Laporan Isolasi dan Inokulasi BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Isolasi mikroorganisme adalah memisahkan mikroba yang berasal dari lingkungan dan membuahkannya sebagai kultur murni dalam suatu medium. Proses pemindahan mikroba dari medium lama ke medium baru harus dilaksanakan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang berhubungan dengan medium dan pekerjaan inokulasi (penanaman) itu benar-benar steril, hal ini untuk menghindari kontaminasi dengan mikroorganisme yang tidak diinginkan (Indah, 2013). Mikroba tidak memiliki ciri anatomi yang nyata, sehingga identifikasi didasarkan pada morfologi, sifat biakan dan sifat biokimiawi. Morfologi mikroorganisme berdasarkan bentuk, ukuran danpenataan biasanya tidak cukup untuk melakukan identifikasi. Ciri lainnya seperti pewarnaan, pola pertumbuhan koloni reaksi pertumbuhan pada karbohidrat dan penggunaan asam amino sangat membantu dalam identifikasi mikroba (Caray, 2013). Adapun yang melatar belakangi dilakukannya praktikum ini adalah untuk mengetahui dengan jelas bagaimana cara memisahkan mikroba dari lingkungannya untuk memperoleh biakan murni atau satu jelas mikroba saja. Selain itu, mahasiswa juga harus dapat mengatahui teknik-teknik penggoresan yang dapat digunakan mengisolasi bakteri, baik itu bentuk dan jenis dari penggoresan tersebut. B. Tujuan Percobaan Adapun tujuan diadakannya praktikum ini yaitu untuk mengetahui dan memahami cara mengisolasi bakteri. BAB II TINJAUAN PUSTAKA Isolasi mikroorganisme adalah memisahkan mikroba yang berasal dari lingkungan dan membuahkannya sebagai kultur murni dalam suatu medium. Proses pemindahan mikroba dari medium lama ke medium yang baru harus dilaksanakan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang berhubungan dengan medium dan pekerjaan inokulasi (penanaman) itu benar-benar steril. Hal ini untuk menghindari kontaminasi dengan mikroorganisme yang tidak diinginkan (Tim Dosen, 2011). Inokulasi Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agar menghindari terjadinya kontaminasi (Dwijoseputro, 1998). Pentingnya mengisolasi suatu mikroba dari lingkungan kita seperti pada makanan (subtrat padat), minuman (subtrat cair) atau pada diri kita sendiri karena banyaknya mikroba/bakteri yang sulit untuk diamati atau dibedakan secara langsung oleh panca indera. Sehingga dengan isolasi akan mempermudah kita untuk melihat dan mengamati bentukbentuk pertumbuhan mikroba pada beberapa medium yang berbeda-beda serta melihat
morfologi dari mikroba tersebut. Selain teknik pertumbuhan bakteri atau teknik isolasi di atas, dikenal juga adanya teknik isolasi mikroba yaitu inokulasi yang merupakan suatu teknik pemindahan suatu biakan tertentu dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tujuan untuk mendapatkan suatu biakan yang murni tanpa adanya kontaminasi dari mikroba yang lain (Ghoni, 2013). Teknik inokulasi merupakan suatu pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Dengan demikian akan diperoleh biakan mikroorganisme yang dapat digunakan untuk pembelajaran mikrobiologi. Pada praktikum ini akan dilakukan teknik inokulasi biakan mikroorganisme pada medium steril untuk mempelajari mikrobiologi dengan satu kultur murni saja (Emma, 2013). Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dalam keadaan cair atau padat. Dalam biakan cair, mikroorganisme menunjukkan ciri pertumbuhan tersendiri. Kekeruhan yan dilihat pada medium terjadi akibat pertumbuhan mikroorganisme. Jumlah mikroorganisme yang diperlukan cukup banyak agar terlihat keruh (lazimnya sekitar 106 sel/ml) Bila pertumbuhan mikroorganisme menumpuk maka di bagian dasar tabung akan terlihat sedimen. sebaliknya, bila pertumbuhan mikroorganisme ini sedikit maka terlihat sebagai partikel berupa lapisan tipis pada permukaan, Kadangkala pertumbuhan yang terlihat pada medium merupakan gabungan dari kekeruhan, sedimen, pelikel (Oetomo, 1990). Penanaman bakteri merupakan pekerjaan memindahkan bakteri dari suatu medium ke medium baru. Di lingkungan sekitar kita terdapat berbagai macam jenis mikroba yang sangat beraneka ragam dalam jumlah yang sangat banyak. Secara alami bakteri akan ditemukan dalam populasi campuran, dimana dalam populasi tersebut terdapat banyak macam dan jenis bakteri. Hanya dalam keadaan tertentu saja populasi ini ditemukan dalam keadaan murni. Untuk dapat mempelajari sifat-sifat biakan, morfologi dan sifat faalinya maka mikroba yang akan diteliti harus dapat dipisahkan. Ini berarti bahwa harus diperoleh biakan murni yang hanya mengandung satu macam bakteri (Djide, 2011) Bakteri di alam umumnya tumbuh dalam populasi yang terdiri dari berbagai spesies. Oleh karena itu, untuk mendapatkan biakan murni, sumber bakteri harus diperlakukan dengan pengenceran agar didapat hanya 100-200 bakteri yang ditransfer ke medium, sehingga dapat tumbuh menjadi koloni yang berasal dari bakteri tunggal (Pelczar, 1986). Proses pemisahan/pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Teknik tersebut dikenal dengan Isolasai Mikroba. Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu isolasi pada agar cawan , isolasi pada medium cair, dan isolasi sel tunggal (Yazurah, 2013). Identifikasi biakan mikroorganisme seringkali memerlukan pemindahan ke biakan segar tanpa terjadi pencemaran. Pemindahan mikroorganisme ini dilakukan dengan teknik aseptic untuk mempertahankan kemurnian biakan selama pemindahan berulang kali. Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dalam biakan cair ataupun padat. Dalam melakukan isolasi mikroba, terlebih dahulu kita harus memperhatikan alat-alat yang digunakan apakah sudah steril, agar tidak terkontaminasi oleh udara luar yang dapat merangsang pertumbuhan mikroba yang tidak kita inginkan pada suatu medium. Untuk tujuan tersebut digunakan media aseptis untuk mencegah kontaminasi (Indah, 2013).
Pemindahan bakteri dari medium lama ke medium yang baru atau yang dikenal dengan istilah inokulasi bakteri ini memerluakn banyak ketelitian. Terlebih dahulu kita harus mengusahakan agar semua alat- alat yang akan digunakan untuk pengerjaan medium dan pengerjaan inokulasi benar- benar steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi, yaitu masuknya mikrooba lain yang tidak diinginkan sehingga biakan yang tumbuh di dalam medium adalah benar- benar biakan murni (Dwidjoseputro, 1998). Di alam bebas tidak ada bakteri yang hidup sendiri terlepas dari spesies lainnya. Di laboratorium, supaya kita hanya mendapat satu spesies saja dalam suatu biakan campuran menjadi biakan murni memerlukan teknik-teknik untuk mengisolasi. Populasi campuran menjadi satu populasi sel. Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri dari satu populasi jenis mikroba yang semuanya berasal dari satu sel induk. Isolasi bakteri artinya memisahkan satu jenis bakteri dari biakan campuran menjadi biakan murni (Caray, 2013). Pekerjaan memindahkan mikroba dari medium lama ke medium yang baru harus dilakukan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang sangkut paut dengan medium dan pekerjaan inokulasi itu benar-benar steril, hal ini untuk menghindari terkontaminasi, yakni masuknya mikroorganisme yang tidak kita inginkan. Beberapa langkah pada pekerjaan inokulasi dan isolasi mikroba yaitu menyiapkan ruangan, karena tidak sembarang tempat dilakukan isolasi dan inokulasi dimana ruangan tersebut harus bersih dan bebas angin. Dinding ruang yang basah menyebabkan butir-butir debu menempel. Pada waktu mengadakan inokulasi baik sekali bila dilakukan di dalam suatu kotak berkaca. Kemudian memindahkan dengan kawat inokulasi yang sebaiknya terbuat dari platina atau nikrom (Indah, 2013). Isolasi bakteri adalah proses mengambil bakteri dari medium atau lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan yang murni. Bakteri dipindahkan dari satu tempat ke tempat lainnya harus menggunakan prosedur aseptik. Aseptik berarti bebas dari sepsis, yaitu kondisi terkontaminasi karena mikroorganisme lain. Teknik aseptik ini sangat penting bila bekerja dengan bakteri. Beberapa alat yang digunakan untuk menjalankan prosedur ini adalah bunsen dan laminar air flow Bila tidak dijalankan dengan tepat, ada kemungkinan kontaminasi oleh mikroorganisme lain sehingga akan mengganggu hasil yang diharapkan. Teknik aseptik juga melindungi laboran dari kontaminasi bakteri (Ghoni, 2013). Ada beberapa metode untuk menginokulasi bakteri sesuai dengan jenis medium tujuannya. Pada medium agar tegak, dilakukan metode tusuk menggunakan jarum ose. Pada medium agar miring, dilakukan metode gores dengan menggunakan loop ose. Pada medium petridisk, dapat digunakan metode streak plate (metode gores), pour plate (metode tuang) atau spread plate (metode sebar) Setelah inokulasi, dilakukan proses inkubasi, yaitu menyimpan medium pada alat atau kontainer ada temperatur tertentu dan periode tertentu, sehingga tercipta lingkungan yang menyediakan kondisi cocok untuk pertumbuhan bakteri. Metode gores atau streak plate menggunakan loop ose dan menggoreskannya ke permukaan medium agar dengan pola tertentu dengan harapan pada ujung goresan, hanya selsel bakteri tunggal yang terlepas dari ose dan menempel ke medium. Sel-sel bakteri tunggal ini akan membentuk koloni tunggal yang kemudian dapat dipindahkan ke medium selanjutnya agar didapatkan biakan murni (Oetomo, 1990). Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan menggunakan bermacam-macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat fisiologis dan perhitungan sejumlah mikroba. Supaya
mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium tersebut harus memenuhi syarat-syarat, yaitu harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba, harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan tumbuh, tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba, harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang ditumbuhkan dapat tumbuh dengan baik (Emma, 2013). BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN B. Pembahasan Metode gores atau streak plate menggunakan loop ose dan menggoreskannya ke permukaan medium agar dengan pola tertentu dengan harapan pada ujung goresan, hanya selsel bakteri tunggal yang terlepas dari ose dan menempel ke medium. Sel-sel bakteri tunggal ini akan membentuk koloni tunggal yang kemudian dapat dipindahkan ke medium selanjutnya agar didapatkan biakan murni. Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garisgaris goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni.Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaiitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan. Berdasarkan hasil pengamatan yang diamati bahwa Bacillus subtilis dapat diketahui bentuknya berbentuk bacil, permukaannya cembung, tepi bulat dan warnanya warna ungu. Sedangkan pada Eschercia coli bentuknya coccus, permukaannya cembung, tepinya bergerigi dan warna putih pucat. Jika mau dibandingkan dengan literatur maka dapat diketahui bahwa menurut Tryana, S.T (2008) menyatakan bahwa Bacillus subtilis merupakan bakteri gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop dan hal ini sama dengan hasil pengamatan yang telah diamati dibawah mikroskop dengan warna ungu. Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Sedangkan Escerchia termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif BAB V PENUTUP A. Kesimpulan Berdasarkan hasil pengamatan yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa bakteri Bacillus subtilis merupakan bakteri gram positif yang diisolasi dan dapat diketahui bentuknya berbentuk bacil dengan permukaan cembung, tepinya bulat dan warnanya berwarna ungu. Sedangkan pada Escerchia coli merupakan bakteri gram negatif dan setelah
diisolasi dapat diketahui bentuknya bebentuk coccus dengan permukaan cembung, tepinya bergerigi dan berwarna putih pucat. B. Saran Adapun saran dari praktikum ini adalah : 1. Sebelum melakukan praktek di laboratorium sebaiknya praktikan mempelajari terlebih dahulu teori teknik isolasi daan inokulasi agar tidak terjadi kesalahan pada saat praktikum berlangsung. 2. Agar kiranya asisten mengawasi dan membimbing praktikan demi kelancaran praktikum tanpa ada hambatan. DAFTAR PUSTAKA Caray.2013.“Pembuatan Media Agar dan sterilisasi”.http://makalahdanskripsi .blogspot.com.(4 Juni 2013). Djide, M. Natsir.Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi Dasar. Makassar:Unhas.2011 Dwidjoseputro.Dasar – dasar Mikrobiologi.Jakarta : Djambatan.1998. Emma,Kharisma.2013.”Isolasi dan Inokulasi”.http://emma-kharisma.blogspot.com /2011/06/isolasi-dan-inokulasi.html.(4 Juni 2013). Ghoni, Achmad.2013.”Isolasi dan Inokulasi Bakteri”.http://www.nvtech.ac.id/ isolasi-dan inokulasi bakteri/2007/com.(4 Juni 2013).
Indah.2013.”Isolasi”.http://isolasi-mikroorganisme-dalam-proses.html.(4 Juli 2013).
Oetomo Hadi, Ratnasari. Mikrobiologi Dasar. Jakarta:PT Gramedia.1990. Pelczar, Michael J.Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: Universitas Indonesia. 1998. Tim Dosen.Penuntun Praktikum Mikrobiologi Ternak. UIN Alauddin. Makassar. 2011. Yazurah,Verani.2013.”InokulasiBakteri”.http://yazura08.blogspot.com/2012/03/laporaninokulasi-bakteri.html.(4 Juni 2013).
laporan mikrobiologi teknik pewarnaan mikroba BAB I PENDAHULUAN A.
Latar Belakang
Untuk mengamati bentuk atau ciri-ciri suatu mikroba menggunakan mikroskop dapat digunakan dua cara yaitu mengamati sel mikroba yang masih hidup tanpa diwarnai dan mengamati sel mikroba yang telah mati dengan diwarnai. Untuk lebih mudah dilihat sebaiknya bakteri diwarnai dengan zat warna, beberapa zat yang digunakan untuk mewarnai bakteri juga dapat digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Dengan adanya pewarnaan terutama bakteri yang mempunyai sel dengan ukuran yang retif kecil akan lebih mudah terlihat di bawah mikroskop denagn menggunakan lensa objektif minyak imersi yang mempunyai tingkat pembesaran yang relatif tinggi. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu bakteri yang hidup akan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Sedangkan, untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya adalah dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, Gram positif dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans Christian gram 1884. Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan pewarnaan diferensial karena pewarnaan ini mampu mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan menjadi dua yaitu Gram negatif dan Gram positif. B.
Tujuan
Adapun tujuan dari praktikum ini adalah sebagai berikut : 1.
Mengetahui dan memahami teknik pewarnaan mikroba
2.
Mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri
3.
Membedakan golongan bakteri gram positif dan gram negatif.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm. Bentuk bakteri bermacam – macam yaitu elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan, 2007). Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagianbagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007). Bakteri yang diwarnai dengan teknik pewarnaan Gram terbagi dua golongan, yaitu: Gram positif , bila warna zat pewarna pertama (karbol gentian violet) tetap bertahan, dengan demikian warna se bakteri tampak ungu tua; dan Gram negatif, bila warna zat pewarna pertama tidak bertahan (luntur) kemudian tercat oleh zat pewarna tandingannya, misal: air fuchsin, safranin, dan oleh zat pewarna tandingan lainnya. (Razali, 1987) Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan struktur dan komposisi dinding sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang penting; dinding sel bakteri Gram negatif pada umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada Gram positif. Kenyataannya dalam eksperimen pengecatan mennjukkan bahwa perlakuan dengan alkohol mengeskstrak lipid, yang menyebabkan poisitas atau permeabilitas didding sel meningkat. Denagn demikian, kompleks karbol gentian violet dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram negatif terwarnakan. Keterangan lain yang hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara kedua golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram negatif kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih sedikit daripada baktri gram posiif. Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram negatif tetap masih cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks karbol gentian violet dan lugol. Selautnya, bila sel-sel Gram psitif diperlakukan dngan lisozim untuk menyingkirkan dinding selnya, sisa strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa dinding akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, sel ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa struktur dinding sel bakteri Gram positif itu yag menjadi tempat tertahannya zat pewarna pertama yaitu karbol gentian violet. (Razali, 1987)
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991). Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008). Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, salah satu di antaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna terdapat pada ion positif (zat pewarna+ Cl-) dan pada pewarna asam, warna akan terdapat pada ion negatif (zat pewarna- Na+). Hubungan antara bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa, Kristal violet, safranin dan metilin blue adalah beberapa zat pewarna basa yang biasa digunakan. Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai bakteri dengan zat pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar belakang saja. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna (Volk & Wheeler, 1993). Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter kebangsaan Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna tersebut merupakan pewarna differensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua kelompok fisiologi, yang akan memudahkan untuk identifikasi. Prosedur pertama dari pewarnaan gram ini adalah memberi pewarna kristal violet, setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan pewarna yodium, setelah satu menit dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol 95% selama 30 detik, kemudian dibilas dan diberi pewarna safranin atau bismarck (untuk buta warna merah) selama 1 menit. Zat pewarna kristal violet dan yodium akan membentuk senyawa yang kompleks. Beberapa bakteri akan melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci dan beberapa bakteri yang lain zat pewarna akan bertahan walaupun dicuci dengan alkohol 95%. Bakteri gram positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri gram negatif akan terwarna merah (safranin) (Umsl, 2008). Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan Ziehl‐ Nelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk kompleks
Kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus, Clostridia, Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Sedangkan bakteri Gram negatif akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan memberikan warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram negative adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella, Hemophillus, dll (Cappuccino & Sherman, 1983). Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium, alkohol dan safranin (Tracy, 2005). Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding sel bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alcohol, maka pori‐pori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. Hal ini akan mengecilkan pori‐pori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif hanya memiliki 1‐2 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih besar. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet, Aalkohol, Ammonium oksalat, Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium iodide, Aquades), Gram C (Aseton, Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol, Aquades) (Madigan, 2003). Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut: pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial (pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam), pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul, pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri (pewarnaan Neisser (granula volutin), pewarnaan yodium (granula glikogen) dan pewarnaan negatif (Gozali, 2009) BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN B.
Pembahasan
Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram negative, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal violet. Contoh dari bakteri gram
positif ialah Clostridium perfringens, Staphylococcus aureas, sedangkan bakteri gram negative misalnya adalah Eschericia Coli. Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik aseptik. Alkohol 70% yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja, bahkan tangan pun sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan agar mendapatkan pengukuran yang akurat. Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya menggunakan alkohol. Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas. Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api. Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan gram A (methylene blue) sebanyak 1-2 tetes dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan dan menggunakan tissue untuk mengeringkan bagian bawah ojek gelas. Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari methylen blue. Kemudian ditambahkan larutan gram B yang merupakan cat mordan, larutan ini mengandung yodium dan kalium yodida, Gram B merupakan larutan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari zat warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna. Pada pewarnaan gram, penambahan larutan mordan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks. Tanpa penambahan larutan mordan, zat warna methylene blue akan larut saat penambahan larutan alkohol. Lalu dibiarkan selama 1 menit untuk dibilas kembali dengan aquades. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat). Alkohol 95% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan biru dari komplek methylen blue dan KI pada gram negatif, karena mengandung lipid sedangkan pada gram positif akan tetap mempertahankan warna biru karena mengandung peptidoglikan. Larutan ini juga berfungsi untuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negatif yang akan menyebabkan poripori sel membesar sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan methylene blue. Perlakuan ini dilakukan tidak membutuhkan waktu yang lama atau secepat mungkin untuk melakukan pembilasan dengan aquades. Kemudian dilakukan pengeringan. Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin (gram D) sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 30 detik. Gram D merupakan cat yang terdiri dari campuran safranin 0, 25 gram , etil alkohol 95% 10 ml, dan akuades 90 ml. Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena persenyawaan kompleks methylene blue tetap terikat pada dinding sel. Pada bakteri gram negatif penambahan safranin
akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah karena warna biru yang dihasilkan oleh methylene blue telah luntur dengan lisisnya membran sel sehingga safranin dapat terikat. Oleh sebab itu, gram D atau zat pewarna kedua berfungsi sebagai pembeda terhadap zat warna kristal violet (Lay, 1994). Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering dianginkan, Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Kemudian preparat dikeringkan dengan cara dianginanginkan lalu dilakukan pengamatan di bawah mikroskop. Pemberian methylen blue pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna biru. Perbedaan respon terhadap mekanis pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna biru. Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Berdasarkan hasil pengamatan di bawah mikroskop, diidentifikasi bakteri jenis termofilik yang mempunyai bentuk coccus (bulat) dan berwarna biru, bakteri ini digolongkan ke dalam bakteri gram positif karena ciri-cirinya menunjukkan ciri bakteri gram positif. Sedangkan untuk sampel bakteri kedua, diidentifikasi bakteri E.coli yang mempunyai bentuk basil (batang) dan berwarna merah, bakteri ini digolongkan ke dalam bakteri gram negatif, karena menunjukkan ciri-ciri dari bakteri gram negatif. Hasil pengamatan tersebut dapat dinyatakan berhasil dan benar, karena berdasarkan literatur yang ada bakteri E.coli merupakan golongan bakteri gram negatif. BAB V PENUTUP A.
Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang dilakukan, maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut : 1. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat digunakan untuk membedakan antara bakteri gram negatif dan gram positif. Pewarnaan ini sering digunakan untuk identifikasi dan klasifikasi bakteri. Komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan bakteri gram negatif sehingga hasil pewarnaan gram akan berbeda. 2. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan warna methylene blue sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal.
3. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan warna methylene blue sewaktu prose pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis. 4. Berdasarkan hasil pengamatan dapat diidentifikasi bahwa bakteri E.coli merupakan golongan bakteri gram negatif, sedangkan bakteri jenis termofilik merupakan golongan bakteri gram positif.
B.
Saran
Diharapkan kepada praktikan diharapkan lebih memahami prinsip percobaan dan prosedur kerja pada percobaan. DAFTAR PUSTAKA Cappuccino, J., G., & Natalie., S, 1983, Microbiology A Laboratory Manual, Addison-Wesley Publishing Company : New York. Gozali, Amir, 2009, Pewarnaan Gram, http://www.gozali.blogspot.com/ gram/pewarnaangram-prinsip.html . Diakses pada tanggal 14 April 2012. Hadiotomo, Ratna Siri., 1990, Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Pt Gramedia. Lay, B.W, 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada : Jakarta. Madigan, M.T, 2003, Brock Biology of Microorganism, Pearson Education : inc. United State of America. Pelczar, M. J., Chan, E.C.S, 2007, Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book Company : New York. Razali, U., 1987, Mikrobiologi Dasar, Jatinangor: FMIPA UNPAD. Sutedjo, M., 1991, Mikrobiologi Tanah, Rineka Cipta. Jakarta. Tracy, 2005, Gram Staining, www.tracy.k12.ca.us/ thsadvbio/ pdfs/ gram%20stain.pdf, Diakses pada tanggal 14 April 2012. Umsl, 2008, Staining Bacteria, www.umsl.edu /~microbes/pdf/ stainingbacteria.pdf, Diakses pada tanggal 14 April 2012. Volk & Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga : Jakarta
laporan mikrobiologi teknik isolasi mikroba BAB I PENDAHULUAN A.
Latar Belakang
Pada umumnya mikroba yang hidup di alam terdapat dalam bentuk populasi campuran. Sangat jarang mikroba di alam dijumpai sebagai spesies yang tunggal. Dengan demikian, agar mikroba tersebut dapat diidentifikasikan, sehingga mudah dipelajari sifat pertumbuhan, morfologis, dan fisiologis masing-masing mikroba maka langkah pertama yang harus dilakukan yaitu spesies tersebut dipisahkan dari organisme lain yang umum dijumpai dalam habitatnya, kemudian ditumbuhkan menjadi biakan murni yaitu suatu biakan yang terdiri dari sel-sel dari satu spesies. Mikroorganisme tersebar luas di dalam lingkungan baik di tanah, air,maupun udara. Keberadaan mikroorganisme baru dapat kita rasakan melewatimakanan yang kita konsumsi dan sebagai akibatnya produk pangan jarang sekali yang steril dan umumnya tercemar oleh berbagai mikroorganisme. Bahan panganselain merupakan sumber gizi bagi manusia, juga sebagai sumber makanan bagi perkembangan mikroorganisme. Pertumbuhan atau perkembangan mikroorganisme dalam makanan sangat erat hubungannya dengan kehidupan manusia. Mikroorganisme merupakan mahluk hidup yang sangat banyak, baik ditanah, air maupun udara. Untuk itu perlunya isolasi maupun permurnian untuk mendapatkan mikroorganisme tersebut. Populasi yang besar dan kompleks dengan berbagai mikroba terdapat dalam tubu manusia termasuk dimulut, saluran pencernaan dan kulit. Isolasi adalah cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobianya berasal dari pembelahan dari satu seltunggal. Kultur murni atau biakan murni diperlukan karena semua metode mikrobiologis yang digunakan untuk menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme, termasuk penelaahan ciri-ciri kultural, morfologis, fisiologis,maupun serologis, memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Adapun yang melatar belakangi sehingga peraktikum ini dilaksanakan adalah untuk mengetahui dan menguasai teknik isolasi mikroba dari wadah yang satu ke wadah yang lain sehingga hanya biakan murni yang dapat tumbuh.
B.
Tujuan
Adapun tujuan dari percobaan Teknik Isolasi Mikroba adalah sebagai berikut : 1. Untuk mengetahui dan memahami teknik pengisolasian mikroba. 2. Untuk mengetahui teknik pemindahan biakan mikroba dari wadah satu ke wadah yang lain sehingga tidak bercampur dengan bakteri lain.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya (Nur, I. dan Asnani, 2007). Dikenal beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah metode cawan gores dan metode cawan tuang. Yang didasarkan pada prinsip pengenceran dengan maksud untuk memperoleh spesies individu. Dengan anggapan bahwa setiap koloni dapat terpisah dari satu jenis sel yang dapat diamati (Afrianto, 2004). Biakan murni diperlukan dalam berbagai metode mikrobiologis, antara lain digunakan dalam mengidentifikasi mikroba. Untuk mengamati ciri-ciri kultural morfologi, fisiologi dan serologi dibutuhkan mikroba yang berasal dari satu spesies (Dwidjoseputro, 2005). Menurut Hadioetomo (1993), ada dua metode yang dilakukan untuk memperoleh biakan murni yaitu : 1. Metode cawan gores Metode ini mempunyai dua keuntungan, yaitu menghemat bahan dan waktu. Metode cawan gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. 2. Metode cawan tuang Cara lain untuk memperoleh koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme adalah dengan mengencerkan spesimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan ( ±50 oC ) yang kemudian dicawankan. Karena konsentrasi sel-sel mikroba di dalam spesimen pada umunya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang-kurangnya satu di antara cawan tersebut mengandung koloni terpisah di atas permukaan ataupun di dalam agar. Metode ini memboroskan bahan dan waktu namun tidak memerlukan keterampilan yang tinggi. Metode cawan gores memiliki dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme seperti yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan oleh para mahasiswa yang baru mulai mempelajari mikrobiologi ialah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik-baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel-sel yang digoreskan (Ratna, 1990). Menurut Dwidjoseputro (1980), sifat-sifat koloni yang tumbuh pada agar-agar lempengan, pada agar-agar miring dan pada tusukan gelatin adalah sebagai berikut : 1. Sifat-sifat koloni pada agar-agar lempengan mengenai bentuk, permukaan dan tepi. Bentuk koloni dilukiskan sebagai titik-titik, bulat berbenang, tak teratur, serupa akar, serum
kumparan. Permukaan koloni dapat datar, timbul mendatar, timbul melengkung, timbul mencembung, timbul membukit dan timbul berkawah. Tepi koloni ada yang utuh, ada yang berombak, ada yang berbelah-belah, ada yang bergerigi, ada yang berbenang-benang dan ada yang keriting. 2. Sifat-sifat koloni pada agar-agar miring. Sifat ini berkisar pada bentuk dan tepi koloni dan sifat itu dinyatakan dengan kata-kata seperti : serupa pedang, serupa duri, serupa tasbih, serupa titik-titik, serupa batang dan serupa akar. 3. Sifat koloni tusukan dalam gelatin. Ada bakteri yang dapat mengencerkan gelatin. Karena itu, maka bentuk-bentuk koloninya juga berbeda-beda. Lagipula bentuk koloni yang tidak dapat mengencerkan gelatin. Bila dilihat dari samping koloni yang tidak mengencerkan gelatin dapat serupa pedang, tasbih, bertonjol-tonjol dan berjonjot. Jika bakteri mampu mengencerkan gelatin, maka bentuk koloninya dapat serupa kawah, serupa mangkuk, serupa corong, pundi-pundi dan berlapis. Setelah mikroba ditumbuhkan pada media agar tabung maupun cawan dan estelah inkubasi akan terlihat pertumbuhan bakteri dengan berbagai macam bentuk, ukuran, sifat, dan berbagai ciri khas yang lain. Ciri-ciri ini akan mengarahkan ke sifat-sifat mikroba tersebut pada media pertumbuhan, sehingga pengamatan morfologi ini sangat penting untuk diperhatikan (Ratna,1990). Bakteri yang memiliki flagella sering kali membentuk koloni yang menyebar terutama jika menggunakan lempengan agar basah, untuk mencegah menyebarnya koloni maka harus digunakan agar benar-benar kering (Djida, N., 2000). B. Pembahasan Percobaan kali ini membahas tentang cara-cara atau teknik yang biasa digunakan dalam mengisolasi mikroba dari habitat alaminya. Teknik isolasi mikroorganisme adalah suatu usaha untuk menumbuhkan mikroba di luar lingkungan alamiahnya. Pemisahan mikroorganisme dari lingkungannya ini bertujuan untuk memperoleh biakan bakteri yang sudah tidak bercampur lagi dengan bakteri lainnya atau yang disebut biakan murni. Di kehidupan normalnya atau di habitat alamiahnya mikroba sulit ditemukan dalam bentuk koloni sendiri. Mikroba ini pasti ditemukan dalam bentuk koloni yang hidup bersama-sama dengan koloni mikroba yang lainnya. Oleh karena itu, pengisolasian ini dilakukan. Percobaan ini diawali dengan tahap pengenceran. Dalam hal ini, medium agar yang digunakan diencerkan terlebih dahulu selama ±15 menit pada Hot Plate dengan suhu 300°C. Hal ini bertujuan agar medium yang digunakan dapat mencair setelah disimpan selama beberapa hari di refrigerator. Setelah diencerkan dengan menggunakan Hot Plate, medium ini didinginkan sekitar 5 menit namun tidak jangan sampai dingin sekali. Hal ini dilakukan untuk menghindari medium agar tidak kembali mengeras. Setelah agak dingin, medium ini pun siap untuk digunakan. Pengisolasian ini dilanjutkan dengan pembuatan medium tempat mikroba ini nantinya akan tumbuh atau dengan kata lain membuat habitus sintetisnya. Medium ini terlebih dahulu disterilkan dengan cara melidah-apikan mulut botol tempat penyimpanan medium agar tersebut. Begitupun dengan cawan petri itu sendiri. Sebelum semua prosedur kerja dilakukan terlebih dahulu tangan harus disterilkan menggunakan alcohol 70% yang disemprotkan ke seluruh permukaan tangan.
Dalam percobaan ini, kami menggunakan jarum ose sebagai media untuk memindahkan mikroba tersebut dari habitus alaminya. Jarum ose tersebut terlebih dahulu harus disterilkan dengan cara membakarnya pada bunsen sampai jarumnya pijar. Lalu jarum ose tersebut didiamkan selama ±2 menit, tujuan hal ini yaitu untuk mendinginkan jarum ose-nya yang habis dipijarkan tadi agar ketika jarum ose itu digoreskan ke dalam cawan petri yang berisi objek mikroba yang akan diisolasi, tidak segera mematikan mikrobanya. Praktikum kali ini adalah mempelajari teknik isolasi mikroba dengan cara goresan. Teknik goresannya dilakukan dalam cawan petri. Dengan menggunakan jarum ose yang sebelumnya dipanaskan pada api bunsen lalu dicelupkan pada alkohol untuk sterilisasi jarumnya. Goresan diberikan sangat tipis sekali pada permukaan atas medium dalam cawan petri secara zig-zag, Pada percobaan ini mikroba yang digunakan hanya satu jenis yaitu bakteri dan menggunakan dua medium yakni medium NA dan medium PDA. Medium NA berfungsi untuk membiakan berbagai macam mikroorganisme serta kultur bakteri. Sedangkan medium PDA berfungsi untuk menumbuhkan fungi jenis kapang. Pada praktikum ini kita mempelajari bagaimana melakukan teknik inokulasi biakan mikroorganisme pada medium steril sehingga bisa mendefinisikan bahwa teknik inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium lama kemedium baru dengan tingkat ketelitian sangat tinggi dan dituntut untuk bekerja secara aseptic yaitu bebas dari pengaruh kontaminan mikroorganisme yang lain. Teknik aseptic dilakukan dengan penyediaan alat-alat kerja yang steril dan bekerja didekat api Bunsen agar terhindar dari kontaminan udara.pada waktu inokulasi jarum yang digunakan untuk meindahkan mikroba harus dipijarkan diatas api segera sebelum dan sesudah melakukan pemindahan. Pemanasan ini menghancurkan semua bentuk kehidupan yang ada pada permukaan jarum atau alat pemindahan, setelah di inokulasi biakan bakteri disimpan dan diinkubasi dalam lingkungan yang sesuai untuk petumbuhan. Setelah diinkubasi selama 48 jam diperoleh hasil pertumbuhan mikroba hanya pada medium NA, sedangkan pada medium PDA tidak mengalami pertumbuhan sama sekali. Hal ini dikarenakan mikroba yang diisolasi adalah jenis bakteri, dan bakteri hanya dapat tumbuh pada medium NA. Jadi yang akan dibahas pada kali ini adalah bagaimana pertumbuhan mikroba pada medium NA. Pada cawan petri pertama, jumlah koloni yang tumbuh adalah sebanyak 8 koloni dan memiliki morfologi seperti warna putih susu, tepi berlekuk, bentuk tak beraturan dan menyebar, permukaan timbul, dan tekstur kusam. Pada cawan petri kedua, jumlah koloni yang ditemukan adalah sebanyak 4 koloni dan berwarna kream, tepi berlekuk, bentuk tak beraturan dan menyebar, permukaan timbul, dan tekstur kusam. Pada cawan petri ketiga dan keempat, masing-masing ditemukan mikroba dengan jumlah 5 koloni dan 1 koloni, dan untuk morfologinya sama dengan pada cawan petri kedua. Untuk cawan petri terakhir ditemukan mikroba sebanyak 6 koloni, dan memiliki morfologi seperti warna kream, tepi tak beaturan, bentuk tak beraturan dan menyebar, permukaan timbul dan tekstur kusam. Berdasarkan hasil percobaan tersebut diatas maka dapat dikatakan percobaan tersebut belum berhasil. Menurut Ratna (1990), bila menggunakan teknik menggores yang baik maka pada suatu area tertentu pada permukaan medium yang digores, sel-sel bakteri akan terpisahkan satu dari lainnya. Sel-sel tunggal yang terpisahkan seperti ini disebut sel induk. Bagi kebanyakan bakteri, setelah masa inkubasi selama 24 jam, satu koloni murni dapat terdiri dari 50-72 generasi sel yang timbul dari satu sel induk tunggal. Dengan perkataan lain, satu koloni murni terdiri dari bermilyar-milyar sel anak. Karena itu, hendaklah dipahami bahwa pertumbuhan bakteri sesungguhnya merupakan pertambahan jumlah sel dan bukan ukuran sel
BAB V PENUTUP A.
Kesimpulan
Adapun yang dapat disimpulkan dari percobaan Teknik Isolasi Mikroba adalah sebagai berikut: 1. Teknik isolasi mikroorganisme adalah suatu usaha untuk menumbuhkan mikroba diluar dari lingkungan alamiahnya, untuk memperoleh biakan murni. Biakan murni yaitu mikroba yang sudah tidak bercampur lagi dengan mikroba lainnya. 2. Teknik yang digunakan untuk teknik isolasi mikroba adalah teknik goresan, yaitu metode goresan radian, langsung dan kuadran. 3. Medium yang digunakan untuk biakkan murni adalah medium NA untuk biakkan bakteri dan medium PDA untuk biakkan kapang.
B.
Saran
Pada praktikum selanjutnya sebaiknya praktikan lebih memperhatikan lagi pada saat praktikum dilaksanakan. Agar tidak terjadi kesalahan-kesalahan kecil yang bisa mempengaruhi hasil yang diperoleh. DAFTAR PUSTAKA Afrianto, L., 2004, Menghitung Mikroba Pada Bahan Makanan, Cakrawala (Suplemen pikiran rakyat untuk iptek), Farmasi FMIPA ITB : Bandung. Djida, N., 2000, Metode Instrumental dalam Mikrobiologi Umum, UNHAS Makassar
Press :
Dwidjoseputro, 1980, Dasar-Dasar Mikrobiologi, Djambatan : Jakarta. Hadioetomo, R. S., 1993, Mikrobiologi Dasar dalam Praktek, Gramedia : Jakarta. Nur Indriyani, Asnani, 2007, Penuntun Praktikum Mikrobiologi Akuatik, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Unhalu : Kendari. Ratna, Sri, 1990, Mikrobiologi Dasar dalam Praktek, Jakarta : Gramedia.
Dasar Teori DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA terdapat pada nukleus, mitokondria, plastida dan sentriol. Molekul DNA pada nucleus memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan DNA yang terletak pada mitokondria dan plastida berbentuk lingkaran (Suryo, 2012 : 59). DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA. Setelah menunggu beberapa saat terjadi presipitasi pada lapisan atas bukan lapisan bawah, yang menunjukkan bahwa DNA tidak larut dalam etanol tetapi larut dalam air. Ketika molekul DNA terlarut, mereka tersebar dalam larutan sehingga tidak terlihat. Ketika molekul tersebut berpindah kedalam larutan yang bukan pelarut meraka akan berkumpul/ menggumpal sehingga dapat dilihat. Presipitat DNA terlihat seperti serabut-serabut putih yang terkumpul diatas permukaan larutan karena masa jenis etanol lebih kecil dari pada masa jenis air. Etanol yang digunakan harus benar-benar dingin dan berasal dari lemari pendingin, hal ini bertujuan untuk menyempurnakan presipitasi. Apabila etanol yang digunakan kurang dingin, maka mengakibatkan pembentukan presipitat kurang sempurna. F.
Pembahasan
Berdasarkan hasil percobaan pada tabel 1, diperoleh hasil bahwa setiap buah memiliki waktu yang berbeda-beda dalam pembentukan molekul DNA dan ketebalan DNA yang terbentuk. Saat penetesan etanol ke tabung reaksi yang berisi alikot melon, dibutuhkan waktu 10,76 detik untuk terbentuknya benang-benang DNA. Sementara pada alikot nanas dan tomat membutuhkan waktu 9 detik untuk pembentukan benang DNA. Waktu untuk pembentukan benang DNA yang tersingkat terjadi pada buah jeruk, yaitu hanya membutuhkan waktu selama 7 detik. Buah semangka membutuhkan waktu 10 detik untuk membentuk benangbenang DNA. Dan buah strawberry memiliki waktu yang paling lama untuk membentuk benang-benang DNA, yaitu selama 77 detik. Ketebalan DNA yang terbentuk pun bervariasi, mulai dari yang tipis sampai yang tebal. Lapisan DNA yang paling tebal berada pada alikot buah jeruk dengan ketebalan 4,4 cm, tetai terdapat gumpalan berwarna kuning di bagian atas lapisan benang DNA. Sementara pada alikot buah lain tidak terjadi gumpalan seperti pada alikot buah jeruk. Ketebalan benang DNA pada buah semangka dan melon sama, yaitu hanya 0,3 cm. Sementara pada buah nanas dan tomat ketebalan benang DNA memiliki angka yang lebih besar, yaitu 0,5 cm. Dan pada buah semangka diperoleh ketebalan benang DNA sepanjang 1,6 cm. Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar air rendah (kaya serat). Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut
di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit. Suatu sumber menyatakan bahwa dalam proses pembuatan sumber DNA untuk isolasi DNA hendaknya jangan terlalu encer karena semakin encer sumber DNA, DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Karena sel yang lisis di dalam air tentunya lebih sedikit jika dibandingkan dengan sumber DNA yang lebih kental (Anonim, 2005). Namun, masalah pengaruh keenceran terhadap hasil isolasi DNA dapat diatasi dengan pengurangan jumlah Akuades yang digunakan sehingga walaupun sumber DNA yang digunakan adalah buah dengan kadar air tinggi, tetap dapat diperoleh ekstrak yang cukup kental. Dengan adanya garam (kation kovalen seperti Na+) dan pada suhu dibawah 20˚ C atau kurang, ethanol absolut akan mempresipitasikan asam nukleat polimerik dengan baik. Pemekatan ini dilakukan dengan penambahan ethanol pada lapisan atas sampel sehingga terjadi pesipitasi DNA pada perbatasan kedua larutan. Dalam proses ini ion Na+ akan memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif ion fosfat DNA. Kutub tersebut bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak menolak satu sama lain sehingga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA, DNA akan berkumpul. garam juga berperan penting, yaitu untuk menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat menyebabkan keduanya terpresipitasi, dan bersama-sama dengan detergent, G.
Kesimpulan
1. DNA dapat diisolasikan dari sumber DNA berupa buah dengan penambahan larutan deterjen dan etanol serta garam untuk membantu presipitasi DNA. 2. Hasil isolasi DNA sangat dipengaruhi oleh jenis buah. Terbukti dari hasil pengamatan, pada masing-masing buah didapatkan hasil yang berbeda. 3. Semakin encer alikot, DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Karena sel yang lisis di dalam air tentunya lebih sedikit jika dibandingkan dengan sumber DNA yang lebih kental. Daftar Pustaka http://zuzoqu.wordpress.com/tag/genetika/, diakses pada 17 September 2012 http://mubtadiahc.blogspot.com/2012/04/isolasidna-dengan-metode-kitchen.html, pada 16 September 2012
diakses
BAB I PENDAHULUAN Teori kehidupan di muka bumi ini bergantung pada fotosintesis, baik langsung maupun tidak langsung. Fotosintesis menghasilkan oksigen dalam atmosfer yang penting bagi mahluk hidup, serta menghasilkan karbohidrat atau amilum yang juga berguna bagi mahluk lain sebagai sumber tenaga. Organisme fungsi suatu sel hidup bergantung pada proses pembakaran energi yang tidak henti-henti sumber energi ini tersimpan dalam molekulmolekul organik seperti karbohidrat yang dihasilkan dari proses fotosintesis. Fotosintesis merupakan suatu proses pembentukan bahan organik dari bahan anorganik dengan bantuan cahaya matahari dan klorifil. Tujuan praktikum Biologi dengan materi fotosintesis adalah untuk membuktikan terbentuknya zat pati atau amilum pada proses fotosintesis yang terjadi pada daun gamal yang mengandung klorofil. Manfaat dari praktikum ini adalah untuk mengetahui secara nyata dan benar tentang terjadinya proses fotosintesis pada tumbuhan dengan bantuan cahaya matahari secara langsung dan yang tidak terkena matahari secara langsung. BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Pengertian fotosintesis Fotosintesis menyediakan makanan bagi hampir seluruh kehidupan dunia baik secara tidak langsung maupun secara langsung. Fotosintesis adalah suatu proses dimana terjadi sintesa karbohidrat tertentu dari karbondioksida dan air yang dilakukan oleh sel-sel yang berklorofil dengan adanya cahaya matahari dan dibebaskan gas oksigen (Campbell, 2002). Di dalam daun terdapat mesofil yang terdiri atas jaringan bunga karang dan jaringan pagar. Pada kedua jaringan ini, terdapat kloroplas yang mengandung pigmen hijau klorofil. Pigmen ini merupakan salah satu dari pigmen fotosintesis yang berperan penting dalam menyerap energi matahari (Prawirohartono, 2005). Klorofil menyerap cahaya yang akan digunakan dalam fotosintesis. Meskipun seluruh bagian tubuh tumbuhan yang berwarna hijau mengandung kloroplas, namun sebagian besar energi dihasilkan di daun (Hopkins dan Hϋner, 2004). 2.2. Macam-macam fotosintesis 2.2.1. Reaksi terang Reaksi terang adalah proses untuk menghasilkan ATP dan reduksi NADPH2. Reaksi ini memerlukan molekul air dan cahaya matahari. Proses diawali dengan penangkapan foton oleh pigmen sebagai antena (Alberts, 2002). Reaksi terang melibatkan dua fotosistem yang saling bekerja sama, yaitu fotosistem I dan II. Fotosistem I (PS I) berisi pusat reaksi P700, yang berarti bahwa fotosistem ini optimal menyerap cahaya pada panjang gelombang 700 nm, sedangkan fotosistem II (PS II) berisi pusat reaksi P680 dan optimal menyerap cahaya pada panjang gelombang 680 nm (Raven, et al. 2005). 2.2.2. Reaksi gelap Pada proses reaksi gelap tidak dibutuhkan cahaya matahari. Reaksi gelap bertujuan untuk mengubah senyawa yang mengandung atom karbon menjadi molekul gula (Taiz dan Zeiger, 2002). Dalam reaksi gelap terjadi proses embentukan karbohidrat dari CO2 dengan
menggunakan hasil-hasil dari reaksi fotokimia atau reaksi terang. Hasil pertama fotosintesis yang stabil adalah PGA (Phosphat Gliseric Acid) dan ribulase diphosphat sebagai aseptor CO2 (Campbell, 2002). 2.3. Faktor-faktor yang mempengaruhi fotosintesis Proses fotosintesis dipengaruhi beberapa faktor, yaitu faktor yang dapat mempengaruhi secara langsung seperti kondisi lingkungan maupun faktor yang tidak mempengaruhi secara langsung seperti terganggunya beberapa fungsi organ yang penting bagi proses fotosintesis. Proses fotosintesis sebenarnya peka terhadap beberapa kondisi lingkungan meliputi kehadiran cahaya matahari, suhu lingkungan, konsentrasi karbondioksida (CO2). Faktor lingkungan tersebut dikenal juga sebagai faktor pembatas dan berpengaruh secara langsung bagi laju fotosintesis. Faktor pembatas tersebut dapat mencegah laju fotosintesis mencapai kondisi optimum meskipun kondisi lain untuk fotosintesis telah ditingkatkan, inilah sebabnya faktorfaktor pembatas tersebut sangat memengaruhi laju fotosintesis yaitu dengan mengendalikan laju optimum fotosintesis (Andrews, 2008). Sedangkan faktor dari dalam tumbuh-tumbuhan terhadap fotosintesis ialah kadar klorofil, hidrasi dari protoplasma dan anatomi dari daun (Campbell, 2002). 2.4. Indikator JKJ JKJ merupakan suatu yang berfungsi sebagai indikator atau petunjuk untuk mengetehui adanya larutan amilum atau glukosa (Campbell, 2002). JKJ dapat bekerja apabila adanya kandungan zat amilum ( Recce, 2002).
Berdasarkan hasil praktikum mengenai fotosintesis, daun gamal yang ditutupi aluminium foil setelah direbus dalam alkohol dan klorofilnya larut kemudian ditetesi JKJ terlihat bagian yang ditutupi aluminium foil tetap berwarna kekuningan sedangkan bagian yang tidak tertutupi aluminium foil berubah menjadi gelap karena bagian daun tersebut mengandung amilum hasil dari fotosintesis. Hal ini bersesuaian dengan pendapat Campbell (2002) JKJ merupakan suatu larutan yang mengandung idium yang berfungsi sebagai indikator atau petunjuk untuk mengetehui adanya larutan amilum atau glukosa. Dan ditambahkan oleh Recce (2002) JKJ dapat bekerja apabila adanya kandungan zat amilum. Berdasarkan hasil praktikum daun gamal yang tidak ditutupi oleh alumunium foil setelah direbus dalam alkohol dan ditetesi JKJ, ternyata warnanya berubah menjadi gelap atau hitam. Klorofil sangat penting sebagai penangkap cahaya matahari sebagai sumber energi dalam proses fotosintesis. Hal ini sesuai dengan pendapat dari Hopkins dan Hϋner (2004) yang menyatakan bahwa klorofil menyerap cahaya yang akan digunakan dalam fotosintesis. Meskipun seluruh bagian tubuh tumbuhan yang berwarna hijau mengandung kloroplas, namun sebagian besar energi dihasilkan di daun. Warna hitam pada daun gamal disebabkan karena daun gamal mengandung amilum yang merupakan hasil fotosintesis yang dibantu oleh cahaya matahari. Hal ini sesuai dengan pendapat dari Andrews (2008) yang menyatakan bahwa proses fotosintesis sebenarnya peka terhadap beberapa kondisi lingkungan meliputi kehadiran cahaya matahari, suhu lingkungan, konsentrasi karbondioksida (CO2). Dan warna gelap terbentuk karena JKJ bereaksi terhadap amilum atau glukosa. Hal ini sesuai dengan pendapat dari Recce (2002) yang menyatakan bahwa JKJ dapat bekerja apabila adanya kandungan zat amilum.
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1. Kesimpulan Berdasarkan hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa fotosintesis membutuhkan cahaya matahari, tanpa cahaya matahari fotosintesis tidak akan berlangsung sehingga zat amilum juga tidak terbentuk. Fotosintesis dapat dilakukan oleh tumbuhan berklorofil. Fotosintesis sangatlah penting bagi seluruh mahluk hidup karena ialah penghasil amilum sebagai sumber energi dan oksigen untuk proses respirasi. Oksigen juga berperan dalam mencegah naiknya suhu bumi. Pemberian JKJ digunakan agar mengetahui apakah ada amilum yang merupakan hasil fotosintesis. 5.2. Saran Berdasarkan praktikum kali ini disarankan agar praktikan lebih teliti dan cermat saat melaksanakan praktikum, agar pelaksanaan praktiku berjalan secara lancar. DAFTAR PUSTAKA Alberts et al. 2002. Molecular Biology of The Cell 4th Edition. New York, Garland Publishing. Andrews N R. 2008. The effect and interaction of enhanced nitrogen deposition and reduced light on the growth of woodland ground flora. Campbell, N. A. 2002. Biologi Jilid 2. Erlangga, Jakarta. Hopkins WG, Hϋner NPA. 2004. Introduction to Plant Physiology. Hoboken: John Wiley & Sons. Prawirohartono S. 2005. Sains Biologi. Jakarta : Bumi Aksara. Raven, Peter H, Ray F. Evert, Susan EE. 2005. Biology of Plants, 7th Edition. New York: W.H. Freeman and Company Publishers. Taiz L, Zeiger E. 2002. Plant Physiology Third Edition. Sunderland: Sinauer Associates.
