I. PEND PENDAH AHUL ULUA UAN N A. Lata Latarr B Bel elak akan ang g Penelitian keragaman genetik tanaman merupakan salah satu kegiatan
penting untuk mendukung pemuliaan tanaman. Perbedaan tanaman dapat dide didete teksi ksi melal melalui ui bebe beberap rapaa pena penand nda, a, anta antara ra lain lain deng dengan an pola pola pita pita DNA DNA (Lamadji, (Lamadji, 1998), 1998), ang sering disebut disebut sebagai penanda molekuler. molekuler. Penanda Penanda molekuler berperan penting dalam konser!asi dan pengelolaan sumber daa genetik tanaman ("arp, 199#). $eknik molekuler ber!ariasi dalam %ara pelaksanaan untuk mendapatkan data, data, baik baik teknik teknikna na maupun maupun tingka tingkatan tan target target data data ang ang diingi diinginka nkan n sesuai sesuai kemudahan pelaksanaan, sumber daa manusia, &asilitas dan biaa. 'alah satu teknik molekuler ang telah dikembangkan untuk berbagai keperluan akni isolasi DNA. Langkah utama dalam isolasi DNA, aitu perusakan dinding sel, pemisahan DNA dari bahan padat, serta pemurnian DNA. DNA DNA ang ang diiso diisola lasi si dari dari tanama tanaman n serin seringk gkali ali terko terkont ntam amin inasi asi oleh oleh polisakarida dan metabolit sekunder. 'alah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel, dikaren dikarenakan akan tanaman tanaman memili memiliki ki dindin dinding g sel ang ang kuat, kuat, dan pada pada beberap beberapaa tanaman kontaminasi sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. "ehadiran kontaminasi diatas dapat menghambat akti!itas enim, misalna DNA tidak sensiti!e oleh enim retriksi dan mengganggu proses ampli&ikasi DNA dengan P*. +lektr +lektro&o o&oresi resiss dengan dengan gel agaros agarosaa merupa merupakan kan metode metode standar standar untuk memisahkan, mengidenti mengidenti&ikasi, &ikasi, mengkarakteri mengkarakterisasi sasi dan puri&ikasi puri&ikasi dari moleku molekull DNA. DNA. ara ara pemisa pemisahan han dengan dengan elektro elektro&ore &oresisi sisi ini merupa merupakan kan alat pendukung ang sangat pokok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan
aplikasi ang begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA. erdasarkan uraian tersebut, maka praktikum dengan judul isolasi DNA menjadi penting untuk dilakukan.
B. Rumusan Masalah *umusan masalah pada praktikum ini adalah bagaimana %ara mengisolasi DNA dari tanaman C. Tujuan Praktikum $ujuan ang ingin di%apai pada praktikum ini adalah untuk mengetahui
%ara mengisolasi DNA dari tanaman. D. Manfaat Praktikum an&aat ang diperoleh pada praktikum ini adalah dapat mengetahui
%ara mengisolasi DNA dari tanaman.
II. TINAUAN PU!TA"A A. Deoxyribonucleic Acid #DNA$
Deoxyribonucleic Acid (DNA)adalah olimer asam nukleat ang tersusun se%ara sistematis dan sabagai mekromolekul biologi untuk penimpanan in&ormasi geneti% ang diturunkan kepada jasad keturunanna. DNA memiliki dua &ungsi ang sangat penting, aitu sebagai autokatalisis dan heterokatalisis. DNA ber&ungsi sebagai autokatalisis karena DNA mampu mensintesis dirina sendiri untuk perbanakan materi genetik (replikasi) sedangkan DNA sebagai heterokatalisis karena DNA mampu mensintesis molekul kimia/i lainna seperti *NA, protein, dan lain0lain (transkripsi dan translasi) (*estu, 21). B. Is%lasi DNA
3solasi DNA dia/ali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, ang dapat dilakukan baik dengan %ara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku0leleh maupun dengan %ara enimatis seperti pemberian lisoim. Langkah berikutna adalah lisis sel. ahan0bahan sel ang relati& lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bu&er nonosmotik, sedangkan bahan0bahan ang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen ang kuat seperti triton 40122 atau dengan sodium dodesil sul&at ('D'). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. 'etelah sel mengalami lisis, remukan0remukan sel harus dibuang. iasana pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentri&ugasi. Protein ang tersisa dipresipitasi menggunakan &enol atau pelarut organik seperti kloro&orm untuk kemudian disentri&ugasi dan dihan%urkan se%ara enimatis dengan proteinase. DNA ang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih ter%ampur dengan *NA sehingga perlu ditambahkan *NAse untuk membersihkan DNA dari *NA. olekul DNA ang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentri&ugasi kerapatan menggunakan sl (Ardiana, 229). 3solasi DNA dengan metode modo&ikasi $A telah mengalami modi&ikasi pada berbagai tahap aitu proses penghomogenan dengan vortex mixer untuk membantu proses lisis sel. 3nkubasi pada suhu 5#6 selama 92 menit dan setiap 72 menit sampel dibolak0balik hal ini bertujuan untuk buffer dapat melisis sel se%ara sempurna karena larutan menjadi homogen. Pemisahan DNA dengan materi lainna dilakukan dengan penambahan
kloro&orm, proses ini diulang sebanak dua kali agar pemisahan DNA dengan komponen lainna menjadi lebih baik (ulani, 21). etode $A menggunakan isopropanol dingin 3sopropanol lebih e&isien dalam persipitasi DNA dibandingkan etanol. Namun, isopropanol kurang !olatil sehingga membutuhkan /aktu ang lebih lama untuk mengeringkan pellet larutan tersebut tetap dapat memberikan hasil ang baik dalam mengendapkan DNA. 'elain itu, jumlah !olume, suhu, dan lama inkubasi berpengaruh terhadap hasil persipitasi DNA. 3solasi DNA ang memiliki kualitas terbaik dan sedikit kontaminan diharapkan untuk kebutuhan P* sehingga diperoleh metode terbaik untuk metode 'D', aitu !ariasi metode menggunakan Proteinase ". ariasi metode menggunakan kalium asetat # bukan metode terbaik disebabkan metode tersebut memiliki ketebalan
pita DNA ang lebih
tipis
menggunakan Proteinase " (tami, 21).
dibandingkan dengan !ariasi
III. MET&DE PRA"TI"UM
A. 'aktu (an Tem)at Praktikum ini dilaksanakan pada hari 'abtu, 7 April 215 pukul 17.22 :
1;.22 <3$A dan bertempat di Laboratorium nit =enetika, >urusan iologi, ?akultas atematika dan 3lmu Pengetahuan Alam, ni!ersitas @alu leo, "endari. B. Bahan Praktikum ahan ang digunakan pada praktikum ini ter%antum pada $abel 1. Ta*el +. Bahan (an kegunaan N% Bahan . 1 2 1 Pu%uk daun %okelat (Theobroma cacao) dan Dioscorea sp. Buffer $A (CetylTrymetil Ammonium Bromide)
7
Larutan β- Marchaptoetanol
B #
P3 ( Phenol-Chloroform Isoamyl Alcohol ) 'odium asetat
5 ; 8 9 12
+tanol 122C +tanol ;2C Akuades (d@) ubuk agarosa $A+ 1
11
+tr ( thidium Bromida)
1 !oadin" dye 17 Akuades C. Alat Praktikum
!atuan 3
g
uL
uL uL uL uL uL uL g mL uL uL mL
"egunaan 4
'ebagai objek pengamatan sampel DNA 'ebagai larutan pelisis membran sel, mendenaturasi protein, membentuk kompleks dengan DNA dan menghambat akti!itas nuklease 'ebagai larutan penghambat radikal bebas 'ebagai larutan ekstraksi DNA 'ebagai larutan pengikat DNA (presipitasi DNA) 'ebagai larutan pengendap DNA 'ebagai larutan pen%u%i DNA 'ebagai larutan pelarut DNA 'ebagai bahan pembuatan gel agarosa 'ebagai bahan %ampuran pembuatan gel agarosa dan larutan elektrolit 'ebagai bahan mengendarkan pita DNA pada gel agarose 'ebagai larutan pe/arna, pemberat dan penanda migrasi DNA 'ebagai larutan blanko
Alat ang digunakan pada praktikum ini ter%antum pada $abel . Ta*el ,. Alat dan kegunaan N% Alat . 1 2 1 $imbangan analitik Alu dan ortar
3 1
1
7
'patula
B #
$abung eppendorff ikropipet
5
#ello$ tip
;
%ater bath
8 9
&ree'er (entrifu"a
1
12 )andscun 11 "u!et
1
1
1 B 1 E 1
1
1
(pectrophotometer
1
17 +rlenmeer 1B )ot plate
1
1# 15
1
1
'umuran F 'isir 'et elektro&oresis
1; Photophoresis* doc 18 Alat tulis
1 "el
"egunaan
umlah
4 ntuk menimbang sampel ntuk menggerus atau menghaluskan sampel ntuk mengambil sampel hasil gerusan ntuk menimpan sampel DNA ntuk memindahkan larutan dalam !olume ke%il (uL) se%ara akurat ntuk mengambil larutan dengan !olume 2,1 mL ntuk menginkubasi sampel dalam kondisi basah ntuk menginkubasi sampel ntuk memisahkan sampel berdasarkan berat jenis molekul ntuk melapisi tangan saat bekerja ntuk menimpan sampel ang akan diabsorbansi ntuk mengetahui nilai absorbansi sampel ntuk /adah pembuatan gel agarosa ntuk memanaskan bahan pembuatan gel agarosa ntuk /adah pen%etak gel agarosa ntuk migrasi DNA berdasarkan berat molekul
1
ntuk mem!isualisasikan pita DNA
0
ntuk menuliskan hasil pengamatan
D. Pr%se(ur "erja Prosedur kerja ang dilakukan pada praktikum ini adalah sebagai berikut G 1. 3solasi DNA =enom $umbuhan 0 enimbang sampel pu%uk daun %okelat (Theobroma cacaoL.)
dan Dioscore sp. sebanak 2,102, gram.
0
enghaluskan sampel dengan %ara menggerusna menggunakan
0
mortar dan alu. emasukkan sampel ke dalam tabung eppendorff (1,# mL), kemudian menambahkan 522 uL buffer $A (Cetyl-Trymetil Ammonium Bromide) dan 1, uL larutan β-Marchaptaetanol lalu membolak0balik
0
sampel tersebut. enginkubasi sampel dalam $ater bath pada suhu 5# o selama 72
0
menit (setiap # menit membolak0balik sampel). 'etelah 72 menit, memasukkan sampel ke dalam free'er (lemari es)
0
selama # menit. engeluarkan sampel dari free'er+ kemudian melakukan sentri&ugasi sampel dalam tabung eppendorff pada ke%epatan 12.222 rpm selama
0
12 menit pada suhu 8 o. engambil supernatan dengan hati0hati dan memindahkan supernatan
0
tersebut pada tabung eppendorff baru (1,# mL). enambahkan 1 !olume P3 ( Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol )
0
kemudian membolak0balik sampel tersebut. elakukan sentri&ugasi sampel dalam tabung eppendorff
0
ke%epatan 12.222 rpm selama 12 menit pada suhu B o. engambil supernatan dengan hati0hati dan memindahkan supernatan
0
tersebut pada tabung eppendorff baru (1,# mL). enambahkan 2,1 !olume NaA dan !olume etanol 122C
pada
(absolut) dalam tabung eppendorff berisi sampel dan membolak0balik
0 0
sampel tersebut. enginkubasi sampel dalam free'er (lemari es) selama B jam. elakukan senti&ugasi sampel dalam tabung eppendorff
0 0
ke%epatan 12.222 rpm selama 2 menit pada suhu B o. embuang supernatan dan memperoleh pellet. enambahkan 2,# mL etanol ;2C, lalu membalikna se%ara perlahan.
pada
0
embuang larutan etanol ;2C, kemudian mengeringanginkan pellet
ang terbentuk. 0 enambahkan 20#2 uL akuades (d@). 0 elakukan pengujian kualitas dan kuantitas sampel DNA. . 'pektro&otometer 0 enalakan terlebih dahulu alat spektro&ometer dan menediakan 7 buah ku!et sebelum memulai pengukuran nilai absorbansi. 0 emasukkan akuades sebanak 1 mL ke dalam ku!et pertama sebagai larutan blanko, ku!et kedua (berisi 99# uL akuades F # uL sampel DNA %okelat) dan ku!et ketiga (berisi 99# uL akudes F # uL sampel
0
DNA Dioscorea sp.) emasukkan ku!et pertama ke dalam /adah spektro&ometer, lalu
0
menekan tombol Hread blan, untuk menghitung nilai absorbansina. emasukkan ku!et kedua ke dalam /adah spektro&ometer, lalu menekan
tombol
Hread
sample
untuk
menghitung
nilai
absorbansina. 0 engulangi poin di atas untuk ku!et ketiga. 0 enekan H print untuk men%etak hasil perhitungan nilai absorbansi. 7. +lektro&oresis 0 embuat gel agarosa 1C (gI!), dengan %ara menimbang bubuk agarosa 2,7 gram dan memasukkan bubuk agarosa tersebut ke dalam
0
erlenmeyer. enambahkan 72 mL $A+ 1 ke dalam erlenmeyer berisi bubuk
0 0 0
agarosa. emanaskan bahan hingga larut sempurna di atas hot plate. endinginkan bahan hingga hangat0hangat kuku enuangkan bahan ke /adah pen%etak ang telah dilengkapi sisir
0
untuk membentuk sumuran. endiamkan bahan hingga memadat membentuk struktur gel (gel
0
agarosa). emasukkan
gel
agarosa
ke
dalam
bak
elektro&oresis
menambahkan $A+ 1 hingga gel agarose terendam.
dan
0
elakukan suspensi sampel DNA dengan loadin" dye+ kemudian
0
memasukkanna ke dalam sumuran gel agarosa. elakukan elektro&oresis dengan %ara mengalirkan listrik 122 !olt, 82 A selama 72 menit pada bak elektro&oresis ang telah berisi sampel
0
DNA. 'etelah 72 menit, merendam gel agarosa berisi sampel DNApada larutan +tr ( thidium Bromide) selama # menit, lalu merendamna ke
0 0
dalam akuades selama 7 menit. elakukan pemba%aan hasil elektro&oresis dengan photophoresis. engambil gambar hasil photophoresis berupa pita0pita DNA ang
berpendar. 0 en%atat dan mendokumentasikan hasil pengamatan.
I-. HA!IL DAN PEMBAHA!AN
@asil pengamatan pada praktikum ini dapat dilihat pada gambar 1.
1
7
B
Pita DNA =enom
am*ar 1. @asil elektro&oresis pita DNA genom, 1. "akao 1, . "akao , 7. Discorea sp. 1, B. Discorea sp.
3solasi DNA merupakan langkah ang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipna ada dua, aitu sentri&ugasi dan presipitasi. 'entri&ugasi merupakan teknik untuk memisahkan %ampuran berdasarkan berat molekul komponenna. olekul ang mempunai berat molekul besar akan berada di bagian ba/ah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. @asil sentri&ugasi akan menunjukkan dua ma%am &raksi ang terpisah, aitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian ba/ah (ampbell, dkk., 22). Presipitasi merupakan langkah ang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari %ampuran. 3solasi DNA atau ekstraksi DNA memiliki tiga langkah utama, aitu perusakan dinding sel atau membran sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. etode isolasi dia/ali dengan penggerusan untuk membantu meme%ahkan dinding sel se%ara mekanik. Penambahan pasir kuarsa saat penggerusan dan merkaptoetanol dalam bu&er ekstraksi bertujuan menghambat enim poli&enol oksidase ang dapat mendegradasi rantai DNA dan menebabkan teroksidasina sena/a
&enol. $erjadina oksidasi ditandai dengan terbentukna /arna %oklat pada jaringan tanaman ang akan diisolasi. 'uatu detergen kationik ang terdapat dalam buffer ekstraksi aitu $A ber&ungsi membantu proses peme%ahan membran sel. Buffer $A perlu diinkubasi dalam $ater bath pada suhu 5#J, karena $A ang berkemampuan melisis membran sel akan akti& pada kondisi panas (5#J). 3solasi DNA dari tanaman sering menghasilkan ekstrak ang banak mengandung polisakarida. Penambahan $A ang bermuatan positi& pada bu&er ekstrak juga ber&ungsi untuk memisahkan polisakarida dari DNA dengan %ara mengikat DNA ang bermuatan negati&. Penghan%uran sel se%ara kimia/i dapat dilakukan dengan meman&aatkan sena/a kimia +D$A ( etilen diamin tetra asetat ). ?ungsi +D$A adalah sebagai perusak sel dengan %ara mengikat ion magnesium sebagai prekursor enim sehingga enim menjadi tidak akti&. Larutan Nal sebagai larutan isotonik ang menjaga tekanan osmotik sel agar DNA tidak rusak. Larutan tris0@l untuk memberikan kondisi p@ ang optimum. DNA ang ter%ampur dengan polisakarida, protein, dan pengotor lainna perlu
dibersihkan.
menggunakan
Pembersihan
larutan
P3
DNA
dilakukan
dengan
( Phenol-Chloroform-Isoamyl
ekstraksi
Alcohol )
dan
sentri&ugasi. Larutan kloro&orm dapat menghilangkan kontaminasi akibat polisakarida sedangkan sentri&ugasi akan memisahkan molekul0molekul berdasarkan bobot molekulna. Larutan P3 sebagai pelarutorganik dapat menghan%urkan dan mengendapkan protein. +kstraksi ang dilakukan berulang0ulang bertujuan agar DNA benar0benar terbebas dari pengotor.
+kstraksi dengan %ara bertahap juga merupakan %ara ekstraksi ang terbaik karena akan menghasilkan jumlah ekstrak ang lebih banak dibandingkan ekstraksi se%ara langsung. Perbedaan kelarutan akan mengakibatkan organel0 organel ke%il dan pengotor terekstrak, sedangkan inti sel atau nu%leus diasumsikan tidak ikut terekstrak sebab memiliki ukuran ang besar sehingga di dalam larutan hana terdapat inti sel ang mengandung DNA. @asil larutan ang disentri&ugasi akan menghasilkan %ampuran larutan ang terpisah menjadi tiga &ase. Larutan P3 memiliki densitas ang tinggi sehingga terletak di bagian ba/ah (&ase organik) tabung eppendorf . agian tengah larutan terdapat protein ang dilarutkan oleh larutan P3. Larutan DNA ang terletak di bagian atas (&ase air) dipipet dengan hati0hati agar bagian proteinna tidak ikut terambil. Larutan DNA ang diambil dimasukkan dalam tabung eppendorf baru dan diekstraksi kembali dengan larutan P3. Pemurnian DNA dilakukan dengan etanol dan isopropanol. Larutan0larutan tersebut dapat mengendapkan DNA sedangkan kontaminan ang lain tetap larut ('ambrook, et al.+ 1989). Penambahan NaA (natrium asetat) ber&ungsi untuk membantu memekatkan dan mengendapkan DNA. Pen%u%ian endapan DNA dengan etanol ;2C bertujuan memisahkan sena/a0sena/a ang masih menempel pada DNA. DNA akan lebih stabil dalam bentuk larutan oleh karena itu DNA ang diperoleh dilarutkan dalam d@ . Pemurnian DNA dari kontaminan *NA dilakukan menggunakan enim *NAse ang ber&ungsi mendegradasi *NA sehingga dihasilkan DNA murni ang terbebas dari *NA dan siap digunakan sebagai %etakan DNA saat P*. DNA hasil isolasi dilakukan uji kualitas dan kuantitas dengan metode spektro&otometer dan elektro&oresis.
'pektro&otometer merupakan metode analisis berdasarkakn pengukuran banakna energi radiasi () ang diabsorbsi (penerapan) oleh suatu at sebagai suatu &ungsi panjang gelombang. "onsentrasi DNA diukur dengan spektro&otometer
pada
panjang
gelombang 52
nm.
3katan
rangkap
terkonjugasi pada basa heterosiklik purin dan pirimidin me njadikan nukleosida, nukleotida, serta polinukleotida menerap sinar (urra, 227). +lektor&oresis merupakan suatu teknik pemisahan molekul bermuatan berdasarkan tingkat migrasina dalam sebuah medan listrik berupa elektroda negati& dan elektroda positi&. edia elektro&oresis ang umum digunakan adalah gel agaraosa. +lektro&oresis gel agarosa digunakan untuk memisahkan &ragmen DNA lebih besardari 122 bp (base pare/ 0 #2 kb (,ilo base/ dan dijalankan se%ara horiontal. Lokasi &ragmen DNA ang terbentuk seperti pita0 pita pada elektro&oresis dapat diamati se%ara spesi&ik dengan menggunakan pe/arna berupa etidium bromide (+tr) ang dapat menisip diantara basa0 basa pada DNA sehingga saat disinari dengan photophoresis DNA akan terlihat berpendar. @asil elektro&oresis DNA ang diisolasi (=ambar 1) menunjukkan bah/a konsentrasi DNA ang berhasil diisolasi tinggi, ditunjukkan oleh tebalna pita DNA ang dihasilkan. Pita DNA hasil elektro&oresis ang semakin tebal belum tentuberbanding lurus dengan tinggina konsentrasi DNA. "ontaminasi sena/a polisakarida dan protein dapat mempengaruhi ketebalan pita, sehingga perlu dilakukan pengukuran kemurnian DNA terhadap sena/a kontaminan tersebut dengan spektro&otometer.$ingkat kemurnian DNA dapat dilihat dari perbandingan absorbansi panjang gelombang 52I82 nm (rasio ?1) dan 52I72 nm (rasio ?). *asio ?1 menunjukkan tingkat
kemurnian terhadap kontaminan protein dan rasio ? menunjukkan tingkat kemurnian akibat kontaminan polisakarida. Nilai rasio ang baik berkisar pada 1.80.2 ('ambrook, et al.+ 1989).
-. PENUTUP
A. "esim)ulan
"esimpulan pada praktikum ini adalah isolasi DNA dari genom tanaman dilakukan melalui proses pelisisan dengan menggunakan larutan $A, pemisahan DNA dari materi organik dengan menggunakan larutan ( PhenolChloroform-Isoamyl Alcohol ) P3, presipitasi DNA dengan penambahan NaA (natrium asetat), dan pemurnian DNA dengan menggunakan etanol ;2C. Pengujian kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi dilakukan dengan metode spektro&otometer dan elektro&oresis. B. !aran 'aran ang dapat diajukan pada praktikum ini adalah agar praktikan dapat
lebih akti& lagi mengikuti praktikum.
DA/TAR PU!TA"A
Ardiana, De/i, <., 229, $eknik 3solasi Dna =enom $anaman Pepaa dan >eruk dengan neggunakan odi&ikasi Buffer $A, 1urnal Buletin Te,ni, Pertanian, 0#+$G 1015 ampbell, N. A., et al.+ 22, Biolo"i+ +rlangga, >akarta. "arp A. 199#. n the %urrent soma%lonal !ariation as a tool &or %rop impro!ement. +uphiti%a. 8#.G9#072. ulani, K., Pur/anto, A., dan Nurrah/ati, 3., 21, Perbandin"an beberapa Metode Isolasi D2A untu, Dete,si D2A 3oi )erpes 4arus 53)4/ pada I,an Mas (Cypirus carpio L.), ni!ersitas Padjajaran, >atinangor. urra. *."., 227, Bio,imia )arper+ edisi ,e-66. Penerbit uku "edokteran. >akarta. *estu, ., ukrimin, dan =usmiat, 21, ptimalisasi $eknik +kstraksi dan 3solasi DNA $anaman 'urem (Toona sureni err.) untuk Analisis "eragaman =enetik erdasarkan 7andom Amplified Polymorphic D2A (*ADP), 1urnal 2atural Indonesia, +0#,$ G 17801B 'ambrook, >., ?rits%h, +, ?., and aniatis, $., 1989, Molecular Clonnin" 8 A laboratory Manual+ second edition. old 'pring @arbor Laborator Press. Ne/ Kork. tami, A., eralita, *., Prihatin, N. A., Ambarsari, L., dan Asri, P., 21, 4ariasi Metode Isolasi D2A Daun Temula$a, (Curcuma xenthorrhi'a *ob.), 'eminar Nasional "imia nesa, 3P, ogor.
