I.
Judul Percobaan
: Kromatografi Lapis Tipis
II. Hari / Tanggal Percobaan
: Selasa, 30 april 2013
III. Selesai Percobaan
: Selasa, 30 april 2013
IV. Tujuan Percobaan
:
- Menentukan komposisi eluen yang tepat dengan metode cincin terkonsentrasi - Menentukan Rf dari zat warna pada tanaman dengan menggunakan pelat KLT
V. Kajian Teori
Kromatografi lapis tipis (KLT) atau Thin Layer Chromatography (TLC) dalah salah satu jenis kromatografi cair-cair dan berdasarkan mekanisme pemisahannya termasuk kromatografi adsorpsi serta jika ditinjau dari konfigurasinya termasuk kromatografi planar. Dasar pemisahan pada KLT adalah perbedaan kecepatan migrasi di antara fasa diam yang berupa padatan dan fasa gerak yang merupakan campuran solvent (eluen) yang juga dikenal dengan istilah pelarut pengembang campur. Kromatografi lapis tipis atau KLT pada prinsipnya sama dengan kromatografi kertas, hanya saja sebagai fasa diam digunakan lapisan tipis absorben yang disalutkan pada sebuah pelat dari kaca atau aluminium foil tebal atau plastik. Pelat KLT perlu dipanaskan dalam oven pada suhu 110o sebelum digunakan untuk menghilangkan molekul-molekul air yang terikat dan mengaktifkan absorben. Karena air yang terikat kuat pada absorben dapat menghambat terjadinya kesetimbangan dengan molekulmolekul analit. Analisis dengan KLT diawali dengan pemilihan pelarut pengembang (eluen) yang digunakan. Pemilihan pelarut pengembang tergantung pada jenis analit yang akan dipisahkan. Untuk hidrokarbon digunakan campuran heksana atau petroleum eter dengan toluena atau eter pada berbagai perbandingan. Campuran pelarut ini memiliki kepolaran sedang dan untuk sampel polar dapat digunakan campuran pelarut etil asetat, aseton, atau metanol. Pelarut yang menyebabkan semua noda merambat naik berarti terlalu polar. Sebaliknya jika noda yang ditotolkan sama sekali tidak bergerak, berarti pelarut tersebut kurang polar.
Cara termudah untuk memilih jenis eluen yang tepat adalah dengan menggunakan metode cincin terkonsentrasi. Pada sebuah pelat ditotolkan beberapa noda dari sampel yang sama. Kemudian untuk setiap noda ditotolkan pelarut yang berbeda. Hasil yang diperoleh dibandingkan dengan gambar berikut :
Noda sampel Lapisan luar pelarut (solvent front)
Kurang
Cukup
Terlalu
Polar
Polar
Polar
Analit yang dipisahkan ditotolkan pada pelat yang kemudian digantungkan pada sebuah bejana gelas berisi pelarut (eluen) sedemikian sehingga bagian bawah pelat terendam sekitar 0,5 cm. Eluen akan merambat naik sepanjang pelat dengan efek kapiler dan membawa komponen analit sehingga mencapai batas atas pelat kromatografi tersebut.
Komponen-komponen analit akan terpisah dan membentuk noda sepanjang pelat.
Noda-noda tersebut kemudian diukur dan dihitung faktor retardasinya (Rf) dengan rumus berikut :
Rf =
jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh eluen
Setiap komponen memiliki harga Rf yang tertentu, yang kemudian dibandingkan dengan Rf senyawa standar. Jika noda tidak tampak, maka dapat disemprot dengan pereaksi penimbul warna seperti ditizon, ninhidrin, kalium kromat, ammonium sulfida dan sebagainya. Cara lain adalah dengan menyinari pelat tersebut dengan lampu ultraviolet atau menjenuhkan kertas tersebut dengan uap iodium.
VI. Alat dan Bahan Alat - Pelat KLT berukuran 5 x 2 cm 2 lembar, 3 x 5 cm 2 lembar - Pipa kapiler untuk menotolkan noda - Gelas dengan dasar rata - 2 buah corong pisah dengan ukuran sesuai - Kertas saring selebar bagian dalam gelas - 2 buah gelas ukur 10 mL - 2 buah gelas kimia 50 mL - Pelat kaca untuk menutup gelas - Pinset panjang Bahan - Metanol dan etanol - Khloroform - Daun pandan yang sudah diblender ± 15 g - Kunyit yang sudah di parut ± 15 g
VII. Alur Kerja 1. PERSIAPAN SAMPEL
15 gram daun pandan suji yang sudah ditumbuk halus
Residu
Direndam dalam etanol 10 mL Ditambah kloroform 5mL Diambil filtratnya
Filtrat
Dimasukkan ke dalam corong pisah Ditambah 25mL Diklorometana
Campuran
Dikocok dengan arah yang sama didiamkan
Terbentuk dua fasa
Pigmen sampel
Diambil lapisan bawah Digunakan sebagai pigmen sampel
15 gram kunyit yang sudah ditumbuk halus
Residu
Direndam dalam etanol 10 mL Ditambah kloroform 5mL Diambil filtratnya
Filtrat
Dimasukkan ke dalam corong pisah Ditambah 10mL Diklorometana
Campuran
Dikocok dengan arah yang sama didiamkan
Terbentuk dua fasa
Pigmen sampel
Diambil lapisan bawah Digunakan sebagai pigmen sampel
2. PERSIAPAN PELAT a) Untuk percobaan cincin terkonsentrasi
Pelat KLT berukuran 3x5 cm
Dimasukkan dalam oven Dimasukkan ± 10 menit dalam oven ±Dibero 10 menit titik dengan pensil Dibero titik dengan pensil untuk tempat penotolan untuk noda tempat penotolan noda Jarak antara titik ± 1 cm Jarak antara titikmemuat ± 1 cm 6 sehingga dapat sehingga dapat memuat 6 titik titik
Pelat memuat 6 titik
b) Untuk penentuan Rf
Pelat KLT berukuran 2x7 cm
Pelat memuat 6 titik
Dioven ±10 menit Diberi batas dengan pensil untuk batas bawah 1 cm dan batas atas 0,5 cm
3. PERSIAPAN ELUEN
a) Untuk cincin terkonsentrasi
Heksan kloroform dan etanol
Dicampurkan dalam vial A-F dengan perbandingan H : K : E A 1 : 4,5 : 4,5 B 3 : 4 :3 C 3 : 3 :4 D 4 : 3 :3 E 4,5 : 4,5 : 1 F 4,5 : 1 : 4,5
Pelat memuat 6 titik
b) Untuk penentuan Rf
Kertas Saring
Dimasukkan ke dalam gelas sedemikian sehingga kertas saring menutupi bagian dinding dalam gelas tanpa adanya tekukan Dimasukkan 5 mL campuran Heksan, kloroform, ethanol dengan perbandingan paling tepat Ditutup dengan pelat kaca sampai kertas saring basah seluruhnya
KertasDAN saring PENGEMBANGAN yang basah, 4. TAHAP PENOTOLAN SAMPEL chamber jenuh dengan eluen
a) Untuk cincin terkonsentrasi
Pelat 3 x 5 cm
Ditotolkan pada titik A sampai F pada pelat KLT Ditotolkan eluen dari titik A sampai F pada noda Asampai F Diamati perbandingan cincin noda yang telah dibuat
Hasil pengamatan
b) Untuk penentuan Rf
Pelat 2 x 5 cm
Kertas saring yang basah, chamber jenuh dengan eluen
Ditotolkan sampel pada kedua titik A dan B Dimasukkan pelat KLT kedalam gelas dengan pelat bagian bawah menyentuh dasar gelas Gelas ditutup dengan penutup kaca Saat eluen menyentuh batas atas pelat, pelat KLT diambil dengan pinset secara perlahan-lahan Ditutup pelat dengan selotip Dihitung harga Rf nya
IX.
Pembahasan
Percobaan kromatografi lapis tipis ini bertujuan untuk menentukan komposisi eluen yang tepat dengan metode cincin terkonsentrasi, serta menentukan Rf dari zat warna pada tanaman dengan menggunakan pelat KLT. Sedangkan langkah-langkah percobaan yang dilakukan adalah sebagai berikut :
1. Persiapan sampel Pertama-tama menyiapkan sampel, yaitu daun pandan suji, dan kunyit, kemudian daun pandan dan kunyit ditumbuk sampai halus. Daun suji dan kunyit yang yang sudah ditumbuk atau diparut ditimbang ± 15 gram, kemudian ditambahkan 10 mL metanol untuk daun pandan dan 10 mL etanol untuk kunyit sampai larutan daun pandan berwarna hijau tua dan larutan kunyit berwarna kuning tua. Fungsi penambahan metanol pada daun pandan dan etanol pada kunyit adalah untuk melarutkan pigmen yang terkandung di dalam daun pandan maupun kunyit tersebut. Setelah itu didiamkan beberapa menit sampai endapan pandan ataupun kunyit mengendap, kemudian diambil filtratnya, pengambilan filtrat jangan dilakukan dengan tangan atau diperas karena bisa menyebabkan terkontaminasinya filtrat, selain alasan itu tidak diperbolehkan menggunakan tangan dikarenakan metanol dan etanol bersifat karsinogen yang dapat membahayakan tubuh. sehingga didapatkan filtratnya sebanyak 10 ml. Pengambilan filtrate juga juga tidak menggunakan kertas saring karena dikawatirkan pigmen warna dari sampel tersebut bisa saja tertinggal pada kertas saring. Sehingga filtrate yang diperoleh untuk daun pandan suji ±10 mL, sedangkan untuk kunyit ±7mL. Filtrat yang dihasilkan kemudian dimasukkan dalam corong pisah dan di tambahkan 5 ml kloroform. Penambahan kloroform pada filtrat memiliki tujuan yaitu mempercepat proses pemisahan fasa organik ( larutan sampel kunyit maupun pandan ). Setelah ditambahkan kloroform kemudian dikocok searah dan sesekali dibuka tutupnya agar gas yang terbentuk dapat keluar. Selanjutnya campuran tersebut didiamkan sampai terbentuk dua lapisan. Untuk sampel kunyit, lapisan bawah berwarna kuning keruh dan lapisan atas berwarna kuning kecoklatan, sedangkan sampel daun pandan lapisan bawah berwarna hijau (++) dan lapisan atas berwarna hijau (+++). Pigmen sampel yang digunakan dalam analisis adalah lapisan bagian
bawah sehingga didapatkan warna pigmen sampel kunyit adalah
kuning (+),
sedangkan pigmen sampel untuk daun pandan suji adalah hijau (++).
2. Persiapan pelat dan penotolan pada cincin terkonsentrasi Persiapan yang dilakukan sebelum melakukan penotolan adalah menyiapkan dulu pelat KLT, setelah pelat disiapkan kemudian pelat dioven selama ± 10 menit, tujuan pengovenan ini adalah untuk menghilangkan molekul-molekul air atau emnghilangkan kadar air yang terkandung dalam pelat tersebut. Sebab adanya kandungan air dalam pelat dapat mempengaruhi pengembangan sampel, jika ada molekul-molekul air dalam pelat proses pengembangan sampel menjadi lambat sehingga berpengaruh terhadap nilai Rf. Pada percobaan cincin terkonsentrasi pelat yang digunakan adalah pelat dengan ukuran 3x5 cm, yang berjumlah sebanyak dua buah, satu plat untuk daun pandan dan satu pelat lagi digunakan untuk kunyit. Masing-masing plat kemudian diberi tanda sebanyak 6 titik dengan menggunakan pensil, dan jarak antara titik yang satu dengan titik yang lain 1 cm. Tujuan dari pemberian jarak ini adalah untuk memberikan ruang pengembangan noda setelah penotolan sampel. Sedangkan Pemberian titik dimaksudkan untuk lebih memperjelas pemisahan dalam cincin terkonsentrasi, pemberian titik pada pelat tersebut tidak akan mempengaruhi terhadap noda yang dihasilkan, sebab tanda titik yang dihasilkan pensil tidak akan bercampur dengan sampel ataupun eluen. Setelah pelat telah siap, titik-titik yang telah dibuat kemudian diberi tanda A,B,C,D,E,F, kemudian pada titik-titik yang telah ditandai tersebut ditotolkan sampel kunyit pada pelat 1 dan sampel daun pandan pada pelat 2 dengan menggunakan pipa kapiler sebanyak 2 totolan(sampai warna terlihat jelas). Setelah sampel ditotolkan pada masing-masing titik A sampai F, masing-masing noda tersebut kemudian ditotoli dengan 6 macam eluen dengan komposisi yang berbeda, komposisi eluen tersebut dapat dilihat sebagai berikut : Eluen A terdiri dari heksana : kloroform : etanol = 4,5 : 4,5 : 1,0 Eluen B terdiri dari heksana : kloroform : etanol = 5,0 : 4,0 : 1,0 Eluen C terdiri dari heksana : kloroform : etanol = 4,0 : 5,0 : 1,0 Eluen D terdiri dari heksana : kloroform : etanol = 4,5 : 3,5 : 2,0 Eluen E terdiri dari heksana : kloroform : etanol = 3,5 : 4,5 : 2,0
Eluen F terdiri dari heksana : kloroform : etanol = 1,0 : 4,5 : 4,5 Berdasarkan hasil percobaan yang telah kelompok kami lakukan, diperoleh eluen E yang cukup polar untuk sampel kunyit maupun sampel daun pandan suji. Hasil ini didasarkan dari pengembangan noda, dengan eluen E noda kunyit maupun noda dari daun pandan yang dihasilkan tidak terlalu melebar dan tidak terlalu kecil pelebarannya dan dikatakan pelebarannya cukup.
3. Penentuan Rf Pada langkah percobaan penentuan Rf ini pelat yang digunakan adalah pelat dengan ukuran 2x7 cm, yang berjumlah sebanyak dua buah, satu plat untuk daun pandan dan satu pelat lagi digunakan untuk kunyit. Pada bagian bawah pelat di beri garis batas sebesar 1 cm dari ujung pelat, sedangkan batas atas 0,5 cm dari ujung pelat. Dalam penentuan Rf ini langkah pertama adalah menyiapkan gelas (chamber) yang memiliki tinggi ± 10 cm, dengan permukaan bawah gelas yang datar. Kemudian melapisi bagian dinding dalam gelas tersebut dengan kertas saring hingga meyelimuti seluruh permukaan gelas, dan diusahakan kertas saring tidak saling menumpuk, hal ini dimaksudkan agar penyerapan eluen oleh kertas saring dilakukan secara maksimal dan merata. Langkah selanjutnya adalah menutup gelas tersebut dengan pelat kaca sampai kertas saring basah seluruhnya. Kertas saring yang basah seluruhnya ini menandakan bahwa di dalam chamber (gelas) benar-benar jenuh dengan eluen. Tujuan dari chamber ditutup dengan pelat kaca adalah agar kondisi dalam gelas tersebut benar-benar jenuh oleh uap dari pelarut. Kemudian, kedua pelat yang telah disiapkan sebelumnya pada masing – masing pelat diberi 2 tanda titik A dan B hal ini digunakan sebagai perbandingan. Sampel kemudian ditotolkan pada kedua titik tersebut, masing-masing sampel sebanyak 2 totolan (warna terlihat jelas), kemudian gelas dibuka pelat dimasukkan ke dalam gelas (chamber) dengan hati-hati menggunakan pinset sehingga posisi pelat bagian bawah menyentuh dasar gelas dan segera ditutup dengan pelat kaca. Noda dibiarkan mengembang sampai eluen mencapai batas atas pelat, kemudian pelat segera diangkat. Tiap-tiap noda sampel terelusi sehingga terbentuk beberapa noda. Lalu noda-noda yang terbentuk tersebut diberi tanda dengan pensil, kemudian dikeringkan dan ditutup dengan selotip agar noda tidak memudar warnanya. Langkah
selanjutnya adalah mengukur dan menghitung nilai Rf yang didapatkan. Pada sampel daun pandan didapatkan 7 buah noda, sedangkan pada sampel kunyit didapatkan 4 noda. Dari hasil perhitungan Rf didapatkan Rf untuk : Kunyit Rf1 :0,0454 Rf2 :0,0909 Rf3 :0,2182 Rf4 :0,3 Daun Pandan Suji Rf1 : 0,3 Rf2 :0,4818 Rf3 :0,6091 Rf4 :0,6636 Rf5 :0,7 Rf6 :0,7455 Rf7 :0,8091 Banyaknya jumlah noda yang tidak sama tersebut menandakan bahwa kandungan pigmen antara sampel kunyit dan daun pandan tersebut tidak sama.
X. Kesimpulan Dari hasil percobaan yang telah kami lakukan, maka dapat kami simpulkan bahwa : 1. Berdasarkan hasil percobaan kami pada langkah percobaan cincin terkonsentrasi baik sampel daun pandan suji maupun sampel kunyit eluen yang cocok adalah E yang terdiri dari heksana : kloroform : etanol dengan perbandingan 4,5 : 4,5 : 1, karena pada eluen E ini noda yang terbentuk cukup polar. 2. Nilai Rf dari zat warna pada tanaman kunyit, daun pandan betawi dan daun pacar dengan menggunakan pelat KLT adalah sebagai berikut : o Kunyit Rf1 :0,0454 Rf2 :0,0909 Rf3 :0,2182 Rf4 :0,3 o Daun Pandan Suji
Rf1 : 0,3 Rf2 :0,4818 Rf3 :0,6091 Rf4 :0,6636 Rf5 :0,7 Rf6 :0,7455 Rf7 :0,8091 XI. Jawaban Pertanyaan 1. Apakah yang terjadi jika eluen yang digunakan sebagai pelarut pengembang pada KLT terlalu polar atau kurang polar? Mengapa? Jawab : Jika eluen yang digunakan sebagai pelarut pengembang pada KLT terlalu polar maka seluruh noda yang ditotolkan pada pelat naik sampai batas atas pelat (solvent front) tanpa mengalami pemisahan. Jika eluen yang digunakan sebagai pelarut pengembang pada KLT kurang polar maka noda yang ditotolkan sama sekali tidak bergerak.
2. Apa fungsi kertas saring pada percobaan penentuan Rf? Jawab : Fungsi kertas saring pada percobaan penentuan Rf digunakan agar atmosfer dalam gelas (chamber) terjenuhkan dengan uap pelarut (menjenuhkan chamber).
3. Mengapa permukaan pelat KLT tidak boleh rusak? Jawab : Permukaan pelat KLT tidak boleh rusak karena dapat mempengaruhi hasil pemisahan noda atau pengembangan noda.
4. Mengapa pelat KLT yang harus digunakan harus dikeringkan dulu dalam oven? Jawab : Pelat KLT yang digunakan harus dikeringkan dulu dalam oven pada suhu 110 o sebelum digunakan untuk menghilangkan molekul-molekul air yang terikat dan mengaktifkan absorben. Karena air yang terikat kuat pada absorben dapat menghambat terjadinya kesetimbangan dengan molekul-molekul analit.
5. Mengapa batas atas dan batas bawah pelat harus diberi tanda dengan pensil? Jawab : Batas atas dan batas bawah pelat harus diberi tanda dengan pensil karena jika menggunakan bolpoin maka noda bolpoin akan ikut terelusi atau mengembang.
DAFTAR PUSTAKA Azizah, Utiya. 2007. Panduan Praktikum Mata Kuliah Kimia Analitik II: Dasar-Dasar Pemisahan Kimia. Surabaya: Unipress Unesa. Clark, Jim. 2007. Kromatografi Kertas. (www.chem-is-try.org, diakses 3 Mei 2013) Day, R. A., Underwood, A. L. 1986. Analisis Kimia Kuantitatif. New York: Prentice-Hall. Sianita B, Maria Monica. 2006.Buku Ajar Mahasiswa Kromatografi. Surabaya: Unipress Unesa.
LAMPIRAN
Perhitungan Table hasil perhitungan Rf Rf1 Sampel
Rf2
Rf3
Rf4
Rf5
A
B
A
B
A
B
A
B
0,0
0,0
0,0909
0,09
0,21
0,21
0,29
0,30
363
54
09
82
82
09
91
Rf6
Rf7
A
B
A
B
A
B
Kunyit
5 Rata-
0,0454
0,0909
0,2182
0,3
rata Sampel
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
0,2
0,3
0,4727
0,49
0,6
0,61
0,65
0,67
0,69
0,70
0,74
0,74
0,
0,81
909
09
82
45
27
09
91
55
55
8
82
Pandan Suji
09
1 0,3
0,4818
Perhitungan Kunyit :
0,6091
0,6636
0,7
0,7455
0,8091
Daun Pandan Suji
