosis es endémica en los climas tropicales y templados y es más frecuente en verano. En Nicaragua, se han aislado con mayor frecuencia las especies de S. flexneri y S. sonnei en segundo lugar. S. boydii se aisla con muy poca frecuencia. El modo de transmisión es fecal-oral, de forma directa o de forma indirecta, al contaminar los alimentos. El período de incubación es de 12-96 horas ó 1-3 días e incluso de una semana en el caso de S. dysenteriae 1. La gravedad y letalidad de la infección y desarrollo de la enfermedad dependen de la edad del enfermo, el estado nutricional, la magnitud de la dosis infectante (de 10 a 100 células bacterianas), la especie y el serotipo de la especie. Entre las exotoxinas que produce Shigella están las citotoxinas que ejercen un efecto nocivo específico sobre la célula intestinal, produciendo una diarrea profusa no sanguinolenta en etapa temprana y la invasión del intestino delgado que da por resultado aparición posterior de sangre con pus en las deposiciones. S. dysenteriae 1 posee, además de las enzimas y exotoxinas que le confieren las características descritas anteriormente, neurotoxinas que se asocian a una alta mortalidad tal y como ocurrió en la epidemia de shigellosis por este serotipo en donde durante los primeros 4 años fueron afectadas más de medio millón y murieron 20,000 personas en toda Centroamérica. Esta neurotoxina actúa bloqueando las terminales nerviosas del SNC y produce hemorragias en la médula espinal que llevan a edema y compresión en los nervios y por último, parálisis y la muerte. Las mejores oportunidades de aislar a las shigellas por medio del coprocultivo se dan en la etapa inicial o fase aguda de la enfermedad cuando este patógeno está en mayor número en las heces y antes de administrar cualquier antibiótico. Deben ser heces recién evacuadas o que tengan moco. 178


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


VII. IDENTIFICACIÓN: 1. EQUIPO, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIÓN:

1.1. Equipo: 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3. 1.1.4. 1.1.5.

Incubadora de 35 oC a 37 oC Microscopio con objetivos de 40x Mechero tipo Bunsen Reloj de mesa Baño María a 100 oC

1.2. Materiales y Reactivos: Materiales: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6. 1.2.7. 1.2.8.

Guantes descartables no estériles Láminas portaobjetos Asas bacteriológicas con punta redonda y recta Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de material no reusable Marcadores indelebles Palillos de madera Pipetas automáticas de 40-200 µL y de 200-1000 µL Lámpara fluorescente blanca para lectura de serología

Reactivos: 1.2.9. 1.2.10. 1.2.11. 1.2.12. 1.2.13. 1.2.14. 1.2.15. 1.2.16. 1.2.17. 1.2.18. 1.2.19. 1.2.20.

Reactivo de Kovac o Erlich Aceite mineral inerte estéril Solución Salina estéril al 0.85% Solución Salina estéril al 2 % Antisueros para serogrupo A de Shigella dysenteriae Antisueros para serogrupo B de Shigella flexneri Antisueros para serogrupo C de Shigella boydii Antisueros para serogrupo D de Shigella sonnei Antisueros para serotipos del 1 al 13 de Shigella dysenteriae Antisueros para serotipos del 1 al 6 de Shigella flexneri Antisueros para serotipos del 1 al 18 de Shigella boydii Antisueros para antígenos de fase I y II de Shigella sonnei

1.3. Medios de cultivo: 1.3.1. Agar Salmonella Shigella 1.3.2. Agar MacConkey 1.3.3. Caldo Selenito Capítulo 12: Procedimientos para bacterias aisladas en el coprocultivo

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


1.4. Pruebas para Identificación: 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3. 1.4.4. 1.4.5. 1.4.6. 1.4.7. 1.4.8. 1.4.9. 1.4.10. 1.4.11.

Triple Sugar Iron Lisine Iron Agar Movilidad Indol Ornitina Utilización de Citrato de Simmons Hidrólisis de Urea Prueba de ONPG Descarboxilación de Ornitina en caldo Utilización de Acetato de sodio Fermentación de Mucato Determinación de especie por seroaglutinación con sueros de grupo Determinación de serotipo y subtipo por seroaglutinación

1.5. Cepas para control de calidad 1.5.1. 1.5.2. 1.5.3. 1.5.4.

Shigella flexneri OPS 45 Escherichia coli ATCC 25922 Escherichia coli CNDR RV 1 Proteus miriabilis ATCC 7002

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS: 1.6. Antimicrobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: Ver capítulo 6. 2. CRECIMIENTO EN AGAR SALMONELLA SHIGELLA (AGAR SS):

2.1. Fundamento del medio de cultivo: ver capítulo 17. 2.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 2.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las shigellas carecen de las enzimas galactósidopermeasa y galactosidasa, por lo tanto no tienen la capacidad de fermentan la lactosa y aparecen como colonias transparentes en el medio, convexas y de 2 a 4 mm de diámetro luego de 24 horas de incubación. Es recomendable usar este medio en conjunto con otro medio menos inhibidor como Agar MacConkey debido a que Salmonella Shigella Agar inhibe el crecimiento de algunas cepas de Shigella dysenteriae serotipo 1.

2.4. Resultado: Crecimiento de colonias incoloras, transparentes, convexas y de 2-4 mm de diámetro.

180


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


2.5. Control de calidad: 2.5.1. Shigella flexneri 2b OPS 45 Resultado: Crecimiento de colonias incoloras, transparentes, convexas y de 2-4 mm de diámetro.

3. CRECIMIENTO EN AGAR MacCONKEY:

3.1. Fundamento del medio de cultivo: ver capítulo 17. 3.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 3.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las shigellas carecen de las enzimas galactósidopermeasa y galactosidasa, por lo que no tienen la capacidad de fermentan la lactosa y las colonias aparecen incoloras o transparentes, convexas y pequeñas de 2 a 4 mm de diámetro después de 24 horas de incubación.

3.4. Resultado: Crecimiento de colonias incoloras, transparentes, convexas y de 2-4 mm de diámetro.

3.5. Control de calidad: 3.5.1. Shigella flexneri 2b OPS 45 Resultado: UFCs lactosa negativas: crecimiento de colonias transparentes, convexas y de 2-4 mm. 3.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: UFCs lactosa positivas: crecimiento de colonias rosadas, convexas y de 2-4 mm.

4. CRECIMIENTO EN CALDO SELENITO:

4.1. Fundamento del medio de cultivo: ver capítulo 17. 4.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 4.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: El selenito es un medio enriquecedor que actúa inhibiendo el crecimiento de la mayoría de gramnegativos, con lo cual favorece el crecimiento de otras bacterias, pero principalmente, shigellas y salmonellas. Las especies de Shigella de pacientes con infecciones leves donde el número de microorganismos puede estar por debajo de 200 por gramo de heces, se pueden recuperar del caldo selenito si se subcultivan dentro de 6 a 12 horas de incubación.

4.4. Resultado: Turbidez del caldo a las 8 a 12 horas de incubación.

4.5. Control de calidad: 4.5.1. Shigella flexneri 2b OPS 45 Capítulo 12: Procedimientos para bacterias aisladas en el coprocultivo

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Resultado: Turbidez del caldo. Buen crecimiento y recuperación. 4.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Poca turbidez del caldo. Sin incremento o en muy pequeña cantidad

5. PRUEBA EN TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO O TRIPLE SUGAR IRON POR SUS SIGLAS EN INGLÉS):

5.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 5.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 5.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Todas las shigellas poseen la enzima glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, por lo que fermentan la glucosa. No poseen la enzima invertasa, por lo tanto no pueden fermentar la sacarosa. Algunas variedades de Shigella flexneri 6 y Shigella boydii 14 que poseen la enzima deshidrogenasa fórmica producen muy poca cantidad de gas a partir de la glucosa, en el punto de inoculación. Shigella sonnei posee la enzima galactosidasa y por lo tanto es la única especie del género Shigella que puede fermentar lentamente la lactosa en 2 a 3 días.

5.4. Resultado: 5.4.1. Shigella spp: K/A (rojo / amarillo)

5.5. Control de Calidad: 5.5.1. Shigella flexneri 2b OPS 45 Resultado: K/A (rojo / amarillo) 5.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: A/Ag (amarillo / amarillo, gas)

6. PRUEBA EN LIA (LISINA HIERRO AGAR O LISINE IRON AGAR POR SUS SIGLAS EN INGLÉS):

6.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 6.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 6.3. Fundamentos bioquímico de la bacteria: Las shigellas no poseen la enzima lisina descarboxilasa, por lo tanto no descarboxilan la lisina. Tampoco poseen la enzima lisina desaminasa por lo que no desaminan la lisina. Algunas variedades de Shigella flexneri 6 y Shigella boydii 14 que poseen la enzima deshidrogenasa fórmica y producen muy poca cantidad de gas a partir de la glucosa, en el punto de inoculación.

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


6.4. Resultado: 6.4.1. Shigella spp: K/A (violeta / amarillo)

6.5. Control de calidad: 6.5.1. Shigella flexneri 2b OPS 45 Resultado: K/A (violeta / amarillo) 6.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: K/K (violeta / violeta )

7. PRUEBA DE MIO (MOVILIDAD, INDOL, ORNITINA):

7.1. Prueba de Movilidad: 7.1.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 7.1.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 7.1.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las shigellas carecen de flagelos, por lo tanto son inmóviles. 7.1.4. Resultado: Movilidad negativa: crecimiento exclusivamente a lo largo de la punción. 7.1.5. Control de calidad: 7.1.5.1. Shigella flexneri 2b OPS 45 Resultado: Movilidad negativa: crecimiento a lo largo de la punción. 7.1.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Movilidad positiva: turbidez difusa en el medio.

7.2. Prueba de producción de Indol: 7.2.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 7.2.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 7.2.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las shigellas carecen de la enzima triptofanasa, por lo tanto, no producen indol como producto terminal. Algunas cepas de las especies dysenteriae, flexneri y boydii poseen la enzima, por lo que pueden producirlo. 7.2.4. Resultado: 7.2.4.1. Shigella spp. Producción de indol variable: ausencia o presencia de anillo rojo al agregar el reactivo de Kovac. 7.2.4.2. Shigella sonneii. Producción de indol negativo: ausencia de anillo rojo con reactivo de Kovac. Capítulo 12: Procedimientos para bacterias aisladas en el coprocultivo

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7.2.5.

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Control de calidad:

7.2.5.1. Shigella flexneri 2b OPS 45 Resultado: Producción de indol negativa: ausencia del anillo rosado. Se forma un anillo transparente o ligeramente amarillento. 7.2.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Producción de indol positiva: presencia de anillo de color rosado intenso.

7.3. Prueba de descarboxilacion de ornitina: 7.3.1.

Fundamento de la prueba: ver capítulo 17.

7.3.2.

Procedimiento: ver capítulo 17.

7.3.3.

Fundamentos bioquímicos de la bacteria:

A excepción de Shigella sonnei que posee la enzima descarboxilasa y por lo tanto descarboxila la ornitina, las especies de Shigella dysenteriae, S. flexneri y S. boydii, no poseen esta enzima, por lo que no descarboxilan la ornitina. 7.3.4. Resultado: 7.3.4.1. Shigella dysenteriae, S. flexneri y S. boydii. Descarboxilación de la ornitina negativa: Hay viraje de color del violeta al amarillo. La reacción es mas intensa en el fondo del tubo. 7.3.4.2. Shigella sonnei. Descarboxilación de la ornitina positiva: No hay viraje de color y se observa violeta en todo el medio. 7.3.5.

Control de calidad:

7.3.5.1. Shigella flexneri 2b OPS 45 Resultado: Descarboxilación de la ornitina negativa: se observa amarillo en el fondo del medio. 7.3.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Descarboxilación de la ornitina positiva: se observa violeta en el fondo del medio.

8. PRUEBA DE CRECIMIENTO EN CITRATO DE SIMMONS:

8.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 8.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 8.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las shigellas no utilizan el citrato como única fuente de carbono.

8.4. Resultado: Utilización del citrato: Negativa. No hay viraje de color ni crecimiento en la superficie del medio en 4 días. El medio se observa de color verde.

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


8.5. Control de calidad: 8.5.1. Shigella flexneri 2b OPS 45 Resultado: Crecimiento en citrato negativo. No hay viraje de color ni crecimiento en la superficie del medio en 4 días. El medio se observa de color verde. 8.5.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Resultado: Crecimiento en citrato positivo: viraje de color del verde al azul.

9. PRUEBA DE HIDRÓLISIS A LA UREA:

9.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 9.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 9.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Todas las shigellas carecen de la enzima ureasa por lo tanto no hidrolizan la urea.

9.4. Resultado: Hidrólisis de la urea negativa: no hay viraje de color del medio. Se observa amarillo pálido.

9.5. Control de calidad: 9.5.1. Shigella flexneri 2b OPS 45 Resultado: Hidrólisis de la urea negativa: se observa amarillo en el fondo del medio. 9.5.2. Proteus mirabilis ATCC 7002 Resultado: Hidrólisis de la urea positiva: viraje de color a rosado intenso.

10.PRUEBA DE ONPG

(ORTO-NITROFENIL -β-D-GALACTOPIRANÓSIDO):

10.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 10.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 10.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria:

A excepción de S. sonnei, única especie que posee la enzima ß-galactosidasa y que por lo tanto es ONPG-positiva y fermentadora lenta de la lactosa, las demás especies de Shigella no poseen la enzima ß-galactosidasa, por lo que son ONPG negativas.

10.4. Resultado: 10.4.1. S. dysenteriae, S. flexneri y S. boydii. ONPG negativa: No hay viraje de color en la suspensión. 10.4.2. Shigella sonnei. ONPG positiva: Hay viraje de color al amarillo en la suspensión.


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


10.5. Control de calidad: 10.5.1. Shigella flexneri 2b OPS 45 Resultado: ONPG negativa: no hay viraje de color en la suspensión. 10.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: ONPG positiva: hay viraje de color a amarillo de la suspensión.

11.PRUEBA DE DESCARBOXILACIÓN DE ORNITINA EN CALDO:


A excepción de Shigella sonnei que posee la enzima descarboxilasa y por lo tanto descarboxila la ornitina, las especies de Shigella dysenteriae, S. flexneri y S. boydii, no poseen esta enzima por lo que no descarboxilan la ornitina.

11.4. Resultado: 11.4.1. S. dysenteriae, S. flexneri y S. boydii. Descarboxilación de la ornitina negativa: hay viraje de color del violeta al amarillo en el fondo del medio. 11.4.2. Shigella sonnei. Descarboxilación de la ornitina positiva: no hay viraje de color y el caldo se observa violeta.

11.5. Control de calidad: 11.5.1. Shigella flexneri 2b OPS 45 Resultado: Descarboxilación de la ornitina negativa: no hay viraje de color. El caldo se observa violeta. 11.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Descarboxilación de la ornitina positiva: se observa violeta en el fondo del medio.

12.PRUEBA DE CRECIMIENTO EN ACETATO DE SODIO:

12.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 12.2. 12.2 Procedimiento: ver capítulo 17. 12.3. Fundamentos bioquimícos de la bacteria: Las shigellas no utilizan el acetato como única fuente de carbono.

12.4. Resultado: 12.4.1. Shigella spp. Utilización del acetato negativa: no hay viraje de color ni crecimiento en la superficie del medio en 7 días. El medio se observa de color verde.

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


12.5. Control de calidad: 12.5.1. Shigella flexneri 2b OPS 45 Resultado: Utilización del acetato como única fuente de carbono negativa: no hay crecimiento ni hay viraje del color. El medio se observa de color verde. 12.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Utilización del acetato como única fuente de carbono positiva: hay crecimiento y viraje de color del verde al azul.

13.PRUEBA DE FERMENTACIÓN DE MUCATO:

13.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 13.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 13.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las shigellas no utilizan el mucato. Esta prueba bioquímica es útil para diferenciar el género Shigella de Escherichia coli inactiva.

13.4. Resultado: 13.4.1. Shigella spp: Utilización del mucato negativa: no hay viraje de color del medio en 2 días. El caldo se observa de color azul.

13.5. Control de calidad: 13.5.1. Shigella flexneri 2b OPS 45 Resultado: Utilización del mucato negativa: en dos días no hay viraje de color. El medio se observa de color azul. 13.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Utilización del mucato positiva: en dos días el medio vira de color del azul al verde.

14.SEROTIPIFICACIÓN:

14.1. Fundamento de la prueba: La presencia de antigenos específicos en la cápsula o pared celular es utilizada como base para la caracterización serológica de algunos géneros y especies bacterianas. En algunos casos el antígeno esta ubicado en el LPS de la pared y están conformados por carbohidratos. Pequeñas variaciones de los azucares dan como resultado variaciones en la especificidad del antígeno. En algunos casos el antígeno esta ubicado en la cápsula. En ambos casos y cuando la naturaleza del antígeno es altamente especifica, es utilizada para clasificar a la bacteria en serogrupos, serotipos o tipos.

14.2. Procedimiento: Ver numeral 18.4 en adelante.


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


14.3. Fundamentos antigénicos de la bacteria: El antígeno somático O constituye la parte más externa de los lipopolisacáridos de la pared celular de las shigellas. Diferentes subunidades de polisacáridos repetidas le confieren especificidad de grupo que son la base para la determinación de la especie: A (dysenteriae ), B (flexneri ), C (boydii ), D (sonnei ).

14.4. Caracterización de los antígenos somáticos O: Los aislamientos con características bioquímicas típicas de Shigella deben someterse a identificación serológica del antígeno somático O por aglutinación en lámina con antisueros para cada especie o grupo. Para ello debe contarse con un cultivo puro de 24 horas de incubación de la cepa en estudio y es necesario verificar que se encuentre en forma lisa, siguiendo los siguientes pasos: 14.4.1. Procedimiento de la verificación de colonias lisas o rugosas: Se debe verificar si la cepa se encuentra en forma lisa, es decir que es aglutinable. Para ello se procede de la siguiente forma: a. Sobre una lámina de vidrio limpia, colocar una gota de solución salina al 2%. b. Con un palillo de madera estéril tomar un inóculo de la cepa, de manera que estén en igual cantidad al mezclarse, el inóculo con la solución salina. c. Mezclar de forma homogénea. d. Rotar manualmente la lámina en forma circular y despacio por un tiempo máximo de un minuto. e. Observar si se producen o no grumos (fuerte aglutinación) 14.4.2. Resultados: Si no se producen grumos (cepa lisa o aglutinable), puede proceder a la aglutinación con los antisueros somáticos. Si se producen fuertes grumos con la solución salina al 2% indica que se trata de una cepa rugosa, por lo tanto debe seguir los siguientes pasos para eliminar el antígeno de cubierta que está enmascarando al antígeno O e inhibiendo la aglutinación. 14.4.3. Procedimiento para la eliminación del antígeno de cubierta: a. Hacer una suspensión de la bacteria en solución salina 0.85%. La suspensión debe ser bastante densa y homogénea, sin partículas flotantes. b. Calentar en baño María a 100 oC de 15 a 30 minutos. c. Dejar enfriar la suspensión d. Reintentar la aglutinación. 14.4.4. Resultados: Si no se producen grumos (cepa lisa o aglutinable), puede proceder a la aglutinación con los antisueros somáticos. Si aún después de este tratamiento, persiste la aglutinación con solución salina al 2%, debe enviar la cepa al laboratorio de referencia CNDR para su debida confirmación y serotipificación. 188


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


14.5. Procedimiento para la serotipificación polivalente somática (aglutinación de cepas de Shigella en forma lisa): Si la prueba con solución salina al 2% no aglutinó (cepa lisa), debe realizar la serotipificación usando los antisueros somáticos para cada especie, en el siguiente orden: Antisuero para serogrupo B de Shigella flexneri Antisuero para serogrupo D de Shigella sonnei Antisuero para serogrupo C de Shigella boydii Antisuero para serogrupo A de Shigella dysenteriae a. Sobre una lámina de vidrio limpia, colocar una gota de antisuero para serogrupo B de Shigella flexneri. b. Con un palillo de madera estéril, tomar un inóculo de la cepa pura, de manera que estén en igual cantidad al mezclarse, el inóculo con el antisuero. c. Mezclar de forma homogénea. d. Rotar manualmente la lámina en forma circular y despacio por un tiempo máximo de un minuto para favorecer la reacción antígeno-anticuerpo. e. Observar si se producen o no grumos (fuerte aglutinación). f.

Si hay aglutinación, anote los resultados de la especie. Si no hay aglutinación proceda a realizar el mismo procedimiento (incisos 1 al 5) con el antisuero D. Proceda con el resto de los antisueros de la misma manera en caso de que las aglutinaciones con los antisueros D y C sean negativas. Ver figura No. 2.

14.5.1. Resultados e Informe: Si aglutina con B informe: Shigella flexneri Si aglutina con D informe: Shigella sonnei Si aglutina con C informe: Shigella boydii Si aglutina con A informe: Shigella dysenteriae Nota: La identificación completa del serotipo se hace con fines epidemiológicos, por lo que corresponde al CNDR hacer estos procedimientos y por lo tanto, todas las cepas aisladas deben ser enviadas a este Centro para su debida confirmación y serotipificación.


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Flujograma de Serotipificación para Shigella spp

Cepacon características bioquímicas de Shigella Estría en TSA u otro medio sin inhibidores Aglutinación con solución salina al 2%

Positivo

Negativo Aglutinar con antisuero para serogrupo B

Calentar suspensión densa en 1mL de solución salina al 0.85% a 100oC 15-30 minutos Positiva S . flexneri

Negativo

Aglutinar con antisuero para serogrupo D

Reintentar aglutinación con solución salina al 2% Negativo aglutinar con antisueros

Positivo S. sonnei

Negativo

Aglutinar con antisuero para serogrupo C Negativo

Positiva S. boydii

Aglutinar con antisuero para serogrupo A Negativo

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Positivo S. dysenteriae


Positivo, enviar al CNDR

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Figura No. 1 Reacciones características de Shigella en agar TSI-LIA

Figura No. 2 Reacciones de aglutinación para determinación de especie en shigellas


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Tabla No. 1 TAXONOMIA DEL GENERO Shigella spp Género

Especies (serogrupo)

Serotipos

Shigella

dysenteriae (A)

1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13

Shigella Shigella

flexneri ( B ) boydii (C)

1,2,3,4,5,6 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18

Shigella

sonnei (D)

Subtipo

Fases

Ejemplo S. dysenteriae 1

a, b

S. flexneri 2a

S. boydii 14

Un sólo serotipo

Fase I lisa virulenta Fase II rugosa avirulenta

S. sonnei fase I

Tabla No. 2 CARACTERÍSTICAS BIOQUIMICAS DIFERENCIALES ENTRE ESPECIES DE Shigella spp Especie

ONPG

Ornitina descarboxilasa

S. dysenteriae

Negativa

Negativa

S. flexneri

Negativa

Negativa

S. boydii

Negativa

Negativa

S. sonnei

Positiva

Positiva

Tabla No. 3 CARACTERÍSTICAS BIOQUIMICAS DIFERENCIALES ENTRE Shigella y Escherichia coli inactiva

192

Prueba bioquímica

Shigella

Escherichia coli

Actato de sodio

Negativa

Positiva

Citrato de sodio

Negativa

Positiva

Mucato

Negativa

Positiva


inactiva

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


VIII. BIBLIOGRAFÍA: 1. Guidelines for the Control of Epidemics due to Shigella dysenteriae 1. Program for Control of Diarrhoeal Diseases. World Health Organization WHO/CDD/SER/88.12. 2. Tribu Escherichiae y Género Shigella en Diagnóstico microbiológico. Elmer W. Koneman, editor, capítulo 4, Pág.196-201, 5ª edición 1996, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 3. Le Minor L, Richard C. Shigella en Méthodes de Laboratoire pour l’identification des Enterobactéries, Cap. 4, pág. 72-78, Institut Pasteur, 1ª ed.1993, Paris, France. 4. Género II. Shigella en Manual Enterobacterias: Actualización Diagnóstica. Servicio de Enterobacterias, Departamento de Bacteriología, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (INEI), 2000, Buenos Aires, Argentina. 5. Shigellosis en Manual para el Control de las Enfermedades Transmisibles, Abram S. Benenson editor, pág. 412-416 OPS/ OMS, 16ª ed. 1997, Washington, D.C. 6. Shigellas en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks, editor, capítulo 16, 16ª edición (de la 21 a edición en inglés) 1998, Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V. México, D.F. 7. Bennington J. Endotoxinas, Exotoxinas, Neurotoxina en Diccionario Enciclopédico del Laboratorio Clínico, págs. 463, 540-543, 999, Editorial Médica Panamericana, 1ª ed.1991, Buenos Aires, Argentina.


193

12.2 Procedimientos para la identificación de Salmonella spp

I. TOMA DE LA MUESTRA: Ver toma de muestra de coprocultivo

II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: Ver transporte en coprocultivo.

III. PROCESAMIENTO PREVIO DE LA MUESTRA: No hay procedimientos previos.

IV. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: Ver equipo, materiales y reactivos en coprocultivo.

V. ALCANCE: Laboratorios de la Red: numeral VII - del 1.4.1 al 1.4. 6 y 1.4.14 con respecto a pruebas de identificación. CNDR: numeral VII - del 1.4.1 al 1.4.15 con respecto a pruebas de identificación.

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: El género Salmonella spp pertenece a las enterobacterias y como tales son bacilos gramnegativos que fermentan la glucosa, no fermentan la lactosa ni la sacarosa, son anaerobias facultativas, la mayoría móviles con flagelos perítricos, no producen indol y suelen producir sulfuro de hidrógeno. Son bacterias de crecimiento rápido, crecen en medios diferenciales como MacConkey y en los altamente selectivos como Agar Salmonella Shigella, así como en medios altamente inhibidores como Selenito. Los miembros del género Salmonella poseen tanto propiedades invasivas como exotóxicas y endotóxicas. La principal forma de transmisión es a través de los alimentos. De las formas clínicas, las más comunes son la fiebre tifoidea y paratifoidea producidas por Salmonella Typhi y Paratyphy A. De las asociadas a infección del torrente sanguíneo, uno de los serotipos más comunes es Salmonella Choleraesuis. Sin embargo, la forma clínica más frecuente es la diarrea asociada a más de 1,500 serotipos. Estos procesos requieren manejo terapéutico distinto por tener morbi mortalidad distinta.


195

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


La gravedad de la enfermedad depende de varios factores, tales como magnitud de la dosis infectante, el estado nutricional y edad del paciente. Con respecto a su nomenclatura y taxonomía, este género ha sido objeto de sucesivas modificaciones a través de los años y aunque todavía se siguen usando muchos de los métodos descritos por Edwards y Ewing, los últimos estudios del DNA mediante técnicas de hibridación, demostraron que el género Salmonella está constituido por dos especies entérica y bongori (que en la clasificación anterior era conocida como subespecie V de la especie entérica). A su vez, la especie entérica está subdividida en seis subespecies: entérica ( o subespecie I), salamae (o subespecie II), arizonae (o subespecie IIIa), diarizonae (o subespecie IIIb), houtenae (o subespecie IV) e indica (o subespecie VI). Dentro de la subespecie entérica y la especie bongori se agrupan más de 2,400 serovariedades que están definidas en función de sus diferentes asociaciones de antígenos: 1. Somáticos (O) los cuales son de naturaleza lipopolisacárida, estables al calor, 2. Antígenos flagelares (H) de naturaleza protéica, lábiles al calor y 3. De envoltura (Vi) de naturaleza polisacárida, lábiles al calor. Estas serovariedades se encuentran descritas en el esquema de Kauffmann y White, publicado por el Centro de Referencia e Investigación del Instituto Pasteur de Paris, el cual funciona como Centro de Referencia de OMS. Estas serovariedades por lo general llevan el nombre relacionado con el lugar geográfico donde se aislaron por primera vez o relacionado con un síndrome y dado que las serovaridades no tienen nivel taxonómico de especie, sus nombres se escapan al dominio del Código Internacional de Nomenclatura Bacteriana y por lo tanto deben escribirse en letra tipo romano como se describe en el siguiente ejemplo: Salmonella enterica subespecie enterica serovar Typhimurium. En la práctica de rutina, Salmonella Typhimurium. Kaufman y White hicieron esta clasificación serológica en base a la última clasificación bioquímica que divide a las salmonellas en dos especies: entérica y bongori. La especie aislada más frecuentemente es Salmonella entérica en la que se encuentran la mayoría de las serovariedades aisladas en humanos. Este procedimiento de identificación es el que se describe en este manual. La identificación completa del serotipo se hace con fines epidemiológicos, por lo que corresponde al CNDR realizar. Todas las Salmonella spp aisladas de los laboratorios de la Red deben ser enviados al CNDR para la caracterización de la serovariedad.


1.1. Equipo: Ver Equipos en coprocultivo. 1.2. Materiales y reactivos: 1.2.1. Antisueros somáticos antisalmonella 1.2.2. Antisueros flagelares antisalmonella

1.3. Medios de cultivo: Ver medios de cultivo en coprocultivo.

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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


1.4. Pruebas para Identificación 1.4.1. TSI 1.4.2. LIA 1.4.3. 1.4.4. 1.4.5. 1.4.6. 1.4.7. 1.4.8. 1.4.9. 1.4.10. 1.4.11. 1.4.12. 1.4.13. 1.4.14. 1.4.15.

MIO Citrato Urea Malonato ONPG Dulcitol Gelatina Sorbitol Mucato Salicina Lactosa Suero polivalente O Seroaglutinación con sueros monovalentes anti O, H y Vi para determinar serovariedad.


Shigella flexneri OPS 45 Escherichia coli ATCC 25922 Proteus miriabilis ATCC 7002 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS: 1.6. Antimicrobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: ver capítulo 16. 1.7. Pruebas especiales: 1.7.1.

Determinación de BLEE por medio de triple disco con CRO, CAZ y AMC

2. CRECIMIENTO EN AGAR Salmonella Shigella (SS AGAR):

2.1. Fundamento del medio de cultivo: ver capítulo 17. 2.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 2.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria ante el medio de cultivo: Las Salmonella spp carecen de las enzimas galactósidopermeasa y galactosidasa, por lo tanto no fermentan la lactosa.


197

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


2.4. Resultado: En este medio las colonias se observan transparentes, convexas, de 2-4 mm, con un punto negro, debido a la producción de H2S por la presencia de las enzimas tisulfato reductasa y cisteína disulfurasa.

2.5. Control de calidad: 2.5.1. Proteus mirabilis ATCC 7002 Resultado: Crecen UFCs que miden de 2-4 mm con el centro negro y el borde transparente. 2.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Crecen UFCs convexas de 2-4mm, color rosado pálido.

3. CRECIMIENTO EN AGAR Mac CONKEY

3.1. Fundamento del medio de cultivo: ver capítulo 17. 3.2. Procedimiento para la siembra: ver capítulo 17. 3.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria ante el medio de cultivo: Las Salmonella spp carecen de las enzimas, galactosidopermeasa y galactosidasa, por lo tanto las colonias en este medio se comportan como lactosa negativas.

3.4. Resultado: Las UFCs se observan incoloras, transparentes y convexas, de 2-4mm.

3.5. Control de calidad: 3.5.1. Proteus mirabilis ATCC 7002 Resultado: Crecen UFCs que miden de 2-4 mm lactosa negativas (incoloras) 3.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Crecen UFCs convexas de 2-4mm, color rosado intenso, con depresión umbilical en el centro.

4. CRECIMIENTO EN CALDO SELENITO:

4.1. Fundamento del medio de cultivo: ver capítulo 17. 4.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 4.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria ante el medio de cultivo: El selenito es un medio enriquecedor que actúa inhibiendo el crecimiento de la mayoría de gram negativos, con lo cual favorece el crecimiento de otras bacterias, pero principalmente E. coli, shigellas y salmonellas.

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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


4.4. Resultado: Las Salmonella spp crecen en un tiempo de 6 a 12 horas de incubación.

4.5. Control de calidad: 4.5.1. Shigella flexneri 2b OPS 45 Resultado: Turbidez del caldo. Buen crecimiento y recuperación. 4.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Ausencia o muy poca turbidez a las 6 a 12 horas de incubación.

5. PRUEBA EN TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO O TRIPLE SUGAR IRON POR SUS SIGLAS EN INGLÉS):

5.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 5.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 5.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las Salmonella spp poseen la enzima glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, por lo tanto fermentan la glucosa, no poseen las enzimas galactosidasa ni galactósidopermeasa por lo tanto no fermentan la lactosa, producen gas debido a la presencia de la enzima hidrogenasa fórmica y H2S (sulfuro de hidrógeno), por la presencia de las enzimas tiosulfatoreductasa y cisteinadisulfurasa. Salmonella Typhi se diferencia de las demás por producir poca cantidad de H2S usualmente concentrado en el tercio superior y centro del medio a las 24 hrs. y más intenso a las 48 hrs. de incubación.

5.4. Resultado: 5.4.1. Salmonella spp: K/Ag + ( rojo/ amarillo, poco gas y abundante cantidad de H2S). 5.4.2. Salmonella Typhi : K/Ag + ( rojo/ amarillo, poco gas y poca cantidad de H2S).

5.5. Control de calidad: 5.5.1. Proteus mirabilis ATCC 7002 Resultado: K/Ag+ (rojo/amarillo, poco gas y abundante H2S). 5.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: A/AG (amarillo/amarillo, abundante gas).

6. PRUEBA EN LIA (LISINA HIERRO AGAR O LISINE IRON AGAR POR SUS SIGLAS EN INGLÉS):

6.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 6.2. Procedimiento: ver capítulo 17.


199

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


6.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: El género Salmonella spp posee la enzima lisinadescarboxilasa, por lo tanto, descarboxilan la lisina excepto la Salmonella Paratyphi A que no posee la enzima. Producen gas debido a la presencia de la enzima hidrogenasa fórmica, producen H2S (Precipitado negro) debido ala presencia de las enzimas tiosulfatoreductasa y cisteinadisulfurasa.

6.4 Resultado: 6.4.1. Salmonella spp: K/Kg+ (violeta/violeta, poco gas y abundante cantidad de H2S). 6.4.2. Salmonella Paratyphi A: K/Ag+ (violeta/amarillo, poco gas, y abundante cantidad de H2S).

6.5 Control de calidad: 6.5.1. Proteus mirabilis ATCC 7002 Resultado: R/Ag+ (rojo/amarillo, poco gas y abundante producción de H2S) 6.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: K/Kg (violeta/violeta, con poco gas)


7.1. Prueba de movilidad: 7.1.1. Fundamento de las pruebas: ver capítulo 17. 7.1.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 7.1.3. Fundamentos de la bacteria: Las Salmonella spp tienen flagelos perítricos excepto, Gallinarum y Pullorum 7.1.4. Resultado: 7.1.4.1. Movilidad positiva: turbidez difusa en el medio. 7.1.4.2. Movilidad negativa: crecimiento alrededor de la línea de inoculación. No hay turbidez. 7.1.5. Control de calidad: 7.1.5.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: La movilidad es positiva:turbidez difusa en el medio 7.1.5.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603: Resultado: La movilidad es negativa: crecimiento alrededor del inóculo, no hay turbidez.

7.2. Prueba de indol: 7.2.1. Fundamento de las pruebas: ver capítulo 17. 7.2.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 7.2.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las Salmonella spp carecen de la enzima triptofanasa, por lo tanto no producen indol.

200


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


7.2.4. Resultado: Producción de indol negativa: Ausencia del anillo rojo en la superficie del medio al adicionar el reactivo de Kovacss. Nota: Esta prueba hace la diferencia de Salmonella spp con Edwarsiella tarda que es indol positivo. Ver tabla No. 1. 7.2.5. Control de calidad: 7.2.5.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: La producción de indol es positiva: presencia de un anillo rojo en la superficie del medio al adicionar el reactivo de Kovac. 7.2.5.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Resultado: La producción de indol es negativa: ausencia del anillo rojo en la superficie del medio al adicionar el reactivo de Kovac.

7.3. Prueba de ornitina: 7.3.1. Fundamento de las pruebas: ver capítulo 17. 7.3.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 7.3.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Con excepción de Salmonella Typhi, todas las Salmonellas poseen la enzima ornitina descarboxilasa. 7.3.4. Resultado: 7.3.4.1. Salmonella spp: Descarboxilación de la ornitina positiva: viraje de color a un violeta ligeramente más intenso en todo el tubo. 7.3.4.2. Salmonella Typhi: Descarboxilación de la ornitina negativa: viraje de color violeta a amarillo en el fondo del tubo 7.3.5. Control de calidad: 7.3.5.1. Escherichia coli ATCC 25922. Resultado: La descarboxilación de la ornitina es positiva: viraje de color a un violeta ligeramente más intenso en todo el tubo. 7.3.5.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Resultado: La descarboxilación de la ornitina es negativa: viraje de color del violeta al amarillo en el fondo del tubo.

8. CRECIMIENTO EN CITRATO DE SIMMONS:

8.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 8.2. Procedimiento: ver capítulo 17. Capítulo 12: Procedimientos para bacterias aisladas en el coprocultivo

201

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


8.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Excepto Salmonella Typhi y Paratyphi A, las salmonellas utilizan el citrato como única fuente de carbono. Salmonella Choleraesuis puede o no utilizarlo. Nota: Esta prueba sirve para diferenciar Salmonella spp de Edwarsiella tarda y Citrobacter freundii. Ver tabla No. 1.

8.4. Resultados: 8.4.1. Salmonella spp: Utilización del citrato positiva: crecimiento y viraje de color del verde al azul en la superficie del medio. 8.4.2. Salmonellas Typhi y Paratyphi A: Utilización del citrato negativa: no hay crecimiento ni viraje del color. El medio se observa de color verde.

8.5. Control de calidad: 8.5.1. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Resultado: La utilización del citrato es positiva: crecimiento y viraje de color del verde al azul en la superficie del medio. 8.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: La utilización del citrato es negativa: no hay crecimiento ni viraje de color, se observa verde.

9. PRUEBA DE HIDRÓLISIS DE LA UREA:

9.1. Fundamento de las prueba: ver capítulo 17. 9.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 9.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria:

Las Salmonella spp carecen de la enzima ureasa, por lo tanto no hidrolizan la urea.

9.4. Resultado: Hidrólisis de la urea negativa: no hay viraje del color, el medio se observa de color amarillo pálido.

9.5. Control de calidad: 9.5.1. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Resultado: La hidrólisis de la urea es positiva: viraje de color del amarillo tenue al rosado intenso 9.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: La hidrólisis de la urea es negativa: no hay viraje del color, se observa amarillo tenue.

202


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


TABLA No. 1. DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA ENTRE SALMONELLA, EDWARSIELLA Y CTROBACTER BACTERIA

TSI

LIA

UREA

CITRATO

MOVILIDAD

INDOL

ORNITINA

Salmonella spp

K/Ag+

K/Kg+

Negativa

Positivo

Positiva

Negativo

Positiva

Salmonella Typhi

K/Ag +

K/Kg+

Negativa

Negativo

Positiva

Negativo

Negativa

Salmonella Choleraesuis

K/Ag+

K/Kg+

Negativa

Variable

Positiva

Negativo

Positiva

Salmonella Paratyphi A

K/Ag+

K/Ag+

Negativa

Negativo

Positiva

Negativo

Positiva

Edwarsiella tarda

K/Ag+

K/Kg+

Negativa

Negativo

Positiva

Positivo

Positiva

Citrobacter freundii

K/Ag+

K/Ag+

Negativa

Positivo

Positiva

Variable

Negativa

Nota: Las pruebas siguientes se utilizan para diferenciación de especies según Kauffmann y White, después de las cuales se realiza la serotipificación.

10.PRUEBA DEL DULCITOL:

10.1. Fundamento de las prueba: ver capítulo 17. 10.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 10.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las Salmonella spp tienen diferentes reacciones con esta prueba. Las salmonellas de las subespecies entérica, salamae y la especie bongori, fermentan el dulcitol. Las subespecies arizonae, diarizinae y houtenae, no lo fermentan. La subespecie indica, puede o no fermentarlo.

10.4. Resultados: 10.4.1. Subespecies entérica, salamae y especie bongori: Fermentación del dulcitol positiva: viraje de color del violeta al amarillo. 10.4.2. Subespecies arizonae, diarizona y houtenae: Fermentación del dulcitol negativa: no hay viraje del color, se observa violeta. 10.4.3. Subespecie indica: Fermentación del dulcitol: Positiva o negativa. Puede o no puede haber viraje del color.


203

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


10.5. Control de calidad: 10.5.1. Klebsiella pneumoniae bATCC 700603 Resultado: La fermentación del dulcitol es positiva. viraje de color del violeta al amarillo. 10.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: La fermentación del dulcitol es negativa: no hay viraje de color, se observa violeta.

11.PRUEBA DE ONPG

(ORTO-NITROFENIL –B-D-GALACTOPIRANÓSIDO):

11.1. F undament o de las pr ueba: ver capítulo 17. 11.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 11.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las Salmonella spp tienen diferentes recciones con esta prueba: Las subespecies arizonae, diarizonae y la especie bongori, poseen la enzima beta- galactosidasa. Las subespecies entérica, salamae y houtenae, no poseen la enzima. La subespecie indica puede tener o carecer de la enzima, por lo que da reacciones variadas.

11.4. Resultados: Subespecies arizonae, diarizonae y especie bongori : ONPG positiva: viraje de color a amarillo Subespecies entérica, salamae y houtenae : ONPG negativa: no hay viraje del color. Se observa transparente. Subespecie indica: ONPG variable: puede o no puede haber viraje del color.

11.5. Control de calidad: 11.5.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: ONPG positiva: viraje del color a amarillo. 11.5.2. Proteus mirabilis ATCC 7002 Resultado: ONGP negativa: no hay viraje del color, se observa transparente.

8. PRUEBA DE CRECIMIENTO EN MALONATO:

12.1. F undament o de las pr ueba: ver capítulo 17. 12.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 12.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las Salmonella spp tienen diferentes reacciones con esta prueba.

204


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Las sub especies salamae, arizonae y diarizonae, utilizan el malonato como única fuente de carbono. Las sub especies entérica, houtenae, indica y especie bongori, no lo utilizan.

12.4. Resultados: Salmonella subespecies salamae, arizonae y diarizonae: Utilización del malonato positiva: viraje de color del verde al azul oscuro. Salmonella subespecies entérica, houtenae, indica y especie bongori : Utilización del malonato negativa: no hay viraje del color. El caldo se observa de color verde.

12.5. Control de calidad: 12.5.1. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Resultado: La utilización del malonato es positiva: viraje de color del verde al azul. 12.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: La utilización del malonato es negativa: no hay viraje de color, se observa verde.

9. PRUEBA DE HIDRÓLISIS DE LA GELATINA:

13.1. F undament o de las pr ueba: ver capítulo 17. 13.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 13.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las Salmonella spp tienen diferentes reacciones con esta prueba. Las subespecies salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica hidrolizan la urea. La subespecie enterica y especie bongori no hidrolizan la urea.

13.4. Resultados: 13.4.1. Salmonella spp: Hidrólisis de la gelatina positiva: halo opaco alrededor del inóculo (contrario al halo sensible de un antibiograma en el que se ve un halo claro). 13.4.2. Las salmonellas subespecies entérica y especie bangori: Hidrólisis de la gelatina negativa: ausencia del halo.

13.5. Control de calidad: 13.5.1. Proteus mirabilis ATCC 7002 Resultado: La hidrólisis de la gelatina es positiva: halo opaco alrededor del inóculo. 13.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: La hidrólisis de la gelatina es negativa: ausencia del halo.


205

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


14.PRUEBA DEL FERMENTACIÓN DEL SORBITOL:

14.1. F undament o de las pr ueba: ver capítulo 17. 14.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 14.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Todas las subespecies de la especie enterica y la especie bongori de Salmonella spp fermentan el sorbitol excepto subespecie indica.

14.4. Resultados: 14.4.1. Salmonella spp: Fermentación del sorbitol positiva: viraje del color de violeta a amarillo 14.4.2. Salmonella sub especie indica: Fermentación del sorbitol negativa: no hay viraje del color, se observa violeta.

14.5. Control de calidad: 14.5.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: la fermentación del sorbitol es positiva: viraje de color del violeta al amarillo. Proteus mirabilis ATCC 7002 Resultado: la fermentación del sorbitol es negativa: no hay viraje de color, se observa violeta.

15.PRUEBA DEL MUCATO:

15.1. F undament o de las pr ueba: ver capítulo 17. 15.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 15.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las Salmonella spp tienen diferentes reacciones con esta prueba. Las Salmonellas de las subespecies entérica, salamae, arizonae e indica y la especie bongori, utilizan el mucato de sodio. La subespecie houtenae no lo utiliza y la subespecie diarizonae, puede o no utilizarlo.

15.4. Resultados: 15.4.1. Salmonella spp: Fermentación del mucato positiva: viraje de color del azul al amarillo. 15.4.2. Salmonella subespecie houtenae: Utilización del mucato negativa: no hay viraje de color, se observa azul. 15.4.3. Salmonella subespecie diarizonae: Utilización del mucato positiva ó Negativa: puede o no puede haber viraje del color.

206


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


15.5. Control de calidad: 15.5.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: La utilización del mucato es positiva: viraje del color de azul a amarillo. 15.5.2. Proteus mirabilis ATCC 7002 Resultado: La utilización del mucato es negativa. No hay viraje de color, se observa azul.

16.PRUEBA DE LA SALICINA:

16.1. F undament o de las pr uebas: ver capítulo 17. 16.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 16.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las Salmonella spp no fermentan la salicina, excepto la subespecie houtenae.

16.4. Resultados: 16.4.1. Salmonella spp: Fermentación de la salicina negativa: no hay viraje de color, se observa violeta. 16.4.2. Salmonella subespecie houtenae: Fermentación de la salicina positiva: viraje de color del violeta al amarillo.

16.5. Control de calidad: 16.5.1. Escherichia coli

ATCC 25922.

Resultado: La fermentación de la salicina es negativa: no hay viraje de color, se observa violeta. 16.5.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Resultado: La fermentación de la salicina es positiva: viraje de color del violeta al amarillo.

17. PRUEBA DE FERMENTACIÓN DE LA LACTOSA EN CALDO:

17.1. F undament o de las pr ueba: ver capítulo 17. 17.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 17.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las Salmonella spp no poseen las enzimas galactosidasa ni galactosido permeasa, por lo tanto no fermentan la lactosa, excepto las sub especies arizonae, diarizonae, e indica que pueden o no fermentarla.

17.4. Resultados: 17.4.1. Salmonella spp: Fermentación de la lactosa negativa: no hay viraje de color, se observa violeta Capítulo 12: Procedimientos para bacterias aisladas en el coprocultivo

207

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


17.4.2. Salmonella subespecies arizonae, diarizonae e indica: Fermentación de la lactosa variable: puede o no puede haber viraje del color del violeta al amarillo.

17.5. Control de calidad: 17.5.1. Proteus mirabilis ATCC 7002 Resultado: La fermentación de la lactosa es negativa: no hay viraje de color, se observa violeta. 17.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: La fermentación de la lactosa es positiva: viraje de color del violeta al amarillo.

18. SEROTIPIFICACIÓN:

18.1. Fundamento de la prueba: La presencia de antígenos específicos en la cápsula, flagelos o pared celular es utilizada como base para la caracterización serológica de algunos géneros y especies bacterianas. En algunos casos el antígeno está ubicado en el LPS de la pared y están conformados por carbohidratos. Pequeñas variaciones de los azúcares dan como resultado variaciones en la especificidad del antígeno. También existen antígenos ubicados en los flagelos de la célula bacteriana y en algunos casos el antígeno está ubicado en la cápsula. En cualquier caso y cuando la naturaleza del antígeno es altamente específica, se utiliza para clasificar a la bacteria en serotipos o serovariedades.

18.2. Pr ocedimient o: Ver numeral 18.4 en adelante. 18.3. Fundamentos inmunológicos de la bacteria: Las salmonellas tienen una estructura antigénica compleja. El antígeno somático, (O) constituye la parte más externa de los lipopolisacáridos de la pared celular, y consisten en unidades repetidas del polisacáridos, resistentes al calor, alcohol y a ácidos diluidos que suelen identificarse mediante aglutinación bacteriana. El antígeno flagelar (H) está localizado en los flagelos y está constituido de aminoácidos y proteínas lábiles al calor. El alcohol los desnaturaliza o elimina y suelen identificarse mediante pruebas de floculación. El antígeno capsular (Vi) es de naturaleza polisacárida, es termolábil y se identifica por aglutinación bacteriana. Las serovariedades de Salmonella spp surgen como consecuencia de una asociación particular de factores antigénicos somáticos y flagelares y en algunos casos (S. Typhi, S. Paratyphi C y algunas cepas de S. Dublin) capsulares.

18.4. Caracterización de los antígenos somáticos O: Esta Reacción antígeno anticuerpo, para caracterizar el serogrupo O (somático) de Salmonella spp, se realiza en lámina a partir de un cultivo puro de 24 hrs. Es importante verificar que la bacteria se encuentre en forma lisa, lo cual se comprueba haciendo aglutinación con solución salina al 2%. A continuación se describe la técnica. 18.4.1. Verificación de las características lisas de las UFCs: 18.4.1.1. Sobre una lámina poner una gota de solución salina al 2%. 208


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


18.4.1.2. Con un palillo, Tomar un pequeño inóculo de la cepa fresca y pura. Mezclar homogenizando bien y cuidadosamente. 18.4.1.3. Mover o rotar la lámina manualmente y en forma circular por un tiempo máximo de 1 minuto. 18.4.1.4. Observar la presencia o ausencia de grumos. 18.4.2. Resultados: Si no hay presencia de grumos se realiza la aglutinación con antisueros polivalentes. Si hay formación de grumos, se debe verificar la bioquímica de la cepa y enviarla al CNDR para su debida confirmación y serotipificación. 18.4.3.

Procedimiento para la serotipificación polivalente somática:

18.4.3.1.

Sobre una lámina poner una gota del antisuero polivalente para Salmonellas

18.4.3.2.

Con un palillo, tomar un pequeño inóculo de la cepa fresca y pura y mezclar homogenizando bien y cuidadosamente.

18.4.3.3.

Mover o rotar la lámina manualmente en forma circular, por un tiempo no mayor de 1 minuto, para favorecer la reacción antígeno anticuerpo.

18.4.4.

Resultados: Si hay aglutinación debe considerarse como Salmonella spp y enviar la cepa al CNDR para su debida confirmación y serotipificación completa.

Nota: aglutinaciones débiles o tardías no deben considerarse como positivas.

Gráfico No. 1.

18.4.5.

Caracterización de los antígenos flagelares H:

La caracterización antigénica flagelar es un procedimiento complejo y que requiere de materiales con los que no cuentan los laboratorios periféricos, por lo que le corresponde al CNDR como centro de referencia. Por lo tanto toda cepa aislada, debe ser identificada bioquímicamente y serotipificada somáticamente en el laboratorio periférico y enviada al CNDR para la realizarle la serotipificación flagelar. Capítulo 12: Procedimientos para bacterias aisladas en el coprocultivo

209

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES ENTRE LAS ESPECIES Y SUB-ESPECIES DE SALMONELLA Especies

S. enterica

Sub-especies

Características Dulcitol ONPG (2h) Malonato Gelatinasa Sorbitol Cultivo con KCN L (+)-tartrato (a) Galacturonato γ-glutamyltransferasa γ-glucuronidasa Mucato Salicina Lactosa Lisis para fago O1 (a) (*) + –

d

210

= = = = =

S. bongori

enterica

salamae

arizonae

diarizonae

houtenae

indica

+

+

–

–

–

–

–

– –

–

– –

–

–

–

–

–

+ + +

+

+

+ + +

+ + + +

+ +

–

+ + + +

d d

–

+ +

+

–

–

–

–

–

–

–

–

+(*) d +

+ + d +

+ +

+

–(70%)

–

+ + d +

+ +

–

+ + +

–

–

–

–

+

–

–

–

–

–(75%)

–

+

–

d +

–

+

+(75%) +

–

–

d-tartrato Typhimurium d. Dublin – 90 % o más de las reacciones positivas. 90% o más de las reacciones negativas. Diferentes reacciones para las diferentes serovariedades.


–

–

–

+

d

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS


DE

FLUJOGRAMA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE SALMONELLA SPP MUESTRA

Caldo Selenito. Incubar 12-18 hrs

Agar SS, agar McCONKEY Incubar 18-24hrs

Agar S S Incubar 18-24 hrs

Colonias sospechosas: Lactosa negativa, con H2S en SS y con o sin H2S en Mc Conkey IDENTIFICACIÓN DE GÉNERO

TSI LIA Incubar 18-24 hrs

MIO

CITRATO UREA Incubar 18-24 hrs

Dulcitol ONPG Malonato Gelatina Sorbitol Mucato Salicina Lactosa Incubar 12- 18 hrs

SEROLOGÍA SOMÁTICA Polivalentes Monovalentes Factores

SEROLOGÍA FLAGELAR Polivalentes Monovalentes Factores

(SEROVARIEDAD) FÓRMULA ANTIGÉNICA Capítulo 12: Procedimientos para bacterias aisladas en el coprocultivo

211

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


VIII. BIBLIOGRAFÍA: 1. Enterobacterias en Diagnóstico Microbiológico. Texto Atlas a color, Elmer W. Koneman editor, capítulo 4, 5ª ed, 1999, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 2. Popoff MY, Le Minor L. Antigenic Formulas of the Salmonellas Serovar Kaufman White Scheme WHO Colaborating Center for Reference and Research on Salmonellas, Instituto Pasteur, París, 1997. 3. Tribu Salmonellae en Enterobacterias Actualización Diagnóstica, páginas 17–30. Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (INEI) Dr. Carlos G. Malbrán, Buenos Aires, Argentina, año 2000. 4. Bacilos Entéricos Gramnegativos (Enterobacteriaceae) En Microbiología Médica de Jawets, Melnick y Adelberg Geo. F. Brooks editor. Capítulo 16. Editorial El Manual Moderno, 16ª edición (traducción de la 21ª edición en inglés). México D. F. 1998.

212


12.3. Procedimientos para la identificación de Escherichia coli O157:H7

I. TOMA DE LA MUESTRA: Ver toma de muestra en coprocultivo.

II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: Ver transporte en coprocultivo.

III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: Ver procesamiento en coprocultivo.

IV. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: Ver en coprocultivo.

V. ALCANCE: Laboratorios de la Red: numerales del 1.4.1 al 1.4.8 con respecto a las pruebas de identificación. CNDR: numerales del 1.1.4 al 1.4.9.2 con respecto a las pruebas de identificación.

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: Escherichia coli forma parte de la familia Enterobacteriaceae a la cual pertenecen otros patógenos importantes como las Shigellas y Salmonellas. Son bacilos gramnegativos, no esporulados, la mayoría móviles aunque también pueden haber variantes no móviles. Crecen en medios de cultivos simples de peptona o extracto de carne sin ningún suplemento, o medios selectivos como el Agar McConkey. Son anaerobios facultativos, fermentan la glucosa con producción de ácido o ácido y gas, son catalasa positivo y oxidasa negativo y reducen los nitratos a nitritos. Forman parte de la microbiota intestinal normal de humanos, animales y se aíslan del medio ambiente. Algunas cepas de Escherichia coli son patógenas para el hombre y los animales. La patogenicidad depende si las bacterias poseen o no elementos genéticos que codifican para diferentes factores de virulencia. Si no lo poseen, permanecen como comensales benignos, pero si adquieren esos factores por algún mecanismo de transferencia de material genético, producen los distintos tipos de diarrea. Para las distintas variedades de Escherichia coli existe un esquema de clasificación basado en la presencia de factores de virulencia. Las características que forman la base de este esquema incluyen : adhesión de las bacterias en las células huéspedes , producción de toxinas y/o invasividad. Capítulo 12: Procedimientos para bacterias aisladas en el coprocultivo

213

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Clasificación de las diferentes variedades Escherichia coli asociadas a diarrea infecciosa: 1. 2. 3. 4. 5. 6.

EPEC Escherichia coli Enteropatógena ETEC Escherichia coli Enterotoxigénico EaggEC Escherichia coli Enteroagregativa DAEC Escherichia coli de Adherencia Difusa EIEC Escherichia coli Enteroinvasiva EHEC Escherichia coli Enterohemorrágica

Actualmente en el CNDR no se realiza el diagnóstico confirmativo para las primeras cinco variedades debido a que se utilizan técnicas moleculares cuya utilidad fundamental es para la investigación o vigilancia epidemiológica. Los costos de dichos procedimientos hacen inaccesible que por el momento se utilicen en el diagnóstico de rutina. La variedad de Escherichia coli entero hemorrágica (conocida anteriormente como verotoxigénica) se transmite a través de carne de res contaminada con heces fecales provenientes del ganado vacuno. Existen más de 150 serotipos asociados a esta causa de diarrea, aunque el prototipo es el serotipo O157:H7. En varios de estos países ha pasado a ser una causa de diarrea más frecuente que la shigelosis y salmonelosis. Para su detección se utilizan medios de cultivo, bioquímicos y antisueros que están disponibles comercialmente, aunque su confirmación requiere procedimientos de biología molecular como el PCR o hibridación con sondas genéticas. La diarrea por Escherichia coli enterohemorrágica serotipo O157:H7 es resultado de la acción de la toxina Shiga (Stx por su homología con la toxina producida por Shigella dysenteriae 1), la cual tiene propiedades de entero toxina, citotoxina y neurotoxina. Se han identificado dos tipos de Stx (Stx1 y Stx2 con dos subtipos Stx2c y Stx2e), de las cuales se han identificado en diarrea asociada a humanos la Stx1, Stx2, Stx1/Stx2 y Stx2/Stx2c. Ambas toxinas penetran en el enterocito e inhiben la síntesis proteica por inactivación del ribosoma 60S, lo cual lleva a la formación de úlceras hemorrágicas. La alta mortalidad que se asocia a esta variedad patogénica de Escherichia coli se debe a la acción de las toxinas sobre el sistema sanguíneo y riñones que dan origen al Síndrome Ureico hemolítico (SUH) o a púrpura trombocitopenica trombótica (PTT). El primer brote de diarrea se reportó en 1982 en personas que ingirieron hamburguesas conteniendo carne de res cocinada insuficientemente. Se ha reportado en varios países de Europa, Norteamérica, Canadá, México y varios países de Suramérica. Escherichia coli O157:H7 es el prototipo de un grupo de más de 150 serotipos de Escherichia coli entre los que están: O26:H11, O26:H32, O103:H2, O111NM, O113: H21, O145: NM y otros, sin embargo el 80% del SUH está asociado a O157:H7. Los otros serotipos se asocian a diarrea mucosa con o sin sangre. Los métodos para su caracterización son: a)

Pruebas bioquímicas y serotipificación.

b)

Hibridación con sondas genética para los genes sxt1, sxt2, eaeA.

c)

PCR para sxt1, sxt2, eaeA, O157 y E-Hly.

d)

Ensayos de toxicidad especifica en células vero para sxt1 y sxt2.

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PROCEDIMIENTOS

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Las pruebas bioquímicas y serotipificación son método presuntivo. Las técnicas moleculares son métodos confirmativos. Escherichia coli fermenta el sorbitol en menos de 24 horas a excepción del serotipo O157:H7 que lo hace en más de 24 horas de incubación, lo cual se utiliza como la característica más notable para su aislamiento rápido.


1.1. Equipos: Ver equipos en coprocultivo: 1.2. Materiales y reactivos: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6. 1.2.7. 1.2.8. 1.2.9. 1.2.10. 1.2.11.

Guantes descartables Gradillas Marcadores indelebles Contenedores con cloro al 10% para desechar material contaminante Asas rectas y redondas Láminas portaobjeto Palillos de madera Reactivo de Kovac Solución de KOH al 40% Antisuero somático para Escherichia coli O157 Antisuero flagelar para Escherichia coli H7

1.3. Medios de cultivo: Ver medios de cultivo en coprocultivo: 1.4. Pruebas de identificacion: 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3. 1.4.4. 1.4.5. 1.4.6. 1.4.7. 1.4.8. 1.4.9. 1.4.9.1. 1.4.9.2.

TSI LIA TSA MIO Urea Citrato Malonato Sorbitol Serología: Antisuero O157 Antisuero H7


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PROCEDIMIENTOS

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1.5. Cepas para control de calidad: 1.5.1. 1.5.2. 1.5.3.

Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Escherichia coli CNDR-SV 1

1.6. Sensibilidad a los Antimicrobianos: 1.6.1. Antimicobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: Ninguno. 1.6.2. Antimicobianos a utilizar por el método de Concentración Inhibitoria Minima (CIM/ MIC): Ninguno.

1.7. Pr uebas especiales de sensibilidad ant imicr obiana: Ninguna. 2. CRECIMIENTO EN AGAR MacConkey (MacC):

2.1. F undament o del medio de cult ivo: ver capítulo 17. 2.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 2.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria ante el medio de cultivo: Las colonias de Escherichia coli poseen enzima glucósidopermeasa, y ß-galactosidasa. Estas enzimas fermentan la lactosa (sustrato), produciendo grandes cantidades de ácidos mixtos y precipitación de las sales biliares. Por lo tanto se observará las colonias color rosado intenso rodeadas de un halo de color rosado menos intenso formado por la precipitación de las sales biliares.

2.4. Resultado: Las colonias características de Escherichia coli son lactosa positiva color rosado intenso, miden de 2 a 4 mm, convexas, con bordes regulares y una depresión umbilical en el centro de la colonia.

2.5. Control de calidad: 2.5.1 Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Colonias lactosa positiva (color rosado intenso). 2.5.2 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Colonias lactosa negativa (incoloras, transparentes).

3. PRUEBA DE TSI (TRIPLE AZÚCAR Y HIERRO):

3.1. F undament o de la pr ueba: ver capítulo 17. 3.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 3.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Escherichia coli posee las enzimas glucósidopermeasa, y ß-galactosidasa que fermentan la lactosa, también poseen glucosa 6-fosfato deshidrogenasa que fermenta la glucosa y la invertasa que fermenta la sacarosa, producen gas debido a la presencia de la enzima hidrogenasa fórmica. 216


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


3.4. Resultado: 3.4.1. Escherichia coli : A/AG ( amarillo/amarillo, con abundante gas).

3.5. Control de calidad: 3.5.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: A/AG ( amarillo/amarillo, con abundante gas).

4. PRUEBA DE LIA (LISINA HIERRO AGAR):

4.1. F undament o de la pr ueba: ver capítulo 17. 4.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 4.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Escherichia coli posee la enzima lisinadescarboxilasa, por lo tanto descarboxila la lisina (sustrato), también poseen la enzima glucosa 6-fosfato deshidrogenasa que fermenta la glucosa. Producen gas debido a la presencia de la enzima hidrogenasa fórmica.

4.4. Resultado: 4.4.1. Escherichia coli : K/Kg (violeta /violeta , poco gas).

4.5. Control de calidad: 4.5.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: K/Kg (violeta / violeta, poco gas).

5. CRECIMIENTO EN AGAR NUTRITIVO (AN) o TRIPTICASA SOYA (TSA):

5.1. Fundamento del medio: ver capítulo 17. 5.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 5.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria:

Se realiza un estriado en forma de S de las colonias sospechosas en un plato de AN o TSA con el objetivo de multiplicar la cepa para obtener una población genética homogéneamente similar, libre de inhibidores químicos, que sirva para realizar las pruebas bioquímicas y serológicas.

5.4. Resultado: 5.4.1. Escherichia coli crecerá confluentemente siguiendo la forma de la estría.

5.5. Control de calidad: 5.5.1. Escherichia coli ATCC 25922. Resultado: Crecimiento confluente en forma de S.


217

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE



6.1. Prueba de movilidad: 6.1.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 6.1.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 6.1.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: 6.1.5.1. Todas las Escherichia coli O157:H7 poseen flagelos perítricos, por lo tanto son móviles. 6.1.4. Resultado: Movilidad: Positiva. Turbidez difusa en el medio. 6.1.5. Control de calidad: 6.1.5.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Movilidad: Positiva. Turbidez difusa en el medio.

6.2. Prueba de indol: 6.2.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 6.2.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 6.2.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: 6.2.3.1. Todas las Escherichia coli O157: H7 poseen de la enzima triptofanasa, por lo tanto producen indol.

6.2.4. Resultado: Producción de Indol: Positivo. Se observa anillo rojo en la superficie del medio al adicionar el reactivo de Kovacs. 6.2.5. Control de calidad: 6.2.5.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Producción de indol: Positivo. Se observa anillo rojo en la superficie del medio al adicionar el reactivo de Kovacs.

6.3. Prueba de ornitina: 6.3.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 6.3.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 6.3.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: El 65% de las Escherichia coli poseen la enzima ornitinadescarboxilasa, por lo tanto descarboxilan la ornitina. El 35% que no poseen la enzima, no descarboxilan la ornitina. Por lo tanto pueden observarse reacciones positivas o negativas

218


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


6.3.4. Resultado: 6.3.4.1. Descarboxilación de la ornitina: Positiva: Intensificación del color violeta en todo el tubo. 6.3.4.2. Descarboxilación de la ornitina: Negativa: Vira de color violeta a amarillo en el fondo del tubo. 6.3.5. Control de calidad: 6.3.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Descarboxilación de la ornitina: Positiva: Intensificación del color violeta en todo el tubo.

7. PRUEBA DE UREA:

7.1. F undament o de la pr ueba: ver capítulo 17. 7.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 7.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: 7.3.1. Escherichia coli carece de la enzima ureasa, por lo tanto, no hidrolizan la urea.

7.4. Resultado: 7.4.1. Hidrólisis de la Urea: Negativa. No hay viraje de color, el medio se observa amarillo pálido.

7.5. Control de calidad: 7.5.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Hidrólisis de la Urea : Negativa: No hay viraje de color, el medio se observa amarillo pálido.

8. PRUEBA DE CITRATO:

8.1. F undament o de la pr ueba: ver capítulo 17. 8.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 8.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: 8.3.1. Escherichia coli: No utiliza el citrato como única fuente de carbono, por lo tanto no hay crecimiento en la superficie inoculada ni cambio de color.

8.4. Resultado: 8.4.1. Utilización del citrato: Negativo. No hay crecimiento ni viraje de color. El medio se observa de color verde.

8.5. Control de calidad: 8.5.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Utilización del citrato: Negativo. No hay crecimiento ni viraje de color. El medio se observa de color verde.


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


9. PRUEBA DE MALONATO: 9.1. F undament o de la pr ueba: ver capítulo 17.

9.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 9.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Escherichia coli no utiliza el malonato como única fuente de carbono, por lo tanto no hay crecimiento en el medio ni cambio de color.

9.4. Resultado: Utilización del malonato: Negativo. No hay viraje del color. El caldo se observa de color verde.

9.5. Control de calidad: 9.5.1 Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Utilización del malonato: Negativo. No hay viraje del color. El caldo se observa de color verde.

10.PRUEBA DE SORBITOL (incubación a 37oC por 24 horas): El diagnóstico presuntivo de Escherichia coli O157:H7 debe realizarse por aglutinación con los antisueros O157 y H7, a partir de colonias no fermentadoras de sorbitol.

10.1. F undament o de la pr ueba: ver capítulo 17. 10.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 10.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: 10.3.1. Escherichia coli O157: H7 se diferencia de los otros serotipos de Escherichia coli enterohemorrágicas porque no fermenta el sorbitol en las primeras 24 horas de incubación. Esta característica es importante confirmarla antes de la caracterización serológica. Nota : Todas las cepas que no fermenten el sorbitol en las primeras 24 horas deben remitirse al CNDR para su respectiva confirmación. Resultado: Fermentación del sorbitol: Negativo. No hay viraje del color, el caldo se observa de color violeta.

10.4. Control de calidad: 10.4.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Positivo. Viraje del color del medio de violeta a amarillo.

11.SEROTIPIFICACIÓN:

11.1. Fundamento de la prueba: La presencia de antígenos específicos en la cápsula o pared celular es utilizada como base para la caracterización serológica de algunos géneros y especies bacterianas. En algunos casos el antígeno está 220


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


ubicado en el LPS (lipopolisacárido) de la pared y están conformados por carbohidratos. Pequeñas variaciones de los azúcares dan como resultado variaciones en la especificidad del antígeno. En algunos casos el antígeno está ubicado en la cápsula o en los flagelos. En todos los casos y cuando la naturaleza del antígeno es altamente específica, es utilizada para clasificar a la bacteria en serogrupos, serotipos o tipos.

11.2. Procedimiento: Ver numeral 11.4.1 en adelante. 11.3. Fundamento inmunológico de la bacteria: Las enterobacterias tienen una estructura antigénica compleja. El antígeno somático (O) constituye la parte más externa de los lipopolisacáridos de la pared celular, y consisten en unidades repetidas de polisacáridos resistentes al calor y al alcohol. El antígeno flagelar (H) está localizado en los flagelos, y son lábiles al calor y alcohol. La caracterización de Escherichia coli O157:H7 se basa en la comprobación del antígeno de la pared O157 y el antígeno flagelar H7.

11.4. Caracterización de los antígenos somáticos O (Ag O): La caracterización del antígeno somático O se realiza por aglutinación en láminas de vidrio a partir de cultivos puros de 24 horas en AN o TSA . 11.4.1.

Verificación de las características lisas de las UFCs:

11.4.1.1. Sobre una lámina poner una gota de solución salina al 2%. 11.4.1.2. Con un palillo de madera, tomar un pequeño inóculo de la cepa fresca. Mezclar vigorosa pero gentilmente hasta obtener una buena homogenización. 11.4.1.3. Mover o rotar la lámina manualmente y en forma circular por un tiempo máximo de 1 minuto. 11.4.1.4. Observar la presencia o ausencia de grumos. 11.4.2. Resultados: Presencia de grumos: indica que la cepa es autoaglutinable y posiblemente es una cepa rugosa no apta para la caracterización serológica. Si no hay presencia de grumos: se realiza la aglutinación con antisuero O157 . 11.4.3.

Procedimiento para la serotipificación polivalente somática:

11.4.3.1. Sobre una lámina poner una gota del antisuero O157. 11.4.3.2. Con un palillo de madera, tomar un pequeño inóculo de la cepa fresca. Mezclar vigorosa pero gentilmente hasta obtener una buena homogenización. 11.4.3.3. Mover o rotar la lámina manualmente en forma circular, por un tiempo no mayor de 1 minuto para favorecer la reacción antígeno anticuerpo. 11.4.4.

Resultados:

Aglutinación: En menos de 1 minuto se forman grumos homogéneos. Su presencia debe considerarse como una prueba presuntiva de Escherichia coli O157. Capítulo 12: Procedimientos para bacterias aisladas en el coprocultivo

221

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


No hay aglutinación: Se observa una suspensión homogénea de aspecto lechoso. Si no hay aglutinación se considera negativa para Escherichia coli O157. Nota: aglutinaciones débiles o tardías no deben considerarse como positivas. 11.4.5.

Control de calidad de los antisueros:

11.4.5.1. Cepa Escherichia coli

O157:H7 CNDR-RV 1

Resultado: Positivo:

Solución Salina : negativo. No se observa aglutinación. Antisuero O157: positivo. Se observa aglutinación.

11.5. Caracterización del antígeno flagelar H: La detección del antígeno flagelar H7 requiere de una estimulación previa de la movilidad (varios pasos) en el medio de Craigy, que se prepara como se describe a continuación: 11.5.1. Preparación del Medio Craigy: 11.5.1.1.

Pesar:

11.5.1.1.1.

Caldo nutritivo

8 gr

11.5.1.1.2.

Extracto de levadura

2 gr

11.5.1.1.3.

Cloruro de sodio

5 gr

11.5.1.1.4.

Nitrato de potasio

1 gr

11.5.1.1.5.

Agar

5 gr

11.5.1.1.6.

Agua destilada c.s.p.

100 ml

11.5.1.1.7.

pH: 7.6

11.5.1.2.

En tubos de 10x160mm con tapa de rosca se introduce una varilla hueca de 8cm de longitud y 3 ó 4 mm de ancho.

11.5.1.3.

Se agregan 5mL del medio de cultivo (el cual contiene agar al 0.5%) en cada tubo.

11.5.1.4.

Se esteriliza durante15 minutos a 121 oC y 15 lb. de presión (o 1.07 kg/cm 2).

11.5.1.5.

El medio se deja gelificar colocando el tubo en posición vertical. El interior de la varilla debe haber quedado lleno del medio de cultivo y los bordes del mismo sobresalir entre 1-3 mm sobre la superficie del medio.

11.5.2.

Procedimiento para la serotipificación flagelar:

11.5.2.1. Con un asa recta sembrar un inóculo en el centro del medio de cultivo contenido en el interior de la varilla y a una profundidad no mayor de 5 mm. Las bacterias móviles más competentes se desplazarán al fondo del medio contenido en la varilla y luego a la superficie del medio de cultivo externo. 11.5.2.2. Tomar una porción del crecimiento del tubo exterior con un asa redonda. 11.5.2.3. Realizar la aglutinación en lamina con el antisuero H7 como se describe para la serología somática (numeral 11.4.4). 222


MANUAL

11.5.3.

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Resultados: Positivo: Solución Salina : Negativo: no se observa aglutinación. Antisuero H7: Positivo: se observa aglutinación con grumos finos.

11.5.4.

Control de Calidad de los antisueros:

11.5.4.1. Escherichia coli O157:H7 CNDR-RV 1 Resultado: Positivo: Solución Salina : Negativo: no se observa aglutinación Antisuero H7 : Positivo: se observa aglutinación

11.6. Informe de resultado del coprocultivo: Negativo: No se aisló Escherichia coli Positivo: Se aisló Escherichia coli

O157 H7.

O157 : H7. No se requiere susceptibilidad antimicrobiana.

VIII. BIBLIOGRAFÍA: 1. López Cruz SR. Normas Técnicas para Coprocultivo en Normas Técnicas de Bacteriologia, Cap.V., 3ª ed., 1996, Ministerio de Salud, Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia CNDR, Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional DANIDA, Editorial Imprimatur, Managua, Nicaragua. 2. Manual de Procedimientos. Parte I: Escherichia coli diarréico. Taller Teórico Práctico. Diagnóstico molecular de las enfermedades diarréicas agudas causadas por Vibrio cholerae y Escherichia coli, 1998, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, “Carlos G. Malbran”, Buenos Aires, Argentina; Siena, Italia. 3. López Cruz SR. Coprocultivo I en Manual de Bacteriología Médica., 3ª ed., 2001, Ministerio de Salud. Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia CNDR, Proyecto de Fortalecimiento de los Laboratorios de Salud Pública Post Huracán MITCH, AID/CDC/APHL/CNDR, Managua, Nicaragua. 4. Tribu Escherichiae en Manual de Enterobacterias: Actualización Diagnóstica. Cap. I, Servicio de Enterobacterias. Departamento de Bacteriología, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, INEI “Dr. Carlos G. Malbrán”, 2000, Buenos Aires, Argentina. 5. Levine MM. Escherichia coli that Cause Diarrea: Enterotoxigenic, Enteropathogenic, Enteroinvasive, Enterohemorrhagic, and Enteroadherent. Journal Infectious Diseases, 1987; 155 (3):377-89. 6. Rivas M, Binsztein N, Basanta G et al. Antibody Responses against Excherichia coli Heat-Labile toxin and Colonization Factor Antigens I and II in Argentinian Children. Journal Infectious Diseases, 1996; 171: 1045-49. 7. Rivas M, Voyer L, Tous M. Hemolytic uremic syndrome: co.infection with two different serotypes of shigalike toxin producing Escherichia coli. Medicina (Buenos Aires), 1993; 53:487-90.


223

CAPÍTULO 13.

Procedimientos para la identificación de Vibrio cholerae I. TOMA DE LA MUESTRA: 1. TIPO DE MUESTRA: 1.1. Heces fecales recién evacuadas 1.2.

Vómitos

1.3.

Hisopado rectal

2. RECOMENDACIONES A LOS PACIENTES: 3.1. Recolectar la muestra en un frasco limpio de boca ancha en cantidad aproximada de 5g. 3.2.

Cerrar herméticamente el frasco.

3.3.

No haber ingerido tratamiento antimicrobiano 3 días antes.

3. 0BTENCIÓN DE LA MUESTRA EN CASO DE PACIENTES SOSPECHOSOS DE CÓLERA: 3.1. Colecte la muestra de heces o vómitos del paciente en un frasco de vidrio o plástico de boca ancha, limpio y seco. Basta colectar el equivalente a 1/4 de taza de las deposiciones. Es importante tomar las muestras antes de iniciar tratamiento con antibióticos. 3.2.

Introduzca dos hisopos en el frasco que contiene la muestra, luego introdúzcalo en el tubo que contiene el medio Cary Blair hasta el fondo del frasco, quebrando la parte superior del hisopo. Deje adentro los hisopos y cierre el tubo. El medio puede obtenerlo en el CNDR. Debe enviarlo a temperatura ambiente.

3.3.

Introduzca un tercer hisopo en el frasco que contiene la muestra de heces o vomito y siémbrelo en medios de agar SS, Mac onkey y caldo selenito, con el objetivo de buscar otros patógenos como Salmonella, Shigella y E. coli. La identificación de estos enteropatógenos debe ser realizada en su laboratorio. En caso que el laboratorio de su unidad no tenga la posibilidad de hacerlo, no es necesario realizar el numeral 3.3. El CNDR utilizará uno de los dos hisopos (punto 3.2) para el aislamiento de shigellas, salmonellas y E. coli enterohemorrágico O157.

3.4.

Si en un momento determinado hay un caso sospechoso y no tiene medio de Cary Blair, colecte la muestra como se menciona en el numeral 1, y guárdela en refrigeración (NO LA CONGELE) LLAME INMEDIATAMENTE AL CNDR. para recibir instrucciones adicionales. Capítulo 13: Procedimientos para la identificación de Vibrio cholerae

225

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Si no es posible comunicarse, envíe la muestra inmediatamente al CNDR. Transpórtela en un termo con refrigerante. 3.5.

En pacientes fallecidos en los que fue posible colectar una muestra, el médico o patólogo debe tomar una muestra de 2 cm del ileon terminal. Esta debe depositarse en un tubo conteniendo caldo nutritivo o un sustituto (BHI, Tipticasa Soya, Mueller Hinton. El caldo debe contener 1% de NaCl).

II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: 1. 2. 2.1.

3.

En caso de heces frescas, transportar en un frasco estéril y de ser posible en un ambiente frío. Si la muestra demora más de 2 horas en llegar al laboratorio, debe transferirse a un medio de transporte de Cary Blair y transportarla a temperatura ambiente. Si la muestra es transportada en medio de transporte Cary Blair introducir 2 hisopos en el medio, uno para procesamiento de cólera y el otro para búsqueda de Salmonella spp, Shigella spp y E. coli 0157 en su laboratorio. En el caso de hisopados rectales, cuando la muestra se procesa en no más de dos horas desde el momento de la toma hasta su llegada al laboratorio, el hisopo se introduce en un tubo vacío estéril con tapa de rosca. Si el transporte durara más de 2 horas, el hisopo se introduce en un tubo con medio de transporte de Cary Blair. En esta última forma, el V. cholerae permanece viable hasta 30 días a temperatura ambiente.

III. PROCESAMIENTO PREVIO DE LA MUESTRA: 1. SI SE TRABAJA LA MUESTRA A PARTIR DE HECES FRESCAS: 1.1.

Tomar un hisopo con punta de algodón.

1.2.

Introducir el hisopo en la muestra teniendo el cuidado de mezclarla homogéneamente

1.3.

Sembrar la muestra con el hisopo directamente en el tubo de agua peptonada (APA).

Con otro hisopo se toma una nueva muestra y se siembra en los medios de Agar MacConkey, Agar SS y caldo Selenito, para búsqueda de Salmonella, Shigella y E. coli O157 (Ver capítulo de Coprocultivo.)

2. SI LA MUESTRA ES DE UN HISOPADO RECTAL O PROVENIENTE DEL MEDIO DE TRANSPORTE CARY Y BLAIR: 2.1. Un hisopo sembrarlo en APA y con el otro realizar un inóculo en MacConkey, otro en SS agar y por último sembrar el hisopo en caldo selenito. A continuación proceder de la forma siguiente: 2.2.

Incubar el APA de 6 a 8 horas a una temperatura de 35 a 37 oC.

2.3.

Subcultivar de la superficie del agua peptonada a agar TCBS ( tiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa). Poniendo una a dos asadas en un extremo del plato, dejar que el exceso de líquido se absorba por unos 5 minutos y estriar el inóculo en la forma convencional.

2.4.

Incubar de 18 a 24 horas a 35 - 37 oC.

226

Capítulo 13: Procedimientos para la identificación de Vibrio cholerae

MANUAL

2.5.

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Picar 2 UFC sospechosos del TCBS subcultivado del APA, y sembrarlo en un plato de TSA con NaCl 1%. El plato de TSA debe ser previamente dividido en su parte posterior en 8 áreas iguales con un marcador indeleble. Cada UFC debe ser sembrada en el área respectiva en forma serpentiforme. Cada una de los 8 UFC sembrados en el TSA deben sembrarse simultáneamente en TSI y LIA e incubarse durante 18-24 horas a 35-37 oC.

IV. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: 1. EQUIPOS: 1.1. Incubadora a 35 - 37 oC 1.2. Refrigeradora a 6 - 8 oC 1.3. Mechero tipo Bunsen 1.4. Reloj de mesa 1.5. Lámpara para lectura de serología 2. MATERIALES Y REACTIVOS: 2.1. Guantes descartables no estériles 2.2. Frasco estéril, boca ancha con tapa de rosca. 2.3. Hisopos estériles con punta de algodón 2.4. Tubos vacíos para el caso de hisopados rectales 2.5. Marcadores indelebles 2.6. Asas rectas y redondas 2.7. Contenedores con cloro al 0.5 % para descarte de materiales no reusables 2.8. Platos petri plásticos ó láminas porta objetos para realizar las aglutinaciones 2.9. Palillos de madera 2.10. Tiras de oxidasa ó reactivo dihidrocloruro de tetrametil para fenilendiamina 2.11. Desoxicolato de sodio al 0.5% 2.12. Solución salina 2% 2.13. Suero Polivalente de V. cholerae O1. 2.14. Antisuero Ogawa 2.15. Antisuero Inaba 2.16. Antisuero monovalente de V. cholerae O139 2.17. Aceite mineral 2.18. Alfa Naftol 2.19. KOH 40% 3. MEDIOS DE CULTIVO: 3.1. APA (Agua Peptonada Alcalina) 3.2. TCBS (Tio Sulfato Citrato Bilis Sacarosa) 3.3. TSA con 1% NaCl ( Agar Tripticasa Soya) Capítulo 13: Procedimientos para la identificación de Vibrio cholerae

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PROCEDIMIENTOS

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V. ALCANCE: Laboratorios de la Red: numerales del 1.4 al 1.4.8 con respecto a pruebas de identificación. CNDR: numerales del 1.4 al 1.4.16 con respecto a pruebas de identificación.

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: La familia vibrionaceae agrupa a bacterias acuáticas, tanto de agua salada como de agua dulce; varias son patógenas a diversos animales acuáticos. Se reconocen once especies del género Vibrio como causantes de infecciones intestinales y extraintestinales en humanos. Son microorganismos halófilos (requieren sodio para su crecimiento), a excepción de dos especies, llamadas por esta razón vibrios “no halófilos”: V. cholerae y V. mimicus. De las especies de vibrio, se considera que las asociadas con diarrea son: V. cholerae, seroptipo O1 y O139 ,V. cholerae no O1, V. parahemolyticus, V. fluvialis, V. mimicus. V. hollisae, y V. furnisii. V. cholerae O1 y O139, productor de enterotoxina es el agente causal de el cólera. Está constituido por bacilos gramnegativos anaerobios facultativos. Son pequeños (0.5 x 1.5-3 m) con morfología de bacilos rectos y semicurvos. Al efectuar varios subcultivos, desaparecen las formas curvas y sólo se observan bacilos rectos. Poseen un solo flagelo polar, cubierto de una envoltura. Son sensibles a pH ácido. El pH de 5 o menos les es letal. Se trata de bacterias de fácil crecimiento, mesófilos y aerobios. Crecen bien en algunos medios de cultivo comunes, especialmente en agar sangre de carnero al 5%. Sin embargo, el uso del medio selectivo y diferencial llamado TCBS (Tiosulfato, Citrato, sales Biliares, Sucrosa) ayuda considerablemente en el aislamiento primario. En este medio las bacterias presentan colonias grandes, aplanadas en los bordes y amarillas. La clasificación serológica de V. cholerae se basa en las características del antígeno somático “O” el cual está constituido por una proteína termolábil y otra termoestable, y varios polisacáridos. Esta especie se divide en 6 serogrupos (1 al 6). Al serogrupo 1 pertenecen los vibriones coléricos epidémicos que causan el cólera ( Vibrio cholerae O1 y O139). Según la proteína somática termoestable, el antígeno “O” se diferencia en 13 tipos (A-L). Vibrio cholerae O1 presenta combinaciones de tres tipos de antígeno somático: A, B y C. En base a las combinaciones de estos antígenos, se diferencian tres subtipos serológicos o serotipos: Ogawa (A + B), Inaba (A + C) e Hikojima (A + B + C). Independiente de la clasificación serológica, V. cholerae O1 se diferencia, según sus características bioquímicas y epidemiológicas en dos biotipos: El Tor y Clásico. El biotipo El Tor se caracteriza por causar epidemias con pocos casos graves (aproximadamente 2%) y muchos casos leves o asintomáticos. También sobrevive más tiempo en el medio ambiente, y es más resistente a los agentes químicos. Esta infección es de transmisión fecal-oral. Se adquiere por la ingestión de Vibrio cholerae O1 de agua contaminada y mariscos principalmente bivalvos (conchas), y de otros alimentos contaminados. El período de incubación es corto, de uno a cinco días. Cuando la infección se ha establecido en la población, las aguas negras desempeñan un importante papel en la cadena de la infección. Vibrio cholerae O1 produce una potente enterotoxina extracelular. Se trata de una proteína cuyo peso molecular aproximado es 84,000 dalton. La enterotoxina activa el sistema adenilato ciclasa de las células de la mucosa del intestino humano. Como consecuencia, intracelularmente se acumula adenosin 228


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PROCEDIMIENTOS

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monofosfato cíclico (AMP-C) que altera el transporte activo de iones a nivel de la membrana celular. Ocurre secreción activa de líquido y electrolitos hacia el lumen del intestino con disminución de la absorción. En los casos graves, el paciente presenta diarrea abundante y acuosa (como “agua de arroz”) y vómitos, lo que causa deshidratación severa y acidosis metabólica. En casos graves sin tratamiento, la muerte puede ocurrir apenas 12 horas después del aparecimiento de los síntomas. Algunos pacientes con cólera severo pueden excretar un volumen de fluido equivalente al peso de su cuerpo en 4 días. Las infecciones moderadas y leves son las más comunes. El objetivo principal del tratamiento es para evitar la muerte por deshidratación a través del pronto reemplazo de agua y electrolitos por la vía oral o parenteral, según el grado de deshidratación. El tratamiento con antimicrobianos acorta el período de la diarrea y disminuye el requerimiento de líquidos, pero no es indispensable para la recuperación del paciente. Además, no eliminan el estado de portador y su uso irracional se convierte en una fuerte presión selectiva para el aparecimiento de cepas multirresistentes.

VII. IDENTIFICACIÓN: 1. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIÓN:

1.1. Equipo: (Ver numerales IV- 1). 1.2. Materiales y Reactivos: (Ver numerales IV-2). 1.3. Medios de cultivo: (Ver numerales IV-3). 1.4. Pruebas para la Identificación 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3. 1.4.4. 1.4.5. 1.4.6. 1.4.7. 1.4.8. 1.4.9. 1.4.10. 1.4.11. 1.4.12. 1.4.13.

TSI (Agar Hierro Tres Azúcares) LIA (Agar Lisina Hierro) Tiras de oxidasa ó reactivo dihidrocloruro de tetrametil para fenilendiamina Desoxicolato de sodio al 0.5% Solución salina 2% Antisuero Polivalente de V. cholerae O1 Antisuero Ogawa y Antisuero Inaba Antisuero Monovalente O139 Caldo de Ornitina con NaCl al 1% Caldo de Lisina con NaCl al 1% Caldo de Arginina con NaCl al 1% Caldo de Sacarosa con NaCl al 1% Caldo nutritivo con NaCl al 1% y Caldo nutritivo sin NaCl

Biotipos: (Clásico y el Tor) 1.4.14. 1.4.15. 1.4.16.

Caldo Vogues Proskauer Hemólisis en Agar Sangre de Carnero al 5% Sensibilidad a la Polimixina B 50 U Capítulo 13: Procedimientos para la identificación de Vibrio cholerae

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PROCEDIMIENTOS

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1.5 Cepas para control de calidad: 1.5.1 1.5.2 1.5.3

Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Vibrio cholerae O1 CNDR AT-1 (no portador de enterotoxina)

SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS: 1.6. Antimicrobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: ver capítulo 16. 1.7. Antimicrobianos a utilizar par la Concentración Minima Inhibitoria: Ninguno. 1.8. Pruebas Especiales: Ninguna. 2. CRECIMIENTO EN CALDO DE ENRIQUECIMIENTO AGUA PEPTONADA ALCALINA (APA):

2.1. F undament o del medio de cult ivo: ver capítulo 17. 2.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 2.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: El pH alcalino del APA inhibe y retrasa el crecimiento de otras bacterias pero no de Vibrio cholerae, por lo que crece sin dificultad en un tiempo de 6-8 horas a una temperatura de 35 a 37oC de incubación.

2.4. Resultado: Se observa turbidez y la formación de una película blanca de crecimiento en la superficie del caldo.

2.5. Control de calidad: 2.5.1. Vibrio choerae O1 CNDR AT-1 Resultado: turbidez del medio y formación de una película blanquecina en la superficie del caldo. Nota: El V. cholerae O1 CNDR AT-1 fue aislado en aguas del balneario de Tipitapa y se comprobó que carecía de los genes que regulan la producción de la toxina y uno de los factores de adherencia. La comprobación fue hecha con métodos moleculares en el Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, “Carlos G. Malbran” de Argentina, por lo cual no existe riesgo en su uso en el laboratorio para fines de control de calidad. Sin embargo, deben tomarse las precauciones universales para su manipulación, almacenamiento y eliminación.

3. CRECIMIENTO EN AGAR TIO SULFATO CITRATO BILIS SACAROSA (TCBS):

3.1. F undament o del medio de cult ivo: ver capítulo 17. 3.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17.

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PROCEDIMIENTOS

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3.3. Fundamento bioquímicos de la bacteria: Vibrio cholerae posee la enzima invertasa por lo tanto fermenta la sacarosa y como resultado las UFCs se observan de color amarillo, de 2-3 mm, “chiclosas”, redondas, lisas, brillantes y ligeramente aplanadas las más grandes o francamente convexas las pequeñas.

3.4. Resultado: UFCs de 2-3mm, planas o convexas, amarillas y brillantes.

3.5. Control de calidad: 3.5.1. Vibrio cholerae O1 CNDR AT-1 Resultado: Crecimiento de UFCs de 2-3mm, planas o convexas, amarillas y brillantes.

4. AGAR TSA CON NACL AL 1%:

4.1. Fundamento del medio de cultivo: ver capítulo 17. 4.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 4.3. Fundamento bioquímicos de la bacteria: El NaCl al 1% confiere un crecimiento más vigoroso a las cepas de V. cholerae. El propósito de la siembra en este medio es obtener un crecimiento masivo para realizar las pruebas presuntivas y confirmativas.

4.4. Resultado: V. cholerae crece confluentemente siguiendo la forma serpentiforme de las estrías.

4.5. Control de calidad: 4.5.1. Vibrio cholerae O1 CNDR AT-1 Resultado: Crecimiento confluente

5. PRUEBA DE TSI (TRIPLE AZUCAR Y HIERRO):

5.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 5.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 5.3. Fundamento bioquímicos de la bacteria: Vibrio cholerae posee las enzimas galactosidasa y galactósidopermeasa, (fermenta la lactosa) posee la enzima invertasa (fermenta la sacarosa) y también posee la enzima glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (fermenta la glucosa). No produce gas porque carece de la enzima deshidrogenasa fórmica y de las enzimas tiosulfatoreductasa y cisteínadisulfurasa por lo tanto, no produce sulfuro de hidrógeno.


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PROCEDIMIENTOS

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5.4. Resultado: Vibrio cholerae : A/A (amarillo / amarillo sin gas y sin H2S).

5.5. Control de calidad: 5.5.1. Vibrio cholerae O1 CNDR AT-1 5.5.2. Resultado: A /A (amarillo / amarillo)

6. PRUEBA DE LIA ( LISINA HIERRO AGAR):

6.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 6.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 6.3. Fundamento bioquímicos de la bacteria: Vibrio cholerae posee la enzima lisina descaborxilasa por lo tanto, descarboxila la lisina.

6.4. Resultado: Vibrio cholerae: K/K (violeta /violeta sin gas y sin H2S)

6.5. Control de calidad: 6.5.1. Vibrio cholerae O1 CNDR AT-1 Resultado: Descarboxilación de la lisina: K/K (violeta/violeta)

PRUEBAS PRESUNTIVAS PARA Vibrio cholerae O1 7.

PRUEBA DE OXIDASA:

7.1. F undament o de la pr ueba: ver capítulo 17. 7.2. Procedimiento: Se realiza con colonias aisladas recientemente de agar TSA con NaCl al 1%. 7.2.1.

Se toma una cinta de oxidasa. Con un palillo se toma un inóculo del agar TSA y se coloca en el centro de la parte de la tira con el reactivo. Una alternativa en vez de la tira comercial es impregnar un pedazo de papel absorbente con una a tres gotas del reactivo tetrametil para fenilendiamina al 1%. El papel debe colocarse previamente en un plato petri.

7.2.2.

El inóculo se extiende, ya sea en la parte correspondiente de la tira o del papel impregnado con el reactivo.

7.2.3.

La lectura debe realizarse en los primeros 10 segundos. El cambio de color a un púrpura intenso indica la presencia de la enzima citocromo oxidasa.

7.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: 7.3.1. 232

Vibrio cholerae posee la enzima citocromo oxidasa, por lo tanto da reacción positiva que se caracteriza por la aparición de un color púrpura en la tira reactiva.


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PROCEDIMIENTOS

DE


7.4. Resultado: Oxidasa positiva: se observa un color a púrpura en la tira reactiva. Ver figura No 1.

7.5. Control de calidad: 7.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Se observa un rápido aparecimiento de un color púrpura en la tira reactiva. 7.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: No hay aparecimiento del color púrpura en menos de 10 segundos.

Figura No. 1

8. PRUEBA DEL CORDÓN:

8.1. Fundamento de la prueba: Las células bacterianas se lisan por efecto del desoxicolato, por esta razón la suspensión perderá turbidez y el DNA liberado de las células lisadas ocasionara que la mezcla se haga viscosa.

8.2. Procedimiento: Sobre un plato petri de plástico ó en una lámina poner una gota de solución acuosa de desoxicolato de sodio al 0.5%. 8.2.1. Con un aplicador de madera ó palillo de dientes estéril, tomar un pequeño inoculo de la cepa fresca y pura del agar TSA. 8.2.2. Mezclar homogenizando de modo circular. Debe leerse en los primeros 30 segundos.

8.3. Fundamento bioquímicos de la bacteria: V. cholerae se alisa por efecto del desoxicolato, por esta razón la mezcla se torna viscosa y se forma un hilo mucoide al suspender o levantar el palillo o asa.


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DE

PROCEDIMIENTOS

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8.4. Resultado: Prueba del cordón positiva: formación de hilo mucoide. Ver figura No. 2.

8.5. Control de calidad: 8.5.1. Vibrio cholerae O1 CNDR AT-1 Resultado: formación de hilo mucoide.

Figura No. 2

9. SEROLOGÍA DEL ANTISUERO POLIVALENTE O1 Y DEL ANTISUERO MONOVALENTE O139:

9.1. Fundamento de la prueba: La tipificación serológica de los aislamientos de Vibrio cholerae se basa en la detección de los antígenos somáticos “O” termoestables y de naturaleza lipopolisacarida. Basándose en los antígenos O se han identificado más de 130 serogrupos en esta especie, pero solamente los que poseen los antígenos O del grupo 1 (serogrupos O1 y O 139) producen la toxina asociada a cólera epidémica. Los antígenos flagelares (“H”) se comparten ampliamente entre los serogrupos O y no han resultado útiles para identificación.

9.2. Pr ocedimient o: Ver numerales 9.4 en adelante. 9.3. Fundamentos antigénicos de la bacteria: Vibrio cholerae O1 y O139 poseen los antígenos somáticos·”O” que aglutinan con suero polivalente O1 y monovalente O139. La aglutinación se puede observar a simple vista por la rápida conformación de grumos. Fig. No. 3. La identificación del serotipo con antisueros monoespecíficos (absorbidos) O139 sigue siendo la prueba serológica confirmatoria para los aislamientos de V. cholerae que no aglutinan con el antisuero polivalente O1.

9.4. Caracterización de los antígenos somáticos O: Se realiza en lámina a partir de un cultivo puro de 24 horas. Es importante verificar que la bacteria se encuentre en forma lisa, lo cual se comprueba haciendo mezclando un inóculo con solución salina al 2%. A continuación se describe la técnica. 234


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9.4.1.

DE

PROCEDIMIENTOS

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Verificación de las características lisas de las UFCs:

9.4.1.1. Sobre una lámina poner una gota de solución salina al 2%. 9.4.1.2. Con un palillo, tomar un pequeño inóculo de la cepa fresca y pura. Mezclar homogenizando bien y cuidadosamente. 9.4.1.3. Mover o rotar la lámina manualmente y en forma circular por un tiempo máximo de 1 minuto. 9.4.1.4. Observar la presencia o ausencia de grumos. 9.4.2.

Resultados:

Si no hay presencia de grumos se realiza la aglutinación con antisuero polivalente O1. La presencia de grumos (autoaglutinación) indica la presencia de una cepa rugosa o de un V. cholerae atípico. La obtención de cepas lisas se logra con varias resiembras en ASC. Luego se repite el procedimiento anterior. 9.4.3.

Procedimiento para la serotipificación polivalente O1:

9.4.3.1. Sobre un plato petri de plástico o en una lámina portaobjetos poner una gota del antisuero polivalente O1. 9.4.3.2. Con un palillo, tomar un pequeño inóculo del agar TSA y mezclar homogenizando bien y cuidadosamente. 9.4.3.3. Mover o rotar manualmente en forma circular el plato o la lámina, por un tiempo no mayor a un 1 minuto. 9.4.3.4. Si la prueba es negativa con el Polivalente O1 realizar el mismo procedimiento con suero monovalente O139. Ver numerales 9.4.3.1-9.4.3.3. 9.4.4.

Resultados: Aglutinación con el polivalente O1: debe considerarse como V. cholerae O1. Aglutinación con el monovalente O139: debe considerarse como V. cholerae O139. En cualquier caso, enviar la cepa al CNDR para su debida confirmación.

Nota: aglutinaciones débiles o tardías no deben considerarse como positivas. Ver figura No. 3.

Figura No. 3

1) Aglutinación Positiva

2) Aglutinación Negativa.


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PROCEDIMIENTOS

DE


10.SEROLOGÍA CON LOS ANTISUEROS, OGAWA E INABA:

10.1. Fundamento de la prueba: Según la proteína somática termoestable, el antígeno “O” se diferencia en 13 tipos (A-L); Vibrio cholerae O1 presenta combinaciones de tres tipos de antígeno somático: A, B y C. En base a las combinaciones de estos antígenos, se diferencian tres subtipos serológicos o serotipos: Ogawa (A + B), Inaba (A + C), e Hikojima (A + B + C). Este úlitmo es muy raro y generalmente inestable. Su identificación se atribuye, con frecuencia, a reacciones en que los antisueros de prueba se absorbieron de manera inadecuada.

10.2. Procedimiento: 10.2.1. Sobre un plato petri de plástico o en una lámina portaobjeto poner una gota de cada uno de los antisueros Ogawa e Inaba. 10.2.2. Con un palillo, tomar un pequeño inóculo de la cepa fresca y pura del agar TSA. Mezclar homogenizando bien y cuidadosamente. 10.2.3. Mover o rotar el plato o la lámina manualmente en forma circular, por un tiempo no mayor de 1 minuto, para favorecer la reacción antígeno anticuerpo.

10.3. Fundamentos antigénicos de la bacteria: Los V. cholerae que tienen los antígenos protéicos A y B se designan como serotipo Owaga. Los que tienen los antígneos protéicos A y C se designan como serotipo Inaba. A diferencia de la aglutinación con el suero polivalente O1, la reacción en el caso de Ogawa es más tardada pero los grumos son claramente visibles. En el caso de Inaba los grupos tardan en aparecer y son muy finos. Fig. No. 3.

10.4. Resultado: Aglutinación positiva con suero Ogawa: se corresponde con V. cholerae O1 serotipo Ogawa. Aglutinación positiva con suero Inaba: se corresponde con V. cholerae O1 serotipo Inaba. Nota: En caso de aglutinación con ambos sueros enviar al CNDR para su confirmación. Ver resumen de las pruebas presuntivas en tabla No. 1.

PRUEBAS CONFIRMATIVAS PARA Vibrio cholerae

O1:

11.PRUEBA DE ORNITINA EN CALDO CON NaCl AL 1%:

11.1. F undament o de la pr ueba: ver capítulo 17. 11.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 11.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Vibrio cholerae, posee la enzima ornitina descarboxilasa, por lo tanto, descarboxila la ornitina dando como producto terminal la putrescina que alcaliniza el medio.

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PROCEDIMIENTOS

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11.4. Resultado: Descarboxilacion de la ornitina positiva: viraje de color que acentúa el color violeta. El crecimiento de la bacteria hace que el caldo se observe turbio. Ver figura No. 4.

11.5. Control de calidad: 11.5.1. Vibrio cholerae O1 CNDR AT-1 Resultado: Decarboxilación de la ornitina positiva: viraje de color que acentúa el color violeta. El crecimiento de la bacteria hace que el caldo se observe turbio.

12.PRUEBA DE LISINA EN CALDO CON NaCl AL 1%:

12.1. F undament o de la pr ueba: ver capítulo 17. 12.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 12.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Vibrio cholerae, posee la enzima lisina descarboxilasa, por lo tanto descarboxila la lisina, dando como producto terminal la cadaverina que alcaliniza el medio.

12.4. Resultado: Descarboxilacion de la lisina positiva: hay un ligero viraje de color que acentúa el color violeta. El crecimiento de la bacteria hace que el caldo se observe turbio. Ver figura No. 4. 12.5.

Control de calidad:

12.5.1. Vibrio cholerae O1 CNDR AT-1 Resultado: Descarboxilacion de la lisina positiva: hay un ligero viraje de color que acentúa el color violeta. El crecimiento de la bacteria hace que el caldo se observe turbio.

13.PRUEBA DE ARGININA EN CALDO AL CON NACL AL 1%:

13.1. F undament o de la pr ueba: ver capítulo 17. 13.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 13.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Vibrio cholerae carece de la enzima argininadihidrolasa, por lo tanto no se forma del producto final citrulina.

13.4. Resultado: Dihidrólisis de la arginina negativo: viraje de color del medio de violeta a amarillo por fermentación de la glucosa. Ver figura No 4.


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DE

PROCEDIMIENTOS

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13.5. Control de calidad: 13.5.1. Vibrio cholerae O1 CNDR AT-1 Resultado: Dihidrolisis de la arginina negativo: viraje de color del medio de violeta a amarillo.

14.PRUEBA DE SACAROSA EN CALDO CON DE NaCl AL 1%:

14.1. F undament o de la pr ueba: ver capítulo 17. 14.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 14.3. Fundamento bioquímicos de la bacteria: Vibrio cholerae posee la enzima invertasa, por lo tanto hay fermentación de la sacarosa. 14.4. Resultado: Fermentación de la sacarosa positivo: viraje de color del medio de violeta a amarillo.

Ver figura No 4.

14.5. Control de calidad: 14.5.1. Vibrio cholerae O1 CNDR AT-1 Resultado: Fermentación de la sacarosa positiva: viraje de color del violeta al amarillo.

15.PRUEBA DE CRECIMIENTO EN CALDO NUTRITIVO CON NaCl AL 1% Y CALDO NUTRITIVO SIN NaCl:

15.1. Fundamento de la prueba: La mayor parte de las especies de Vibrio diferentes de Vibrio cholerae son halófilas, por lo que requieren de una cantidad mínima de sal en los medios de cultivo para su crecimiento. La capacidad de V. cholerae para crecer en medios de cultivo con o sin sal es una característica selectiva útil.

15.2. Procedimiento: Los caldos se inoculan con un inóculo muy pequeño tomado del agar TSA recién obtenido. El inóculo debe de ser tan pequeño que no cause turbidez antes de incubar los caldos. Luego se incuban a 238


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DE

PROCEDIMIENTOS

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una temperatura de 35 a 37 oC y se leen entre las 18 a 24 horas. Si no hay crecimiento en 24 horas, se incuban hasta 7 días.

15.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: Vibrio cholerae y el Vibrio mimicus no son halófilos pero sí halotolerantes, por lo que crecen bien tanto en el caldo nutritivo con el NaCl al 1% y en el caldo sin NaCl, debido a que el caldo simple contiene trazas de sal suficientes para el crecimiento.

15.4. Resultado: Crecimiento en ambos tubos. Se observa mayor turbidez en el tubo que contiene NaCl al 1%.

15.5. Control de calidad: 15.5.1. Vibrio cholerae O1 CNDR AT-1 Resultado: Crecimiento en ambos tubos con mayor turbidez en el que contiene NaCl.

DETERMINACIÓN DE LOS BIOTIPOS EL TOR Y CLÁSICO: 16.PRUEBA VOGUES PROSKAUER CON NaCl AL 1%:

16.1. F undament o de la pr ueba: ver capítulo 17. 16.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 16.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: V. cholerae produce acetilmetilcarbinol como producto metabólico final del metabolismo de la glucosa. En presencia de oxígeno atmosférico e hidróxido de potasio al 40%, el acetilmetilcarbinol se convierte a diacetilo. Al agregar el α naftol, el cual sirve de catalizador se forma un complejo en la superficie del tubo, por lo que aparenta un anillo de color zapote. Nota: en el caso de V. cholerae la incubación del caldo con VP se requieren 48 horas antes de realizar la prueba.

16.4. Resultado: 16.4.1. Vogues Proskauer positivo: se forma un anillo de color zapote en la superficie del caldo. 16.4.2. Vogues Proskauer negativo: se forma un anillo de color café claro u oscuro que se corresponde con el color del α naftol.

16.5. Control de Calidad: 16.5.1. Vibrio cholerae O1 CNDR AT-1 Resultado: Vogues Proskauer positivo: se forma un anillo de color zapote en la superficie del caldo. 16.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Se forma un anillo color café claro u oscuro (color del α naftol )


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PROCEDIMIENTOS

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17.PRUEBA DE HEMÓLISIS EN ASC AL 5%

17.1. F undament o de la pr ueba: Ver capítulo de Streptococcus. 17.2. Pr ocedimient o: Ver capítulo de Streptococcus. 17.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Vibrio cholerae 01 biotipo El Tor produce hemolisinas, observándose desde una leve a una marcada beta hemólisis. El biotipo Clásico no es hemolítico.

17.4. Resultado: 17.4.1. Producción de hemolisinas: Beta hemólisis alrededor de las colonias, biotipo El Tor. 17.4.2. Sin producción de hemolisinas: Ausencia de beta hemólisis alrededor de las colonias, biotipo Clásico.

17.5. Control de calidad: 17.5.1. Vibrio cholerae O1 CNDR AT-1 Resultado: Beta hemólisis alrededor de las colonias

18.PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA POLIMIXINA B 50 U:

18.1. Fundamento de la prueba: El disco de polimixina B 50 U es un antimicrobiano polipéptido catiónico, bactericida para numerosos bacilos aerobios gramnegativos que actúa a nivel de las membranas celulares ricas en fosfatidiletanolamina y cuyo resultado es la alteración del transporte activo y la permeabilidad selectiva.

18.2. Procedimiento: 18.2.1. Proceda a la preparación de un inóculo y su siembra en el medio de Mueller Hinton según se describen en el capítulo de sensibilidad a los antimicrobianos por el método de Kirby y Bauer. 18.2.2. Coloque un disco de polimixina B de 50 unidades en el centro del agar inoculado con el V. cholerae. 18.2.3. Incube de 18 a 24 horas y a una temperatura de 35 a 37 oC.

18.3. Fundamentos fisiológicos de la bacteria: V. cholerae O1 es sensible o resistente a la acción bactericida de la polimixina B, según el biotipo. El Tor es resistente y el biotipo Clásico es sensible.

18.4. Resultado: Halo de inhibición (no importa el diámetro): biotipo Clásico. Ningún halo de inhibición: biotipo El Tor. (ver figura No. 5).

240


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


18.5. Control de calidad: 18.5.1. Vibrio cholerae O1 CNDR AT-1 Resultado: Halo de inhibición negativo: El crecimiento del V. cholerae llega hasta la orilla del disco. Biotipo El Tor.

Figura No. 5

Biotipo El Tor

Biotipo Clásico

Nota: Ver resumen de las pruebas confirmativas en tabla No. 2.


241

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Diagrama de flujo para el aislamiento e identificación de V. cholerae

Muestras: Heces, hisopado rectal ó vómitos

Medio de trasporte Cary-Blair

Enriquecimiento en agua peptonada alcalina (APA) Incubación 6 a 8 horas a 35-37ºC

Subcultivo de la superficie del caldo (APA) en agar TCBS Incubar 18 a 24 horas a 35-37ºC

UFCs sospechosas amarillas 2-3mm de diámetro aplanadas

Sembrar en agar TSA con NaCl al 1%

Pruebas presuntivas

Oxidasa ( – ) Se descarta de V. cholerae

TSI y LIA A/A y K/K

Oxidasa (+) Cordón ( – ) Se descarta

Cordón (+)

Solución Salina (+)

Solución Salina ( – )

Polivalente O1 ( – )

Polivalente O1 (+)

Monovalente O139

O139 ( – ) Se descarta V. cholerae

242

Serotipo Ogawa

Factores A, B

Inaba Hikojima

A, C A, B, C

0139 (+) se reporta V. cholerae O139


Ogawa +

Inaba –

– +

+ +

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


TABLAS DE DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA TABLA No. 1 PRUEBAS PRESUNTIVAS DE V. cholerae 01 CORDON S S 01 0139 POS NEG POS NEG

01

OXIDASA POS

01

POS

POS

NEG

POS

NEG

0139

POS

POS

NEG

NEG

POS

Inaba POS

Ogawa NEG

NEG

POS

SS: solución salina - Pos: positivo - Neg: negativo

TABLA No. 2 PRUEBAS CONFIRMATIVAS DE V. cholerae 01 O

L

A

S

NaCl 1%

Caldo sin NaCl

VP

Hemólisis

Polimixina

01 El Tor

POS

POS

NEG

POS

POS

POS

POS

POS

R

01 Clásico

POS

POS

NEG

POS

POS

POS

NEG

NEG

S

0139

POS

POS

NEG

POS

POS

POS

POS

POS

18.6. Informe: 18.6.1. Positivo Vibrio cholerae O1, Ogawa, El Tor. Vibrio cholerae O1, Inaba, El Tor. Vibrio cholerae O139. 18.6.2. Negativo para Vibrio cholerae O1 y O139

VIII. BIGLIOGRAFÍA: 1. Tórrez MF, Cano F., González Camargo CL, Aguilar de Miranda T., Paniagua F. Etiología y Diagnóstico de Laboratorio de el Cólera. Organización Panamericana de la Salud. Publicación Técnica No.1, 1991, Guatemala. 2. Métodos de laboratorio para el diagnóstico de Vibrio cholerae. Centro para el Control y Prevención de Enfermedades CDC y Organización Panamericana de la Salud, OPS, Programa Especial de Publicaciones, OPS, 1994, Washington, D.C. 3. López Cruz SR. Vibrio cholerae: Manual de Bacteriología Médica 3ª ed., Ministerio de Salud. Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia CNDR. Proyecto de Fortalecimiento de laboratorios Post Huracán MITCH. AID/CDC/APHL/CNDR, Managua, Nicaragua. 4. González Mairena A, López Cruz SR. Diagnóstico de Cólera por Laboratorio en Normas técnicas de Bacteriología, Cap. IV. Ministerio de Salud, Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia CNDR, 3ª edición, 1996, Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional, DANIDA, Editorial Imprimatur, Managua, Nicaragua. 5. Quimioterapia Antimicrobiana en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks, editor, capítulo 10, 16ª edición (de la 21a edición en inglés) 1998, Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V. México, D.F. Capítulo 13: Procedimientos para la identificación de Vibrio cholerae

243

CAPÍTULO 14.

Procedimientos para la identificación de microorganismos aislados en exudado vaginal I.

TOMA DE LA MUESTRA:

1. RECOMENDACIONES AL PACIENTE: 1.1. No debe haber recibido ningún tratamiento local o sistémico con antimicrobianos, tres días antes de la toma de la muestra. 1.2.

Abstinencia sexual el día anterior a la toma de la muestra.

1.3.

Debe presentarse sin haberse realizado ducha vaginal. Las niñas no deberán haberse bañado o limpiado los genitales.

1.4.

Este examen no debe realizarse durante el período menstrual.

2. TIPO DE MUESTRA:

2.1. Exudado vaginal y endocervical: 2.1.1. Acostar al paciente en posición ginecológica e introducir el espéculo estéril sin aplicar ningún tipo de lubricante. 2.1.2. Con un hisopo estéril, tomar la muestra del exudado de las paredes y el fondo del saco de Douglas. 2.1.3. Hacer un frotis en el extremo de una lámina portaobjetos. 2.1.4. El frotis debe quedar transparente y sin residuos que impidan una buena lectura después de la tensión. 2.1.5. Introducir el hisopo en un tubo de ensayo con 1mL de solución salina al 0.85% para examen al fresco. 2.1.6. Localizar el endocérvix e introducir un hisopo estéril en el mismo. 2.1.7. Rotar el hisopo sobre si mismo con el objetivo de eliminar el moco cervical. 2.1.8. Introducir un segundo hisopo estéril y seco, a una profundidad de 1-1.5cm dentro del canal endocervical y rotarlo gentilmente. 2.1.9. Hacer un frotis de forma redonda a la par del frotis del exudado del fondo de saco de Douglas. El frotis debe tener un espesor tal que permita leer letras pequeñas a través de él y un diámetro no mayor de 2 cm. Capítulo 14: Procedimientos para la identificación de Thrichomonas vaginalis,

245

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


2.1.10. Utilizando otro hisopo estéril, repita el procedimiento descrito en 2.1.7. 2.1.11. Inocule el hisopo en un plato de agar Thayer Martin. Estríelo en la forma convencional e introdúzcalo inmediatamente en una jarra de vidrio y genere CO 2 con el método de la vela. Utilice sólo velas de parafina blanca.

2.2. Toma de muestra de exudado vulvar: 2.2.1.

Cuando se trate de niñas es conveniente que siempre esté presente un familiar o un testigo de la institución. Debe explicarse claramente a la madre o pariente que el hisopo no será introducido en la vagina. En los casos de tipo médico legal, la muestra debe ser tomada exclusivamente por un ginecólogo.

2.2.2.

Acostar al paciente en posición ginecológica. Separar los labios mayores.

2.2.3.

Con un hisopo estéril, tomar por frotación una muestra del introito vaginal y uretral. Hacer un frotis en una lámina portaobjetos con las mismas características descritas en el apartado 2.1.8 de exudado vaginal y endocervical.

2.2.4.

Con la misma técnica y utilizando un segundo hisopo estéril repita el procedimiento de tomar la muestra según se describe en 2.2.2. En caso de enrojecimiento en los labios mayores, frote la cara contralateral del hisopo en las zonas eritematosas.

2.2.5.

Inocular el hisopo en el plato con agar Thayer Martin. Estriarlo en la forma convencional e introducirlo inmediatamente en una jarra de vidrio. Generar ambiente de CO 2 por el método de la vela.

2.2.6.

Introducir el hisopo en un tubo de ensayo con 1mL de solución salina al 0.85% para examen al fresco.

2.3. Exudado uretral en mujeres: 2.3.1. 2.3.2. 2.3.3. 2.3.4. 2.3.5.

Ponerse guantes descartables estériles. Acostar al paciente en posición ginecológica. Separar los labios mayores. Presionar el orificio uretral y tomar la muestra con un hisopo estéril. Inocular la muestra en el medio Thayer Martin. Con la misma técnica y utilizando otro hisopo estéril, hacer un frotis en una lamina portaobjetos.

II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: Trasportar el exudado vaginal para examen al fresco en un tubo de ensayo con solución salina 0.85%.

III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: No hay procedimientos previos.

246

Capítulo 14: Procedimientos para la identificación de Thrichomonas vaginalis,

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


IV. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS: 1. TOMA DE LA MUESTRA:

1.1. Equipos: 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3.

Camilla Espéculo estéril Lámpara cuello de ganso

1.2. Materiales y Reactivos: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6.

Guantes Hisopos de algodón estériles Láminas porta objetos Marcador indeleble Solución de cloro al 0.5%. Tubos de ensayo con 1mL de solución salina al 0.85%

1.3. Medios de Cultivo: 1.3.1.

Agar Thayer Martin


2.1. Materiales: 2.1.1. 2.1.2.

Gradilla Tubos de ensayo con 1mL de solución salina al 0.85%

V. ALCANCE: Ver alcance en procedimientos para la identificación de cada microorganismo.

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS DEL EXUDADO VAGINAL: Las infecciones del aparato genital femenino son causadas por una amplia variedad de microorganismos que incluyen bacterias, hongos y virus. Algunos síntomas son ocasionados por organismos exógenos mientras que otros son causados por miembros de la microbiota local de la paciente. El tipo de infección y el agente causal es influenciado por un sinnúmero de factores que incluyen: Actividad sexual, uso de dispositivos intrauterinos, instrumentación del aparato genital, administración de antimicrobianos y enfermedades sistémicas. Los microorganismos que causan este tipo de infecciones se pueden clasificar en tres grupos Grupo 1: microorganismos que no son parte de la microbiota local. Si se aíslan se reportan siempre: a.) Neisseria gonorrhoeae b.) Trichomonas vaginalis c.) Chlamidia trachomatis* *No se incluye en el presente Manual. Capítulo 14: Procedimientos para la identificación de Thrichomonas vaginalis,

247

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Grupo 2: Son parte de la microbiota local, pero en condiciones especiales, en asociación con anaerobios son causa de leucorrea. Se identifican y se reportan si reúne un conjunto de criterios diagnósticos. a.) b.) c.) d.) e.)

Gardnerella vaginalis Candida albicans Mobiluncus spp Ureaplasma urealyticum* Micoplasma hominis*

* No se incluyen en el presente Manual. Grupo 3: Son parte de la microbiota local y están asociados a leucorrea si hay cambios en el pH, daño local (partos, legrados, maniobras quirúrgicas), o enfermedad sistémica. No se aíslan de rutina sino cuando el médico lo solicita y la solicitud debe acompañarse de una breve historia clínica acerca del problema. Una excepción es el Streptococcus ß hemolítico del grupo B (Streptococcus agalactiae), que siendo miembro de la microbiota local, debe aislarse y reportarse en mujeres embarazadas, cuando el cultivo se realiza en los últimos días previo a la fecha probable del parto. En niños recién nacidos prematuros o recién nacidos a término pero con historia de sufrimiento fetal o en niños inmunocomprometidos, suelen desarrollarse infecciones pulmonares, cardíacas, infección del torrente sanguíneo (sépsis) o meningitis por Streptococcus ß hemolítico del grupo B adquirido en la vagina durante el transcurso del parto. Por esta razón, a este grupo de mujeres se le administra tratamiento profiláctico antes del parto.

248


14.1 Procedimientos para la identificación de Trichomonas vaginalis

I. TOMA DE LA MUESTRA: Ver toma de la muestra al inicio de este capítulo.

II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: Ver transporte de la muestra al inicio de este capítulo.

III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: Ver procesamiento de la muestra al inicio de este capítulo.

IV. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS: Ver equipo, materiales y reactivos muestra al inicio de este capítulo.

V. ALCANCE: Laboratorios de la Red y Centro de Referencia aplican todos los incisos con respecto a las pruebas de identificación.

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: La trichomoniasis es una enfermedad de transmisión sexual causada por Trichomonas vaginalis, un protozoario flagelado. Morfológicamente tiene forma de pera, con una membrana ondulante que se extiende desde la parte media a la posterior. Además, en la parte anterior posee cuatro flagelos con los cuales se desplaza con movimientos rotatorios y vacilantes. Dado a su tamaño (longitud de 15-20 µm) es fácilmente visible con un objetivo de 40X. De las tres especies de tricomonas que infectan al hombre, solamente Trichomonas vaginalis es patógeno. Trichomonas vaginalis puede causar inflamación moderada, sobre todo cuando la invasión a la mucosa es intensa. El pH, el estado fisiológico de las superficies vaginales y la microbiota bacteriana acompañante son los principales factores que afectan la patogenicidad. En la mujer, la infección está limitada a la vulva, vagina y cérvix. Rara vez se extiende al interior del útero. En el hombre es poco común, pero se pueden infectar las vesículas seminales, próstata y uretra. Los signos y síntomas en las mujeres son: leucorrea, sensibilidad local, prurito vulvar y sensación de quemadura. Alrededor del 10% de los hombres infectados tienen un exudado uretral blanquecino. Capítulo 14: Procedimientos para la identificación de Thrichomonas vaginalis,

249

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE



1.1. Equipos: 1.1.1. 1.1.2.

Centrífuga Microscopio

1.2. Materiales y reactivos: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4.

Láminas portaobjetos Láminas cubreobjetos Pipetas Pasteur Guantes descartables no estériles

1.3. Pruebas para identificación: 1.3.1.

Examen al fresco.

2. EXAMEN AL FRESCO:

2.1. Fundamento: El examen al fresco consiste en determinar visualmente la presencia Trichomonas vaginalis.

2.2. Procedimiento: 2.2.1.

Centrifugar la muestra entre 3,000 a 5,000 rpm durante tres minutos.

2.2.2.

Eliminar el sobrenadante.

2.2.3.

Con una pipeta de Pasteur, tomar una gota del sedimento y colocarla en una lámina portaobjetos. Colocar encima un cubreobjetos.

2.2.4.

Observar al microscópico con objetivo de 40X.

2.3. Fundamento de la bacteria: Trichomonas vaginalis es un protozoario flagelado en forma de pera, que se evidencia principalmente por su movimiento rotatorio y ondulatorio.

2.4. Resultado: Presencia de Trichomonas vaginalis en el examen al fresco.

2.5. Informe: Positivo: Se observaron Trichomonas vaginalis. Negativo: No se observaron Trichomonas vaginalis.

250


14.2. Procedimientos para la identificación de Gardnerella vaginalis






VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: Gardnerella vaginalis es un bacilo aerobio Gram variable, con similitud a la pared de los grampositivos a excepción que es mas delgada, es inmóvil, y forma parte de la microbiota normal de la vagina y el ano de adultos de ambos sexos. También se encuentra en el ano de los niños. En ciertas circunstancias se torna virulento y causa una vaginitis no específica (vaginosis). Los frotis húmedos de vaginitis inespecífica dan lugar a las “células pista”, las cuales son células epiteliales de la vagina recubiertas con muchos bacilos gramnegativos muy pequeños, principalmente en la periferia de estas células. La leucorrea suele tener un olor característico a pescado que se acentúa o se hace evidente al agregar una una gota de hidróxido de potasio. En casos de vaginosis por G. vaginalis el pH vaginal se incrementa a 4.5-5.5 (normal: 3.5-4.5). La referencia (regla de oro) para la identificación de Gardnerella vaginalis no es el cultivo sino su identificación directa. Para su diagnóstico se valoran estos tres aspectos: olor característico a pescado (prueba de aminas), presencia de células pista y pH de la vagina.


251

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE



1.1. Equipos: 1.1.1.

Microscopio

1.2. Materiales y reactivos: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6. 1.2.7.

Láminas porta objetos KOH al 10% Colorantes de Gram Aceite de inmersión Pipetas Pasteur Guantes descartables no estériles Palillos de madera

1.3. Pruebas para la identificación: 1.3.1. Prueba de aminas 1.3.2. Gram 1.3.3. pH vaginal* * El pH vaginal debe ser tomado con cintas especiales que puedan detectar cambios de pH entre 2 y 5. Estas cintas no están disponibles para el laboratorio por lo que únicamente se hará el diagnóstico basado en la prueba de aminas y Gram.

2. PRUEBA DE AMINAS:

2.1. Fundamento: Al poner en contacto una gota de la muestra de exudado vaginal o vulvar con una gota de KOH al 10%, se desprende un olor a pescado característico que indica la presencia de aminas.

2.2. Procedimiento: 2.2.1. Colocar una gota de la muestra en un portaobjeto y agregar a ésta, una gota de KOH al 10%. 2.2.2. Olfatear la muestra para determinar si ocurre desprendimiento de un olor a pescado característico que indica la presencia de aminas.

2.3. Fundamento de la bacteria: Gardnerella vaginalis al ponerse en contacto con KOH al 10% libera un olor a pescado característico que indica la presencia de aminas.

252


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


2.4. Resultado: Desprendimiento de un olor a pescado característico que indica la presencia de aminas al mezclar la muestra con el KOH.

2.5. Informe: 2.5.1. Positivo: Prueba de aminas positiva 2.5.2. Negativo: Prueba de aminas negativa

3. GRAM:

3.1. Fundamento: El análisis de la tinción de Gram consiste en observar la presencia o ausencia de células pista, que en caso de estar presentes evidencian de la presencia de Gardnerella vaginalis.

3.2. Procedimiento: 3.2.1. Observar al microscopio con objetivo de inmersión el Gram del frotis directo de exudado vaginal.

3.3. Fundamento de la bacteria: La infección causada por Gardnerella vaginalis se caracteriza por la presencia de células pista las cuales son células epiteliales de la vagina recubiertas con coco bacilos gramnegativos y o positivos.

3.4. Resultado: Presencia de células epiteliales de la vagina recubiertas con coco bacilos gramnegativos y o grampositivos.

3.5. Informe: Positivo: Se observaron células pista Negativo: No se observaron células pista


253

14.3. Procedimientos para la identificación de Mobiluncus spp






VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: Es un bacilo gramnegativo anaerobio estricto y de difícil crecimiento en medios de cultivo. El diagnóstico se realiza por medio del Gram. En el frotis se observan predominantemente bacilos grampositivos cortos y curvos en la superficie de las células epiteliales o fuera de ellas. Es frecuente el pleomorfismo. El papel de Mobiluncus en la vaginosis no es bien claro aunque se le puede identificar en asociación con Gardnerella y otros anaerobios. Su potencial papel patógeno se conoce porque ha sido aislado de abscesos de senos, exudados umbilicales y del torrente sanguíneo, así como de aspirados de mujeres con infección pélvica. No está indicado su cultivo de rutina, pues su identificación es relativamente fácil, la cual se realiza por medio del Gram.


255

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE



1.1. Equipos: 1.1.1. Microscopio


Láminas portaobjetos Colorantes de Gram Aceite de inmersión Guantes descartables no estériles

1.3. Pruebas para la identificación: 1.3.1. Gram

2. GRAM:

2.1. Fundamento: El análisis de la tinción de Gram consiste en observar la presencia o ausencia predominante de bacilos grampositivs semicurvos y pleomórficos que sugieren la presencia de Mobiluncus.

2.2. Procedimiento: Observar al microscopio con objetivo de inmersión el Gram del frotis directo de exudado vaginal o vulvar.

2.3. Fundamento de la bacteria: La infección causada por Mobiluncus se caracteriza por la presencia de bacilos grampositivos cortos y curvos en la superficie de las células epiteliales o fuera de estas.

2.4. Resultado: Presencia de bacilos grampositivos cortos y curvos en la superficie de las células epiteliales o fuera de éstas. Presencia de leucocitos polimorfonucleares abundantes por campo.

2.5. Informe: Positivo: Bacilos grampositivos semicurvos abundantes. Leucocitos polimorfonucleares abundantes. Sugiere Mobiluncus. Negativo: No se observó Mobiluncus.

256


14.4.

Procedimientos para la identificación de Candida albicans






VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: Es una levadura oval gemante que produce seudihifas en cultivo, tejidos y exudados. El género Candida es miembro de la microbiota local de las mucosas del aparato respiratorio, digestivo y genital femenino encontrándose en este último caso en aproximadamente el 20% de las mujeres sanas. El 85-90% de éstas son Candida albicans, por lo tanto, lo que interesa demostrar es si es la causa de la infección. Para ello es básico conocer que el criterio de virulencia aceptado es la producción de seudohifas. En los frotis de exudados, Candida spp aparece como una levadura grampositiva, con gemaciones que miden 2-3 x 5-6 µm y en las cuales se observan prolongaciones ramificantes denominadas seudohifas. Cuando éstas últimas se observan, es una evidencia particular de virulencia y de la presencia de Candida albicans, por lo que no se requiere alguna prueba adicional para la caracterización de la especie.


257

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE



1.1. Equipos: 1.1.1. Microscopio


Láminas portaobjetos Colorantes de Gram Aceite de inmersión Guantes descartables no estériles

1.3. Pruebas para la identificación: 1.3.1. Gram

2. GRAM:

2.1. Fundamento: El análisis de la tinción de Gram consiste en observar la presencia o ausencia de levaduras y si éstas manifiestan la presencia de gemaciones y seudohifas. También permite determinar la presencia de leucocitos polimorfonucleares.

2.2. Procedimiento: 2.2.1. Observar al microscopio con objetivo de inmersión (100X).

2.3. Fundamento de la bacteria: En casos de vaginitis, Candida albicans suele observarse con gran cantidad como levaduras gemantes y varias de ellas con seudohifas. En casos de otras especies, lo común es la abundante cantidad de células gemantes sin seudohifas. Las seudohifas forman ramificaciones de diverso tamaño.

2.4. Resultado: Presencia de levaduras grampositivas con y sin seudohifas

2.5. Informe: Positivo: Se observaron levaduras con y sin seudohifas. Negativo: No se observaron levaduras.

258


14.5.

Procedimientos para la identificación de otras levaduras






VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: Las especies no dimórficas (no producen seudohifas en los tejidos) eventualmente logran causar enfermedad. Cuando en el Gram se observan abundantes levaduras sin seudohifas pueden deberse a especies de Candida.

VII. IDENTIFICACIÓN: 1. MEDIOS DE CULTIVO: 1.1.

Agar Sabouraud.

1.2.

CMA (Corn Meal Agar o Agar de Harina de Maíz con Teewen 80).

2. PRUEBAS PARA LA IDENTIFICACIÓN: 2.1.

Gram.

2.2.

Morfología y agrupación de las levaduras en CMA.


259

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


3. PRODUCCIÓN DE SEUDOHIFAS EN CMA:

3.1. Fundamento: El agar de harina de maíz facilita la formación de seudohifas y blastoconidias en Candida albicans o la formación de tubos germinales y agrupación de las levaduras en racimos característicos en otras especies. El tipo de estructura morfológica y su agrupación se emplean para la determinación de la especie.

3.2. Procedimiento: Cuando en las muestras teñidas con Gram se observen abundantes levaduras sin seudohifas, se procede de la siguiente manera: 3.2.1. Con un asa redonda sembrar en forma serpentiforme en el medio de Sabouraud e incubar de 24 a 48 horas a 35 oC. 3.2.2. Tomar una asada de la cepa sembrada en Sabouraud y realizar un Gram para verificar la presencia de levaduras y pureza del cultivo. Si se confirman las dos variables anteriores, sembrar una asada en el centro de un plato de CMA, dispersándola en un área aproximada de 2 cm por lado. 3.2.3. Con una pinza sin dientes, tomar un cubreobjetos y flamearlo en el mechero y luego dejarlo enfriar. 3.2.4. Colocar el cubreobjeto sobre el estriado del centro del plato de CMA, de tal manera que los lados del mismo coincidan con los del estriado. 3.2.5. Incubar el CMA durante 4 horas. 3.2.6. Terminado el período de incubación, quite la tapa del plato de Petri y observe al microscopio utilizando un objetivo de 40 X.

3.3. Resultados: La identificación de la especie de Candida se realiza comparando la morfología de las sudohifas y blastoconidias de la muestra con la morfología de diferentes especies de Candida presentadas en las fotos siguientes:

260


MANUAL

DE

a: Candida kruzei c: Candida guilliermondii e: Candida albicans

PROCEDIMIENTOS

DE


b: Candida tropicalis d: Candida lusitaniae f: Candida parapsilosis

Informe: Reportar el género y la especie identificada. Si no es posible la identificación de la levadura, reportar Candida spp.


261

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


VIII. BIBLIOGRAFÍA: 1. López SR. Reyes J. Normas Técnicas para el Estudio de Exudado Vaginal en Normas Técnicas de Bacteriología, 3ª ed. 1996, Ministerio de Salud, Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia, Managua, Nicaragua. Imprimatur. 2. Rodloff AC, Hillier SL and Moncla BJ. Peptostreptococcus, Propionibacterium, Lactobacillus, Actinomyces, and Other Non-Spore-Forming Anaerobic Gram-Positive Bacteria in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray editor in chief. Chap 47, 7th edition, ASM, Washington, 1999. 3. Funke G, Bernard K. Coryneform Gram-Positive Rods in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray editor in chief. Chap 21, 7th edition, ASM, Washington 1999. 4. Warren NG, Hazen KC. Candida, Crytococcus, and Other Yeasts of Medical Importance in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray editor in chief. Chap 95, 7th edition, ASM, Washington, 1999. 5. Visvesvara GS. Pathogenic and Opportunistic Free-Living Amebae in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray editor in chief. Chap 108, 7th edition, ASM, Washington, 1999.

262


CAPÍTULO 15.

Procedimientos para la identificación de Neisseria gonorrhoeae I. TOMA DE LA MUESTRA: 1. RECOMENDACIONES AL PACIENTE: 1.1. No debe haber recibido ningún tratamiento local o sistémico con antimicrobianos, tres días antes de la toma de la muestra. 2. TIPO DE MUESTRA:

2.1. Exudado uretral en hombres: 2.1.1. Ponerse guantes descartables estériles. 2.1.2. Indicar al paciente que se retracte el prepucio y presione suavemente el canal uretral, de atrás hacia delante, con el fin de extraer la muestra hacia el meato urinario. 2.1.3. Introducir con gentileza, en el orificio uretral, un tercio de la torunga de un hisopo estéril. 2.1.4. Inocular en agar Thayer Martin. 2.1.5. Hacer un frotis en una lámina portaobjetos.

2.2. Exudado rectal: 2.2.1. Indicar al paciente de presentarse habiendo defecado previamente. 2.2.2. Introducir el hisopo estéril 2.5 cm dentro del ano y gírelo sobre sí mismo tratando de tocar las paredes. Si el hisopo contiene material fecal, repita el procedimiento las veces que sea necesario utilizando en cada ocasión un hisopo diferente. 2.2.3. Después de unos segundos, retirar el hisopo e inocular el agar Thayer Martin.

2.3. Exudado endocervical: ver capítulo 14. 2.4. Exudado vulvar: ver capítulo 14. 2.5. Exudado uretral en mujeres: ver capítulo 14. II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: 1. De no ser incubado inmediatamente en el laboratorio de la institución, el Thayer Martin debe ser transportado en atmósfera de CO 2 utilizando una jarra con vela de parafina blanca. Capítulo 15: Procedimientos para la identificación de Neisseria gonorrhoeae

263

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: Estriar el inóculo sembrado en Thayer Martin de manera convencional e incubarlo inmediatamente en ambiente con CO2. Si no se tiene una incubadora con CO2 , se debe utilizar una jarra con una vela de parafina blanca.

IV. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: 1. TOMA DE MUESTRA:

1.1. Equipos: 1.1.1. Camilla 1.1.2. Espéculo estéril 1.1.3. Lámpara cuello de ganso

1.2. Materiales y Reactivos: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5.

Guantes Hisopos de algodón estériles Láminas portaobjeto Lápiz graso o marcador Solución de cloro al 0.5% para descarte de material contaminado

1.3. Medios de Cultivo: 1.3.1. Agar Thayer Martin


2.1. Materiales: 2.1.1. Jarra con vela de parafina blanca.

3. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:

3.1. Equipos: 3.1.1. Incubadora a 35-37oC 3.1.2. Mechero tipo Bunsen

3.2. Materiales: 3.2.1. Jarra con vela de parafina blanca (si no cuenta con incubadora de CO 2).

3.3. Reactivos: Ninguno 3.4. Medios de Cultivo: Ninguno. 264

Capítulo 15: Procedimientos para la identificación de Neisseria gonorrhoeae

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


V. ALCANCE: Laboratorios de la Red: Numerales del 1.4.1 al 1.4.5 con respecto a las pruebas de identificación. CNDR: Numerales del 1.4.1 al 1.4.5 con respecto a las pruebas de identificación.

VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: En el siglo II, Galeno denominó a esta enfermedad con las palabras griegas gonor “semilla” y rhoia “flujo”, lo que sugiere que Galeno consideraba que estaba relacionada con el flujo de semen. En el siglo XII la gonorrea fue reconocida como enfermedad de transmisión sexual. En el siglo XIX la gonorrea fue diferenciada de la sífilis. En 1879, Neisser observó por primera vez gonococos en exudados purulentos uretrales y conjuntivales y en 1885 Bumm la aisló, y luego la recuperó después de inocularla a voluntarios, probando con ello la relación causal entre el microorganismo y la enfermedad. Los miembros del género Neisseria, son microorganismos gramnegativos cocoides, que suelen estar agrupados predominantemente en pares, aunque pueden observarse cadenas cortas. Los diplococos tienen sus caras adyacentes aplanadas, lo que le confiere el aspecto de granos de café. Son inmóviles, no forman esporas y crecen en forma óptima entre 35 oC y 37 oC con atmósfera de CO 2 al 5%. N. gonorrhoeae posee proyecciones de polímeros proteínicos, llamados pili, que funcionan como factor de adherencia a las mucosas. Los pili también pueden interferir en la ingestión y destrucción del gonococo por parte de los neutrófilos. También se ha demostrado que el gonococo produce una proteasa contra la inmunoglobulina A secretora (IgA1) que degrada y consecuentemente neutraliza. En relación al cultivo, el frotis de exudado uretral de hombres tiene una sensibilidad de 90% y una especificidad de 99%. En contraste, en mujeres los frotis de exudados endocervicales tiene una sensibilidad cercana a 50% y una especificidad aproximada de 95%, siempre y cuando sean analizados por un microscopista experimentado. En medios enriquecidos como el Thayer Martin, a las 24-48 horas de incubación los gonococos forman colonias mucoides, convexas, resplandecientes, elevadas, transparentes u opacas, no pigmentadas y con un diámetro de 1 a 5 mm. N. gonorrhoeae es oxidasa y catalasa positivas. Esta última característica se utiliza como un método rápido y eficaz para la identificación presuntiva. Las especies del género Neisseria producen ácidos por la oxidación de algunos carbohidratos. Neisseria gonorrhoeae produce ácido a partir de glucosa, pero no de maltosa, sacarosa ni lactosa.


1.1. Equipos: 1.1.1. Mechero tipo Bunsen 1.1.2. Incubadora 1.1.3. Microscopio con objetivo de inmersión y ocular de 10X Capítulo 15: Procedimientos para la identificación de Neisseria gonorrhoeae

265

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


1.2. Materiales y Reactivos: 1.2.1.

Asas bacteriológicas con punta recta y redonda

1.2.2.

Gradilla

1.2.3.

Guantes descartables no estériles

1.2.4.

Laminas portaobjetos

1.2.5.

Palillos de madera

1.2.6.

Colorantes de Gram

1.2.7.

Aceite de inmersión

1.2.8.

Peroxido de hidrógeno al 3%

1.2.9.

Tiras de oxidasa

1.2.10. Base para los azúcares: Cisteína Triptona Agar (CTA). 1.2.11. Discos con glucosa, maltosa, sacarosa y lactosa.

1.3. Medios de cultivo: 1.3.1. Agar Chocolate.

1.4. Pruebas para identificación: 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3. 1.4.4. 1.4.5.

Observación macroscópica de la morfología de las colonias. Gram. Oxidasa. Catalasa. Producción de ácidos a partir de glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa.

1.5. Cepas para control de calidad: 1.5.1. 1.5.1.1. 1.5.1.2. 1.5.1.3. 1.5.1.4. 1.5.1.5. 1.5.2. 1.5.2.1.

Sensibilidad a los antimicrobianos Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 Antimicrobianos a utilizar por el método de Kirby y Bauer: Ver capítulo 16. Pruebas especiales: Betalactamasa por el método de nitrocefina.

2. CARACTERÍSTICAS DE LAS UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC) EN EL AGAR THAYER MARTIN: Colonias mucoides, convexas, resplandecientes y elevadas, transparentes u opacas, no pigmentadas, con un diámetro de 1 a 5 mm.

266


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


3. GRAM:

3.1. Fundamento: ver capítulo 3. 3.2. Procedimiento: ver capítulo 3. 3.3. Fundamentos morfológicos de la bacteria: Neisseria gonorrhoeae se observa como un diplococo gramnegativo intra y extracelular. En los casos de uretritis crónica es común observar las formas extracelulares.

3.4. Resultado: 3.4.1. Frotis directo: Diplococos gramnegativos arriñonados intra o extracelulares en polimorfonucleares. 3.4.2. Frotis del Agar Thayer Martin: Diplococos gramnegativos arriñonados. Cocos sueltos y cadenas cortas.

3.5. Control de calidad para la tinción de Gram: 3.5.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Bacilos gramnegativos: se observan de color rojo o rosado intenso. 3.5.2. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Cocos grampositivos: se observan de color azul a púrpura.

4. OXIDASA:

4.1. Fundamento: ver capítulo 17. 4.2. Procedimiento: ver capítulo 17. 4.3. Fundamento bioquímico de la bacteria: N. gonorrhoeae posee la enzima citocromo oxidasa. Lo cual se manifiesta por el aparecimiento de un color púrpura en la tira reactiva.

4.4. Resultado: Oxidasa positiva: Hay viraje de color al púrpura en el inóculo puesto en la tira reactiva. El viraje aparece en los primeros 30 segundos.

4.5. Control de calidad para la prueba de oxidasa: 4.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Oxidasa positiva. Se observa un viraje de color al púrpura intenso en el inóculo puesto en la tira reactiva. 4.5.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Oxidasa negativa. No hay viraje de color. Se observa un color amarillo pálido en el inóculo puesto en la tira reactiva. Capítulo 15: Procedimientos para la identificación de Neisseria gonorrhoeae

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


5. CATALASA:

5.1. Fundamento de la prueba: ver capítulo 17. 5.2. Pr ocedimient o: ver capítulo 17. 5.3. Fundamentos de la bacteria: Neisseria gonorrhoeae posee la enzima catalasa, por lo tanto descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en oxígeno y agua. La liberación del oxígeno se puede observar a simple vista por la formación rápida e intensa de burbujas.

5.4. Resultado: Catalasa positiva: producción vigorosa e inmediata de burbujas.

5.5. Control de calidad: 5.5.1. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Presencia de la enzima catalasa. Producción inmediata e intensa de burbujas. 5.5.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Ausencia de la enzima catalasa. No hay producción de burbujas.

6. PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS A PARTIR DE GLUCOSA, MALTOSA, SACAROSA Y LACTOSA:

6.1. Fundamentos de las pruebas: Tradicionalmente la producción de ácido de carbohidratos ha sido determinada usando la base de Cistina Tripticasa Agar (CTA) con los carbohidratos en una proporción al 1%. Esta base sirve más para detectar cambios de acidez producida por microorganismos fermentativos y es relativamente insensible para detectar ácidos producidos por las especies oxidativas de Neisseria. El azúcar por esta vía es convertido en productos intermedios como el ácido pirúvico. Al carecer de las enzimas deshidrogenasas, las bacterias oxidativas transfieren iones de hidrógenos disponibles del ácido pirúvico al ciclo de Krebs, los que se unen con el oxígeno para formar agua. El ácido pirúvico es transformado en ácido láctico y otros ácidos mixtos. Estos ácidos que se producen en esta vía son extremadamente débiles, por lo que la visualización de la conversión del pH en el medio es igualmente débil. Con la base CTA se requiere un fuerte inóculo y un tiempo de incubación de 48 horas para observar los cambios oxidativos de los carbohidratos.

6.2. Procedimiento: 6.2.1. Marce 4 tubos de CTA con las iniciales G (glucosa), M (maltosa), S (sacarosa) y L (lactosa). 6.2.2. De un cultivo de 24 horas y empleando un asa redonda, tome varias UFC, de tal manera que quede bien cargada. 268


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


6.2.3. Introduzca varias veces el asa en el tubo de CTA, de tal manera que el inóculo quede esparcido ampliamente. 6.2.4. Repita el procedimiento anterior en los restantes 3 tubos de CTA. 6.2.5. Introduzca un disco de glucosa en el primer tubo y repita el procedimiento en los restantes 3 tubos con discos de maltosa, sacarosa y lactosa. 6.2.6. Cierre herméticamente con tapones de rosca e incube entre 35 o - 37oC en aerobiosis durante 18-24 horas.

6.3. Fundamentos bioquímicos de la bacteria: Las pruebas de oxidación de azúcares son pruebas confirmativas y son necesarias para distinguir entre varias especies del género Neisseria. Las especies de Neisseria se pueden diferenciar entre si por los patrones de acidificación de 4 azúcares: Glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa. Neisseria gonorrhoeae oxida la glucosa pero no la maltosa, lactosa ni sacarosa. La oxidación se detecta en el tubo de CTA por un viraje de color del rosado al amarillo, visible en la parte más superficial del tubo.

6.4. Resultados: Oxidación de la glucosa positiva: Viraje de color del rosado al amarillo en el sitio de inserción del disco. Oxidación de la maltosa, sacarosa y lactosa negativa: No hay viraje de color en los tubos conteniendo los discos de esos azúcares. El medio queda de color rosado pálido.

6.5. Control de calidad: 6.2.1. Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 Resultado: Oxidación de la glucosa positiva. Viraje de color del rosado al amarillo en el tubo que contiene el disco de glucosa. No hay viraje de color en los tubos conteniendo los discos de maltosa, sacarosa y lactosa.


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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


ESQUEMA DE IDENTIFICACIÓN MUESTRA

FROTIS

CULTIVO

GRAM

GRAM

DIPLOCOCOS GRAMNEGATIVOS ARRIÑONADOS INTRA O EXTRACELULARES

DIPLOCOCOS GRAMNEGATIVOS ARRIÑONADOS

BETALACTAMASA

REAISLAMIENTO EN AGAR CHOCOLATE

OXIDASA POSITIVA

OXIDACIÓN DE AZUCARES EN CTA

ANTIBIOGRAMA

GLUCOSA

MALTOSA

SACAROSA

LACTOSA

AMARILLO

ROSADO INTENSO

ROSADO INTENSO

ROSADO INTENSO

Neisseria gonorrhoeae

VII. INFORME DE RESULTADOS: 1. Frotis directo: Positivo: Se observaron diplococos gramnegativos extra celulares. Se observaron diplococos gramnegativos intra y extra celulares. Negativo: No se observan diplococos gramnegativos. 2. Cultivo: Positivo: Se aisló Neisseria gonorrhoeae Negativo: No se aisló Neisseria gonorrhoeae. 3. Sensibilidad: Reportar la interpretación de los halos de inhibición con sus diámetros en milímetros. 4. Betalactamasa: Betalactamasa positiva. Betalactamasa negativa. 270


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PROCEDIMIENTOS

DE

DE


VIII. BIBLIOGRAFIA: 1. Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis en Diagnóstico microbiológico. Elmer W. Koneman, editor, capítulo 10, 5ª edición 1996, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 2. López SR, Reyes CJ, González MA, Centeno R: Normas Técnicas para el Neisseria gonorrhoeae en Normas Técnicas de Bacteriología, capítulo VII, 3ª ed. 1996, DANIDA/MINSA, Editorial Imprimatur, Managua, Nicaragua. 3. Neisserias en Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks, editor, capítulo 21, 16ª edición (de la 21 a edición en inglés) 1998, Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V. México D.F.


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CAPÍTULO 16.

Susceptibilidad antimicrobiana: Procedimientos para la sensibilidad por el método de difusión en Agar I. ALCANCE: Todos los laboratorios de la Red.

II. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: Hacia 1950, se empleaba una amplia variedad de métodos que diferían de laboratorio a laboratorio, ya que no existía un procedimiento estándar aceptable. Por tal razón, la OMS formó un comité para investigar el problema, el cual proporcionó las bases que condujeron al desarrollo de métodos estandarizados. En los Estados Unidos el método estándar usado se basa en los estudios de Kirby y Bauer, método que después sería el más usado en el mundo por ser barato, fácil de realizar y dar la posibilidad de evaluar varios antimicrobianos al mismo tiempo. La prueba de sensibilidad por difusión con discos o método de Kirby-Bauer consiste en colocar discos de papel impregnados de antibióticos en la superficie de un agar previamente inoculado con una suspensión bacteriana de concentración conocida. La concentración del antibiótico disminuye a medida que se incrementa la distancia desde el disco. Se produce simultáneamente la difusión de antibiótico y el crecimiento bacteriano en la superficie del agar. Cuando se alcanza la masa celular crítica de bacterias, después de 4 ó 10 horas, aparece el crecimiento bacteriano. En el área donde la concentración de antibiótico es suficiente para evitar el crecimiento bacteriano se observa un halo de inhibición con borde definido claramente y con el disco ubicado en el centro del círculo. En el borde de este halo la concentración del antibiótico, conocida también como concentración crítica, se aproxima a la CIM (Concentración Inhibitoria Mínima o MIC por sus siglas en inglés) obtenida en las pruebas de dilución.

1. INDICACIONES: 1.1. Bacterias no fastidiosas de rápido desarrollo de 16-18 horas de incubación. 1.2. Bacterias no fastidiosas si: 1.2.1. Se usa el medio de cultivo adecuado y además se suplementa según las exigencias del microorganismo. 1.2.2. Se modifican los tiempos y la atmósfera de incubación según las exigencias del microorganismo. 1.2.3. Se cuenta con los medios de interpretación adecuados. Capítulo 16: Susceptibilidad antimicrobiana

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


2. LIMITACIONES DE LA PRUEBA: 2.1. La prueba sólo deberá aplicarse a especies bacterianas cuidadosamente evaluadas. 2.2. No realizar la prueba a aquellas bacterias que crecen con lentitud. 2.3. No realizar la prueba a aquellas bacterias que necesitan condiciones anaerobias para su desarrollo. La lista de bacterias a las cuales se les puede realizar la sensibilidad por difusión en agar, según NCCLS 2004 son: 2.3.1. Todos los géneros y especies de las enterobacterias. 2.3.2. Bacilos gramnegativos no fermentadores: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp, Stenotrophomonas maltophilia y Burkholderia cepacia. 2.3.3. Haemophilus spp 2.3.4. Streptococcus pneumoniae (excepto penicilina) 2.3.5. Staphylococcus spp 2.3.6. Streptococcus spp 2.3.7. Enterococcus spp 2.3.8. Neisseria gonorrhoeae 2.3.9. Vibrio cholerae La sensibilidad antimicrobiana de cualquier otra bacteria aerobia o anaerobia facultativa que no sea de la lista anterior debe realizarse por CIM o Epsilon Test (E Test). Para la realización de esta prueba se deben tomar en cuenta algunas características del medio de cultivo que pueden alterar la susceptibilidad, como el grosor de la placa de agar, el pH, la concentración de cationes bivalentes (Ca y Mg ) y las concentraciones de Timina y Timidina. Existen otros factores a tomar en cuenta como la temperatura, tiempo de incubación, la atmósfera y la adición al agar de nutrientes especiales, sin embargo, estos factores dependen del microorganismo a evaluar.

III. EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS: 1. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS, MEDIOS DE CULTIVO:

1.1. Equipos: 1.1.1. Espectrofotómetro. 1.1.2. Incubadora calibrada a 35oC.

1.2. Materiales y Reactivos: 1.2.1. Tubos de ensayo del mismo diámetro que el que contiene el estándar de McFarland. 1.2.2. Estándar 0.5 de McFarland. 1.2.3. Asas bacteriológicas con punta recta. 1.2.4. Mechero tipo Bunsen. 274

Capítulo 16: Susceptibilidad antimicrobiana

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1.2.5. 1.2.6. 1.2.7. 1.2.8. 1.2.9. 1.2.10. 1.2.11. 1.2.12. 1.2.13. 1.2.14.

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Gradilla Hisopos Pinza recta sin dientes Solución salina al 0.85% estéril. Aislamiento bacteriano en fase logarítmica (crecimiento de 24 horas). Discos de antimicrobianos. Alcohol de 70 o para esterilización de pinzas. Cepas de referencia para control de calidad Regla milimetrada o calíper-vernier para la medición de los diámetros de los halos de inhibición. Normas NCCLS actualizadas* para interpretación de resultados.

*Solicitar versión actualizada al Departamento de Bacteriología del CNDR.

1.3. Medios de cultivo: 1.3.1. Agar Mueller Hinton: Enterobacterias, Staphylococcus spp , Bacilos no fermentadores, Vibrio cholerae y Enterococcus spp. 1.3.2. Agar Mueller Hinton más 5% de sangre de carnero: Streptococcus spp excepto Streptococcus viridans. 1.3.3. Agar HTM (Haemophilus Test Medium): Haemophilus influenzae. 1.3.4. Agar Chocolate: Neisseria gonorrhoeae.

1.4. Cepas para control de calidad: 1.4.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 1.4.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212

IV. FACTORES QUE AFECTAN EL DIÁMETRO DEL HALO DE INHIBICIÓN: 2. PROFUNDIDAD DEL AGAR:

2.1. Principios y fundamentos: La medición de la profundidad del agar debe realizarse con cada nueva preparación de Mueller Hinton y debe ser de 4mm. Este grosor se logra agregando 25 mL de agar por cada plato de 100mm de diámetro. Cuando se tengan lotes de platos de petri mayores de este diámetro se debe agregar mayor cantidad de agar de tal manera que la profundidad del agar sea siempre de 4mm. Para medir la profundidad del agar utilice un “calíper” (“pie de rey”, denominación con las que se obtiene en las ferreterías de Nicaragua). Otro factor que puede alterar la profundidad del agar es la superficie de la mesa de trabajo. Si ésta tiene alguna inclinación, los platos con el agar tendrán profundidades distintas en el centro y en los bordes. Para verificar esta variable utilice un nivel (de los utilizados en albañilería). Por otro lado, algunas marcas de platos petri de vidrio no tienen una base plana. Tenga el cuidado de no utilizar este tipo de plato para el agar de Mueller Hinton, ya que usualmente la profundidad en el centro es menor que en las orillas. Capítulo 16: Susceptibilidad antimicrobiana

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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


2.2. Procedimiento: Hay varias formas de medir la profundidad del agar. La más exacta y fácil es introducir la parte saliente de un calíper en el centro del plato: 2.2.1. Coloque el medidor de mm en la cuarta raya, la cual se corresponde con 4mm. En este momento, en el extremo contrario sale una parte del medidor que se corresponde con un largo de 4mm. 2.2.2. Introduzca la parte saliente del medidor en el centro del plato con el agar. 2.2.3. Cuando la profundidad del agar es de 4mm, la base del calíper toca paralelamente toda la superficie. Si dicha base se hunde en el agar, significa que la profundidad es mayor de 4mm. Por el contrario, si hay espacio entre la base del calíper y la superficie del agar, indica que la profundidad es menor de 4mm. Cuando no se cuente con un calíper puede medirse cortando en el centro un cuadro de agar de un centímetro por lado aproximadamente. Luego se extrae dicha parte y se mide el grosor con una regla milimetrada. Otra opción es introducir la punta de una pipeta de Pasteur en el centro del medio y luego retirarla, procurando que en la punta de la pipeta se haya extraído una porción del agar, luego, medir el trozo de agar que ha quedado en el interior.

3. pH DEL AGAR:

3.1. Principios y fundamentos: El pH del medio de cultivo para realizar el antibiograma debe de estar entre 7.2 y 7.4. El diámetro de los halos de inhibición se ve afectado por el pH según la naturaleza de los distintos antimicrobianos: pH mayor de 7,4 (alcalino) suelen dar halos mayores (falsa sensibilidad) para: macrólidos (ERY), aminoglucósidos (GEN, AMK) y quinolonas (CIP, OFX, NOR). Con pH ácido: pasa lo contrario. pH menor de 7, (ácido) suelen dar halos mayores (falsa sensibilidad) para: tetraciclinas (TCY), betalactámicos (AMP, AMX) y nitrofuranos (NIT). Con pH alcalino: pasa lo contrario.

3.2. Procedimiento: 3.2.1. Medir el pH del medio después de haber sido esterilizado y antes de ser vaciado en los platos. Ajustar la temperatura del medio, según la que tenga el Baño de María donde previamente mantuvo el medio. Para ajustar el pH del medio, usar NaOH al 0.1N y HCl al 0.1N. 3.2.2. Realice la medición del pH del agar en cada nueva preparación de Mueller Hinton.

4. CONCENTRACIÓN DE CATIONES BIVALENTES (Ca Y Mg ):

4.1. Principios y fundamentos: Las concentraciones de estos cationes en el agar Mueller Hinton deben ser: para Ca de 20 a 25 mg/ L y para Mg de 10 a 12.5 mg /L. Esta concentración de cationes en el medio se evalúa utilizando la cepa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


La concentración de cationes es crucial para el tamaño de los halos de inhibición antimicrobiana. Concentraciones mayores a las descritas de los cationes Ca y Mg suelen dar halos menores para tetraciclinas y aminoglucósidos, por lo que los resultados pueden asociarse a falsa resistencia. Concentraciones menores a las descritas, suelen dar halos mayores para tetraciclinas y aminoglucósidos, por lo que los resultados pueden asociarse a falsa sensibilidad. La determinación de cationes se debe hacer únicamente al abrir un nuevo frasco de Mueller Hinton. Si la prueba indica que los niveles de cationes son mayores o menores a lo esperado, el frasco debe eliminarse y abrir otro. Cuando tenga duda de los resultados, solicite al CNDR que los confirme.

4.2. Procedimiento: 4.2.1. Utilice la cepa ATCC 27853. Prepare su siembra, incubación y lectura según se describe en el apartado V (procedimiento). 4.2.2. Colocar en el centro del plato un disco de gentamicina de 10 µg.

4.3. Interpretación: 4.3.1. El halo de inhibición debe medir entre 16 y 21 mm de diámetro.

5. CONCENTRACIÓN DE TIMINA Y TIMIDINA:

5.1. Principios y fundamentos: En algunos lotes de medio se encuentran grandes cantidades de estas sustancias y algunos microorganismos pueden utilizarlas para evitar el mecanismo de acción del trimetoprim y desarrollarse, aun cuando sean intrínsicamente sensibles. Este mecanismo afecta especialmente a los enterococos. Es por eso que para evaluar la concentración de timina y timidina en el Mueller Hinton se utiliza la cepa de Enterococcus faecalis ATCC 29212. Las concentraciones de timina y timidina afectan específicamente los halos de inhibición del trimetoprim-sulfametoxazol, por lo que la prueba se limita a la evaluación de este antimicrobiano. Los halos menores de 20 mm representan una alta concentración de timina y timidina lo que implica una falsa resistencia al SXT. Realice la medición de la concentración de timina y timidina a cada lote nuevo de agar Mueller Hinton.

5.2. Procedimiento: 5.2.1. Utilice la cepa ATCC 29212. Prepare su siembra, incubación y lectura según se describe en el apartado V (procedimiento). 5.2.2. Colocar en el centro del plato un disco de sulfametoxazol/trimetoprim de 23.75/1.25µg

5.3. Interpretación: 5.3.1. El halo de inhibición debe medir más de 20 mm de diámetro.


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V.

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


PROCEDIMIENTO:

1. PREPARACIÓN DEL INÓCULO: 1.1. Con un asa recta tomar una UFC del TSA. 1.2. Hacer una suspensión homogénea en un tubo de ensayo conteniendo 3 mL de solución salina estéril al 0.85%. (Utilizar un agitador de tubos si lo considera necesario). 1.3.

Ajustar la turbidez del inóculo a la del estándar 0.5 de McFarland comparándolo visualmente. Para ello, se debe colocar la cepa problema en una gradilla y a la par el estándar de McFarland. Esta gradilla debe tener en la parte posterior una tira de papel blanco con una o dos líneas negras de 0.5 a 1 cm de ancho, la cual actúa como contraste para comparar la turbidez de los tubos. Si la turbidez del inóculo es menor, se agrega más inóculo. Si la turbidez es mayor, se debe diluir con solución salina.

Para el inóculo tome en cuenta lo siguiente: l

l

Los tubos para preparar el inóculo deben ser del mismo diámetro que el que contiene el patrón de McFarland. El patrón de turbidez deberá mantenerse sellado a temperatura ambiente y en la oscuridad.

2. INOCULACIÓN EN EL MUELLER HINTON Y COLOCACIÓN DE DISCOS DE ANTIMICROBIANOS: 2.1. Introducir un hisopo estéril en la suspensión, luego presionarlo contra las paredes del tubo, con el fin de escurrir el exceso de inóculo. 2.2.

Estriar en tres direcciones, de tal manera que se cubra de manera uniforme toda la superficie del medio.

2.3.

Dejar secar la placa por un período de 3 a 5 minutos. Nunca dejar secar la placa por más de 15 minutos antes de aplicar los discos de sensibilidad.

2.4.

Colocar los discos utilizando una pinza sin dientes. Inmediatamente ejerza una ligera presión sobre el centro del disco. También se pueden utilizar aplicadores de multidiscos.

Para el medio de cultivo tome en cuenta lo siguiente: l

l

El medio de cultivo que empleará para realizar el antibiograma debe conservarse en refrigeración de 4-8oC. Para realizar el antibiograma debe emplearse a temperatura ambiente. A la hora de ser inoculada, la superficie del agar debe tener la humedad adecuada, sin gotas de condensación, ya que estas absorberían parte del antimicrobiano inmediatamente que los discos sean colocados.

Para la colocación de los discos tome en cuenta lo siguiente: l l

El retardo en la colocación de los discos (más de 15 minutos) induce halos más pequeños. No se deben mover los discos una vez que han hecho contacto con el agar. Los antimicrobianos se difunden inmediatamente.

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Para los discos de sensibilidad tome en cuenta lo siguiente: l

Los discos que contienen drogas de la familia de los betalactámicos deben mantenerse en freezer a temperaturas menores a –20 oC.

l

Los de uso diario deben mantenerse a temperaturas entre 4o - 8oC.

l

Deben estar envueltos en paquetes herméticos, con desecante, para protegerlos de la humedad.

l

Verificar la fecha de vencimiento antes de utilizarlos.

l

Se deben sacar del refrigerador una 1 a 2 horas antes de su empleo, para que estén a temperatura ambiente al momento de usarlos.

3. CONDICIONES DE INCUBACIÓN: 3.1. Incubar las placas en forma invertida dentro de los 15 minutos posteriores a la aplicación de los discos. 3.2.

Las condiciones y tiempos de incubación están en dependencia del microorganismo evaluado.

Para la incubación tome en cuenta lo siguiente: l

Atender las temperaturas recomendadas en NCCLS. Menor temperatura: Pobre crecimiento de la bacteria (halos más grandes). Mayor temperatura: dependiendo de ésta podemos ocasionar la muerte de la bacteria o inhibir su crecimiento (halos más grandes). Tiempo de incubación mayor o menor que el recomendado por la técnica. A menor tiempo de incubación, menor desarrollo bacteriano (halos más grandes). Mayores tiempos de incubación: halos más pequeños.

Temperatura, tiempo de incubación y atmósfera requerida para realizar la sensibilidad por el método de difusión en agar: Microorganismo

Temperatura de incubación

Tiempos de incubación

Atmósfera Aire ambiental Aire ambiental 5% CO2 Aire ambiental

Enterobacterias Bacilos no fermentadores Streptococcus spp Enterococcus spp

350C 350C 350C 350C

16-18 16-18 20-24 16-18

Streptococcus pneumoniae Staphylococcus spp

350C 350C

20-24 16-18

Haemophilus influenzae Neisseria gonorrhoeae Vibrio cholerae Stenotrophomonas maltophilia Burdcolderia cepacia

350C 350C 350C 350C 350C

16-18 20-24 16-18 20-24 20-24

horas horas horas horas (a) horas horas (a) horas horas horas horas horas

5% CO2 Aire ambiental 5% CO2 5% CO2 Aire ambiental Aire ambiental Aire ambiental


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MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


4. LECTURA DEL HALO DE INHIBICIÓN:

Previo a la medición tome en cuenta que: l

Utilizar un fondo antirreflejo y oscuro La luz debe incidir de forma directa desde arriba

l

Posición del plato de Mueller Hinton: Invertido.

l

l

Posición del plato con suplemento con sangre: Sin la tapa, directamente de la superficie del agar. Discriminar bien la zona de hemólisis.

Medición: l

l

l l

l

Medir con regla milimetrada o con un calíper. Al medir el halo tome en cuenta que ya sea con regla o con calíper, el diámetro tomado debe pasar por el centro del disco. Puede haber superposición de la zona de inhibición (ZI) por halos grandes cuando se colocan más discos de los recomendados (5 a 7 discos por placas de 100 mm). En caso de bacterias fastidiosas es recomendable poner menos discos que en el antibiograma estándar. Con los discos de sulfametoxazol-trimetoprim (SXT) tome en cuenta que las bacterias sensibles pueden crecer en la ZI. Debido a su acción bacteriostática, el SXT requiere varias generaciones para inhibir completamente a las bacterias. Acción: medir el halo más evidente a simple vista. Staphylococcus y Enterococcus con oxacilina (OXA) y vancomicina (VAN): l

l

l l l l

No se deben de leer antes de 24 horas. Utilice luz transmitida (luz lateral) l

¡Cualquier UFC intra ZI indica resistencia!

En caso de Proteus puede haber crecimiento de velo en la ZI. Acción: ignorar la invasión. Medir el halo evidente a simple vista.

Cuando se logra ver más de un halo, ¿cuál es el borde que se mide?: l

“el punto final deberá tener en cuenta el área que no tiene desarrollo evidente (obvio) a simple vista”.

l

Los tamaños de las zonas de inhibición serán interpretadas con las tablas de las normas NCCLS.

VI. INFORME: Reportar los resultados utilizando el programa WHONET. El resultado debe contener: 1.

Nombres y apellido del paciente.

2.

Edad

3.

Sexo

4.

Sala del paciente o en su defecto la procedencia de la muestra (reportar si es un paciente ambulatorio o hospitalizado).

5.

Número de la muestra.

280


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


6.

Fecha de recepción de la muestra.

7.

Tipo de muestra.

8.

Género y especie de la bacteria aislada (Reportar solamente el género en caso de no tener la posibilidad de identificar la especie).

9.

Pruebas especiales de sensibilidad: 9.1. Betalactamasa para microorganismos fastidiosos. 9.2. CAT (Cloralfenicol Acetil Transferasa) para Haemophilus spp. 9.3. Betalactamasas de Espectro Extendido (BLEE): reportar BLEE si fue confirmada con doble o triple disco (ver capítulo de betalactamasas).

10. Resultados de la sensibilidad antimicrobiana (reportar la interpretación de los resultados en Sensible, Intermedio o Resistente de cada antimicrobiano y la medida en milímetros de los halos de inhibición). 11. Comentarios y datos adicionales. 11.1. Resultado de la tinción de Gram. 11.2. En caso de urocultivo reportar el recuento de colonias. 12. Cualquier otra variable que, en conjunto con el Comité de Infecciones Intrahospitalarias o el epidemiólogo del hospital se determine que es importante para la vigilancia. 13. Firma del técnico que realizó el análisis. 14. Sello de la institución.

VII.

CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD POR DIFUSIÓN CON DISCOS O MÉTODO DE KIRBY-BAUER:

1. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: Para este propósito se deben utilizar las cepas de referencia: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Staphylococcus aureus ATCC 25923. Los objetivos de este control de calidad son, mantener la vigilancia de la precisión y exactitud de los procedimientos para la evaluación del antibiograma, controlar el comportamiento y la calidad de los reactivos usados y evaluar el desempeño técnico de quienes realizan las pruebas y leen los resultados. El control de calidad con las cepas de referencia se debe realizar semanalmente en el CNDR y cada dos semanas en los laboratorios de hospitales, laboratorios regionales, y cada vez que se vaya a utilizar un lote nuevo de Mueller Hinton o de discos de sensibilidad.

2. PROCEDIMIENTO: 2.1.

Al inicio de la semana, incluir las cepas ATCC como una muestra más de la rutina. Utilizar los medios de cultivo y bioquímica que se emplean para los aislamientos de rutina así como el resto de pruebas diagnósticas.


281

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2.2.

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Realice la prueba de sensibilidad por difusión con discos o método de Kirby-Bauer a las cepas ATCC utilizando los mismos discos de sensibilidad que se emplean en la rutina y que hayan sido elegidos previamente según las normas NCCLS.

2.2.1. Escherichia coli ATCC 25922: AMP, AMC, SXT, CHL, AMK, CEC, CRO, CTX, CIP, NIT. 2.2.2. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853: GEN, CAZ, FEP, IPM, MEM, PIP, TZP. 2.2.3. Staphylococcus aureus ATCC 25923: PEN, OXA, VAN, ERY, CLI. 2.2.4 Escherichia coli ATCC 35218*: AMC, SAM, TZP. * Para control de los inhibidores de betalactamasas. 2.3.

Se espera que la medición de los halos en mm para estas cepas, estén dentro de los puntos de corte que se indican en las normas NCCLS.

2.4.

Todos los laboratorios de la Red deben tener las tablas y gráficos que se han elaborado para anotar los resultados obtenidos de los controles. Los resultados que hay que anotar son los resultados de la medición de los halos de inhibición para cada antimicrobiano y cada cepa realizados quincenalmente, así como los datos colectados sobre las variables a controlar del Mueller Hinton (si este fuera el medio a utilizar) y los discos de sensibilidad. Los datos anotados con respecto a los halos de inhibición generan automáticamente las gráficas que facilitan la visión de los resultados obtenidos en el tiempo.

3. TOMAR MEDIDAS CORRECTIVAS EN LOS SIGUIENTES CASOS: 3.1.

Cuando se detecten resultados fuera de rango causado por errores obvios como el uso de cepa ATCC equivocada, contaminación de la cepa o el medio, condiciones de incubación incorrecta:

3.1.1. Documentar la razón y evaluar nuevamente la cepa el mismo día que se encontró el error. 3.2.

Cuando se detecten resultados fuera de los rangos aceptables no causados por error obvio:

3.2.1. Repetir el procedimiento por cinco días consecutivos desde el día que se detecta el error. 3.2.2. Si las cinco medidas están dentro de los rangos normales no se necesita ninguna acción correctiva. Si alguna permanece fuera de rangos normales, se requiere una acción correctiva adicional. 3.2.3. Revisar la fecha de caducidad y condiciones de almacenamiento de los medios de cultivo, discos de sensibilidad y escala de McFarland utilizadas en la realización del antibiograma. 3.2.4. Evaluar si los pasos para la realización del antibiograma fueron correctamente realizados. 3.2.5. Revisar la calibración de la temperatura y atmósfera de incubadoras utilizadas para incubar los antibiogramas. 3.2.6. Revisar la calibración de refrigeradoras utilizadas para el almacenamiento de los discos. 3.2.7. Realizar control a la cepa de referencia para evaluar si está contaminada o ha cambiado.

282


16.1.

Detección de betalactamasas en Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus spp y Enterococcus spp. Método cromogénico

I. ALCANCE: Todos los Laboratorios de la Red y CNDR: aplican todos los incisos. Los antibióticos betalactámicos actúan sobre la pared celular bacteriana bloqueando su síntesis por lo que se obtiene un efecto bacteriostático y luego bactericida. Su excelente efecto antimicrobiano se ve limitado por la existencia de betalactamasas producidas por una gran variedad de microorganismos. Estas enzimas rompen eficientemente el anillo beta lactámico con la producción de ácido penicilinóico. La resistencia a los beta lactámicos puede estar codificada genéticamente en el cromosoma bacteriano o bien por plásmidos. En este caso, ocurre la transferencia de la resistencia entre bacterias de la misma especie y aún entre bacterias de diferentes géneros y especies. Una determinación positiva de betalactamasas predice: a. Resistencia a penicilina; ampicilina y amoxicilina para Haemophilus spp, N. gonorrhoeae, M. catarrhalis. b. Resistencia a penicilina, acilamino, carboxi y ureidopenicilinas para Staphylococcus spp. y Enterococcus spp. Hay varias pruebas para demostrar la producción de betalactamasas, la mayoría se basan en la determinación de la producción de ácido penicilinóico: a. Método acidométrico: denota un cambio de pH que se visualiza por un cambio de color del indicador rojo de fenol. b. Método iodométrico: se basa en que el ácido penicilinóico producido por la acción de la enzima betalactamasa sobre el anillo beta lactámico de la penicilina reduce el yodo a yoduro, decolorando la mezcla del almidón-yodo empleada para visualizar la reacción. c. Método cromogénico: se basa en el cambio de color amarillo a rosado de una cefalosporina cromogénica (nitrocefina), cuando la fracción amida del compuesto unida al anillo betalactámico es hidrolizada por la betalactamasa. Una determinación negativa de betalactamasas no descarta resistencia debido a que existen otros mecanismos. No corresponde realizar la determinación de betalactamasas en Enterobacteriaceae,


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PROCEDIMIENTOS

DE


Pseudomonas spp. y otros bacilos gramnegativos aeróbicos por los métodos descritos anteriormente debido a que estos resultados no pueden predecir la susceptibilidad a los diferentes betalactámicos.

1. EQUIPO, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:

1.1. Equipos: 1.1.1. Mechero tipo Bunsen 1.1.2. Reloj de mesa

1.2. Materiales y Reactivos: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4.

Contenedores con cloro al 0.5%. Palillos de madera estériles. Slide (portaobjetos desechable) comercial impregnado con nitrocefina. Agua destilada.

1.3. Cepas para control de calidad: 1.3.1. Staphylococcus aureus ATCC 25923 1.3.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

2. PROCEDIMIENTO: 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 2.6. 2.7.

Abra la bolsa que contiene las láminas con nitrocefina, éstas generalmente están compuestas de cuatro cuadrantes. Rotule 3 de los cuadrantes de la siguiente manera: P (paciente), C+ (control positivo), C - (control negativo). Humedezca uno de los cuadrantes con una gota de agua destilada. Utilice los otros cuadrantes para los controles positivo y negativo. Con un palillo de madera estéril seleccione varias UFCs aisladas o una banda de crecimiento confluente del cultivo puro de la cepa en estudio. Extienda la muestra sobre la zona de reacción humedecida de la lámina. Deseche el palillo de madera en el contenedor con cloro al 5%. Proceda de igual manera con las cepas control en los otros cuadrantes. Examine la zona de reacción para detectar un cambio de color.

3. RESULTADOS: 3.1.

Betalactamasa positiva: En 5 a 60 segundos, el inóculo de la cepa en estudio vira al color rosado.

3.2.

Betalactamasa negativa: No se observa cambio de color en la zona del inóculo de la cepa en estudio.

284


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


4. CONTROL DE CALIDAD: 4.1. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Resultado: Betalactamasa positiva. Se observa viraje a color rosado en los primeros 60 segundos. 4.2. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Betalactamasa negativa. No hay viraje de color en los primeros 60 segundos.

5. INFORME: El programa WHONET incluye la posibilidad de informar la presencia de betalactamasas. 5.1.

Beta lactamasa positiva

5.2.

Beta lactamasa negativa


285

16.2. Métodos para la detección de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) en bacilos gramnegativos

I. ALCANCE: Todos los Laboratorios de la Red y CNDR: aplican todos los incisos. Las infecciones intrahospitalarias asociadas a bacilos gramnegativos productores de β lactamasas de Espectro Extendido (BLEE) constituyen un serio problema en el manejo terapéutico de los afectados por su elevada mortalidad y altos costos. La detección de brotes asociados a bacilos gramnegativos productores de BLEE se reportan cada vez con mayor frecuencia, variando entre países o áreas geográficas el tipo de enzimas según el género y especie de microorganismos causales. El problema es mayor debido a que los megaplásmidos que contienen los genes que codifican estas enzimas suelen acompañarse de otros que codifican resistencia a otros antimicrobianos no β-lactámicos como aminoglucósidos y quinolonas. Hasta hace poco, los β-lactámicos resistentes a la hidrólisis de BLEE tales como los carbapenems eran una alternativa para el tratamiento, sin embargo, el aparecimiento de enzimas que los hidrolizan dejan muy pocas alternativas para el tratamiento de los afectados. Por esta razón su detección en el laboratorio de bacteriología debe ser un procedimiento de rutina, sobre todo en aquellos géneros bacterianos que son causa frecuente de infecciones nosocomiales.

1. FUNDAMENTOS FISIOLÓGICOS DE LAS BACTERIAS: Las BLEE son enzimas que son sintetizadas por los bacilos gramnegativos (enterobacterias y no fermentadores) e hidrolizan los antimicrobianos betalactámicos y por lo tanto, confieren resistencia a penicilinas, cefalosporinas (de primera, segunda, tercera y cuarta generación) y monobactames. Dada su particular estructura química, algunos de estos betalactámicos son resistentes a la hidrólisis: cefamicinas (cefoxitina, cefotetan y otros) y carbapenems (imipenem, meropenem y otros). Las BLEE se han derivado de las Betalactamasas de Expectro Ampliado (BLEA). Unas pocas mutaciones en el gen que codifica a una de estas enzimas convierten una BLEA en BLEE con lo cual amplían su expectro hidrolítico a cefalosporinas y monobactames que las BLEA no poseen. Sin embargo, esta característica suele acompañarse de una pérdida de la eficiencia hidrolítica y como resultado, en la mayoría de los casos, los niveles de resistencia son muy bajos, lo que complica su detección. El significado clínico de esto es que las cepas que se informan sensibles con el método de difusión en agar


287

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


(Kirby y Bauer) pueden ser portadoras de una BLEE y por lo tanto, ser resistentes a varios antimicrobianos betalactámicos lo que si no se toma en cuenta, implica fallas en el tratamiento con antimicrobianos betalactámicos. Por esta razón, hoy se acepta que la presencia de una BLEE en cualquier microorganismo debe informarse como resistente a penicilinas, monobactames y todas las cefalosporinas de tercera y cuarta generación independientemente de su sensibilidad in vitro. Para mejorar la detección de BLEE las normas NCCLS han modificado los puntos de corte de algunas cefalosporinas de tercera generación en el caso de Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca y Escherichia coli, cuando el método empleado es el de difusión en agar. Sin embargo, estos puntos de corte no incluyen a otras enterobacterias ni bacilos no fermentadores como Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter spp que también pueden elaborar BLEE, lo que los convierte en un serio problema en los casos de infección nosocomial. Las BLEE son codificadas en genes presentes en megaplásmidos transferibles entre bacilos gramnegativos por el mecanismo de conjugación. Estas enzimas reciben distintos nombres. En EEUU y Europa predominan las BLEE derivadas de las BLEA TEM-1, TEM-2 y SHV-1. En Argentina y países del cono sur de suramérica se ha detectado CTX-M-2 (grupo 2be de la clasificación de Karen Bush) con muy poca actividad hidrolítica sobre ceftacidima (CAZ) y aztreonam (AZT) y además, inhibida por ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam. Igualmente se ha detectado PER-2 que se diferencia de la anterior en que tiene una fuerte actividad ceftacidimasa, SHV-2 y SHV-5. PER-1 se ha descrito en Turquía. En un país determinado pueden estar circulando diferentes tipos de enzimas BLEE y por lo tanto, el efecto hidrolítico en las cefalosporinas de tercera generación es tan variado como el tipo de enzima se detecte en cada caso particular. El nivel de dificultad para detectar este mecanismo de resistencia depende especialmente del tipo de betalactamasa que se trate. La detección de las tipo TEM o SHV son particularmente difíciles debido a la baja actividad hidrolítica sobre las cefalosporinas de tercera y cuarta generación. Existen diferentes métodos para detectar las BLEE. El mas sencillo es la resistencia obvia que se detecta con los puntos de corte usuales según las normas NCCLS. Pero esto no siempre es posible debido a la existencia de BLEE con pobre actividad hidrolítica y cuyos diámetros de inhibición son grandes para una o varias cefalosporinas de tercera generación y monobactames con lo cual se interpretarían como sensible si se utilizan los puntos de corte usuales de las normas NCCLS. De esta manera, en los casos de Klebsiella spp y Escherichia coli estas normas recomiendan puntos de corte diferentes para ciertas cefalosporinas de tercera generación y monobactames. Utilizando estos puntos de corte, los mejores discos para detectar BLEE en bacilos gramnegativos son ceftriaxona, cefotaxima, cefpodoxima, cefatacidima y aztreonam.

2. DETECCIÓN DE CEPAS SOSPECHOSAS DE BLEE POR EL MÉTODO DE LOS PUNTOS DE CORTE: Según estos puntos de corte, se debe sospechar e informar la presencia de BLEE en Klebsiella spp y E. coli cuando los halos de inhibición son los siguientes:

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PROCEDIMIENTOS

DE


Tabla No. 1. Puntos de corte para Klebsiella spp y Escherichia coli a partir de los cuales se debe sospechar la presencia de BLEE. Antibiótico

E. coli y Klebsiella spp sospechosas de BLEE

Ceftacidima Ceftriaxona Cefotaxima Cefpodoxima Aztreonam

≤ ≤ ≤ ≤ ≤

22 mm 25 mm 27 mm 17 mm 27 mm

Para confirmación utilizar: Ceftacidima con ceftacidima/ ácido clavulánico 30/10 µg ma mas Cefotaxima con cefotaxima/ ácido clavulánico ácido clavulánico 30/10 µg

El método anterior es presuntivo, por lo que inmediatamente hay que confirmarlo. Para ello se utilizan varios métodos. El siguiente es el recomendado por NCCLS:

2.1 CONFIRMACIÓN DE BLEE POR DIFERENCIA EN EL TAMAÑO DE LOS HALOS ENTRE DOS DISCOS: Cuando la diferencia entre ceftacidima (o cefotaxima) y ceftacidima/ácido clavulánico (o cefotaxima/ ácido clavulánico) es >5mm se confirma la presencia de BLEE. Es necesario realizar las dos pruebas para determinar si la las BLEE son ceftacidimazas, cefotaximasas o ambas.

2.2 MÉTODO DEL “HUEVO” (DEFORMACIÓN) CON TRIPLE DISCO: 2.2.1.

Discos a utilizar:

2.2.1.1 Ceftacidima (CAZ) 30 µg 2.2.1.2 Ceftriaxona (CRO)* 30 µg o cefotaxima (CTX) 30 µg 2.2.1.3. Amoxicilina con ácido clavulánico (AMC) 20/10 µg 2.2.2. Fundamentos fisiológicos del método: Para realizar el antibiograma se colocan en fila los tres discos anteriores teniendo cuidado de colocar el de amoxicilina/clavulánico en el centro de la fila. La distancia recomendada debe ser entre 2 a 3 cm entre el centro de la cefalosporina y el centro del disco de AMC. Un diámetro menor de 2 cm mejora la visualización del efecto huevo en cepas con diámetros de inhibición muy pequeños (ver la tabla anterior) pero en estos aislamientos no sería necesario detectar la BLEE porque las cepas ya son claramente resistentes a las cefalosporinas de tercera generación. Con distancias mayores de 3 cm puede no producirse el efecto huevo debido a las bajas concentraciones del inhibidor (ácido clavulánico). Cuando las bacterias producen BLEE se observa una deformación del halo producido por la cefalosporina de tercera generación (o una o ambas), fenómeno conocido como “efecto huevo” (ver figura 1). Este

* Cefepima (FEP) en caso de Pseudomonas aeruginosa. Capítulo 16: Susceptibilidad antimicrobiana

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PROCEDIMIENTOS

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fenómeno toma distintas formas dependiendo del diámetro de inhibición de las cefalosporinas utilizadas, la capacidad inhibitoria del inhibidor de las BLEE (en este caso el ácido clavulánico) y de la distancia a la que son colocados los discos. El efecto huevo se debe a que el inhibidor se difunde radialmente con gradientes de concentración decrecientes alrededor del disco de AMC. Las bacterias que se encuentran en la zona alrededor de este disco tendrán la BLEE inhibida hasta una distancia tal que el ácido clavulánico haya disminuido lo suficiente como para no seguir inhibiendo a la enzima. Es decir, a mayor distancia del disco de AMC, menor concentración de clavulánico, menor inhibición de la BLEE. Por otro lado, el mismo fenómeno de gradientes de concentración ocurre en los discos de las cefalosporinas puestos a los lados del disco de AMC: a mayor distancia del disco, menor concentración de la cefalosporina de tercera generación. La interacción de estos dos gradientes es la que determina la deformación del halo de inhibición (ver figura 1). Cualquier aislamiento que presente este efecto en el antibiograma debe ser considerado como una prueba confirmativa de la producción de BLEE y debe informarse resistente a todas las penicilinas, cefalosporinas (excepto las de cuarta generación como cefepime) y monobactames, independientemente del halo de inhibición, en caso que previamente se haya hecho un antibiograma de la forma usual. En el caso de Enterobacter spp, Serratia spp, M. morganii y Providencia spp el mecanismo de resistencia mas común es la producción de betalactamas cromosómica tipo AMP-C inducible por derrepresión de la enzima que se produce de manera natural. Sin embargo, la presencia de BLEE plasmídicas en estos dos géneros bacterianos es cada vez mayor. La detección de BLEE en estos géneros tiene un impacto vital en los pacientes ya que invalida la utilización de cefalosporinas de tercera y cuarta generación. El método para detectar BLEE en ellos es similar a los descritos para Klebsiella spp y Escherichia coli, con la diferencia que los puntos de corte para las cefalosporinas de tercera generación son los recomendados para enterobacterias por lo que no se deben aplicar los puntos de corte designados para la detección sospechosa de BLEE en Klebsiella spp y Escherichia coli (ver tabla 2). Esto significa que para la detección de BLEE en estos géneros sólo pueden usarse métodos confirmativos como el del doble o triple disco. El ácido clavulánico además de inhibir la BLEE induce la producción de la betalactamasa tipo AMP-C y no posee acción inhibitoria sobre esta enzima. Esto significa que tiene efectos contrapuestos con respecto a estos dos tipos de enzimas y por lo tanto, cuando se realiza la prueba del doble o triple disco, estos efectos competirán: por un lado, inhibirá la BLEE y se producirá el efecto huevo, por otro lado inducirá la producción de la enzima AMP-C propia de estos géneros, la cual hidroliza a las cefalosporinas de tercera generación, y se observará el achatamiento característico. Sin embargo el efecto que predomina, a pesar que son contrapuestos, es el efecto huevo sobre el achatamiento. El efecto de achatamiento se puede observar colocando un disco de cefoxitina (FOX) frente a una cefalosporina de tercera generación (ver figura 2). En conclusión, el método de doble o triple disco utilizando AMC + CRO o AMC + CRO + CAZ tiene buenas sensibilidad y especificidad para detectar BLEE en enterobacterias que además producen betalactamasas inducibles tipo AMP-C.

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PROCEDIMIENTOS

DE


Tabla No.2 Puntos de corte para indicar sensibilidad a cefalosporinas en el caso de enterobacterias productoras de betalactamasas AMP-C inducible. Antibiótico

Enterobacter spp, C. freundii, Serratia spp, M. morganii y Providencia spp sensibles

Ceftacidima

≤ 18 mm

Ceftriaxona

≤ 21 mm

Cefotaxima

≤ 23 mm

Cefpodoxima

≤ 21 mm

Aztreonam

≤ 22 mm

3. CONTROL DE CALIDAD DE BLEE POR DIFERENCIA EN EL TAMAÑO DE LOS HALOS: Escherichia coli ATCC 25922: <2mm de incremento en la zona de inhibición. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603: >5mm de incremento en el halo entre ceftacidima y ceftacidima/ácido clavulánico. >3mm de incremento en el halo entre cefotaxima y cefotaxima/ácido clavulánico.


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PROCEDIMIENTOS

DE


Figura 1. Detección de BLEE con el método del doble o triple disco

Figura 2. Imagen de achatamiento que se observa cuando la cefoxitina induce la producción de betalactamasa AMP-C frente a una cefalosporina de tercera generación

292


16.3

Determinación de cloranfenicol acetil transferasa (CAT)

I. ALCANCE: Laboratorios de Bacteriología hospitalarios, de SILAIS y laboratorios de Referencia (CNDR) aplican todos los incisos.

II. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS: El cloranfenicol es un agente bacteriostático que inhibe la síntesis de proteínas. Contiene en su estructura química un anillo nitrobenceno. La mayoría de los aislamientos de H. influenzae resistentes al cloranfenicol producen la enzima cloranfenicol acetil-transferasa (CAT) que tiene la capacidad de inactivar el cloranfenicol. Su síntesis está mediada por plásmidos. En casos excepcionales, los aislamientos de H. influenzae pueden adquirir la resistencia al cloranfenicol a través de mecanismos no enzimáticos. Esta resistencia puede ser detectada por la prueba de difusión de disco (Kirby - Bauer). La técnica para la detección de la enzima cloranfenicol acetiltrasferasa se basa en visualizar la inhibición del crecimiento de una cepa de Escherichia coli (Escherichia coli ATCC 25922), sensible al cloranfenicol.

1. EQUIPO, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:

1.1. Equipo: 1.1.1. Incubadora calibrada a 37oC. 1.1.2. Mechero tipo Bunsen

1.2. Materiales y reactivos: 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6. 1.2.7. 1.2.8.

Asas bacteriológicas con punta redonda y recta Pinzas estériles para sensidiscos Contenedor con cloro al 0.5% para descarte de materiales Discos de papel de filtro de 8.5mm de diámetro estériles Hisopo estéril Sensidiscos de Cloranfenicol con carga de 30µg Escala McFarland No. 3 Solución Salina al 0.85%


293

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PROCEDIMIENTOS

DE


1.3. Medios de cultivo:

1.3.1. Agar tripticasa soya

1.4. Cepas para control de calidad: 1.4.1 Haemophilus influenzae ATCC 49247 1.4.2. Haemophilus influenzae CNDR 24

2. PROCEDIMIENTO: 2.1. 2.2.

2.3. 2.4. 2.5. 2.6. 2.7. 2.8.

En 2mL de solución salina al 0.85% prepare una suspensión de Escherichia coli ATCC 25922 con crecimiento de 18-24 horas, hasta lograr una turbidez igual al tubo de McFarland No. 3. Introduzca un hisopo estéril dentro de la suspensión. Elimine el exceso de inóculo rotando el hisopo en la pared del tubo. Luego inocule en la superficie de un plato de agar tripticasa soya. Difunda en tres direcciones, horizontal, vertical y transversal. Luego coloque 4 discos de papel filtro estéril, separados aproximadamente 2 cm entre sí y del borde de la placa. Rotule 3 de los discos de papel de filtro de la siguiente manera: P (paciente), C+ (control positivo), C-(control negativo). El cuarto disco déjelo sin rotular como control de esterilidad del papel filtro. Sobre el disco de papel filtro rotulado como P (cepa proveniente del paciente), extienda con un asa bacteriológica un inóculo suficiente de tal manera que cubra toda la superficie del disco. Realice el mismo procedimiento con las cepas control en los otros dos discos de papel filtro. Coloque sobre cada uno de los discos inoculados un disco de cloranfenicol de 30µg. Incube la placa a 37oC en atmósfera aeróbica con la tapa de la placa hacia arriba y observe a partir de las 16 horas de incubación.

3. RESULTADOS: 3.1.

CAT Positiva: No se observa inhibición de crecimiento de E. coli. Esto significa que el aislamiento en estudio produce la enzima cloranfenicol acetil- transferasa, es decir el cloranfenicol fue inactivado por lo tanto no puede actuar sobre la E. coli.

3.2.

CAT Negativa: Se observa un halo de inhibición de crecimiento de E. coli. Esto significa que la cepa en estudio no produce la enzima cloranfenicol acetil-transferasa, es decir, el cloranfenicol no fue inactivado, por lo tanto actua sobre la E. coli.

4. CONTROL DE CALIDAD: 4.1. Haemophilus influenzae CNDR-24 Resultado: CAT positivo. No hay inhibición de Escherichia coli, la cual crece hasta los bordes del disco de papel absorbente donde fue inoculada la cepa CNDR-. 4.2. Haemophilus influenzae ATCC 49247 Resultado: CAT negativo. Hay inhibición del Escherichia coli. Se presenta un halo de inhibición alrededor del disco donde fue inoculada la cepa ATCC 49247. 294


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PROCEDIMIENTOS

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5. INFORME: 5.1. Cloranfenicol Acetil- Transferasa positiva. 5.2. Cloranfenicol Acetil-Transferasa negativa.


295

16.4

Lista Oficial de discos de susceptibilidad y tablas de discos con antimicrobianos que deben emplearse según bacterias

I. AL CANCE: Todos los laboratorios de la Red. II. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS 1.

La selección de los antibióticos se hace en base a:

1.1.

Una lista básica de antimicrobianos de uso clínico, a la cuál se ajusta el laboratorio. Esta lista la determina un Comité formado por personal médico representante de la unidad de salud respectiva.

1.2.

Se toma en cuenta la prioridad del antimicrobiano de acuerdo al grupo al que pertenece (ver tabla No. 1).

1.3.

Se toma en cuenta el valor predictivo que tienen algunos antimicrobianos respecto a otros del mismo grupo (ver tabla No. 1).

2.

A continuación se presenta el listado de los antimicrobianos a utilizar a partir del 2005 en los laboratorios de la Red Nacional, para las pruebas de susceptibilidad.

2.1.

1. Penicilina (PEN) 2. Oxacilina (OXA) 3. Ampicilina (AMP) 4. Cefalotina (CEP) 5. Cefaclor (CEC) 6. Ceftriaxona (CRO) 7. Ceftacidima (CAZ) 8. Cefotaxima (CTX) 9. Cefepima (FEP) 10. Cefoxitina (FOX) 11. Cefuroxima (CXM) 12. Piperacilina (PIP) 13. Imipenem (IPM) 14. Meropenem (MEM) 15. Aztreonam (ATM) 16. Amoxicilina/Ácido clavulánico + (AMC) 17. Ampicilina/Sulbactam (SAM) 18. Piperacilina/Tazobactam (TZP) 19. Eritromicina (ERY) 20. Azitromicina++ (AZM) 21. Amicacina ( AMK), 22. Gentamicina (GEN) 23. Gentamicina de alta carga (GEH) 24. Estreptomicina de alta carga (STH) 25. Levofloxacina (LVX), 2 6 . Ciprofloxacina (CIP) 2 7 . Ácido nalidixico + + + (NAL) 2 8 . Vancomicina (VAN), 29. Nitrofurantoína (NIT), 30. Cloranfenicol (CHL), 31. Tetraciclina (TCY) 32. Minociclina (MNO) 33. Clindamicina (CLI) 34. Rifampicina (RIF) 35. Sulfametoxazol/Trimetoprim (SXT). 36. Colistin (COL).

+ ++ +++

Sólo para la detección de BLEE. Sólo para el centro de referencia. Sólo para detectar sensibilidad desminuida a quinolonas fluoradas en salmonellas extra intestinales y otras enterobacterias. Capítulo 16: Susceptibilidad antimicrobiana

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


III. DISCOS DE SENSIBILIDAD QUE SE DEBEN EMPLEAR SEGÚN LOS DIFERENTES GRUPOS BACTERIANOS 1. CEPAS DE LA COMUNIDAD: 1.1. Salmonella spp: AMP (10 µg), SXT (1.25/23.75 µg), CHL (30 g), NAL (30 µg), CIP (5 µg), CRO (30 µg)*, AMC (20/10 µg)*, CAZ (30 µg)* . 1.2. Shigella spp: AMP (10 µg), SXT (1.25/23.75 µg), CTX (30 µg), CHL (30 µg), NAL (30 µg), CIP (5 µg), NIT (300 µg). 1.3. Escherichia coli **: AMP (10 µg), SXT (1.25/23.75 µg), CIP (5 µg), NIT (300 µg), CEP (30 µg), SAM (10/10 µg), GEN (10 µg), CRO (30 µg)*, AMC (20/10 µg)*, CAZ (30 µg,)*. 1.4. Haemophilus influenzae: AMP (10 µg), SAM (10/10 µg), CRO (30 µg), CHL (30 µg), CEC (30 µg), CXM (30 µg), LVX (5 µg), AZM (15 µg), SXT (1.25/23.75 µg). 1.5. Streptococcus pneumoniae: OXA (1 µg), PEN***, CTX***, IPM***, CXM***, ERY (15 µg), SXT (1.25/23.75 µg), CHL (30 µg), VAN (30 µg), TCY (30 µg), LVX (5 µg), RIF (5 µg). 1.6. Neisseria meningitidis: PEN***, CTX***, CHL***, RIF***, CIP***, SXT***, TCY***. 1.7. Neisseria gonorrhoeae: PEN (10 µg), CTX o CRO (30 µg), TCY (30 µg), CIP (5 µg). 1.8. Vibrio cholerae: AMP (10 µg), CHL (30 µg), TCY (30 µg), SXT (1.25/23.75 µg). 2. CEPAS DE ORIGEN HOSPITALARIO Escherichia coli : AMP (10 µg), SXT (1.25/23.75 µg), CIP (5 µg), CEP (30 µg), GEN (10 µg), AMK (30 µg), IPM (10 µg), CHL (30 µg), CRO (30 µg)*, AMC (20/10 µg)*, CAZ (30 µg)*. Klebsiella spp: AMP (10 µg), SXT (1.25/23.75 µg), CIP (5 µg), NIT (300 µg)**, CEP (30 µg), SAM (10/10 µg), GEN (10 µg), AMK (30 µg), TZP (100/10 µg), IPM (10 µg), MEM (10 µg), CHL (30 µg), CRO (30 µg)*, AMC (20/10 µg)*, CAZ (30 µg)*, COL (10 µg)****, FOX (30 µg)****. Enterobacter spp: AMP (10 µg), SXT (1.25/23.75 µg), CRO (30 µg), CIP (5 µg), GEN (10 µg), AMK (30 µg), TZP (100/10 µg), IPM (10 µg), FEP (30 µg), CRO (30 µg)*, AMC (20/10 µg)*, CAZ (30 µg)*, COL (10 µg)****, FOX (30 µg)****. Otras enterobacterias: AMP (10 µg), SXT (1.25/23.75 µg), CIP (5 µg), CEP (30 µg), GEN (10 µg), AMK (30 µg), TZP (100/10 µg), IPM (10 µg), CHL (30 µg), MEM (10 µg), NIT (300 µg), CRO (30 µg)*, AMC (20/10 µg)*, CAZ (30 µg)*. Pseudomonas aeruginosa: GEN (10 µg), AMK (30 µg), CIP (5 µg), IPM (10 µg), PIP (100 µg), MEM (10 µg), TZP (100/10 µg), FEP (30 µg), ATM (30 µg), CFP (30 µg), FEP (30 µg)*, AMC (20/10 µg)*, CAZ (30 µg,)*. Acinetobacter spp: GEN (10 µg), AMK (30 µg), CIP (5 µg), IPM (10 µg), PIP (100 µg), MEM (10 µg), CHL (30 µg), SAM (10/10 µg), TZP (100/10 µg), SXT (25 µg), FEP (30 µg)*, AMC (20/ 10 µg)*, CAZ (30 µg)*. Stenotrophomonas maltophilia: LVX (5 µg), SXT (1.25/23.75), MNO (30 µg). Burkholderia cepacia: CAZ (30 µg), MEM (10 µg) MNO (30 µg). 298


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Staphylococcus aureus y Staphylococcus spp: PEN (10 UI), OXA (1 µg), VAN (30 µg), FOX (30 µg), ERY (15 µg), CLI (2 µg), GEN (10 µg), RIF (5 µg), SXT (1.25/23.75 µg), CIP (5 µg), CHL (30 µg), TCY (30 µg), NIT (300 µg)**. Streptococcus spp beta hemolíticos: PEN (10 UI), LVX (5 µg), ERY (15 µg), CHL (30 µg), AMP (10 µg). Streptococcus viridans: CRO (30 µg), CHL (30 µg), ERY 15 µg), VAN (30 µg), LVX (5 µg). Enterococcus spp: VAN (30 µg), AMP (10 µg) PEN (10 µg), GEH (120 µg), STH(300 µg), NIT (300 µg)**. * ** *** ****

Para detección de BLEE por el método del triple disco. Asociada a infecciones urinarias bajas no complicadas. Las pruebas de sensibilidad se realizan por CIM. Prueba para diferenciación de género en el grupo KES ( Klebsiella, Enterobacter, Serratia ).

Nota para Enterococcus spp: La prueba de sinergia entre betalactámicos (AMP, PEN) o glicopéptidos (VAN) y aminoglucósidos (GEH y STH) es fundamental en pacientes con enterococos aislados de sitios estériles, especialmente en endocarditis bacteriana. Detecta bajos o altos niveles de resistencia a aminoglucósidos: halos ≥10mm en los discos de alta carga indican sinergia, entre 7-9mm debe hacerse CIM y halos ≤6mm indican resistencia y por lo tanto falta de sinergia. La prueba se realiza colocando un disco de AMP frente a GEH y STH. Si el enterococo es resistente a AMP (≤16mm), la prueba de sinergia debe repetirse con VAN. Cuando es resistente a AMP y VAN (v.g. Enterococcus faecium), lo más probable es que no haya sinergia. En tal caso enviar la cepa al CNDR para probar la sensibilidad a linezolid y quinupristina-dalfopristina. Los enterococos pueden tener resistencia de alto y bajo nivel a AMP. La resistencia de bajo nivel puede detectarse con la prueba de sinergia, realizada con aminoglucósidos de alta carga tal y como se ha descrito en el párrafo anterior. De forma rutinaria debe realizarse y reportarse la prueba de sinergia para los enterococos aislados de sitios estériles.

TABLA No. 1. TABLA DE CLASIFICACION DE ANTIBIÓTICOS Y SU VALOR PREDICTIVO ANTIBIOTICO

VALOR PREDICTIVO PARA

Ampicilina (AMP)

Amoxicilina. Amoxicilina/ácido clavulánico, ampicilina/sulbactam, piperacilina y piperacilina/tazobactam.

Cefalotina (CEP)

Cefapirina, cefradina, cefalexina, cefaclor y cefadroxil.

Ceftriaxona (CRO)

Cefotaxima.

Tetraciclina (TCY)

Todas las tetraciclinas (doxiciclina y minociclina).

Eritromicina (ERY)

Azitromicina, claritromicina y diritromicina.

Nitrofurantoína (NIT)

Furazolidona.

Oxacilina (OXA)

Todos los betalactámicos, penicilinas betalactamasa lábiles (ampicilina, amoxicilina, azlocilina, carbenicilina, mezlocilina, piperacilina y ticarcilina), penicilinas betalactamasa estables (cloxa y dicloxacilina), combinaciones de inhibidores betalctámicos (clavulanato y sulbactam), cefems relevantes y carbapenems.

Penicilina (PEN)

Betalactámicos y combinaciones de betalactámicos - inhibidores de betalactamasas. Capítulo 16: Susceptibilidad antimicrobiana

299

300

N

N

Stenotrophomonas maltophilia

Burkholderia cepacia

Capítulo 16: Susceptibilidad antimicrobiana N

N

N

S

SJ

S

S

N

N

N

N

S

S

N

N

S

S

N

S

N

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N

N

N

SL

L

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C

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N

N

N

N

N

N

N

SL

X

O

NOTAS: A. Se utilizan para la detección de BLEE por el método de triple disco. B. No debe reportarse en urocultivos. C . Se utiliza para bacterias aisladas de orina y determinar el valor predictivo de furazolidona en shigellas. D . Se utiliza para la detección de BLEE y BLEA. E. Se utiliza para detectar sensibilidad reducida a quinolonas fluoradas F. Sólo para Klebsiellas spp de origen hospitalario. G. Para E. coli de origen hospitalario. H . Sólo para Shigella spp I . Sólo para Enterobacter spp, Klebsiella spp y E. coli. J. Se puede usar indistintamente CRO o CTX. K . Para aislamientos provenientes de LCR o SANGRE de pacientes en riesgo de muerte (meningitis, epiglotitis, bacteremia, celulitis facial) sólo deberá informarse sensibilidad a ampicilina, una cefalosporina de tercera generación y cloranfenicol. Los resultados obtenidos con agentes administrados por vía oral sólo deberán informarse en aquellos aislamientos provenientes de infecciones no complicadas (otitis media, sinusitis e infecciones broncopulmonares). L . Para diferenciar grupo KES. Klebsiella spp: FOX: S, COL: S, Enterobacter spp: FOX: R, COL: S, Serratia spp: FOX: S o R, COL: R.

S: si

N

N

N

N

N

N

S

S

LB

H

C

DE

N

N

N

N

N

S

N

S

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S

A

C

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PROCEDIMIENTOS

N: no

S

Vibrio cholerae

S

N

Neisseria gonorrhoeae

spp K

N

Acinetobacter spp

S

S

P

E

C

DE

H a e m o p h i l u s

N

Psedomonas aeruginosa spp

S

K

P

S

A M

A

M

Enterobacterias

ESPECIE

TABLA No 2. ANTIMICROBIANOS A USAR CON EL METODO DE KIRBY Y BAUER PARA ENTEROBACTRIAS Y OTROS GRAMNEGATIVOS BASÁNDOSE EN LISTA BASICA y NCCLS


N

Enterococcus sppK

N

S S

S

N

N S

N

N

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N

N SG

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N

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N

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N

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N

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N N

N

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S

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N

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N S

N

N

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Sn

N N

N

N

GEH

N

N N

N

S

CRO

NOTAS: A. No deben reportarse en urocultivos. B. No se hace la sensibilidad por difusión en agar con discos, se hace por CIM (concentración inhibitoria mínima). C . Se usa en lugar de penicilina por el método de Kirby y Bauer. Si se obtienen valores ≤ de 19 mm debe realizarse CIM a penicilina, cefotaxima e imipenem y reportar según el resultado obtenido. D . Streptococcus pneumoniae aislados de vías respiratorias bajas. E. Halos menores de 17 mm o crecimiento de colonias intrahalos, enviar la cepa al CNDR. F. En primer instancia usar PEN, si no hay, usar AMP, si no hay, usar CTX. Halos menores de 24 mm, enviar la cepa al CNDR. G. La actividad de los antibióticos betalactámicos para Staphylococcus puede deducirse con sólo el uso de estos dos antibióticos. Penicilina sensible: predice resultados de penicilinas y combinaciones con inhibidores betalactámicos, cefems y carbapenems. Penicilina resistente y oxacilina sensible: predice resistencia a penicilinas betalactámicas lábiles a betalactamasas estafilocóccicas (ampicilina, amoxicilina, carbenicilina, mezlocilina, piperacilina y ticarcilina) pero predice sensibilidad a penicilinas betalactamasa estables (cloxacilina y dicloxacilina) y a combinaciones de inhibidores betalactámicos (clavulanato y sulbactam), cefems relevantes y carbapenems. H . Halos menores de 14mm o crecimiento de colonias intrahalos, enviar la cepa al CNDR. I . La resistencia de Staphylococcus aureus mediada por el gen mecA puede ser detectada con cefoxitina (FOX). Cuando el diámetro del halo es ≤19mm debe ser reportado como oxacilina resistente. Cuando el diámetro del halo es ≥20mm debe ser reportado como oxacilina sensible J. La resistencia de Staphylococcus spp a macrólidos puede presentarse sola (por eflujo codificada por el gen msrA) y se observa en el antibiograma como ERY (R) y CLI (S) sin atachamiento o presentarse con resistencia metilasa constitutiva ERY (R) y CLI (R), metilasa inducible ERY (R) y CLI (S) con atachamiento. Esta última ocurre por metilación del rRNA 23S codificada por el gen erm y se presenta como resistencia a macrólidos, clindamicina y estreptograminas. Estos mecanismos pueden ser detectados poniendo un disco de clindamincina de 2 µg a unos 15-26 mm de otro de eritromicina de 15 µg como parte del antibiograma de rutina. K . Hacer determinación de betalactamasa con Nitrocefina. L . En Enteococcus no productores de betalactamasa , la sensibilidad a penicilina predice la sensibilidad a AMP, SAM, AMC, PIP y TZP. M. El crecimiento de cualquier UFC dentro del halo de inhibición indica resistencia, no importa los mm de inhibición que tenga el halo. En este caso, la cepa debe ser referida al CNDR. En caso de observarse una zona de inhibición entre 15 y 16 mm (intermedio) se debe confirmar el resultado por un método de dilución, por lo que la cepa, también debe ser enviada al CNDR. N. Ver nota de Enterococcus en página 299.

S: si

N N

S S

N: no

S

S

S

ERYA

DE

N

N

S

CHL A TCY

Streptococcus viridans Streptococcus pneumoniae Streptococcus spp β hemolíticos Staphylococcus spp

GÉNERO Y ESPECIE

TABLA No 3. ANTIMICROBIANOS A USAR CON EL METODO DE KIRBY Y BAUER PARA MICROORGANISMOS GRAMPOSITIVOS BASÁNDOSE EN LISTA BASICA y NCCLS

MANUAL PROCEDIMIENTOS DE



301

MANUAL

1.

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Al realizar los antibiogramas de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Klebsiella oxytoca, Acinetobacter spp y Pseudomonas aeruginosa deben ponérsele de rutina los discos de ceftriaxona (CRO) (cefepima, FEP, en el caso de Pseudomonas), amoxicilina/ácido clavulánico (AMC) y ceftacidima (CAZ) con el propósito de detectar BLEE (ver prueba de BLEE en capítulo 16.2). Si la prueba detecta BLEE debe adjuntarse una nota advirtiendo que el microorganismo aislado debe considerarse resistentes a todas las cefalosporinas de primera, segunda, tercera y cuarta generación, (excepto cefoxitina), aztreonam y cualquier penicilina excepto carbapenems (impipenem, ertapenem, meropenem).

III. FUNDAMENTO DEL METODO PARA REALIZAR LA PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD F undament os f isiológicos: Ver capítulo 16.1.

Control de calidad: Quincenalmente los laboratorios de la Red, deben realizar control de calidad de los discos de sensibilidad utilizando las cepas de ATCC que se indican en el capítulo 16.

Temperaturas y tiempos de incubación: Ver capítulo 16.1 de susceptibilidad por difusión en agar (Kirby Bauer).

IV. BIBLIOGRAFÍA 1. Ferraro MJ, Wikler MA, Craig WA and others. Performance Standards for Antimicrobial Disks Susceptibility Testing; Fourteenth Informational Supplement. Disk diffusion. National Comittee for Clinical Laboratory Standards, Volume 24 No.1, 2004. Pensylvania, USA. 2. Pruebas de Sensibilidad a Agentes Antimicrobianos en Diagnóstico Microbiológico. Elmer W. Koneman, Stephen D. Allen, William M. Janda, Paul C. Schereckenberger y Washington C. Winn, Capítulo 15. 5a Edición, 1996. Editorial Medica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 3. Galas M., Corso A. III Curso Latinoamericano de Actualización en Antimicrobianos. PAHO / OPS, INEI, CNDR. Managua Nicaragua, 2000. 4. Manual de Haemophilus influenzae, Instituto Nacional de Salud (Colombia) / Organización Panamericana de la Salud. Taller Sobre la Identificación Bioquímica y Serológica de Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae. Managua, Nicaragua, 1998.

302


MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


Bibliografía BLEE: 5.

Stonereak PW, Gupta A, Loughrey M, Della-Latta P et al. Attributable Costs and Length of Stay of an Extended-Spectrum Beta-Lactamase-Producing Klebsiella pneumoniae Outbreak in a Neonatal Intensive Care Unit. Journal of Infection Control and Hospital Epidemiology, 2003;24(8):601-606.

6.

Pagani L, Migliavacca R, Pallecchi L. Emerging Extended-Spectrum ß-Lactamases in Proteus mirabilis . Journal of Clinical Microbiology, 2002;40(4):1549-1552.

7.

Gruteke P, Wil Goessens W, van Gils J. Patterns of Resistance Associated with Integrons, the Extended-Spectrum ß-Lactamase SHV-5 Gene, and a Multidrug Efflux Pump of Klebsiella pneumoniae Causing a Nosocomial Outbreak. Journal of Clinical Microbiology, 2003; 41(3): 1161-1166.

8.

M. Quinteros, M. Radice, N. Gardella Extended-Spectrum ß-Lactamases in Enterobacteriaceae in Buenos Aires, Argentina, Public Hospitals. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2003; 47(9): 2864 - 2867.

9.

Poirel L, Menuteau O, Agoli N et al. Outbreak of Extended-Spectrum ß-Lactamase VEB-1-Producing Isolates of Acinetobacter baumannii in a French Hospital. Journal of Clinical Microbiology, 2003; 41(8): 3542-3547

10. Endimiani A, Luzzaro F, Perilli M et al Bacteremia Due to Klebsiella pneumoniae Isolates Producing the TEM-52 Extended-Spectrum b Lactamase: Treatment Outcome of Patients Receiving Imipenem or Ciprofloxacin. Clinical Infectious Diseases, 2004;38:243-251. 11. Paterson DL, Wen-Chien Ko, Von Gottberg A et al. Outcome of Cephalosporin Treatment for Serious Infections Due to Apparaently Susceptible Organisms Producing ExtendedSpectrum b-Lactamases: Implications for the Clnical Microbiology Laboratory. Journal of Clinical Microbiology, 2001;39(6):2206-2212. 12. Grupo KES. Programa Latinoamericano de Control de Calidad en Bacteriología y Resistencia a los Antimicrobianos, Organización Panamericana de la Salud OPS, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas INEI, Dr. Carlos G. Malbrán, Buenos Aires, Argentina, Boletín No.1, 2001. 13. Ferraro MJ, Wikler MA, Craig WA and others. Performance Standards for Antimicrobial Disks Susceptibility Testing; Fourteenth Informational Supplement. Disk diffusion. National Comittee for Clinical Laboratory Standards, Volume 24, No. 1, 2004. Pensylvania, USA.


303

CAPÍTULO 17.

Fundamentos fisiológicos y bioquímicos de las pruebas I. INTRODUCCIÓN: La utilización de los medios de cultivo se basa, en evidenciar la presencia o ausencia de diferentes enzimas, que dirigen el metabolismo bacteriano a lo largo de diversas vías. Un conjunto determinado de enzimas o su carencia discrimina género y especies bacterianas. La forma usual de detectar una enzima se basa en el principio de que si está presente, utilizará un sustrato determinado que ha sido puesto adrede en el medio de cultivo o en una prueba bioquímica determinada. Los productos terminales de la acción enzimática son detectados a través de indicadores de pH o por el aparecimiento de pigmentos que hacen virar el color del medio. Algunos medios de cultivo iniciales contienen inhibidores cuyo propósito es el de favorecer el crecimiento de unos pocos géneros bacterianos. Este principio se conoce como selectividad y es bastante frecuente su empleo cuando las muestras tomadas provienen de partes del cuerpo donde el posible agente causal se acompaña de una microbiota amplia y abundante.

1. FUNCIONES DE LOS COMPONENTES BÁSICOS DE LOS MEDIO DE CULTIVO:

1.1. Sustrato: Reacciona con una enzima específica y da origen a productos terminales que pueden ser ácidos o alcalinos.

1.2. Indicador de pH: Detectan productos terminales de la utilización del sustrato. Son colorantes añadidos para indicar los cambios que hay en el medio durante el crecimiento de los microorganismos. Estos indicadores son sensibles a los cambios de pH, por lo tanto, los virajes de color de los mismos indican de manera indirecta la presencia de productos terminales del empleo de sustratos. Los más usados son: rojo fenol, rojo neutro, púrpura de bromocresol y azul de metileno.

1.3. Nutriente: En la mayoría de los casos, las bacterias no crecerán sólo con la presencia del sustrato básico, por lo que se requiere agregar diversos nutrientes que varían, dependiendo de los requerimientos de cada bacteria.

1.4. Inhibidores: Son utilizados más en medios selectivos iniciales, pero hay que tener en cuenta que no todos los microorganismos deseados serán inhibidos y no todos los deseados crecerán. La selectividad de agentes químicos y colorantes es afectada por la cantidad y tipo de nutriente presente. Capítulo 17: Fundamentos fisiológicos y bioquímicos de las pruebas

305

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


PRINCIPIO BÁSICO PARA LA DETECCIÓN DE UNA REACCIÓN BIOQUÍMICA

II. MEDIOS DE CULTIVO PARA ENTEROBACTERIAS Y V. cholerae 1. AGAR Mac CONKEY (MacC): MEDIO SELECTIVO

1.1. Fundamento: Es un medio selectivo y diferencial que se emplea para discriminar las bacterias gramnegativas en fermentadoras y no fermentadoras de la lactosa. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben a los grampositivos.

1.2. Composición: 1.2.1. Nutriente: Peptona 1.2.2. Sustrato: Lactosa 1.2.3. Inhibidores: Sales biliares y cristal violeta 1.2.5. Amortiguador: Cloruro de Na 1.2.6. Indicador de pH: Rojo neutro 1.2.7. Temperatura de incubación: 35-37oC 1.2.8. Tiempo de incubación: 18-24 horas

306

Capítulo 17: Fundamentos fisiológicos y bioquímicos de las pruebas

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


1.3. Técnica de inoculación: 1.3.1. Rotular el plato que contiene el medio de cultivo. 1.3.2. Con un asa redonda o un hisopo poner el inóculo de manera circular en un extremo del plato (tomar de referencia el punto donde se escribió el número de la muestra) tal que abarque un área aproximada de 1 cm de diámetro. Hacer el inóculo en forma circular de aproximadamente 10 mm de diámetro con un asa redonda o hisopo. 1.3.3. Dejar secar el inóculo hasta que desaparezca la humedad. 1.3.4. Utilizar un asa redonda esterilizada para dispersar la muestra en el primer cuadrante del plato. 1.3.5. Esterilizar nuevamente el asa, dejarla enfriar y estriar los 3 cuadrantes restantes del medio en la forma convencional, con el objetivo de tener colonias aisladas y evitar contaminación. 1.3.6. Incubar el plato en forma invertida. 1.3.7. Seleccionar las Unidades Formadoras de Colonia (UFC) que va a trabajar.

Figura No. 1: Forma final de un plato estriado con la técnica convencional.

1.4. Control de calidad: 1.4.1. Shigella flexneri OPS 45 Resultado: UFCs no fermentadoras de la lactosa: las colonias se observan incoloras o transparentes. 1.4.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: UFCs fermentadoras de la lactosa: las colonias se observan de color rosado.

2. CALDO SELENITO:

2.1. Fundamento: El caldo Selenito sirve para el enriquecimiento de salmonellas y shigellas a partir de muestras como heces y orina. Es inhibidor de otros coliformes que incluyen algunas de las especies de Shigella. Este Capítulo 17: Fundamentos fisiológicos y bioquímicos de las pruebas

307

MANUAL

DE

PROCEDIMIENTOS

DE


medio funciona mejor bajo una reducida tensión de oxígeno, y para que sea más óptimo, se recomienda distribuirlo en tubos que proporcionen por lo menos 5 cm de profundidad. El medio preparado es claro y ligeramente amarillento. El sobrecalentamiento a la hora de la preparación y el almacenamiento prolongado pueden modificar el color a rojo ladrillo o rojizo, lo cual afecta la eficacia microbiológica.

2.2. Composición: 2.2.1. Nutriente: Peptona, lactosa 2.2.2. Inhibidor: Selenito 2.2.3. Amortiguador: Fosfato de sodio 2.2.4. Agua destilada 2.2.5. PH final 7.0 ± 0.1

2.3. Técnica de inoculación: 2.3.1. Si el material es sólido se pone un inóculo (por ejemplo, hisopo rectal) cargado directamente en el caldo, si el material es líquido (heces diarréicas), se ponen en una relación 1:1 con el caldo. 2.3.2. Tiempo de incubación: 8-12 hrs. En este período el caldo se vuelve turbio. 2.3.3. Temperatura de incubación: de 35- 37oC. 2.3.4. Hacer un subcultivo de la superficie del caldo y sembrarlo en agar Salmonella Shigella. No agite el tubo antes de tomar la muestra. Procedimiento: Ver el medio Agar Salmonella y Shigella (ASS)

2.4. Control de calidad: 2.4.1. Shigella flexneri OPS 45 Resultado: Se observa turbidez en el caldo por crecimiento adecuado. 2.4.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Hay poca turbidez o ausencia de la misma por falta de crecimiento adecuado.

3. AGAR SALMONELLA Y SHIGELLA (ASS). MEDIO SELECTIVO:

3.1. Fundamento: Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de algunos bacilos entéricos, especialmente los que pertenecen a los géneros Salmonella y Shigella.

3.2. Composición: 3.2.1. 3.2.2. 3.2.3. 3.2.5. 3.2.6. 3.2.7. 308

Nutriente: Peptonas. Sustratos: Lactosa, Tíosulfato de Na, Citrato de Na, Citrato de NH4 y Hierro III. Inhibidor: Verde brillante y bilis de buey Indicador de pH: Rojo Neutro Temperatura de incubación : 35 - 37 oC Tiempo de incubación :18-24 horas


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


3.3. Técnica de inoculación: 3.3.1.

Inoculación primaria.

3.3.1.1. Rotular el plato que contiene el medio de cultivo. 3.3.1.2. Con un asa redonda o un hisopo poner el inóculo de manera circular en un extremo del plato (tomar de referencia el punto donde se escribió el número de la muestra) tal que abarque un área aproximada de 1 cm de diámetro. 3.3.1.3. Dejar secar el inóculo hasta que desaparezca la humedad. 3.3.1.4. Utilizar un asa redonda esterilizada para dispersar la muestra en el primer cuadrante del plato. 3.3.1.5. Esterilizar nuevamente el asa, dejarla enfriar y estriar los 3 cuadrantes restantes del medio enla forma convencional, con el objetivo de tener colonias aisladas y evitar contaminación. 3.3.1.6. Incubar el plato en forma invertida. 3.3.1.7. Seleccionar las Unidades Formadoras de Colonia (UFC) que va a trabajar.

A partir del Caldo Selenito: 3.3.1.8. Con un asa redonda tomar un inóculo de la superficie del Selenito y sembrarlo en el medio de ASS como se indica en los numerales 3.3.1 al 3.3.7. No agite el tubo antes de tomar la muestra.

3.4. Control de calidad: 3.4.1. Shigella flexneri OPS 45 Resultado: UFCs no fermentadoras de la lactosa: las colonias se observan incoloras o transparentes. 3.4.2. Esecherichia coli ATCC 25922 Resultado: UFCs fermentadoras de lactosa: las colonias se observan de color rosado pálido.

4. AGUA PEPTONADA ALCALINA (APA):

4.1. Fundamento: El enriquecimiento en este caldo favorece al aislamiento de Vibrio cholerae cuando hay pocos microorganismos, como en muestras de personas convalecientes y de portadores asintomáticos.

4.2. Composición: 4.2.1. 4.2.2. 4.2.3. 4.2.4. 4.2.5.

Nutriente: Peptona Inhibidor: Cloruro de Na pH: 8.4 a 8.5 Temperatura de incubación : 35 -37 oC Tiempo de incubación : de 6 a 8 horas

4.3. Técnica de inoculación de la muestra en el caldo de enriquecimiento APA: 4.3.1. Con una pinza previamente flameada, tomar el hisopo proveniente del medio de transporte Cary Blair. Capítulo 17: Fundamentos fisiológicos y bioquímicos de las pruebas

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PROCEDIMIENTOS

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4.3.2. Introducir el hisopo en el caldo. 4.3.3. Incubar a una temperatura de 35 a 37 oC por un periodo de 6 a 8 horas. 4.3.4. Realizar un subcultivo en el medio de TCBS (ver Agar TCBS).

4.4. Control de calidad: 4.4.1. Vibrio cholerae CNDR AT-1 Resultado: Se observa turbidez en el caldo. Buen aislamiento en la resiembra en TCBS. 4.4.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Se observa poca o ninguna turbidez en el caldo. Ninguna UFC en la resiembra en TCBS.

5. AGAR TIOSULFATO CITRATO SALES BILIARES SACAROSA (TCBS):

5.1. Fundamento: El medio es utilizado para el aislamiento y cultivos selectivos de V. cholerae y otros vibriones entero patógenos (V. parahaemolyticus).

5.2. Composición: 5.2.1. 5.2.2. 5.2.3. 5.2.4. 5.2.5. 5.2.6.

Nutriente: Peptonas Sustrato: Sacarosa Inhibidores: Bilis de buey Indicador de pH: Azul de bromotimol y azul timol Temperatura de incubación : 35 -37 oC Tiempo de incubación : 18-24 horas

5.3. Técnica de inoculación del caldo de enriquecimiento APA al medio de Cultivo TCBS: 5.3.1. Rotular el plato que contiene el medio de cultivo. 5.3.2. Con un asa redonda tomar un inóculo de la superficie del caldo APA y ponerlo de manera en un extremo del plato (tomar de referencia el punto donde se escribió el número de la muestra) tal que abarque un área aproximada de 1 cm de diámetro. Hacer el inóculo en forma circular con un diámetro de aproximadamente 1cm. 5.3.3. Dejar secar el inóculo hasta que desaparezca la humedad. 5.3.4. Utilizar un asa redonda esterilizada para dispersar la muestra en el primer cuadrante del plato. 5.3.5. Esterilizar nuevamente el asa, dejarla enfriar y estriar los 3 cuadrante restantes del medio en la forma convencional, con el objetivo de tener colonias aisladas y evitar contaminación. 5.3.6. Incubar el plato en forma invertida. 5.3.7. Seleccionar las Unidades Formadoras de Colonia (UFC) que va a trabajar. NOTA: En un plato de TCBS puede trabajarse cómodamente 4 muestras por plato.

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PROCEDIMIENTOS

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5.4. Control de calidad: 5.4.1. Vibrio cholerae CNDR AT-1 Resultado: UFCs de color amarillo, 2-4 mm, brillantes, planas o convexas, bordes bien definidos. 5.4.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: No hay crecimiento.

6. AGAR SANGRE DE CARNERO (ASC):

6.1. Fundamento: Este medio de cultivo es adecuado para el crecimiento de microorganismos exigentes, aerobios comunes y bacterias facultativas. La presencia de sangre permite comprobar la presencia de algunas hemolisinas y tipo de hemólisis. 6.1.1. Estreptolisina O (SLO): Es lábil al oxígeno, antigénica, inhibida por el colesterol y tóxica para una gran variedad de tipos celulares. Debido a su labilidad frente al oxígeno, es la responsable fundamental de la beta hemólisis, que se ve por debajo de la superficie del agar. 6.1.2. Estreptolisina S (SLS). Es estable frente al oxígeno, no es antigénica pero tóxica para una gran variedad de tipos celulares. Es activa tanto en la hemólisis superficial como en la profundidad del agar.

6.2. Composición: Para su preparación se pueden utilizar diferentes bases como: Tripticasa Soya Agar (TSA), Mueller Hinton (MH), Caseína con harina de Soya (Casoy) y otros. La cantidad de sangre de carnero que se agrega, es de acuerdo al uso que se le pretende dar. De manera general, como medio inicial se emplea un volumen tal que quede a una concentración de 5%.

6.3. Técnica de inoculación: 6.3.1. Rotular el plato que contiene el medio de cultivo. 6.3.2. Con un asa redonda o un hisopo poner el inóculo de manera circular en un extremo del plato (tomar de referencia el punto donde se escribió el número de la muestra) tal que abarque un área aproximada de 1 cm de diámetro. 6.3.3. Dejar secar él inóculo hasta que desaparezca la humedad. 6.3.4. Utilizar un asa redonda esterilizada para dispersar la muestra en el primer cuadrante del plato. Realizar dos o tres estrías a profundidad. 6.3.5. Esterilizar nuevamente el asa, dejarla enfriar y estriar los 3 cuadrantes restantes del medio en la forma convencional, con el objetivo de tener colonias aisladas y evitar contaminación. 6.3.6. Incubar el plato en forma invertida. 6.3.7. Seleccionar las colonias alfa o beta hemolíticas. Capítulo 17: Fundamentos fisiológicos y bioquímicos de las pruebas

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PROCEDIMIENTOS

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6.4. Control de calidad: 6.4.1. Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Resultado: Lísis total de los eritrocitos, se observa un halo transparente alrededor de la colonia. La hemólisis es mayor en las zonas de las estrías profundas. 6.4.2. Steptococcus pneumoniae ATCC 49619 Resultado: Lísis parcial de los eritrocitos, se observa un halo verde alrededor de la colonia. 6.4.3. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: No hay lísis de los eritrocitos, no hay halo alrededor de la colonia.

7. AGAR NUTRITIVO (AN). MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO:

7.1. Fundamento: Es un medio para microorganismos poco exigentes. Es utilizado con el propósito de reproducir, mantener o verificar la pureza de subcultivos antes de realizar pruebas bioquímicas y serológicas. También se utiliza para obtener cultivo con crecimiento confluente (por ejemplo, serpentiforme) cuando se necesita obtener suficiente inóculo con el propósito de realizar simultáneamente muchas pruebas.

7.2. Composición: 7.2.1. Nutrientes: Peptona de carne y extracto de carne 7.2.2. Amortiguador: Cloruro de sodio 7.2.3. Agar

7.3. Técnica de inoculación de la muestra en el medio de Cultivo 7.3.1.

Para observar la pureza del cultivo:

7.3.1.1. Rotular el plato que contiene el medio de cultivo. 7.3.1.2. Con un asa redonda y poner el inóculo de manera circular en un extremo del plato (tomar de referencia el punto donde se escribió el número de la muestra) tal que abarque un área aproximada de 1 cm de diámetro. 7.3.1.3. Dejar secar el inóculo hasta que desaparezca la humedad. 7.3.1.4. Utilizar un asa redonda esterilizada para dispersar la muestra en el primer cuadrante del plato. 7.3.1.5. Esterilizar nuevamente el asa, dejarla enfriar y estriar los 3 cuadrantes restantes del medio en la forma convencional, con el objetivo de tener colonias aisladas y evitar contaminación. 7.3.1.6. Incubar el plato en forma invertida. 7.3.1.7. Seleccionar las Unidades Formadoras de Colonias (UFCs) que va a trabajar. Verificar si las colonias que se van a trabajar están puras y no contaminadas. NOTA: A partir de la verificación la cepa se puede guardar, trabajar la bioquímica, antibiograma y serología si es necesario. 7.3.2. Para obtener un crecimiento confluente: 312


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PROCEDIMIENTOS

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7.3.2.1. Si se utiliza un medio en plato petri, dividir su parte posterior en 4 a 12 áreas iguales, empleando para ello un marcador indeleble. 7.3.2.2. Tome una UFC (cerciórese que no arrastra otra UFC) y siémbrela el área elegida en forma serpentiforme. Ver figura No. 2.

Figura No. 2: Plato dividido en 8 áreas con estriado y crecimiento en forma serpentiforme

7.3.2.1. Si se utiliza el medio en tubo de vidrio, estriar la superficie del agar con un movimiento en forma de S a medida que se retira el asa del tubo. 7.3.2.2. Incubar el tubo. 7.3.2.3. Verificar si hay suficiente crecimiento para realizar todas las pruebas. NOTA: No es conveniente guardarlas cepas a partir del crecimiento en tubo, ya que no hay suficiente y no se observa bien la pureza del microorganismo.

7.1. Control de calidad: 7.4.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Se observa un crecimiento confluente.

8. AGAR MUELLER HINTON (AMH)

8.1. Fundamento: Se usa principalmente para realizar pruebas de sensibilidad ante diferentes antimicrobianos. Es además una base apropiada para preparar Agar sangre de Carnero, obteniéndose así un medio necesario para el aislamiento primario de microorganismos de difícil crecimiento.

8.2. Composición: Nutrientes: Infusión de carne, hidrolizado de caseína, almidón, Agar. Capítulo 17: Fundamentos fisiológicos y bioquímicos de las pruebas

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PROCEDIMIENTOS

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8.3. Técnica de inoculación: Ver capítulo de susceptibilidad antimicrobiana.

8.4. Control de Calidad 8.4.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: se observa un crecimiento confluente.

III. MEDIOS BIOQUIMICOS: 1. AGAR HIERRO TRES AZUCARES O TRIPLE AZÚCARES Y HIERRO (TSI):

1.1. Fundamento: Este medio se utiliza para determinar la capacidad de los bacilos gramnegativos para fermentar lactosa, sacarosa y glucosa, así como para determinar su capacidad de producir H2S (ácido sulfhídrico). 1.1.1. Fermentación de los Carbohidratos: El medio contiene dos cámaras de reacción, en la parte inclinada se fermenta la sacarosa y la lactosa y en la parte profunda se fermenta la glucosa. Se puede fermentar los 3 carbohidratos o uno de ellos depende de la bacteria que se estudie. 1.1.2. Producción de Sulfuro de Hidrógeno: Si la bacteria tiene la enzima tiosulfatasa, reacciona con el tiosulfato de Na como una fuente de azufre para la producción del sulfuro de hidrógeno, el cual es incoloro, pero al reaccionar con sales de hierro, en este caso citrato férrico, se produce un precipitado de color negro. Para que esto ocurra debe haber un pH ácido, lo cual se consigue con la fermentación de la glucosa. 1.1.3. Producción de Gas: El primer paso es la fermentación de la glucosa, uno de cuyos productos terminales es el ácido fórmico. Si la bacteria tiene la enzima deshidrogenasa fórmica, el ácido fórmico es descompuesto en CO2 y H2.

1.2. Composición del medio: 1.2.1. Nutrientes: Peptona 1.2.2. Sustratos: Glucosa, Lactosa, Sacarosa, Sulfato Ferroso, Tiosulfato de Sodio 1.2.3. Indicador de pH: Rojo fenol 1.2.4. Temperatura de Incubación: 35-37oC 1.2.5. Tiempo de Incubación: 18-24 horas NOTA: En caso de sospechar de Salmonella Typhi hay que dejar incubar hasta 48 horas.

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DE

PROCEDIMIENTOS

SUSTRATO

DE


ENZIMA

PRODUCTO TERMINAL

Fermentación de Carbohidratos: Lactosa (glucosa + galactosa) Glucosa Sacarosa

Galactósido permeasa Galactosidasa

Acido pirúvico Acidos mixtos

Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa

Acido pirúvico Acidos mixtos

Invertasa

Acido pirúvico Acidos Mixtos

Deshidrogenasa fórmica

CO2 + H2

Tiosulfatasa

H2S (incoloro)

Producción de gas: Ac. Fórmico Producción de H2S: Tiosulfato de sodio

Precipitado de color negro

Sales de hierro Citrato de Na

1.1. Técnica de inoculación: 1.3.1. Rotular el tubo que contiene el medio de cultivo. 1.3.2. Seleccionar una UFC y tomar un inóculo con un asa recta. El inóculo debe ser tomado de la superficie de la UFC. No tome la muestra por arrastre ya que puede llevar partes de otras UFCs. 1.3.3. Introducir el asa en forma vertical hasta unos 2-3 mm antes de llegar al fondo. Tener cuidado de no tocar el fondo del vidrio del tubo porque puede entrar aire atmosférico y se anulan las condiciones de anaerobiosis. 1.3.4. Estriar la parte inclinada del agar desde el fondo a la parte superior con un movimiento en forma de S a medida que se retira el asa del tubo. 1.3.5. Incubar el tubo. 1.3.6. Leer la reacción bioquímica del medio.

1.4. Control de calidad: 1.4.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultados: A/AG Parte inclinada: Fermentación de lactosa y sacarosa*. Hay viraje de color del rojo al amarillo. Parte profunda: Fermentación de la glucosa con producción de gas abundante. Hay viraje de color del rojo al amarillo. El agar se observa fragmentado por la presencia abundante de gas. *La fermentación de la sacarosa por parte de Escherichia coli es variable. Capítulo 17: Fundamentos fisiológicos y bioquímicos de las pruebas

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PROCEDIMIENTOS

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1.4.2. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultados: K/K Parte inclinada: No hay fermentación de lactosa ni sacarosa. No hay viraje de color. Parte profunda: No hay fermentación de la glucosa, ni producción de gas. No hay viraje de color. 1.4.3. Proteus mirabilis ATCC 7002 Resultados: K/AG+ Parte inclinada: No hay fermentación de lactosa ni sacarosa. No hay viraje de color. Parte profunda: Fermentación de la glucosa con producción de gas abundante. Presencia de precipitado negro en toda la parte profunda. Hay viraje de color del rojo al amarillo el cual no se observa por la presencia del sulfuro de hidrógeno.

2. LISINA HIERRO AGAR (LIA):

2.1. Fundamento: Es un medio para detectar enzimas que descarboxilan o desaminan la lisina en bacilos gramnegativos. Adicionalmente detecta enzimas que producen sulfuro de hidrógeno y gas proveniente de la glucosa. 2.1.1. Prueba de descarboxilación de la Lisina: Si la bacteria posee la enzima descarboxilasa, la descarboxilación de la lisina produce cadaverina, un producto terminal alcalino que acentúa el color violeta del medio. Un requerimiento previo de la descarboxilación es un pH ácido, el cual se logra con la fermentación de la glucosa. Esta reacción se lleva a cabo en anaerobiosis, por lo que se observa en la parte profunda del medio. 2.1.2. Prueba de desaminación de la Lisina: La desaminasa de la lisina actúa solo en ambiente de aerobiosis por lo que se verá en la parte inclinada. La desaminación de la lisina termina en productos cetoácidos que en combinación con el Fe+++, (proveniente del citrato de amonio férrico) hacen que la molécula combinada se observe de color rojo intenso. El indicador de pH no interviene en este caso. Por esta razón, la lectura de esta reacción no se abrevia con los símbolos de ácido (A) sino como R (rojo). No existen enterobacterias que posean las dos enzimas (descarboxilasa y desaminasa de la lisina) por lo que sólo se tiene que observar, o una de ambas reacciones o la ausencia de ambas. Cuando no hay desaminasa ni descarboxilasa, en la parte inclinada se observará una alcalinización del medio por crecimiento y muerte bacteriana, la cual hará que esta parte se observe de color violeta (K) y en la parte profunda, acidificación por los productos terminales de la fermentación de la glucosa. En este caso, la parte profunda se observará de color amarillo (A). 2.1.3. Producción de Sulfuro de Hidrógeno: La presencia de la enzima tiosulfatasa actuará sobre el tiosulfato de sodio y se producirá H2S, que en presencia del hierro proveniente del citrato de amonio férrico, formarán un precipitado de color negro. 2.1.4. Producción de Gas: La presencia de la enzima deshidrogenasa fórmica actuará sobre el ácido fórmico proveniente de la fermentación de la glucosa y en consecuencia, habrá gas de CO 2 y H2. 316


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


2.2. Composición: 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.2.4. 2.2.5.

Nutriente: Peptona Sustratos: Lisina, glucosa, citrato de amonio férrico, tiosulfato de sodio Indicador de pH: Rojo fenol Temperatura de Incubación: 35-37oC Tiempo de incubación: 18-24 horas

SUSTRATO

ENZIMA

PRODUCTO TERMINAL

Descarboxilación o desaminación de la lisina: Lisina Lisina

Lisina Decarboxilasa Lisina Desaminasa

Cadaverina Ácido acetocarbónico

Fermentación de carbohidratos: Glucosa

Glucosa 6 fosfato Deshidrogenasa

Ácido pirúvico Ácidos mixtos

Deshidrogenasa fórmica

CO2

Tiosulfatasa

H2S (incoloro)

Producción de gas: Ácido Fórmico Producción de H2S Tiosulfato de sodio Precipitado de color negro

Sales de hierro

2.3. Técnica de inoculación: 2.3.1. Rotular el tubo que contiene el medio de cultivo. 2.3.2. El medio debe ser inoculado con la misma UFC que se sembró en TSI. 2.3.3. Introducir el asa ven forma vertical hasta unos 2-3mm antes de llegar al fondo. Tener cuidado de no tocar el fondo del vidrio del tubo porque puede entrar aire atmosférico y se anulan las condiciones de anaerobiosis. Repetir dos veces mas este procedimiento, de tal manera que las tres punciones se hagan en los vértices de un triángulo imaginario. 2.3.4. Estriar la parte inclinada del agar desde el fondo a la parte superior con un movimiento en forma de S a medida que se retira el asa del tubo. 2.3.5. Incubar el tubo. 2.3.6. Leer la reacción bioquímica del medio.


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


2.4. Control de calidad: 2.4.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultados: K/Kg Parte inclinada: No hay desaminación de la lisina. El medio no vira de color. Se observa violeta. Parte profunda: Descarboxilación de la lisina positiva. Fermentación de la glucosa con producción moderada de gas. No se observa el viraje de la acidificación de la glucosa por la alta producción de cadaverina. No hay viraje de color. El medio se observa violeta y turbio. El medio se observa fragmentado por la presencia moderada de gas. 2.4.2. Shigella flexneri OPS 45 Resultados: K/A Parte inclinada: No hay desaminación de la lisina. El medio no vira de color. Se observa violeta. Parte profunda: No hay descarboxilación de la lisina, ni producción de gas ni H2S. Hay viraje de color del violeta al amarillo. 2.4.3. Proteus mirabilis ATCC 7002 Resultados: R/Ag+ Parte inclinada: Desaminación de la lisina positiva. Hav viraje de color del violeta al rojo intenso. Parte profunda: No hay descarboxilación de la lisina. La fermentación de la glucosa hace virar el medio del violeta al amarillo. Se produce gas y un precipitado de color negro por la presencia del sulfuro de hidrógeno.

3. MOVILIDAD, INDOL, ORNITINA (MIO):

3.1. Fundamento: Es un medio que se utiliza para determinar la presencia de flagelos, así como las enzimas descarboxilasa de ornitina y triptofanasa. Por lo tanto, sirve para determinar la movilidad, descarboxilación de la orinitina y producción de indol. 3.1.1. Movilidad: Algunas bacterias poseen flagelos y otras carecen de ellos. Este medio ayuda a diferenciar las móviles de las no móviles. 3.1.2. Producción de Indol: Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, el aminoácido triptófano será degradado en varios productos entre los cuales está el indol, el cual se hace visible al agregarle el reactivo de Kovac (pdimetilaminobenzaldehido) o Erlich con un color rosado intenso. Sin la presencia de la enzima y ausencia del indol, el reactivo se ve transparente. 3.1.3. Descarboxilación de la ornitina: Detecta la presencia de la enzima descarboxilasa de la ornitina, que de estar presente desdobla la ornitina en putrescina, un producto con pH alcalino, lo que hace instensificar el color violeta del medio.

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


3.2. Composición: 3.2.1. 3.2.2. 3.2.3. 3.2.4. 3.2.5.

Nutrientes: Peptona Sustratos: Ornitina, glucosa y triptofano. Indicador de pH: Púrpura de bromocresol Temperatura de Incubación: 35-37oC Tiempo de Incubación: 18-24 horas

SUSTRATO

ENZIMA

PRODUCTO TERMINAL

Triptófano

Triptofanasa

Indol

Orinitina

Ornitina descarboxilasa

Putrescina

Glucosa

Glucosa 6-fosfato Deshidrogenasa

Acidos mixtos Acido pirúvico

3.3. Técnica de inoculación: 3.3.1. Rotular el tubo que contiene el medio de cultivo. 3.3.2. Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA. 3.3.3. Introducir el inóculo en forma vertical, en un trayecto de 0.5cm, si el tubo contiene 2mL de MIO. 3.3.4. Retirar el asa a lo largo de la misma línea de punción del agar. 3.3.5. Incubar el tubo. 3.3.6. Leer la reacción bioquímica del medio. Para ver si hubo producción de indol se agregan 2 gotas del reactivo de Kovac. La presencia de indol se detecta por un rápido aparecimiento de un color rosado intenso en la parte superior del medio. NOTA: Un movimiento excesivo del asa puede dar como resultado un patrón de crecimiento a lo largo de la línea de punción, que puede ser interpretada falsamente como movilidad positiva, al igual que una punción mas profunda que lo indicado.

3.4. Control de calidad: 3.4.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Movilidad positiva: Se observa turbidez difusa en el medio Producción de indol positiva: Al agregar dos gotas del reactivo de Kovac aparece rápidamente un anillo de color rosado intenso. Descarboxilación de la ornitina positiva: El medio no vira de color. Se observa de color violeta. 3.4.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Resultado: Movilidad negativa: Sólo hay crecimiento a lo largo de la punción del inóculo. El medio se observa transparente. Producción de indol negativa: Al agregar dos gotas del reactivo de Kovac no hay viraje de color. El reactivo aparece transparente.


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PROCEDIMIENTOS

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Descarboxilación de la ornitina negativa: El medio vira de color del violeta al amarillo, más intenso en la parte profunda.

4. UREA DE CRHISTENSEN:

4.1. Fundamento: Detecta la presencia de la enzima ureasa. Cuando la bacteria tiene la enzima, la urea es desdoblada a amonio y CO2. El amonio alcaliniza el medio haciendo virar el indicador al rosado intenso.

4.2. Composición: 4.2.1. 4.2.2. 4.2.3. 4.2.4. 4.2.5. 4.2.6.

Nutriente: Peptona Sustratos: Urea Amortiguadores: Cloruro de sodio, fosfato de potasio monobásico Indicador de pH: Rojo fenol Temperatura de incubación: 35-37oC Tiempo de incubación: 18-24 horas. Máximo 4 días

SUSTRATO

ENZIMA

PRODUCTO TERMINAL

Urea

ureasa

NH4 (Amonio)

4.3. Técnica de inoculación: 4.3.1. Rotular el tubo que contiene el medio de cultivo. 4.3.2. Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA. 4.3.3. Estriar la superficie del agar desde el fondo a la parte superior con un movimiento en forma de S, a medida que retira el asa del tubo. 4.3.4. Incubar el tubo. 4.3.5. Leer la reacción bioquímica del medio.

4.4. Control de calidad: 4.4.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Ureasa negativa: no hay viraje de color. 4.4.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Resultado: Ureasa positiva: hay viraje de color a rosado intenso.

5. CITRATO DE SIMONS:

5.1. Fundamento: Determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el citrato como única fuente de carbono.

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


5.2. Composición: 5.2.1. 5.2.2. 5.2.3. 5.2.4. 5.2.5.

Sustrato: Citrato de Na, fosfato de amonio monobásico. Amortiguadores: Fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio, sulfato de magnesio. Indicador de pH: Azul de bromotimol Temperatura de incubación: 35-37oC Tiempo de Incubación: 24 – 48 horas. Máximo 4 dias

SUSTRATO

ENZIMA

Citrato

Citratasa

PRODUCTO TERMINAL Hidróxido de Na y Carbonato de sodio

5.3. Técnica de inoculación: 5.3.1. Rotular el tubo que contienen el medio de cultivo. 5.3.2. Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA. 5.3.3. Estriar la superficie del agar desde el fondo a la parte superior con un movimiento de ida y vuelta en forma de S a medida que se retira el asa del tubo. 5.3.4. Incubar el tubo. 5.3.5. Leer la reacción bioquímica del medio.

5.4. Control de calidad: 5.4.1. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Resultado: Citrato positivo: No hay crecimiento ni viraje de color. Se observa de color verde. 5.4.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Citrato negativo. Viraje de color del verde al azul y crecimiento en la superficie.

6. ACETATO DE SODIO:

6.1. Fundamento: Es un medio sintético en el que la única fuente de carbono y de energía es el acetato. Su utilización ocurre en aerobiosis, resultando en alcalinización del medio con el consiguiente viraje del indicador de pH de verde a azul.

6.2. Composición: Sustrato: Acetato de sodio. Amortiguadores: Cloruro de sodio, sulfato de magnesio, fosfato de amonio monobásico, fosfato de potasio dibásico. Indicador de pH: Azul de bromotimol.

6.3. Técnica de inoculación: 6.3.1. Rotular el tubo que contienen el medio de cultivo.


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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


6.3.2. Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA. 6.3.3. Estriar la superficie del agar desde el fondo a la parte superior con un movimiento serpentiforme a medida que se retira el asa del tubo. 6.3.4. Incubar el tubo de 35 o a 37oC por 7 días, revisando diariamente la presencia de cambios en la reacción.

6.4. Control de calidad: 6.4.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Hay viraje de color del verde al azul. El viraje de color se observa a las 24 horas. Crecimiento en la superficie del medio. 6.4.2. Shigella flexneri OPS 45 Resultado: No hay crecimiento en la superficie del medio ni viraje de color en 7 días. El medio se observa de color verde.

7. MALONATO Y FENILALANINA DESHIDROGENASA (CALDO MALONATO FENILALANINA):

7.1. Fundamento: Evalúa la capacidad del microorganismo de utilizar el malonato como única fuente de carbono y la desaminación de la fenilalanina, en forma combinada. Las enterobacterias no tienen la capacidad enzimática de realizar las dos reacciones simultáneamente, por lo que, o se observa la utilización del malonato o la desaminación de la lisina. Las bacterias que no utilizan el malonato no poseen la enzima fenilalanina desaminasa, por lo que es posible reacciones de malonato y fenilalanina desaminasa negativas.

7.2. Composición: 7.2.1. Nutriente: Extracto de levadura. 7.2.2. Sustrato: Malonato de sodio y L-fenilalanina. 7.2.3. Amortiguadores: Fosfato de potasio mono básico, fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio. 7.2.4. Indicador de pH: Azul de bromotimol. 7.2.5. Temperatura de incubación: 35-37oC. 7.2.6. Tiempo de incubación: 18-24 horas, máximo 2 días. SUSTRATO

ENZIMA

PRODUCTO TERMINAL

Fenilalanina

Fenilalanina desaminasa

Acido fenil pirúvico

Compuesto de color verde musgo

HCl + Hierro III

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DE

PROCEDIMIENTOS

DE


7.3. Técnica de inoculación: 7.3.1. Rotular el tubo que contiene caldo. 7.3.2. Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA. 7.3.3. Inclinar el tubo e inocularlo, tocando la superficie interna del tubo, en el ángulo agudo del menisco formado por el caldo. 7.3.4. Incubar el tubo. 7.3.5. Leer la reacción bioquímica del medio.

7.4. Utilización del Malonato: 7.4.1. Control de Calidad: 7.4.1.1. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Resultado: Malenato positivo. Hay viraje de color del verde claro al azul intenso. 7.4.1.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Malenato negativo. No hay viraje de color. El medio conserva su color verde.

7.5. Desaminación de la fenilalanina: Si el malonato es negativo se realiza la prueba de fenillalanina, agregando 1 gota de HCl (Ácido clorhídrico). En este momento el caldo se torna amarillo y luego 2 gotas de Fe2Cl3 (Cloruro férrico). 7.5.1. Control de Calidad: 7.5.1.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: No hay viraje de color. El medio se observa de color amarillo. 7.5.1.2. Proteus mirabilis ATCC 25933 Resultado: Hay viraje de color del verde claro al verde musgo

8. ROJO DE METILO (RM):

8.1. Fundamento: Esta prueba permite diferenciar 2 vías metabólicas para la utilización de la glucosa: ácido mixta y butanodiólica. Las bacterias RM positivas producen grandes cantidades de ácidos, capaces de disminuir el pH < 4.4. Las bacterias RM negativas continúan metabolizando los ácidos hasta productos neutrales que causan una reversión del pH inicial hasta 6.0. Este comportamiento diferencial se pone en evidencia al agregar un indicador de pH (Rojo de Metilo) que vira de color al rojo si el pH del medio es menor de 4.4 o no varía de color si el pH está por encima de ese valor o es amarillo si el pH es > 6.2

8.2. Composición: 8.2.1. Nutriente: Peptonas 8.2.2. Sustrato: Glucosa Capítulo 17: Fundamentos fisiológicos y bioquímicos de las pruebas

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PROCEDIMIENTOS

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8.2.3. Amortiguador: Fosfato de potasio dibásico 8.2.4. Temperatura de Incubación: 35-37oC 8.2.5. Tiempo de Incubación: 18-24 horas

8.3. Técnica de inoculación: 8.3.1. Rotular el tubo que contiene el caldo. 8.3.2. Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA. 8.3.3. Inclinar el tubo e inocularlo, tocando la superficie interna del tubo, en el ángulo agudo del menisco formado por el caldo. 8.3.4. Incubar el tubo. 8.3.5. Agregar dos gotas de rojo de metilo. 8.3.6. Leer la reacción inmediatamente

8.4. Control de calidad: 8.4.1. Proteus mirabilis ATCC 25933 Resultado: Rojo de metilo positivo. Inmediatamente se observa un anillo color rojo en la superficie del medio al agregar 2 gotas de rojo de metilo. 8.4.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Rojo de metilo negativo. Se observa anillo color amarillo en la superficie del medio al agregar dos gotas de rojo de metilo.

9. VOGUES PROSKAUER (VP):

9.1. Fundamento: Evalúa la utilización de la glucosa por una vía alterna a la del ácido pirúvico.El producto terminal es el acetil metil carbinol (acetoína, 3-hidroxi-2-butanona), un compuesto incoloro que es detectado en dos pasos: 1. alcalinización del medio con hidróxido de potasio (KOH al 40%). En presencia de oxígeno, el compuesto vira a lo cual provoca, en presencia del Oxigeno, la oxidación del Acetil-Metil-Carbinol a diacetilo. 2. Al agregarle alfanaftol, el diacetilo vira a un color zapote intenso.

9.2. Composición: 9.2.1. 9.2.2. 9.2.3. 9.2.4. 9.2.5.

Nutriente: Peptonas Sustrato: Glucosa Amortiguador: Fosfato de potasio dibásico Temperatura de incubación: 35-37oC Tiempo de incubación: 18-24 horas

9.3. Técnica de inoculación: 9.3.1. Rotular el tubo que contiene el caldo. 9.3.2. Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA. 324


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PROCEDIMIENTOS

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9.3.3. Inclinar el tubo e inocularlo, tocando la superficie interna del tubo, en el ángulo agudo del menisco formado por el caldo. 9.3.4. Incubar el tubo. 9.3.5. Agregar 4 gotas de KOH al 40%. 9.3.6. Agregar 6 gotas de alfanaftol. 9.3.7. Leer la reacción después de 30 minutos.

9.4. Control de calidad: 9.4.1. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Resultado: Producción de acetilmetilcarbinol positiva: se observa un anillo de color zapote intenso en la superficie del medio. 9.4.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Producción de acetilmetilcarbinol negativa: se observa anillo color amarillo en la superficie del medio.

10. MUCATO:

10.1. Fundamento: El mucato es una sal del ácido múcico que es utilizado por algunas bacterias como única fuente de carbono. A diferencia del citrato y malonato, los productos terminales acidifican el medio, lo cual hace virar el indicador de pH del azul al amarillo.

10.2. Composición: 10.2.1. 10.2.2. 10.2.3. 10.2.4. 10.2.5.

Nutrientes: Peptona Sustrato: Ácido múcico Indicador de pH: Azul de bromotimol Temperatura de incubación: 35-37 oC Tiempo de incubación: 48 horas.

10.3.

Técnica de inoculación:

10.3.1. 10.3.2. 10.3.3. 10.3.4. 10.3.5. 10.3.6.

Rotular el tubo que contiene caldo. Con una asa recta, tomar el inóculo reciente del agar nutritivo o TSA. Homogenizar en el caldo, un pequeño inóculo de la cepa pura y reciente. Inclinar el tubo e inocularlo, tocando la superficie interna del tubo, en el ángulo. Incubar el tubo. Leer la reacción bioquímica del medio.

10.4.

Control de calidad:

10.4.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Mucato positivo. Viraje del color del azul al verde claro o amarillo. Capítulo 17: Fundamentos fisiológicos y bioquímicos de las pruebas

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10.4.2. Proteus mirabilis ATCC 7002 Resultado: Mucato negativo. No hay viraje de color. El caldo se observa de color azul.

11.ORTO-NITRO PARA-FENIL GALACTOSIDASA (ONPG):

11.1. Fundamento: Las bacterias fermentadoras de lactosa poseen tanto lactosa permeasa como β-galactosidasa, dos enzimas necesarias para la producción de ácido en la prueba de fermentación de la lactosa. La permeasa es necesaria para que la molécula de lactosa pueda penetrar en el interior de la célula bacteriana, donde la β-galactosidasa puede degradar el enlace galactósido, produciendo glucosa y galactosa. Las bacterias no fermentadoras de lactosa, carecen de ambas enzimas y son incapaces de producir ácido a partir de la lactosa. Las bacterias fermentadoras lentas de lactosa carecen de la enzima β-galactósido permeasa, o su actividad es deficiente; pero poseen la enzima β-galactosidasa y dan reacción de ONPG positiva. La prueba ONPG detecta la enzima β-galactosidasa mucho más rápido que la misma prueba de fermentación de lactosa. Y es útil para la identificación de los fermentadores tardíos de la lactosa deficientes en β-galactósido permeasa. - La o-nitrofenil-β-D- galactopiranósido (ONPG) es similar a la lactosa, excepto porque la glucosa ha sido sustituida por un grupo orto-nitrofenilo. - El ONPG permeabiliza la pared bacteriana más rápidamente que la lactosa y bajo la acción de la β-galactosidasa (que si poseen los fermentadores lentos de lactosa), se hidroliza a galactosa y o-nitrofenol. - El o-nitrofenol es un compuesto que no tiene color cuando está unido al D-galactopiranósido, pero es amarillo en su forma libre (no unido), lo que permite la visualización de la hidrólisis.

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Véase siguiente diagrama:

ONPG o-nitrofenilo Enlace galactósido galactosa ß -galactósido permeasa deficiente (bacteria fermentadora tardía de lactosa Pared bacteriana

ß - galactosidasa

o-nitrofenilo

galactosa

galactosa

o-nitrofenilo libre ( compuesto amarillo) ONPG positivo

11.2. Composición: 11.2.1. Sustrato: O-nitrofenil-β-galactopianósido. 11.2.2. Termperatura de incubación: 35-37oC. 11.2.3. Tiempo de incubación: 18-24 horas.

11.3. Técnica de inoculación: 11.3.1. En un tubo que contenga 0.5 mL de agua destilada estéril, agregar un inóculo de la cepa problema. Hacer una suspensión cuya densidad debe ser mayor que la escala 0.5 de MacFarland. 11.3.2. Agregar a esta suspensión el disco de ONPG.

11.4. Control de calidad: 11.4.1. Escerichia coli ATCC 25922 Resultado: ONPG positivo. Viraje de color al amarillo. 11.4.2. Proteus mirabilis ATCC 7002 Resultado: ONPG negativo. No hay viraje de color. El agua se observa turbia. Capítulo 17: Fundamentos fisiológicos y bioquímicos de las pruebas

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12.FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN CALDO:

12.1. Fundamento: Esta prueba sirve para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar los carbohidratos (azúcares) produciendo ácidos o ácidos y gas visibles. Se utiliza una base rica en nutrientes, cuyo indicador de pH es el púrpura de bromocresol. El carbohidrato requerido se agrega, ya sea en forma de discos comerciales impregnados o adicionando al caldo el carbohidrato previamente esterilizado por filtración. La ventaja de usar discos es que la base sirve para todos los carbohidratos y que este se agrega al momento de ser requerido. Para observar la formación de gas deben colocarse en forma invertida tubos de Durham, cerciorándose que el tubo quede completamente sumergido en el caldo.

12.2. Composición: 12.2.1. 12.2.2. 12.2.3. 12.2.4. 12.2.5. 12.2.6. 12.3. 12.3.1. 12.3.2. 12.3.3.

Nutriente: Peptonas y extracto de carne Sustrato: Carbohidrato adicionado según el lote a preparar. Amortiguador: Cloruro de sodio Indicador de pH: Púrpura de bromocresol Temperatura de Incubación: 35-37oC Tiempo de Incubación: 18-24 horas si esta negativo se deja hasta 7 días. Técnica de inoculación Rotular el tubo que contiene el caldo de púrpura de bromocresol simple. Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA. Inclinar el tubo e inocularlo, tocando la superficie interna del tubo, en el ángulo agudo del menisco formado por el caldo. 12.3.4. Si el caldo utilizado no contiene el carbohidrato, proceda a tomarlo del frasco comercial que lo contiene. Utilice una pinza previamente flameada para extraerlo del frasco. Auxíliese de otra pinza (previamente flameada) para doblarlo e introdúzcalo hasta el fondo del caldo. 12.3.5. Incubar el tubo. 12.3.6. Leer la reacción bioquímica del medio.

12.4. Control de calidad: 12.4.1. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Fermentación positiva: Dependiendo del carbohidrato. Hay viraje de color del violeta al amarillo. Puede observarse o no gas en el tubo de Durham. El caldo se observa de color violeta y el tubo de Durham se observa sin caldo o con pequeñas burbujas de gas en la parte superior (presencia de gas) o completamente lleno de caldo (ausencia de gas). Fermentación negativa: Dependiendo del carbohidrato. No hay viraje de color ni se observa gas en el tubo de Durham. El caldo se observa de color violeta y el tubo de Durham se observa lleno de caldo.

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12.CALDO DE MOELLER PARA DETERMINAR DESCARBOXILACIÓN DE AMINOÁCIDOS:

13.1. Fundamento: La base para descarboxilasa de Moeller se emplea para la diferenciación bioquímica de los bacilos entericos y microorganismos a fines, mediante pruebas que involucran la descarboxilación de los aminoácidos. Los aminoacidos más empleados son: Lisina, Ornitina y Arginina las cuales se agregan para obtener una concentración final de 1 o 2% en el medio base. Los aminoacidos se esterilizan por filtración, ya que la esterilización por calor desnaturaliza las proteinas. A diferencia de la base de carbohidratos, la de Moeller lleva glucosa con el propósito de discriminar entre las reacciones positivas de las negativas. Una reacción de descarboxilación de aminoacidos alcaliniza el medio (contrario a los carbohidratos) por lo que el púrpura de bromocresol no variará significativamente de color. Si la bacteria no descarboxila el aminoacido contenido en el caldo, fermentará la glucosa produciendo ácidos que harán virar el púrpura de bromocresol al amarillo. De esta manera, el color púrpura indica descarboxilación y amarillo ausencia de descorboxilación. La prueba de descarboxilación requiere de una atmósfera libre de oxígeno, por lo que el medio ya inoculado debe sellarse con aceite mineral estéril. El medio tiene incorporado un indicador de pH combinado (púrpura de bromocresol y rojo cresol).

13.2. Composición del medio: 13.2.1. Nutrientes: Peptonas, extracto de levadura, piridoxal. 13.2.2. Sustrato: Aminoácido según requerimiento. Dextrosa (glucosa) para discriminar los positivos de los negativos. 13.2.3 Indicador de pH: Púrpura de bromocresol y rojo cresol. 13.2.4. Temperatura de Incubación: 35-37oC. 13.2.5. Tiempo de Incubación: 18-24 horas. SUSTRATO

ENZIMA

PRODUCTO TERMINAL

Lisina

lisina decarboxilasa

Cadaverina

Ornitina

ornitina descarboxilasa

Putrecina

Arginina

arginina dehidrolasa

Citrulina

NOTA: El producto terminal de la arginina (citrulina) es convertido en ornitina, luego se da la descarboxilación y como producto final resulta la putrecina. Las descarboxilasas son un grupo de enzimas que actúan sobre sustratos específicos, capaces de reaccionar con el residuo carboxilo (COOH) de los aminoácidos para formar aminas alcalinas. Cada enzima descarboxilasa es específica para cada aminoácido.


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13.3. Técnica de inoculación: 13.3.1. Rotular el tubo que contiene el caldo. 13.3.2. Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA. 13.3.3. Inclinar el tubo e inocularlo, tocando la superficie interna del tubo, en el ángulo agudo del menisco formado por el caldo. 13.3.4. Volver el tubo a la posición vertical, lo cual tiene el efecto de sumergir el punto de inoculación bajo la superficie. 13.3.5. Agregue de 5 a 10 gotas de aceite mineral estéril. 13.3.6. Incubar el tubo. 13.3.7. Leer la reacción bioquímica del medio.

13.4. Control de Calidad 13.4.1. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Descarboxilación de lisina positiva: El caldo no vira de color. Se observa de color púrpura. Descarboxilación de arginina negativa: El caldo vira de color del violeta al amarillo. Descarboxilación de ornitina negativa: El caldo vira de color del violeta al amarillo. 13.4.2. Proteus mirabilis ATCC 7002 Resultado: Descarboxilación de lisina negativa: El caldo vira de color del violeta al amarillo. Descarboxilación de arginina negativa: El caldo vira de color del violeta al amarillo. Descarboxilación de ornitina positiva: El caldo no vira de color. Se observa de color púrpura.

IV. MEDIOS DE CULTIVO PARA BACILOS GRAMNEGATIVOS NO FERMENTADORES: 1. PRUEBA DE OXIDASA:

1.1. Fundamento: El tetrametil-parafenilendiamina dihidrocloruro al 1% se emplea para la determinación de la citocromooxidasa. Este reactivo sustituye al oxígeno como aceptor de electrones para la respiración bacteriana, proceso que se lleva a cabo en la membrana celular. En su estado reducido es incoloro, pero en presencia de la enzima citocromooxidasa se oxida formando el azul de indofenol, visible en los primeros 10 segundos de la prueba.

1.2. Procedimiento: Realice la prueba a partir de un cultivo de 18-24 horas de un medio que no contenga azúcares, ni sangre. 1.2.1. Utilizando un palillo de madera tome una UFC del plato donde ha sido reproducida la bacteria en estudio (agar nutritivo, Mueller Hinton, agar BHI). 1.2.2. Disperse la colonia sobre la tira. 1.2.3. Descarte el palillo en el contenedor conteniendo cloro. 230


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1.2.4. El desarrollo de un color de morado a púrpura en los primeros 10 segundos, indica una reacción positiva. La prueba no debe leerse en un tiempo mayor ya que el oxígeno atmosférico interferirá oxidando el reactivo y dando resultados falsos positivos. NOTA: El crecimiento en un medio que se ha acidificado debido a la fermentación de carbohidratos no debe emplearse ya que la acidez inhibe la enzima citocromo oxidasa.

1.3. Control de calidad: 1.3.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Positivo. Presencia de la enzima indofenoloxidasa. Se observa un color púrpura en la tira reactiva el cual aparece en los primeros 10 segundos. 1.3.2. Escherichia coli ATCC 2592 Resultado: Negativo. Ausencia de la enzima indofenoloxidasa. No hay viraje de color en la tira reactiva.

2. PRUEBA DE MOVILIDAD AL FRESCO

2.1. Fundamento de la prueba: Las bacterias se mueven por medio de flagelos, cuyo número y localización varían entre los diferentes géneros y especies. Las Pseudomonas poseen uno o más flagelos polares, pero la especie aeruginosa sólo posee 1 flagelo polar. La movilidad en fresco se realiza como procedimiento de primera elección para detectar la movilidad de especies bacterianas que no crecen bien en agar semisólido.

2.2. Procedimiento: En un portaobjetos limpio, colocar una gota de solución salina estéril al 0.85%. 2.2.1. Con un palillo de madera tomar una colonia o un pequeño inóculo de la cepa y mezclarlo con la solución salina. Asegúrese de no excederse en la cantidad de inóculo para evitar una falsa interpretación de la movilidad. 2.2.2. Coloque sobre la mezcla un cubreobjetos y obsérvelo al microscopio con objetivo 40X.



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3. GLUCOSA OF (OXIDACIÓN-FERMENTACIÓN):

3.1. Fundamento del medio de cultivo: Los medios bioquímicos usados para las bacterias fermentativas no pueden ser aplicados a las bacterias oxidativas que producen ácidos débiles insuficientes para hacer virar el indicador de pH y debido a esto, Hugh y Leifson diseñaron un medio OF (oxidativo-fermentativo) que se adapta a las propiedades de los bacilos gramnegativos no fermentadores. Los bacilos gramnegativos fermentadores oxidativos utilizan vías alternativas a la vía de EmbdenMeyerhof a través de las cuales es oxidada la glucosa. El término oxidación significa la forma en que el ácido pirúvico transfiere sus iones hidrógeno. Al carecer de la enzimas deshidrogenasas, necesarias para oxidar el ácido pirúvico a ácido láctico y otros ácidos mixtos, las bacterias oxidativas transfieren los iones hidrógeno del ácido pirúvico al ciclo de Krebs, donde se une al oxígeno para formar agua. Este medio es útil para la diferenciación de microorganismos no fermentadores. La consistencia semisólida del agar, el uso de azul bromotimol como indicador de pH y la inclusión de una pequeña cantidad de buffer de difosfato están destinados a aumentar la detección de ácidos.

3.2. Composición: 3.2.1. 3.2.2. 3.2.3. 3.2.4.

Nutrimentos: Peptona. Sustrato: Glucosa. Amortiguadores: Cloruro de sodio y fosfato de potásico dibásico. Indicador de pH: Azul de bromotimol.

3.3. Procedimiento: 3.3.1. Rotular con la muestra los dos tubos necesarios para la prueba OF (oxidativo-fermentativo). 3.3.2. Con un asa recta, inocular una buena carga de la bacteria, introduciendo el asa hasta el fondo del tubo. 3.3.3. Utilizando el mismo inóculo, siembre otro tubo, de la misma manera que el anterior. 3.3.4. Con un gotero, deje caer 9 gotas (0.5 mm) de aceite mineral estéril, a uno de los tubos inoculados. Esto favorecerá un ambiente anaerobio. 3.3.5. Deje sin apretar el tapón de rosca del tubo sin aceite mineral para favorecer un ambiente aerobio. 3.3.6. Incubar ambos tubos a 35 oC por 24 horas.

3.4. Control de calidad: 3.4.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Oxidación de la glucosa positiva. Se observa viraje de color al amarillo en la parte superior del tubo sin aceite mineral (reacción en aerobiosis). No hay actividad en el tubo con aceite mineral (reacción en anaerobiosis). No hay viraje de color. 3.4.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Oxidación de la glucosa negativa. Fermentación de la glucosa positiva. Hay viraje de color a lo largo de los dos tubos (aerobiosis y anaerobiosis). 332


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4. AGAR P:

4.1. Fundamento del medio de cultivo: El agar P contiene digestivo pancreático de gelatina que proveen aminoácidos y magnesio, potasio y iones sulfato que realzan la producción de piocianina. La piocianina es un pigmento azul verde o azul turquesa no fluorescente que se difunde alrededor del crecimiento de Pseudomonas aeruginosa. Algunas cepas pueden producir pequeñas cantidades de pioverdina o fluoresceína.

4.2. Composición: Nutrimentos: Digestivo pancreático de gelatina. Suplementos: Sulfato de potasio, cloruro de magnesio.

4.3. Procedimiento: 4.3.1. 4.3.2. 4.3.3. 4.3.4. 4.3.5.

Rotular el tubo. Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA y estriar en forma serpentina. Dejar el tapón de rosca semiabierto para favorecer un ambiente aerobio. Incubar el tubo a 36 oC durante 18 a 24 horas, máximo por 2 días. Finalizada la incubación, observar la presencia de un pigmento de color azul en toda la zona de crecimiento.

Resultados: Producción de piocianina positiva: Presencia de un pigmento azul-verde o azul turquesa sobre el crecimiento bacteriano. Producción de piocianina negativa: Ausencia de un pigmento azul-verde o azul turquesa sobre el crecimiento bacteriano.

4.4. Control de calidad: 4.4.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Producción de piocianina positiva: Se observa un pigmento verde azulado o azul turquesa sobre el crecimiento bacteriano. 4.4.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Producción de piocianina negativa: Se observa crecimiento sin pigmento.

5. AGAR F:

5.1. Fundamento del medio de cultivo: Ver Agar P. El agar F realza la elaboración de pioverdina o fluoresceína e inhibe la formación de piocianina, por acción de los fosfatos que estimulan la formación del pigmento pioverdina.

5.2. Composición: Nutrimentos: Digestivo pancreático de caseína y péptico de tejido de animal. Suplementos: Fosfato de potasio dibásico y sulfato de magnesio. Capítulo 17: Fundamentos fisiológicos y bioquímicos de las pruebas

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5.3. Procedimiento: 5.3.1. 5.3.2. 5.3.3. 5.3.4. 5.3.5.

Rotular el tubo que contiene el agar inclinado. Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA y estriar en forma serpentiforme. Dejar el tapón de rosca semiabierto para favorecer un ambiente aerobio. Incubar el tubo a 36 oC por 18 a 24 horas, máximo por 2 días. Finalizada la incubación, observar con una lámpara de ultravioleta (luz de Wood), la presencia de fluorescencia.

5.4. Control de calidad: 5.4.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Producción de piocianina positiva: Se observa fluorescencia verde amarillenta en toda la zona de crecimiento bacteriano cuando el tubo se expone a luz ultravioleta. 5.4.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Producción de piocianina negativa: Se observa crecimiento sin fluorescencia cuando el tubo se expone a luz ultravioleta.

6. CRECIMIENTO EN AGAR CETRIMIDA:

6.1. Fundamento del medio de cultivo: La cetrimida un agente químico que actúa como detergente catiónico disminuyendo la tensión superficial en el medio. Como resultado, muchas bacterias son inhibidas por esta acción. La presencia de cloruro de magnesio y sulfato de potasio estimulan la formación del pigmento azul verde o azul turquesa no fluorescente piocianina y el pigmento verde-amarillo fluorescente de pioverdina que puede ser detectado bajo luz ultravioleta de onda larga (400nm.)

6.2. Composición: 6.2.1. Nutrimientos: Peptona de gelatina. 6.2.2. Suplementos: Cetrimida (Bromuro de cetil-trimetil-amonio). 6.2.3. Cloruro de magnesio y sulfato de potasio.

6.3. Procedimiento: 6.3.1. 6.3.2. 6.3.3. 6.3.4.

Rotular el plato. Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA y estriar en forma serpentiforme. Incubar a 36 oC durante 18 a 24 horas, máximo por 2 días. Finalizada la incubación, observar con una lámpara de de Wood, la presencia de fluorescencia.

6.4. Control de calidad: 6.4.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Crecimiento en cetrimida positivo: Hay buen crecimiento con pigmento azul verde o azul turquesa no fluorescente y verde amarillento fluorescente que detecta la pioverdina o fluoresceína en presencia de luz ultravioleta. 334


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6.4.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Crecimiento en cetrimida negativo. No hay crecimiento.

7. REDUCCIÓN DE NITRATOS:

7.1. Fundamento del medio de cultivo: El caldo de nitrato es útil en la identificación de microorganismos aerobios y anaerobios facultativos gramnegativos -

La presencia de nitritos en el medio de prueba se detecta al agregar el reactivo A (alfa naftilamina) y B (ácido sulfanílico) en igual proporción, éstos detectan los nitritos con formación de un colorante rojo intenso de diazonio, (para-sulfobencenoazo-alfa naftilamina) después de 1 a 2 minutos, lo cual indica que los nitratos fueron reducidos a nitritos (reacción positiva).

-

Si no se observa color después del agregado de los reactivos de prueba, indica que no se han reducido nitratos a nitritos (reacción negativa) o que han sido reducidos a productos diferentes a los nitritos como amoníaco (NH3), nitrógeno molecular (N 2) (desnitrificación), óxido nítrico (ON) u óxido nitroso (N2O) e hidroxilamina. Debido a que los reactivos sólo detectan nitritos, es necesario agregar una pequeña cantidad (aproximadamente 20 mg) de polvo de cinc a todas las reacciones negativas (incoloras) para confirmar que son verdaderamente negativas. Los iones cinc reducen los nitratos a nitritos y el viraje de un color rojo después de 5 a 10 minutos, indica que la reacción es verdaderamente negativa.

-

La reducción de nitratos a gas nitrógeno u oxido nitroso se denomina desnitrificación. En el medio caldo, la formación de gas nitrógeno se detecta por la presencia de burbujas de gas en la parte superior del tubo de Durham colocado en forma invertida, lo cual es considerado como una reacción positiva.

Nitratos

Nitritos + Reactivos A y B

Color rojo intenso

Nitratos

Nitratos + Reactivos A y B

Caldo incoloro (Reacción negativa) Más Cinc

Nitratos

Gas Nitrógeno U otros: (NH3, ON, N 2O)

(Reducción de Nitratos a Nitritos) Reacción Positiva

Color rojo

En tubo de Durham: burbujas de gas

(No hubo Reducción de Nitratos) Reacción verdaderamente negativa

Reacción positiva


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Nota: En el caso de Pseudomonas aeruginosa la interpretación del esquema anterior es diferente ya que convierten los nitratos a nitritos pero que también producen gas de nitrógeno en gran cantidad y por lo tanto la detección de los nitritos después de agregar los reactivos no es observable. Esto se puede comprobar fácilmente al agregar aproximadamente 20 mg de cinc. Cuando los nitratos no han sido convertidos a nitritos, el cinc hace la conversión y el viraje a color rojo intenso se hace presente. Sin embargo, en el caso de las Pseudomonas aerugionsa este viraje no se presenta, lo que comprueba la conversión La producción de gas nitrógeno es detectada por la presencia de burbujas en la parte superior del tubo de Durham.

7.2. Composición: 7.2.1. Nutrientes: Peptona de carne 7.2.2. Sustrato: Nitrato de potasio 7.2.3. Cloruro de sodio

7.3. Reactivos requeridos: 7.3.1. Reactivo A: Alfanaftilamina. 7.3.2. Reactivo B: Ácido Sulfanílico. 7.3.3. Polvo de Cinc.

7.4. Técnica de inoculación: 7.4.1. Rotular el tubo que contiene caldo. 7.4.2. Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA. 7.4.3. Inclinar el tubo e inocularlo, tocando la superficie interna del tubo, en el ángulo agudo del menisco formado por el caldo. 7.4.4. Incubar a 35 oC durante 18 a 24 horas. 7.4.5. Finalizada la incubación, agregar 500µL del reactivo A. 7.4.6. Inmediatamente agregar 500µL del reactivo B. 7.4.7. Leer en los primeros 1 a 2 minutos. 7.4.8. Si no hay viraje de color, agregar una pizca (alrededor de 20 mg) de polvo de cinc. 7.4.9. Observar y anotar si hay presencia de burbujas en el tubo de Dirham. Resultado: Conversión de nitratos a nitritos positiva: Viraje al color rojo intenso entre 1 a 2 minutos al agregar los reactivos de prueba. Conversión de nitratos a nitritos negativa: No hay viraje de color al agregar los reactivos de prueba. Confirmación de la negatividad de nitratos a nitritos: Después de agregar 20 mg polvo de cinc hay viraje de color al rosado durante los primeros 5 a 10 minutos. Presencia de gas libre de nitrógeno: Presencia de burbujas en el tubo de Durham.

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7.5. Control de calidad: 7.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Reducción de nitratos a nitritos positiva. No hay viraje de color después de agregar los reactivos de prueba, ni al agregar 20 mg de polvo de cinc. Producción de gas de nitrógeno a partir de nitratos positiva: Se observan burbujas de gas en la parte superior del tubo de Durham. 7.5.2. Enterococcus faaecalis ATCC 29212 Resultado: Reducción de nitratos a nitritos negativa. No hay viraje de color después de agregar los reactivos de prueba. Confirmación: Luego de la adición de aproximadamente 20 mg de cinc el caldo vira a color rojo entre 5 a 10 minutos y la reacción es verdaderamente negativa. Producción de gas de nitrógeno a partir de nitratos negativa: No hay burbujas de gas en el tubo de Durham. Todo el tubo aparece lleno con el caldo.

8. HIDRÓLISIS DE ARGININA:

8.1. Fundamento del medio de cultivo: Este medio se usa para determinar la presencia de la enzima dihidrolasa que convierte la arginina en el producto primario citrulina que luego es convertido en ornitina, el cual se descarboxila para formar putrescina. Este último alcaliniza el medio, lo cual acentúa el color púrpura del medio.

8.2. Composición: 8.2.1. Nutrimentos: Peptona y extracto de carne 8.2.2. Sustratos: Disco conteniendo arginina y glucosa 8.2.3. Indicador de pH: Púrpura de bromocresol y rojo cresol

8.3. Técnica de inoculación: 8.3.1. Rotular el tubo que contiene el caldo base (sin arginina). 8.3.2. Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA. 8.3.3. Inclinar el tubo e inocularlo, tocando la superficie interna del tubo, en el ángulo agudo del menisco formado por el caldo. 8.3.4. Incubar a 35 oC durante 18 a 24 horas. Resultado: Dihidrólisis de arginina positiva: No hay viraje de color. El caldo se observa con un púrpura más acentuado. Dihidrólisis de arginina negativa: Hay viraje de color al amarillo por fermentación de la glucosa.


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8.4. Control de calidad: 8.4.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Hidrólisis de arginina positiva: No hay viraje de color. El caldo se observa con un púrpura mas intenso. 8.4.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Resultado: Hidrólisis de arginina negativa: Hay viraje de color al amarillo por la fermentación de la glucosa.

9. HIDRÓLISIS DE GELATINA:

9.1. Fundamento del medio de cultivo: El medio de cultivo de gelatina sirve para determinar la gelatinólisis o licuefacción de la gelatina a través de la enzima gelatinaza.

9.2. Composición: 9.2.1. Nutrimentos: Peptona de caseína. 9.2.2. Sustrato: Gelatina

9.3. Técnica de inoculación: 9.3.1. 9.3.2. 9.3.3. 9.3.4.

Rotular el plato. Con un asa recta, tomar un inóculo del agar nutritivo o TSA. Hacer un inóculo redondo y puntiforme en el centro del plato. Incubar a 36oC por 24 horas de incubación. Máximo 4 días de incubación, vigilando diariamente alguna reacción positiva.

Resultado: Hidrólisis de la gelatina positiva: Se observa un halo opaco alrededor del inóculo.

9.4. Control de calidad: 9.4.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Resultado: Hidrólisis de la gelatina positiva. Se observa un halo opaco alrededor del inóculo. 9.4.2. Escherichia coli ATCC 25922 Resultado: Hidrólisis de la gelatina negativa. No se observa un halo opaco alrededor del inóculo.

V. GRAMPOSITIVOS: 1. PRUEBA DE CATALASA:

1.1. Fundamento: La catalasa es una enzima que cataliza el peróxido de hidrógeno (H2O2) en oxígeno y agua. La liberación del oxígeno se puede observar a simple vista por la formación de burbujas.

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1.2. Procedimiento: 1.2.1. Recoja, con un asa varias colonias de 18-24 horas de crecimiento. 1.2.2. Colóquelas sobre la superficie de un portaobjetos de vidrio limpio. 1.2.3. Agregue una gota de H2O2 al 3%. La formación inmediata denota una reacción positiva. La producción puede ser leve, moderada o intensa.

1.3. 23.3 Control de calidad: 1.3.1. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado: Presencia de la enzima catalasa. Producción inmediata e intensa de burbujas. 1.3.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Ausencia de la enzima catalasa. No hay producción de burbujas.

2. PRUEBA DE LA SUSCEPTIBILIDAD A LA OPTOQUINA:

2.1. Fundamento: La optoquina (hidrocloruro de etilhidrocupreína), es un compuesto al cual S. pneumoniae es susceptible en bajas concentraciones (5µg o concentraciones menores) y por tanto inhibe su crecimiento. La optoquina puede inhibir el crecimiento de otros Streptococcus alfa hemolíticos, pero en concentraciones altas. Es soluble en agua y se difunde rápidamente en el medio, por lo tanto, los discos de papel filtro impregnados con optoquina pueden ser colocados directamente sobre la superficie del agar para la realización de la prueba.

2.2. Procedimiento: 2.2.1. Trabaje con un cultivo puro. Inocule una placa de agar sangre bovina al 5%. 2.2.2. Estríe el inóculo en 3 ó 4 direcciones, lo cual favorecerá un crecimiento homogéneo del microorganismo. 2.2.3. Coloque el disco de optoquina en el centro del inóculo inicial e incube de 18-24 horas en CO2. 2.2.4. Mida el tamaño de la zona de inhibición (en mm).

2.3. Control de calidad: 2.3.1. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Resultado: Halos de inhibición ≥ 14 mm. Zonas de inhibición mayor o igual a 14 mm son interpretadas como susceptibles. 2.3.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Halos de inhibición ≤ 14 mm. Zonas de inhibición menores a 14 mm son interpretadas como resistentes.


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3.1. Fundamento: Las sales de bilis, específicamente el desoxicolato y el taurocolato de sodio tienen la capacidad de lisar selectivamente a Streptococcus pneumoniae, cuando una suspensión del microorganismo se agrega a una solución de las sales (suspensión realizada a partir de un cultivo fresco de 18-24 horas en agar sangre de carnero al 5%). S. pneumoniae produce enzimas autolíticas que son las responsables de la característica umbilicada de la colonia en cultivos viejos. La adición de sales de biliares a la suspensión de la bacteria activa las autolisinas y acelera el proceso de lisis, lo cual está asociado a la disminución de la tensión superficial entre el medio y la membrana celular bacteriana.

3.2. Procedimiento: 3.2.1. A partir de un subcultivo puro, prepare una suspensión densa del microorganismo en solución salina estéril, con una turbidez igual al patrón No. 1 de la escala de McFarland. 3.2.2. Para cada microorganismo tome dos tubos de 12 x 75 mm, marque un tubo como tubo prueba (P), y el otro como tubo control (TC). 3.2.3. Coloque en cada tubo 0,5 ml de la suspensión salina del microorganismo; al tubo prueba adicione 0,5 ml de desoxicolato de sodio al 10% y al tubo control adicione 0,5mL de la solución salina estéril (0,85%). 3.2.4. Mezcle suavemente los tubos e incube a 37 oC por un período de 2 horas. 3.2.5. Examine la lisis del cultivo por aclaración del mismo después de 1 y 2 horas de incubación. Soluble en bilis (reacción positiva): Hay un aclaración visible de la suspensión del tubo que contiene desoxicolato de sodio y sin cambios en la suspensión control con solución salina. Insoluble en bilis (reacción negativa): No hay cambio en la turbidez de la suspensión del tubo que contiene desoxicolato de sodio, en comparación con la suspensión control en solución salina. NOTA: Un resultado de solubilidad parcial es interpretado como positivo.

3.3. Control de calidad: 3.3.1. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Resultado: Solubilidad en bilis positiva: Se observa claridad o transparencia en el tubo. 3.3.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Solubilidad en bilis negativa: Se observa turbidez en el tubo.

4. PRUEBA DE BILIS ESCULINA:

4.1. Fundamento: Se basa en la capacidad que tienen ciertas bacterias, en particular los Estreptococos del grupo D y especies de Enterococcus spp, de tolerar grandes concentraciones de bilis (40%). Para detectar esta alta tolerancia se agrega esculina, la cual es hidrolizada si la bacteria se desarrolla. La hidrólisis de la 340


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esculina da como resultado la formación de glucosa y un compuesto denominado esculetina. Esta a su vez reacciona con los iones férricos para formar un complejo negro.

4.2. Procedimiento: 4.2.1. 4.2.2. 4.2.3. 4.2.4. 4.2.5. 4.2.6.

Rotular un tubo para coagulasa Agregar 100 µL de agua destilada estéril. Tomar 2 ó 3 colonias de un cultivo fresco y hacer una suspensión homogénea. Con una pinza estéril colocar el disco de bilis esculina dentro del tubo que contiene la suspensión. Incubar a una temperatura de 35-37 oC durante 4 horas. Realizar la lectura.

4.3. Control de calidad: 4.3.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Positiva. Se observa ennegrecimiento del disco. 4.3.2. Streptococcus grupo viridans INS 003 Resultado: Negativa: El disco se observa de color amarillo pálido.

5. PRUEBA DE TOLERANCIA A LA SAL: La prueba de tolerancia a la sal (caldo con 6.5% de NaCl) diferencia las especies de Enterococcus de los Streptococcus del grupo D no enterococos (Streptococcus bovis).

5.1. Fundamento: Se basa en la capacidad de la bacteria de desarrollarse en presencia de cantidades variadas de cloruro de sodio (NaCl). Es una propiedad que ha sido utilizada para caracterizar varios géneros y especies bacterianas, incluyendo los Streptococcus del grupo viridans. En este caso se utiliza la concentración de Cloruro de Sodio al 6,5%.

5.2. Procedimiento: 5.2.1. Rotular el tubo que contiene caldo nutritivo con 6.5% de cloruro de Sodio. 5.2.2. Tomar 2 ó 3 colonias de un cultivo puro de 24 horas de incubación. Hacer una suspensión homogénea. Si el caldo se inocula con cantidad excesiva de bacterias, él inoculo puede ser reportado como si desarrollara crecimiento, lo cual sería un resultado falso positivo. 5.2.3. Incubar a una temperatura de 35-37 oC durante 24 horas. 5.2.4. Realizar la lectura.

5.3. Control de calidad: 5.3.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Positivo. Turbidez en el caldo por crecimiento de la bacteria. 5.3.2. Streptococcus grupo viridans INS 003 Resultado: Negativo. No se observa turbidez en el caldo por ausencia de crecimiento de la bacteria. Capítulo 17: Fundamentos fisiológicos y bioquímicos de las pruebas

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6.1. Fundamento de la prueba: La prueba de PYR se utiliza como prueba rápida para la diferenciación presuntiva de los Enterococcus spp de los Streptococcus del grupo D (S. bovis). El sustrato utilizado es la L-pirrolidonilo α naftilamida (PYR por sus siglas en inglés). Este compuesto es hidrolizado por la enzima pirrolidonilopeptidasa. La hidrólisis del sustrato por esta enzima libera α naftilamida libre, que se detecta al agregar el reactivo p-dimetil-dimetil-aminocinamaldehido. Si la hidrólisis se llevó a cabo, se forma un compuesto de color rojo cereza oscuro.

6.2. Procedimiento: 6.2.1. Con un palillo descartable tomar 2 ó 3 colonias del cultivo puro de 24 horas de incubación y realizar un frotis en la superficie del cuadrante de la lámina que ha elegido para el caso. La lámina contiene cuatro cuadrantes para trabajar. 6.2.2. Agregar una gota del reactivo p-dimetil-dimetil-aminocinamaldehido 6.2.3. Realizar la lectura inmediatamente. Si no hay desarrollo de color realizar la segunda lectura al minuto de haber agregado el reactivo.

6.3. Control de calidad: 6.3.1. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Resultado: Positivo: Desarrollo de un color rojo cereza oscuro. 6.3.2. Streptococcus grupo viridans INS 003 Resultado: Negativo: Se observa un color amarillo o naranja (color del reactivo).

VI. BIBLIOGRAFÍA: 1. Manual de Medios de Cultivos: E. Merk, Darmstadt Alemania, Edición 1994. 2. Pruebas Bioquímicas en Diagnóstico microbiológico. Elmer W. Koneman editor, capítulos del 2 al 7, 5ª edición 1996, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, Argentina. 3. Pruebas Bioquímicas para la identificación de Enterobacterias: Actualización Diagnóstica. Cap. I, Servicio de Enterobacterias. Departamento de Bacteriología, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, INEI “Dr. Carlos G. Malbrán”, 2000, Buenos Aires, Argentina. 4. Dr. López Cruz SR. y colaboradores. Reacciones Bioquímicas más comunes en Enterobacterias en: Manual de Bacteriología Médica. Curso de Capacitación en Bacteriología Médica 3ª edición, 2001, Ministerio de Salud. Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia CNDR, APHL (Public Health Laboratories) /AID, Proyecto de Fortalecimiento de los Laboratorios de Salud Pública Post Huracán Mitch, Managua, Nicaragua, 2001. 5. Lauderdale T-L, Chapin KC, Murray PR. Reagents in: Manual of Clinical Microbiology. Patrick R. Murray Editor. 7th. Ed., 1999, chap. 128, American Society for Microbiology, Washington, D.C. 6. Chapin KC, Murray PR. Media in: Manual of Clinical Microbiology. Patrick R. Murray, editor. 7th. Ed., 1999, chap. 130, American Society for Microbiology, Washington, D.C. 342


Esta obra fue impresa en los talleres de LITOGRAFÍA NICARAGÜENSE (LITONIC) Managua, Nicaragua. Tiraje: 150 ejemplares. Se terminó de imprimir en enero de 2005.

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