LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA ANALITIK
PEMISAHAN KANDUNGAN ASAM-ASAM AMINO DENGAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)
Nama NIM Kelompok Asisten
: Nindy Permatasari Permatasari : 12/338448/PBI/01066 12/338448/PBI/01066 : VI : Lisna Hidayati
LABORATORIUM BIOKIMIA FAKULTAS BIOLOGI PROGRAM PASCASARJANA PROGRAM STUDI BIOLOGI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2013
1
A. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah sebagai berikut: 1. Menghitung harga R f dari noda-noda yang dibentuk oleh asam-asam amino dan membandingkannya dengan Rf standar 2. Menentukan kandungan asam-asam amino dengan berdasarkan har ga R f yang telah diperoleh. B. Dasar Teori Kromatografi dan Jenis-jenisnya
Kromatografi merupakan suatu metode yang digunakan untuk memisahkan campuran komponen berdasarkan distribusi komponen tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak (Stoenoiu et al. 2006). Apabila molekul-molekul komponen berinteraksi secara lemah dengan fasa diam maka komponen tersebut akan bergerak lebih cepat meninggalkan fasa diam. Keberhasilan pemisahan kromatografi bergantung pada daya interaksi komponen-komponen campuran dengan fasa diam dan fasa gerak (Hendayana, 2006). Ada
berbagai
macam
kromatografi
yaitu
gel
filtrasi,
kolom
kromatografi, kromatografi partisi, kromatografi pertukaran ion dan gas kromatografi. Kromatografi partisi terdiri dari kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (KLT). Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
KLT merupakan bentuk kromatografi planar yang serupa dengan kromatografi kertas, tetapi fase diamnya adalah serbuk halus, yang tersebar merata sebagai lapis tipis yang didukung plat plastis, alumunium atau plat gelas. Migrasi pelarut melewati fase diam dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio distribusi, dengan nilai pergerakkan yang besar (Kealey and Haines, 2002). Sistem pengembangan yang digunakan pada KLT berdasarkan prinsip like dissolves like, yaitu memisahkan komponen bersifat polar menggunakan sistem pelarut yang bersifat polar juga ataupun sebaliknya. Deteksi hasil 2
kromatogram dilakukan di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, serta dapat dilakukan juga dengan pereaksi semprot (Santosa dan Hertiani 2005). Pada KLT digunakan adsorben halus yang tersangga pada papan kaca, alumunium atau plastik. Lapisan tipis adsorben ini pada pemisahan berlaku sebagai fasa diam (Soebagyo et al, 2002). Pelaksanaan kromatografi lapis tipis (Gandjar, 2007): 1.
Fase diam Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 µm. Semakin kecil ukuran ratarata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya. Mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah adsorpsi dan partisi. Berikut ini adalah beberapa penjerap fase diam yang digunkanan pada KLT : Tabel 1. Berbagai penjerap pada KLT Penjerap Silica Gel
Mekanisme Sorpsi Adsorpsi
Silica modifikasi dengan hidrokarbon Serbuk selulosa
Partisi termodifikasi
Alumina
Adsorpsi
Kieselgur
Partisi
Partisi
Selulosa Penukar ion
Pertukaran Ion
Gel Sephadex
Eksklusi
β-siklodekstrin
Interaksi adsorpsi stereospesifik
3
Penggunaan Asam amino, hidrokarbon, vitamin, alkaloid Senyawa-senyawa non polar Asam amino, nukleotida, karbohidrat Hidrokarbon, ion logam, pewarna makanan, alkaloid Gula, asam asam lemak Asam nukleat, nukleotida, halide dan ion-ion logam Polimer, protein, kompleks logam Campuran enansiomer
2.
Fase Gerak Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak : a.
Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif.
b.
Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
c.
Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti s ilica gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solute yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
d.
Solut-solut ionik dan solute-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan methanol dengan perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau ammonia masing-masing akan meningkatkan solutesolut yang bersifat basa dan asam.
3.
Aplikasi (Penotolan) Sampel Untuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 µl. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 µl, maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan.
4.
Pengembangan Bila
sampel
telah
ditotolkan
maka
tahap
selanjutnya
adalah
mengembangkan sampel dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase gerak. Tepi bagian bawah lempeng tipis 4
yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus dibawah lempeng yang telah berisi totolan sampel. Bejana pengembang yang akan digunakan harus dalam keadaan jenuh dengan uap eluen. Sebagai indikator, diletakkan kertas saring pada bagian dinding sebelah dalam bejana pengembang (Gambar 1). Apabila rambatan eluen telah mencapai batas atas, bejana tersebut dapat dikatakan jenuh. Proses penjenuhan ini juga dapat dipercepat dengan menutup bejana pengembang (Scott, 2003).
Gambar1. Bejana pengembang dengan proses penjenuhan normal (kiri) dan dengan dilapisi kertas saring pada bagian dinding dalam bejana (kanan) untuk mempercepat proses penjenuhan (Scott, 2003)
5.
Deteksi Bercak Deteksi bercak pada KLt dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara
fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah
dengan denagan cara pencacahan radioaktif dan fluorosensi sinar ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas. Berikut adalah cara-cara kimiawi untuk mendeteksi bercak :
5
a.
Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan bereaksi secara kimia dengan solute yang mengandung gugus fungsional tertentu sehingga bercak menjadi berwarna. Kadangkadang dipanaskan terlebih dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna dan intensitas warna bercak.
b.
Mengamati lempeng dibawah lampu ultraviolet yang dipasang panjang gelombang emisi 254 atau 366 untuk menampakkan solute sebagai bercak yang gelap atau bercak yang berfluorosensi terang pada
dasar
yang
berfluorosensi
seragam.
Lempeng
yag
diperdagangkan dapat dibeli dalam bentuk lempeng yang sudah diberi dengan senyawa fliorosen yang tidak larut yang dimasukkan ke dalam fase diam untuk memberikan dasar fluorosensi atau dapat pula dengan menyemprot lempeng dengan reagen fluorosensi setelah dilakukan pengembangan. c.
Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat lalu dipanaskan untuk mengoksidasi solute-solut organic yang akan nampak sebagai bercak hitam sampai kecoklat-coklatan.
d.
Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber tertutup.
e.
Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer, suatu instrument yang dapat mengukur intensitas radiasi yang direfleksikan dari permukaan lempeng ketika disinari dengan lampu UV atau lampu sinar tampak. Solut-solut yang mampu menyera[p sinar akan dicatat sebagai puncak (peak) dalam pencatatan (recorder).
6.
Perhitungan Nilai Rf Untuk identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah dari lapisan tipis menggunakan harga R f ( Racing factor ). R f ( Racing factor ) merupakan jarak pengembang senyawa pada kromatogra. Perhitungan nilai R f didasarkan atas rumus :
6
R f =
Jarak yang ditempuh oleh zat yang diteliti Jarak yang ditempuh oleh pelarut
Nilai R f dinyatakan hingga angka 1,0. Nilai R f menunjukkan pemisahan yang cukup baik adalah berkisar antara 0,2-0,8. Kromatografi lapis tipis memiliki beberapa kelebihan dan kekurangan. Berdasarkan pendapat Kealey and Haines (2002), keuntungan metode KLT dibandingkan dengan GC dan HPLC antara lain: 1. Kemampuan merunning 10-20 atau lebih sampel secara bersama-sama dan langsung dibandingkan dengan standar, dengan demikian menunjukan penghematan waktu. 2. Merupakan teknik yang murah, serbaguna dan cepat. 3. Semua sampel yang bisa larut, termasuk di dalamnya yang tidak dapat berpindah (larut) dari awal dapat terdeteksi. Kekurangan metode KLT adalah keterbatasan hasil nilai Rf terutama karena perubahan dalam komposisi fase gerak selama pengembangan plat dan peningkatan difusi noda (pita yang mellebar) karena kecepatan aliran fase gerak sangat lambat saat melewati plat. Aplikasi Kromatografi
KLT merupakan metode kromatografi yang cepat, murah, sederhana, effisien dan meluas untuk digunakan dalam isolasi produk alam. KLT kanya membutuhkan sedikit sampel
(Fessenden et al., 2001). KLT dapat
diaplikasikan untuk analisis beragam zat terlarut (analit) terutama senyawasenyawa organik. KLT khususnya berguna untuk menguji kemurnian, untuk monitor jalannya reaksi dan proses produksi, serta untuk identifikasi bahan kompleks seperti produk alam. Pemisahan sampel dari obat dalam klinik, studi forensik dan dalam uji kehadiran atau ketidakhadiran substansi spesifik (tes terbatas) dalam aplikasi tambahan (Kealey and Haines, 2002).
7
C. Metode 1. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam pemisahan asam-asam amino dengan kromatografi lapis tipis adalah solut yang dipisahkan (campuran asam amino), fase gerak campuran n-butanol : asa m asetat : air (3:1:1), asam amino standard, silika gel GF 254, kertas saring, dan penampak bercak Ninhydrin.
2. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam pemisahan asam-asam amino dengan kromatografi lapis tipis adalah bejana pengembang beserta tutupnya dan telah diisi kertas saring untuk penjenuhan, pipa kapiler untuk menotolkan larutan senyawa, oven, hair dryer untuk mengeringkan totolan larutan senyawa, gelas ukur dan pipet tetes untuk mengambil larutan pelarut, botol penyemprot, UV chamber dengan λ 254 nm dan 366 nm untuk mengamati noda yang terbentuk, kamera digital, gunting, serta pensil dan penggaris untuk mengukur harga R f. 3. Cara Kerja Pemantauan
senyawa
dalam
fraksi
yang
dihasilkan
dengan
kromatrografi lapis tipis (KLT)
Bejana pengembang beserta tutupnya disiapkan untuk pembuatan larutan pengembang dan bagian dalam bejana pengembang dilapisi oleh kertas saring, hal ini bertujuan untuk penjenuhan dalam bejana. Fase gerak (eluen) berupa n-butanol : asam asetat : air dengan perbandingan 3:1:1 sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam dua bejana pengembang, kemudian ditutup agar proses penjenuhan dapat homogen dan cepat. Sebagai indikator jenuh, dimasukkan kertas saring ke dalam bejana dan dilihat rambatan fase gerak pada kertas saring tersebut. Tahap berikutnya adalah pembuatan kromatogram. Plat silika gel dipotong dengan ukuran 5 x 10 cm cukup untuk 3 totolan, lalu diberi tanda dengan pensil posisi batas atas
8
(0.5 cm dari atas) dan batas bawah (1 cm dari bawah) jarak totolan antar sampel 1 cm. Campuran asam amino yang akan dikromatografikan ditotolkan masing-masing pada tiap plat silika gel dengan pipa kapiler (diameter totolan + 3 mm) dan tunggu hingga kering (dapat dibantu dengan hair dryer ). Asam amino standard juga ditotolkan pada plat silika gel sebagai pembanding, dan dikeringkan dengan bantuan hair dryer . Selanjutnya, plat silika gel dimasukkan ke dalam bejana pengembang, lalu ditutup kembali dan ditunggu hingga 45 menit. Setelah itu, plat silika gel dikeluarkan dan dikeringkan dengan oven, kemudian diamati noda yang terbentuk di bawah sinar UV λ 254 nm dan 366 nm. Hasil kromatogram difoto dengan dasar warna gelap. Untuk memperjelas noda, plat silika gel disemprot dengan Ninhydrin, lalu dikeringkan sesaat di dalam oven dan difoto kembali. Harga R f dapat ditentukan dari noda-noda yang tampak pada kromatogram dengan rumus sebagai berikut. Jarak yang ditempuh oleh zat yang diteliti
R f =
Jarak yang ditempuh oleh pelarut
D. Hasil dan Pembahasan
Hasil yang diperoleh dari praktikum ini yaitu kromatrogram dan nilai R f dari tiap fraksi yang dihasilkan dari pemisahan asam-asam amino dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
A
B
9
Gambar 2. Kromatogram senyawa dari sampel protein (X6) dengan asam amino standar leusin dan alanin pada KLT dengan eluen butanol : AAG : air (6 ml : 2 ml : 2 ml) di bawah sinar UV pada λ 254 nm (A) dan 366 nm (B)
A
B
Gambar 3. Kromatogram senyawa dari sampel protein (X 6) dengan asam amino standar arginin dan metionin pada KLT dengan eluen butanol : AAG : air (6 ml : 2 ml : 2 ml) di bawah sinar UV pada λ 254 nm (A) dan 366 nm (B)
Gambar 4. Silika gel setelah disemprot dengan larutan ninhydrin sebagai hasil KLT senyawa dari sampel protein (X6) dengan eluen n-butanol : AAG : air (6 ml : 2 ml : 2 ml). (kiri) sampel dan asam amino standar metionin dan arginin, (kanan) sampel dan asam amino standar leusin dan alanin.
10
Tabel 2. Nilai R f senyawa dalam sampel protein (X6) dengan fase gerak butanol : AAG : air 3:1:1 No
Senyawa KLT
1
Sampel (X6)
2 3 4 5
Alanin Leusin Metionin Arginin
yang
di
Nilai R f 1. 0,01 2. 0,29 0,14 0,28 0,25 0,023
Pada praktikum ini dilakukan pemisahan campuran asam amino dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). KLT merupakan bentuk kromatografi planar yang serupa dengan kromatografi kertas, tetapi fase diamnya adalah serbuk halus, yang tersebar merata sebagai lapis tipis yang didukung plat plastis, alumunium atau plat gelas. Pada KLT, adanya gaya kapiler menyebabkan eluen merambat sebagai fase gerak di sepanjang fase diam berupa plat silika gel, sehingga menghasilkan jarak rambatan yang berbeda-beda dari tiap jenis zat yang dipisahkan dalam satuan waktu tertentu. Jarak tersebut diukur dan dianalisis untuk memperoleh suatu konstante yang dikenal sebagai R f masing-masing zat. Senyawa yang memiliki polaritas tinggi akan berinteraksi baik dengan plat silika gel dan memiliki nilai R f yang kecil, sedangkan senyawa dengan polaritas rendah akan berinteraksi baik dengan pelarut dan memiliki nilai R f yang besar. Pada praktikum ini digunakan fase gerak (eluen) berupa n butanol:asam asetat:air dengan perbandingan 3:1:1 sebanyak 10 ml. Eluen tersebut dimasukkan ke dalam dua bejana pengembang, kemudian ditutup agar proses penjenuhan dapat homogen dan cepat. Selain itu di dalam bejana juga dimasukkan kertas saring hal ini bertujuan untuk penjenuhan dalam bejana. Pada saat pembuatan kromatogram campuran asam amino yang akan dikromatografikan dan asam amino standar ditotolkan masing-masing pada tiap plat silika gel dengan pipa kapiler
11
dan dikeringkan dengan menggunakan hair dryer. Pengeringan ini bertujuan agar totolan campuran asam amino pada plat silika gel tidak melebar sehingga didapatkan pemisahan yang optimal. Noda yang terbentuk pada silika gel diamati di bawah sinar UV λ 254 nm dan 366 nm. Dari hasil pengamatan (Gambar 2 dan 3), diketahui bahwa sinar UV λ 254 nm lebih optimal dalam menghasilkan pendar warna yang jelas daripada pengamatan di bawah sinar UV λ 366 nm. Hal ini dikarenakan sinar UV λ 254 nm termasuk dalam kisaran sinar tampak. kemudian plat silika gel
juga disemprot dengan Ninhydrin hal ini bertujuan untuk
memperjelas noda. Harga R f dapat ditentukan dari noda-noda yang tampak pada kromatogram tersebut. Jika dilihat dari noda yang tampak (gambar 4), dapat diketahui bahwa campuran asam amino tersebut mengandung leusin, metionin, dan arginin. Secara teori nilai R f akan menunjukkan identitas suatu zat yang dicari,diketahui bahwa R f asam amino alanin 0,14, leusin 0,28, metionin 0,25, dan arginin 0,023 sedangkan R f sampel pertama 0,01 sampel kedua 0,29. R f sampel pertama yaitu 0,01 mendekati
R f arginin (0,023)
sedangkan R f sampel kedua yaitu 0,29 mendekati R f leusin dan metionin (0,28 dan 0,25), namun pada metionin memang kurang begitu mendekati, hal ini terjadi karena ketika memasukkan plat silika gel ke dalam bejana pengembang bagian bawah plat dalam kedaan tidak lurus, sehingga bagian plat yang terdapat totolan asam amino metionin tercelup atau masuk ke dalam eluen lebih dahulu, sehingga jarak rambatannya lebih jauh dari yang seharusnya, hal ini mempengaruhi perhitungan R f.
12
E. Kesimpulan
R f asam amino alanin 0,14, leusin 0,28, metionin 0,25, dan arginin 0,023 sedangkan R f sampel pertama 0,01 sampel kedua 0,29. R f sampel pertama yaitu 0,01 mendekati
R f arginin (0,023) sedangkan R f sampel kedua yaitu 0,29
mendekati R f leusin dan metionin (0,28 dan 0,25), sehingga dapat diketahui bahwa asam-asam amino yang terkandung dalam campuran asam amino tersebut adalah arginin, leusin dan metionin.
13
DAFTAR PUSTAKA
Fessenden, R.J., J.S. Fessenden, and P. Feist. 2001. Organik Laboratory Techniques, 3rd edition. Brook/Cole. Canada. Gandjar, I. G., A. Yogyakarta.
Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar.
Hendayana, S. 2006. Kimia Pemisahan: Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. Cetakan I. PT Remaja Rosdakarya. Bandung. Kealey, D. And Haines, P.. 2002. Instant Notes, Anal. Chem. Bios Scientific Publishers Limited, Oxford. USA. 131-135. Scott, R.P.W. 2003. Principles and Practice of Chromatography. Library for Science, LLC. Diakses dari http://www.library4science.com/ pada tanggal 29 Mei 2013. Santosa CM, dan Hertiani T. 2005. Kandungan senyawa kimia dan efek ekstrak daun bangun-bangun (Coleus ambonicus, L.) pada aktivitas fagositosis netrofil tikus putih (Rattus nervogicus). Majalah Farmasi Indonesia 16: 141-148. Stoenoiu CE. Bolboaca AD, Jantschi L. 2006. Mobile phase optimization for steroid separation. edical Informatics 18: 17-24. Subagyo, et al. 2002. Bank dan Lembaga Keuangan Lainnya. Yogyakarta: Bagian Penerbitan Sekolah Tinggi Ilmu Ekonomi YKPN.
14
