Inokulasi (penanaman bakteri) merupakan pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru minta banyak ketelitian. Untuk itu terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang ada sangkutpaut dengan medium dan pekerjaan inokulasi itu benar-benar steril, ini untuk menghindari kontaminasi yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak kita inginkan (Dwidjaseputro, 1998). Untuk meumbuhkan suatu biakan bakteri dalam media steril sejumlah sel-sel (inokulum) dipindahkan (diinokulasi) kedalam media dengan perlakuan khusus untuk mempertahankan kemurnian dari biakan. Pada waktu inokulasi, jarum yang digunakan untuk memindahkan mikroba harus dipijarkan diatas api segera sebelum dan sesudah sesudah melakukan pemindahan. pemindahan. Pemanasan Pemanasan ini menghancurkan setiap bentuk kehidupan yang ada pada permukaan jarum atau alat pemindah (Sutedjo, 1997). Prinsip dari isolasi mikroba adalah mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapa dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, karena dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya. Bila digunakan media cair, sel-sel mikroba sulit dipisahkan secara individu karena terlalu kecil dan tidak tetap tinggal ditempatnya (Sutedjo, 1997). Sifat-sifat koloni pada agar-agar lempengan mengenai bentuk, permukaan, dan tepi. Bentuk koloni dilukiskan sebagai titik-titik, bulat, benang, serupa akar, serupa kumparan. Sifat-sifat koloni pada agar-agar miring berkisar bentuk dan tepi koloni dan sifat itu dinyatakan dengan pedang, seperti duri, serupa tasbih, serupa titik, serupa batang, dan serupa akar (Volk W.A.F Wheeter., 1998). Pengertian dan Tujuan Pengenceran Pengenceran adalah melarutkan atau melepasan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Tujuan pengenceran yaitu untuk mengurangi kepadatan kepadatan bakteri yang ditanam (Fais, 2009). Pengenceran merupakan proses yang dilakukan untuk menurunkan atau memperkecil konsentrasi larutan dengan menambah zat pelarut ke dalam larutan sehingga volume larutan menjadi berubah (Nurohaianah et al, 2007). Macam Metode Penanaman beserta Kelebihan dan Kekurangannya Menurut Fais (2009), metode penanaman ada dua yaitu : Dari deskripsi yang singkat ini mengenai ciri – – ciri nutrisi bakteri haruslah dikenal dua langkah penting bagi intensitasnya. Di laboratorium (1) inokulasi penanaman penting bagi suatu medium dengan kandungan nutrisi yang sesuai (2) inkubasi medium yang sudah diinokulasi pada keadaan fisik (Waluyo, 2005). Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage adalah harus adanya kondisi optimum untuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteriofage yang paling baik dan paling utama adalah habitat inang. Sebagai
contoh fage koli yang dijumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi dari limbah atau pupuk kandang. Hal ini dilakukan dengan sentifugasi atau filtrasi bahan sumbernya dan penambahan kloroform untuk membunuh sel-sel bakterinya (Adams, 2000). Dikenal beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari suatubiakan campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah metode cawan gores dan metode cawan tuang. Yang didasarkan pada prinsip pengenceran dengan maksud untuk memperoleh spesies individu. Dengan anggapan bahwa setiap koloni dapat terpisah dari satu jenis sel yang dapat diamati (Afrianto, 2004). Biakan murni diperlukan dalam berbagai metode mikrobiologis, antara lain digunakan dalam mengidentifikasi mikroba. Untuk mengamati ciri-ciri kultural morfologi, fisiologi dan serologi dibutuhkan mikroba yang berasal dari satu spesies (Dwidjoseputro, 2005). Metode cawan tuang Cara lain untuk memperoleh koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme adalah dengan mengencerkan spesimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan ( ±50 oC ) yang kemudian dicawankan. Karena konsentrasi sel-sel mikroba di dalam spesimen pada umunya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang-kurangnya satu di antara cawan tersebut mengandung koloni terpisah di atas permukaan ataupun di dalam agar. Metode ini memboroskan bahan dan waktu namun tidak memerlukan keterampilan yang tinggi. Metode cawan gores memiliki dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme seperti yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan oleh para mahasiswa yang baru mulai mempelajari mikrobiologi ialah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik-baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel-sel yang digoreskan (Ratna, 1990). Menurut Dwidjoseputro (1980), sifat-sifat koloni yang tumbuh pada agar-agar lempengan, pada agar-agar miring dan pada tusukan gelatin adalah sebagai berikut : 1. Sifat-sifat koloni pada agar-agar lempengan mengenai bentuk, permukaan dan tepi. Bentuk koloni dilukiskan sebagai titik-titik, bulat berbenang, tak teratur, serupa akar, serum kumparan. Permukaan koloni dapat datar, timbul mendatar, timbul melengkung, timbul mencembung, timbul
membukit dan timbul berkawah. Tepi koloni ada yang utuh, ada yang berombak, ada yang berbelah-belah, ada yang bergerigi, ada yang berbenang-benang dan ada yang keriting. 2. Sifat-sifat koloni pada agar-agar miring. Sifat ini berkisar pada bentuk dan tepi koloni dan sifat itu dinyatakan dengan kata-kata seperti : serupa pedang, serupa duri, serupa tasbih, serupa titik-titik, serupa batang dan serupa akar. 3. Sifat koloni tusukan dalam gelatin. Ada bakteri yang dapat mengencerkan gelatin. Karena itu, maka bentuk-bentuk koloninya juga berbeda-beda. Lagipula bentuk koloni yang tidak dapat mengencerkan gelatin. Bila dilihat dari samping koloni yang tidak mengencerkan gelatin dapat serupa pedang, tasbih, bertonjol-tonjol dan berjonjot. Jika bakteri mampu mengencerkan gelatin, maka bentuk koloninya dapat serupa kawah, serupa mangkuk, serupa corong, pundi-pundi dan berlapis. Setelah mikroba ditumbuhkan pada media agar tabung maupun cawan dan estelah inkubasi akan terlihat pertumbuhan bakteri dengan berbagai macam bentuk, ukuran, sifat, dan berbagai ciri khas yang lain. Ciri-ciri ini akan mengarahkan ke sifat-sifat mikroba tersebut pada media pertumbuhan, sehingga pengamatan morfologi ini sangat penting untuk diperhatikan (Ratna,1990). Bakteri yang memiliki flagella sering kali membentuk koloni yang menyebar terutama jika menggunakan lempengan agar basah, untuk mencegah menyebarnya koloni maka harus digunakan agar benar-benar kering (Djida, N., 2000). Inokulasi adalah menanam inokula secara aseptic kedalam media steril baik pada media padat maupun media cair. Inokula merupakan bahan yang mengandung mikroba atau biakan mikroba baik dalam keadaan cair maupun padat. Teknik aseptis sangat diperlukan untuk memindahkan biakan dari suatu tempat ke tempat lainnya. Dengan teknik aseptis berusaha mencegah terjadinya kontaminasi dengan biakan yang mungkin bersifat pathogen. Untuk menunjang pekerjaan secara aseptis perlu dipahami mengenai teknik kerja aseptis, teknik dekontaminasi, serta penyelesaian pekerjaan secara cepat dan efisien, (Wesley A Volk, 1998) Untuk mendapatkan koloni bakteri sebagai sumberbiakan ada dua tehnik yang dapat dipakai yaitu metode piringan goresan dan metode piringan Tuangan. Pirngan tenmpat bahan yang mengandung bakteri disebarkan terdiri atas zat makanan seperti kaldu sapi yang telah dipadatkan dengan menambah agar-agar berasal dari gangang laut yang larut dalam air mendidih dan menjadi padat jika di padatkan, (Wesley A Volk, 1998) 1. Perhitungan Bakteri Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap.
Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri koliform dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan secara tidak langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel) seperti yang dilakukan pada percobaan ini (Penn, 1991). 2. Metode Standar atau viable plate count perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Sutedjo, 1991). 1. Berdasarkan kekeruhannya, Mikroba dalam suatu bahan cair dapat dideteksi berdasarkan kekeruhannya. Pertumbuhan sel bakteri didalam suatu medium cair akan meningkatkan kekeruhan media, yang akan mempengaruhi jumlah sinar yang dapat ditransmisikan menembus medium(Rukmi, MG.I., A.T. Lunggani, A. Suprihadi, 2008). 2. Berdasarkan jumlah lempeng total (plate count). Berdasarkan lempeng total, Cara ini adalah cara yang paling umum digunakan untuk menentukan jumlah mikroba yang masih hidup, berdasarkan jumlah koloni yang tumbuh. Teknik ini diawali dengan pengenceran sampel secara seri, dengan kelipatan 1 : 10. Masing-masing suspensi pengenceran ditanam dengan metode tuang (pour plate) atau sebar (spread plate). Bakteri akan bereproduksi pada medium agar dan membentuk koloni setelah 18-24 jam inkubasi. Untuk menghitung jumlah koloni dalam cawan petri dapat digunakan alat ’colony counter’ yang biasanya dilengkapi dengan pencatat elektronik. (Rukmi, MG.I., A.T. Lunggani, A. Suprihadi, 2008). 3. Metode analisa spektrofotometer Beer dan lambert menemukan hukum yang menerangkan interaksi bahan kimia dengan gelombang cahaya (elektromagnetik), yang disimpulkan dalam hukum Beer-Lambert menyebabkan berkembangnya analisis kimia dengan menggunakan alat instrumentasi yakni spektrofotometer (P Tipler 1991). Suatu spektrofotometer standar terdiri atas spektrofotometer untuk menghasilkan cahaya dengan panjang gelombang terseleksi yaitu bersifat monokromatik serta suatu fotometer yaitu suatu piranti untuk mengukur intensitas berkas monokromati, penggabungan bersama dinamakan sespektrofotometer. Penggabungan alat optik ini merupakan elektronika sifat kimia dan fisiknya dan detektor yang digunakan secara langsung mengukur intensitas dari cahaya yang dipancarkan (It) dan secara tidak lansung cahaya
yang diabsorbsi (Ia). Kemampuan ini bergantung pada spektrum elektromagnetik yang diabsorb (serap) oleh benda. Fungsi alat spektrofotometer dalam laboratorium adalah mengukur transmitans atau absorbans suatu contoh yang dinyatakan dalam fungsi panjang gelombang. Prinsip kerja spektrofotometer adalah bila cahaya (monokromatik maupun campuran) jatuh pada suatu medium homogen, sebagian dari sinar masuk akan dipantulkan, sebagian di serap dalam medium itu, dan sisanya diteruskan. Nilai yang keluar dari cahaya yang diteruskan dinyatakan dalam nilai absorbansi karena memiliki hubungan dengan konsentrasi sampel. Studi spektrofotometri dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Hukum Beer menyatakan absorbansi cahaya berbanding lurus dengan dengankonsentrasi dan ketebalan bahan/medium. Secara garis besar spektrofotometer terdiri dari 4 bagian penting yaitu : a. Sumber Cahaya Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah panjang gelombang (l ) adalah 350 – 20 nanometer (nm). b. Monokromator Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya polikromatis menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu (monokromatis) yang bebeda (terdispersi). c. Cuvet Cuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat contoh atau cuplikan yang akan dianalisis. Cuvet biasanya terbuat dari kwars, plexigalass, kaca, plastic dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm dan tinggi 5 cm. Pada pengukuran di daerah UV dipakai cuvet kwarsa atau plexiglass, sedangkan cuvet dari kaca tidak dapat dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV. Semua macam cuvet dapat dipakai untuk pengukuran di daerah sinar tampak (visible). d. Detektor Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi sinyal listrik yang selanjutnya akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk jarum penunjuk atau angka digital. Dengan mengukur transmitans larutan sampel, dimungkinkan untuk menentukan konsentrasinya dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Spektrofotometer akan mengukur intensitas cahaya melewati sampel (I), dan membandingkan ke intensitas cahaya sebelum melewati sampel (Io). Rasio
disebut transmittance, dan biasanya dinyatakan dalam persentase (% T) sehingga bisa dihitung besar absorban (A) dengan rumus A = -log %T Spektrofotometer dibagi menjadi dua jenis yaitu spektrofotometer single -beam dan spektrofotometer double-beam. Perbedaan kedua jenis spektrofotometer tersebut hanya pada pemberian cahaya, dimana pada single-beam, cahaya hanya melewati satu arah sehingga nilai yang diperoleh hanya nilai absorbansi dari larutan yang dimasukan. Berbeda dengan single-beam, pada spektrofotometer double-beam, nilai blanko dapat langsung diukur bersamaan dengan larutan yang diinginkan dalam satu kali proses yang sama. Prinsipnya adalah dengan adanya chopper yang akan membagi sinar menjadi dua, dimana salah satu melewati blanko (disebut juga reference beam) dan yang lainnya melewati larutan (disebut juga sample beam). Dari kedua jenis spektrofotometer tersebut, spektrofotometer double-beam memiliki keunggulan lebih dibanding single-beam, karena nilai absorbansi larutannya telah mengalami pengurangan terhadap nilai absorbansi blanko. Selain itu, pada single-beam, ditemukan juga beberapa kelemahan seperti perubahan intensitas cahaya akibat fluktuasi voltase (anonim, 2011). 4. Pengenceran bakteri Dalam perhitungan jumlah mikroorganisme ini seringkali digunakan pengenceran. Di dalam laboratorium, pengenceran di lakukan dengan botol pengenceran seperti lazimnya pada SPC, namun dapat pula menggunakan tabung reaksi. Pada pengenceran dengan menggunakan botol cairan terlebih dahulu dikocok dengan baik sehingga kelompok sel dapat terpisah. Pengenceran sel dapat membantu untuk memperoleh perhitungan jumlah mikroorganisme yang benar. Namun pengenceran yang terlalu tinggi akan menghasilkan lempengan agar dengan jumlah koloni yang umumnya relatif rendah (Hadioetomo, !996). Pada metode perhitungan cawan dilakukan pengenceran yang bertingkat yang mana ditujukan untuk membentuk konsentrasi dari suatu suspensi bakteri. Sampel yang telah di encerkan ini di hitung ke dalam cawan baru kemudian di tuang ke mediumnya (metode tuang). Kemudian setelah diinkubasi selama 24- 48 jam, amati koloni yang tumbuh dan koloni yanng diamati hanyalah koloni yang berjumlah 30- 300 koloni (Gobel, 2008). Tingkat pengenceran yang diperlukan didasarkan pada pendugaan populasi bakteri yang ada dalam contoh. Hasil yang baik adalah jika pada pengenceran yang lebih rendah contoh yang diduga lebih banyak menunjukkan hasil uji positif (adanya pertumbuhan bakteri) dan pada pengenceran lebih tinggi contoh yang diduga lebih sedikit menunjukkan hasil uji negatif (tidak ada pertumbuhan bakteri). Oleh karena itu jumlah populasi bakteri yang ada dalam contoh diduga tinggi maka contoh harus diencerkan sampai diperoleh tingkat pengenceran yang lebih tinggi sehingga nilai
maksimum dapat dihitung. Metoda pengenceran yang paling mudah dengan melakukan pengenceran 10 kali lipat dengan menggunakan 3 atau 5 tabung pengenceran sekali gus ( Fridaz, Srikandi, 1992 ). Beberapa cara penghitungan jumlah mikrobia yaitu cara penghitungan pada lempeng pembiakan, cara menghitung langsung (metode kaca objek), metode ukur kekeruhan, metode turbidimetri dan nefelometri serta dengan jumlah perkiraan terdekat (JPT). Cara penghitungan pada lempeng pembiaakan disebut juga metode penghitungan bakteri hidup atau metode penghitungan koloni. Penghitungan koloni dilakukan penyimpanan pada suhu yang sesuai. Oleh karena itu, suatu bakteri dapat tumbuh menjadi satu koloni yang terhitung mewakili jumlah bakteri hidup yang terdapat dalam tiap volum pengenceran yang digunakan. Dalam hal ini pun, bahan pemeriksaan jika perlu harus diencerkan untuk menghindari jumlah koloni terlalu banyak sehingga tidak dapat dihitung. Hasil hitungan yang dapat diandalkan adalah antara 30-300 koloni pada tiap lempeng pembiakan ( Agus, Esti, 2011 ).
Pengenceran yaitu suatu cara atau metoda yang diterapkan pada suatu senyawa dengan jalan menambahkan pelarut yang bersifat netral, lazim dipakai yaitu aquadest dalam jumlah tertentu. Penambahan pelarut dalam suatu senyawa dan berakibat menurunnya kadar kepekatan atau tingkat konsentrasi dari senyawa yang dilarutkan/diencerkan (Brady,1999). Dalam pembuatan larutan dengan konsentrasi tertentu sering dihasilkan konsentrasi yang tidak kita inginkan. Untuk mengetahui konsentrasi yang sebenarnya perlu dilakukan standarisasi. Standarisasi sering dilakukan dengan titrasi. Zat-zat yang didalam jumlah yang relative besar disebut pelarut (Baroroh, 2004). Serial Dilution adalah pengenceran bertahap dari suatu zat dalam larutan. Biasanya faktor pengenceran di setiap langkah adalah konstan, sehingga dalam perkembangan geometris dari konsentrasi dalam mode logaritmik. media pertumbuhan yang akan digunakan sesuai dengan sifat bakteri tersebut. Kehadiran mikrobia pada makanan dapat bersifat menguntungkan Pengenceran yaitu suatu cara atau metoda yang diterapkan pada suatu senyawa dengan jalan menambahkan pelarut yang bersifat netral, lazim dipakai yaitu aquadest dalam jumlah tertentu. Penambahan pelarut dalam suatu senyawa dan berakibat menurunnya kadar kepekatan atau tingkat konsentrasi dari senyawa yang dilarutkan/diencerkan (Brady,1999). Dalam pembuatan larutan dengan konsentrasi tertentu sering dihasilkan konsentrasi yang tidak kita inginkan. Untuk mengetahui konsentrasi yang sebenarnya perlu dilakukan standarisasi. Standarisasi sering dilakukan dengan titrasi. Zat-zat yang didalam jumlah yang relative besar disebut pelarut (Baroroh, 2004). Serial Dilution adalah pengenceran bertahap dari suatu zat dalam larutan. Biasanya faktor pengenceran di setiap langkah adalah konstan, sehingga
dalam perkembangan geometris dari konsentrasi dalam mode logaritmik. Sebuah pengenceran sepuluh kali lipat serial dapat 1 M, 0,1 M, 0,01 M, 0,001 M. .. Pengenceran serial digunakan untuk menciptakan solusi yang sangat akurat diencerkan serta solusi untuk percobaan menghasilkan kurva konsentrasi dengan skala logaritmik. Sebuah pengenceran sepuluh kali untuk setiap langkah ini disebut pengenceran logaritmik atau log-pengenceran, pengenceran (100,5 kali lipat) 3.16 kali lipat disebut pengenceran setengahlogaritmik atau setengah-log pengenceran, dan pengenceran (100,25 kali lipat) 1,78 kali lipat disebut pengenceran seperempat-seperempat-logaritmik atau pengenceran log. Pengenceran serial yang banyak digunakan dalam ilmu pengetahuan Pengenceran yang dilakukan dalam percobaan ini adalah pengenceran decimal yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 dan 10-6. Dan yang diplating dan diamati adalah pengenceran 10-5 dan10-6. Hal ini karena diperkirakan koloni yang dibentuk oleh sampel bakteri berada pada jumlah yang dapat dihitung pada pengenceran tersebut. Selain itu, untuk perhitungan jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika pengenceran dilakukan secara desimal. Pada penanaman bakteri dibutuhkan kondisi aseptik atau steril, baik pada alat maupun proses, untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikroba yang tidak diinginkan. (Fardiaz, 1993). Media KNA digunakan karena media KNA merupakan media yang paling cocok untuk kultur bakteri. Selanjutnya cawan petri diinkubasikan selama 2 x 24 jam pada suhu 37 ºC. inkubasi dilakukan selama 2 x 24 jam karena jumlah mikroba maksimal yang dapat dihitung langsung oleh mata. Metode cawan petri / plate count metode dengan penaksiran jumlah kepadatan bakteri secara tidak langsung dan penghitungan bakterinya hanya yang hidup saja yang mati tidak. Dalam metode ini dilakukan pengenceran yang berseri 101-1010 agar populasi dapat terbaca, pengenceran yang menghasilkan 30-300 bakteri saja yang dapat dibaca dan dikatakan berhasil karena bila kuarang dari 30 untuk alasan statistic tidak dapat diterima bila lebih dari 300 kemungkinan ada koloni yang terlalu padat, terlalu dekat satu dengan yang lainya. Kelebihan metode ini perhitungan lebih meyakinkan karena yang dihitung bakteri yang hidup saja, dapat menghitung jasad renik lain sekaligus serta mengidentifikasi dan mengisolasi jasad renik mengetahui pertumbuhan jasad renik tersebut namun kekurangannya butuh waktu yang lama, media serta kondisi inkubasi yang berbeda menghasilkan data yang berbeda, membutuhkan media yang padat kering agar metode berhasil, dan terkadang hasil perhitungan tidak menunjukan hasil sebenarnya karena sel mungkin membuat koloni lain. 1. Berdasarkan jumlah koloni (Plate count)
Cara ini yang paling umum digunakan untuk perhitungan jumlah mikrobia. Dasarnya ialah membuat suatu seri pengenceran bahan dengan kelipatan 10 (Jutono dkk, 1980). Menurut Jutono (1980), tidak semua jumlah bakteri dapat dihitung. Ada beberapa syarat perhitungan yang harus dipenuhi, yaitu : 1. Jumlah koloni tiap petridish antara 30-300 koloni, jika memang tidak ada yang memenuhi syarat dipilih yang jumlahnya mendekati 300. 2. Tidak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas petridish, koloni tersebut dikenal sebagai spreader. 3. Perbandingan jumlah bakteri dari hasil pengenceran yang bertururtturut antara pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran sebelumnya, jika sama atau lebih kecil dari 2 hasilnya dirata-rata, tetapi jika lebih besar dari 2 yang dipakai jumlah mikrobia dari hasil pengenceran sebelumnya. 4. Jika dengan ulangan setelah memenuhi syarat hasilnya dirata-rata. Dalam perhitungan jumlah mikroorganisme ini seringkali digunakan pengenceran. Pada pengenceran dengan menggunakan botol cairan terlebih dahulu dikocok dengan baik sehingga kelompok sel dapat terpisah. Pengenceran sel dapat membantu untuk memperoleh perhitungan jumlah mikroorganisme yang benar. Namun pengenceran yang terlalu tinggi akan menghasilkan lempengan agar dengan jumlah koloni yang umumnya relatif rendah (Hadioetomo, 1990). Pengenceran dilakukan agar setelah inkubasi, koloni yang terbentuk pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung. Dimana jumlah terbaik adalah antara 30 sampai 300 sel mikrobia per ml, per gr, atau per cm permukaan (Fardiaz, 1992). Prinsip pengenceran adalah menurunkan jumlah sehingga semakin banyak jumlah pengenceran yang dilakukan, makin sedikit sedikit jumlah mikrobia, dimana suatu saat didapat hanya satu mikrobia pada satu tabung. Inkubasi dilakukan selama 2 x 24 jam karena jumlah mikrobia maksimal yang dapat dihitung, optimal setelah masa tersebut yaitu akhir inkubasi. Selama masa inkubasi, sel yang masih hidup akan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung oleh mata (Waluyo, 2004). Pada perhitungan bakteri secara langsung menggunakan pengenceran bakteri 10-3 untuk bakteri susu atau 10-4 untuk bakteri tanah karena dalam pengenceran tersebut bakteri yang ada dalam medium dapat dihitung, populasinya tidak padat dan juga tidak sedikit. Populasi bakteri yang padat dapat mempersulit perhitungan karena bakteri yang ada tumpang tindih dan polulasi yang sedikit kurang mewakili jumlah bakteri yang ada secara keseluruhan. Jadi pengenceran tersebut antara suspensi yang diambil dari pengenceran terdahulu untuk diencerkan kembali, jumlah bakteri yang ada lebih memencar satu sama lain dan mudah dihitung. Bakteri susu dengan pengenceran 10-3 setelah penghitungan didapat hasil 9,95 x 1011 mm3 dan untuk bakteri tanah dengan pengenceran 10-4 dengan penghitungan didapat hasil 4,25 x 109 mm3.
Perhitungan jumlah bakteri secara langsung memiliki kelebihan dan kekurangan. Kelebihannya, adalah waktunya yang digunakan singkat, penghitungannya lebih mudah, tidak membutuhkan bahan yang banyak. Sedangkan kekurangannya adalah tidak dapat membedakan sel hidup dan mati dan sel yang berukuran kecil sulit dilihat dengan mikroskop. Pada percobaan ini spreader terjadi karena pengenceran suspensi tanah yang kurang encer sehingga bakteri yang terikut masih sangat banyak sehingga tidak bisa dihitung dan harus diencerkan lagi. Selain faktor pengenceran, kualitas dari bahan juga dapat menyebabkan spreader, kualitas bahan yang jelek dapat menyebabkan banyaknya mikrobia yang ada sehingga karena faktor pengencerannya kurang bakteri yang diinokulasikan ke dalam petridish menjadi bertumpuk sehingga tidak dapat dihitung jumlahnya dan mengalami spreader. Perhitungan jumlah bakteri secara langsung maupun secara tidak langsung dipengaruhi oleh beberapa faktor, yakni : 2. Faktor pengenceran, semakin tinggi pengenceran suatu suspensi maka akan semakin sedikit jumlah bakteri yang dikandung atau tidak ada sama sekali 3. Temperatur dan pH, berkaitan dengan pertumbuhan bakteri pada suhu dan pH optimum 4. Komposisi medium, medium yang digunakan untuk penanaman harus sesuai dengan bakteri yang akan dihitung 5. Segi teknis yaitu Alat yang digunakan dan tingkat ketelitian dalam penghitungan. Untuk melaporkan suatu analisis mikrobiologi digunakan suatu standar yang disebut “Standard Plate Count” yang menjelaskan cara menghitung koloni pada cawan serta cara memilih data yang ada untuk menghitung jumlah koloni dalan suatu contoh. Cara menghitung koloni pada cawan adalah sebagai berikut : 1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30 sampai 300. 2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni. 3. suatu deretan (rantai) kolini yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni. Sedangkan data yang dilaporkan sebagai SPC harus mengikuti peraturan sebagai berikut :
1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama dibelakang koma dan angkan kedua dibelakang koma. Jika angka ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua. 2. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk menanam menghasilkan angka kurang dari 30 pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran yang terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan. 3. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk menanam menghasilkan angka lebih besar dari 300 pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan. 4. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan 2, yang digunakan adalaha rata-ratanya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih besar dari 2, yang dilaporkan hanya hasil terkecil. 5. Jika digunakan dua cawan Petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut, meskipun salah satunya tidak memenuhi syarat diantara 30 dan300.
Koloni adalah kumpulan dari mikrobia yang memilki kesamaan sifat-sifat seperti bentuk, susunan, permukaan, dan sebagainya. Sifat-sifat yang perlu diperhatikan pada koloni yang tumbuh di permukaan medium adalah (Dwidjoseputro, 1978) : 1. Besar kecilnya koloni. Ada koloni yang hanya serupa suatu titik, namun ada pula yang melebar sampai menutup permukaan medium. 2. Bentuk. Ada koloni yang bulat, ada yang memanjang. Ada yang tepinya rata, ada yang tidak rata. 3. Kenaikan permukaan. Ada koloni yang rata saja dengan permukaan medium, ada pula yang timbul yaitu menjulang tebal di atas permukaan medium. 4. Halus kasarnya permukaan. Ada koloni yang permukaannya halus, ada yang permukaannya kasar dan tidak rata. 5. Wajah permukaan. Ada koloni yang permukaannya mengkilat, ada yang permukaannya suram. 6. Warna. Kebanyakan koloni bakteri berwarna keputihan atau kekuningan. 7. Kepekatan. Ada koloni yang lunak seperti lendir, ada yang keras dan kering.
Keuntungan menggunakan perhitungan secara tidak langsung ialah metode tersebut hanya dapat menghitung jumlah mikroorganisme yang hidup atau sel yang hidup. Tidak seperti perhitungan secara langsung, seluruh mikroorganisme baik yang mati maupun hidup dihitung seluruhnya (Lay 1994). Kelemahan utama metode tersebut adalah keselektifannya sehingga hasil perhitungan kadang kala menjadi bias. Kondisi pertumbuha bakteri, termasuk komposisi media yang digunakan, waktu inkubasi, suhu, dan Ph, sangat menentukan jenis bakteri yang dapat tumbuh dari seluruh populasi yang ada. Tidak ada satu kondisi yang universal untuk membuat seluruh mikroorganisme dapat tumbuh dengan baik. Contoh yang alami, misalnya pada tanah yang mengadung berbagai jenis microorganisme, tidak mungkin untuk menghitung semua mikroorganisme yang terkandung didalamnya dengan cara viable plating tersebut. Kekurangan tersebut dapat menjadi suatu keunggulan jika kita ingin menghitung populasi mikroorganisme spesifik. Sebagai contoh, kita dapat mendesain prosedur yang selektif untuk menghitung bakteri koliform atau kelompok mikroorganisme fisiologis lainnya (Harmita 2006). Sedangkan perhitungan secara tidak langsung dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu: 6. Penentuan volume total Cara ini adalah semacam modifikasi penentuan hematokrit pada pengukuran volume total butir-butir darah, misalnya 10 ml biakan dimasukkan ke dalam tabung reaksi khusus (tabung hopklins) yang bagian bawahnya berupa silinder dan bergaris ukuran (Hadietomo, 1990). 5. Metode turbidometri Teknik ini sudah dipakai sebagai cara mengukur keker han suspensi atas dasar penyerapan dan pemencaran cahaya yang dilintaskan, sehingga yang mengandung lebih dari 107-108 sel/ml, tampak lebih keruh oleh mata telanjang. Suatu volume biakan yang telah ditakar ditempatkan dalam tabung khusus yang jernih dengan diameter tertentu (Hadietomo, 1990). c. Metode MPN (Most Probable Number) Most Probable Number dalam bidang kesehatan masyarakat dari mikrobiologi pangan, dipergunakan secara luas untuk menghitung jumlah bakteri yang ada dalam bahan pangan. Media ini banyak digunakan untuk menghitung bakteri patogenik dalam jumlah sedikit yang terdapat dalam bahan pangan. Metoda ini berdasarkan atas pengenceran. Apabila suatu larutan yang mengandung sel-sel mikroorganisme diencerkan terus-menerus, akhirnya akan diperoleh suatu larutan dimana tidak dijumpai sel lagi yaitu dikatakan steril (Buckle dkk, 1985).
Metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi, dimana perhitungan dilakukan berdasarkan pada jumlah tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan, atau timbulnya gas di dalam tabung kecil (tabung Durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik pembentukan gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya digunakan tiga tau lima seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas yang digunakan juga lebih banyak. (Fardiaz, 1992) d. Metode perhitungan cawan Metode perhitungan cawan didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang hidup dapat berkembang menjadi koloni. Jadi jumlah koloni yang muncul pada cawan adalah indeks bagi jumlah mikroorganisme yang terkandung dalam sampel. Teknik yang harus dikuasai dari metode ini adalah mengencerkan sampel dan mencawankan hasil pengenceran tersebut. Setelah inkubasi, jumlah semua koloni diamati untuk memenuhi persyaratan statistik. Cawan yang dipilih untuk menghitung koloni adalah cawan yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni. Organisme yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Waluyo, 2007). Berdasarkan kekeruhan (turbiditas/turbidimetri) Salah satu metode cepat yang digunakan untuk menghitung massal sel adalah melalui perhitungan kekeruhan (turbidity). Kekeruhan dapat diukur dengan menggunakan fotometer atau spertofotometer. Pengukuran kekeruhan ini didasarkan atas pertikel-pertikel kecil yang menyebarkan cahaya lengsung secara propisional (sampai batas-batas tertentu) dengan konsentrtasinya. Zat cahaya melewati tabung yang berisi suspensi mikroba, maka cahaya akan dihamburkan (Pelezar, 1989). Pada percobaan penghitungan populasi jamur tanah dengan metode plat pengenceran. Untuk mengisolasi jamur tanah pengenceran yang digunakan adalah pengenceran 10-4 dan 10-5. Pengenceran ini dimaksudkan untuk agar partikel-partikel tanah tidak ikut. Pada penentuan populasi jamur tanah media agar yang digunakan adalah PDA yang telah diberi antibiotik. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan suatu jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, karena dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya. Media yang digunakan dalam isolasi ini harus sesuai dengan mikroorganisme yang akan kita ketahui populasinya. Karena kalau tidak sesuai agarnya maka mikroorganisme tidak akan tumbuh. Jika sel-sel tersebut tertangkap oleh media padat pada beberapa tepat yang terpisah,
maka setiap sel atau kumpulan sel yang hidup akan berkembang menjadi suatu koloni yang terpisah, sehingga memudahkan pemisahan selanjutnya. Bila digunakan media cair, sel-sel mikroba sulit dipisahkan secara individu karena terlalu kecil dan tidak tetap tinggal di tempatnya. Akan tetapi bila selsel tersebut di pisahkan dengan cara pengenceran, kemudian di tumbuhkan dalam media padat dan di biarkan membentuk koloni, maka sel-sel tersebut selanjutnya dapat diisolasi dalam tabung-tabung reaksi atau cawan petri yang terpisah.