BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 Lata Latarr Bela Belaka kang ng Deoxyribonucleic acid (DNA) isolasi adalah proses ekstraksi DNA dari berbagai sumber. Sumber untuk isolasi DNA sangat beragam. Pada dasarnya dapat diisolasi dari organisme hidup atau mati. Sumber-sumber umum untuk isolasi DNA meliputi seluru seluruh h darah, darah, rambut, rambut, sperma sperma,, tulang tulang,, kuku, kuku, jaring jaringan an,, noda noda darah, air liur, bukal (pipi) kapas, sel epitel, urin. Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA tergantung pada sumber, umur, dan ukuran sampel. Meskipun berbagai metod etodee yang ang digu diguna naka kan n ada ada bebe bebera rapa pa kesa kesam maan aan di anta antara ra mere mereka ka.. Seca Secara ra umum umum,, merek merekaa bertu bertuju juan an untuk untuk menyaji enyajika kan n DNA terpisah dalam inti sel dari komponen seluler lainnya. Iso Isolasi lasi DNA diper iperlu luk kan untu untuk k ana analis lisis gene geneti tik k, yang ang digu diguna naka kan n untu untuk k tuju tujuan an ilm ilmiah, iah, medis edis,, atau atau fore forens nsik ik.. Para Para ilm ilmuwan uwan mengg enggun unak akan an DNA DNA di seju sejum mlah lah apli aplika kasi si,, sepe sepert rtii pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman, atau untu untuk k tujua tujuan n diag diagno nost stik. ik. Dalam Dalam obat obat aplik aplikas asii yang ang terak terakhi hir r adal adalah ah yang pali paling ng umum umum.. Di sisi sisi lain lain,, ilmu ilmu foren forensi sik k perlu perlu memulihkan DNA untuk identifikasi individu (bagi pemerkosa misal isalny nya, a, penc pencur urii keci kecil, l, kece kecela laka kaan an,, atau atau korb korban an pera perang ng), ), penentuan ayah, dan pabrik atau atau identifikasi hewan.
1.2 Tuj Tujuan
Untuk mengetahui pengertian isolasi DNA dan PCR.
Untuk mengetahui uji kualitas DNA. 1
Untuk mengetahui komponen dan tahapan PCR.
Untuk mengetahui manfaat PCR.
2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian Isolasi DNA dan PCR a. Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel yaitu pada mitokondria dan kloroplas. (Anonymous B, 2012) b. Isolasi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen sel lainnya. c. PCR adalah metode perbanyakan DNA secara enzimatik
sehingga DNA yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis / penelitian. (Anonymous A, 2012) d. PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap
yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. (Handoyo, 2000) e. Polymerase
Chain Reaction (PCR) merupakan metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu dengan cara in vitro.
2.2 Uji Kualitas DNA Uji kualitas DNA dilakukan dengan horizontal elektroforesis, pengecekan hasil isolasi DNA pada gel agarose. Campur bahan untuk membuat 0,8 %, yaitu 0,32 mg agarose dan 40 ml buffer TBE dalam erlenmeyer. Kemudian larutan gel 3
dihomogenkan dengan cara dipanaskan dalam microwave hingga larutan gel benar-benar homogen. Setelah tidak terlalu panas, larutan gel dituangkan pada cetakan dan didiamkan sampai memadat. Gel yang sudah memadat dipindah ke dalam mesin elektroforesis. Kemudian tuangkan buffer TBE ke dalam mesin elektroforesis hingga seluruh bagian gel terendam. DNA hasil amplifikasi (5 μl) dicampur dengan loading dye (1 μl) dengan cara pipeting, kemudian dimasukkan ke dalam sumuran/wells. Proses dilakukan selama 20 menit dengan tegangan listrik 100 V. Setelah proses elektroforesis selesai dilakukan, hasil elektroforesis direndam dalam larutan Ethidium Bromide selama ± 15 menit. Gel yang telah direndam dalam Ethidium Bromide diamati dengan UV transluminator dan didokumentasikan. Jika muncul pita berarti DNA hasil isolasi siap untuk digunakan sebagai template untuk PCR. (Heneine, W., R. F. Khabbaz. 1992) 2.3 Komponen dan Tahapan PCR Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah template DNA; sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat; dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim polimerase DNA. a. DNA template adalah DNA untai ganda yang membawa
urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan target (target sequence).
b. Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya penambahan basa demi basa dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. Namun, pada PCR enzim DNA polimerase yang digunakan harus termostabil karena salah satu tahap reaksinya adalah denaturasi untai ganda DNA yang membutuhkan suhu sangat 4
tinggi (± 95°C). Salah satu enzim DNA polimerase yang umum digunakan adalah Taq DNA polimerase, yang berasal dari bakteri termofilik Thermus aquaticus.
c. Enzim Taq Polymerase yang beredar saat ini terdiri atas dua macam, yaitu enzim alami (native) yang diisolasi dari sel bakteri Thermus aquaticus dan enzim rekombinan yang disintesis di dalam sel bakteri E. coli.
d. Deoxyribonucleoside
Triphosphate (dNTPs) merupakan material utama yang dibutuhkan untuk sintesis DNA baru dalam proses PCR.
e. Larutan penyangga (buffer) yang biasa digunakan untuk reaksi PCR mengandung 10 mM Tris-HCl pH 8,3 50 mM KCl dan 1,5mM MgCl2. (Wongsosupantio, 1992) 2.4 Manfaat PCR a. Digunakan untuk membuat fragmen pelacak yang dibuat
secara in vitro menggunakan teknik PCR. b. Untuk
menggandakan secara in vitro.
urutan
basa
nukleotida
tertentu
c. Untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target
tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut dengan bantuan enzim dan oligonukleotida. d. Digunakan
pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitasi molekul mRNA.
e. Pada kedokteran forensik, digunakan untuk diagnosis genetika
dan mikrobiologis serta manipulasi dan rekayasa gen. Selain 5
itu juga dapat digunakan untuk menganalisis penyakit, Duchenne’s muscular dystrophy, hemofilia A, untuk mendeteksi limfoma T pada manusia, Human immunodeficiency virus (HIV), virus hepatitis B, dan retinoblastoma serta untuk membuat DNA mutan dengan situs mutasi yang spesifik.teknik ini banyak digunakan baik untuk penelitian maupun diagnosa klinik karena cukup spesifik, efesien dan memiliki derajat keberhasilan yang tinggi. (Puspita, 2010)
6
BAB III METODOLOGI
3.1 Alat dan Bahan Alat :
- Mortar & Pestle
: untuk menghaluskan bahan.
- Tip - Gelas Ukur
: : untuk mengukur bahan.
- Tabung Eppendorf : untuk tempat/wadah bahan. - Tissue
: untuk membersihkan alat-alat.
- Gunting
:
- Plastik Pembungkus; - Mikropipet : untuk ukurannya µ liter/ 1000 µ.
mengambil
larutan
yg
- Spatula
: Mengaduk dan mengambil bahan
- Erlenmeyer
: untuk menampung larutan/bahan.
- Microwave homogen.
: untuk memanaskan bahan agar
- Spektrofotometer
: untuk mengukur nilai absorbansi.
- Mesin PCR elektroforesis.
:untuk
- Oven bahan tsb.
:untuk menginkubasi ekstrak dari
visualisasi
hasil
&
7
- Mesin Vortex
: untuk menghomogenkan.
- Timbangan Analitik : untuk menimbang - Stirer
: untuk mengaduk bahan.
- PH Meter
:mengetahui kadar keasaman
- Mesin Elektroforesis:mengetahui hasil rantai DNA - Mesin Centrifuge : untuk memisahkan larutan yang beda massa. - Autoclave
:
- Mesin UV Transluminator : untuk mengamati gel agarose. - Lemari Es
Bahan
: untuk menginkubasi larutan DNA.
: - Daun tomat : untuk bahan isolasi DNA. - Buffer Ekstraksi CTAB : untuk lisis membrane sel dan merusak dinding sel yang belum pecah. - Nitrogen Cair : untuk mempermudah penggerusan (merusak sel tanpa merusak DNA). - PVP (Polyvinilpirolidone) : untuk melindungi DNA agar tetap utuh/tidak rusak. - CHISAM (Chloroform, Isoamilalkohol) / enzim proteinase : untuk menghilangkan kontaminasi protein. - Buffer Pencuci : untuk mencuci endapan pellet / menghilangkan kontaminasi dan supernatan. 8
- Buffer TE : untuk meresuspensi endapan DNA. - RNAse : untuk menghilangkan kontaminasi RNA. -β Mercaptoethanol : kontaminasi polisakarida.
untuk
menghilangkan
- Isopropanol : untuk presipitasi (menggumpalkan kembali DNA). - DNA Ladder : - Agarosa : untuk menguji kualitas DNA. - Buffer Elektroforesis (TAE/TBE) : - Loading Dye : untuk memberi warna pada DNA . - Ethidium Bromida : untuk memberi tanda adanya DNA dengan cara menyisipkan pada basa nitrogen. - "PROMEGA " PCR Reaction Kit : untuk proses PCR. - Primer Mikrosatelit SSR :
3.2 Langkah Kerja + Buffer ekstraksi (CTAB) 1 ml
Daun tomat 0,1 gr
+ N2 cair & PVP t = -1980C , gerus
+ 500 ml CHISAM
Sentrifuge 6-8 x 103 Rpm 101 Ambil supernatan 9
Sentrifuge 6-8 x 103 Rpm 101 Ambil supernatan + Isopropanol 1x volume
Inkubasi freezer 30’
Sentifuge
Buffer Pencuci 2x (500 ml)
Resuspensi TE Buffer 200 ml
RNAse 1 ml
Inkubasi 370C 30’
Simpan freezer
3.3 Analisa Perlakuan 10
Hal yang pertama dalam melakukan praktikum isolasi DNA adalah menyiapkan alat dan bahan yang digunakan. Kemudian melakukan pembufferan ekstraksi CTAB sebanyak 1 ml berfungsi untuk melisis membrane serta menimbang sampel yaitu daun tomat sebesar 01 gram dan ditambahkan PVP 1% agar tidak merusak DNA dan N 2 cair dengan suhu -1920C agar memudahkan saat pengerusan bersama daun sirkaya. setelah itu dilakukan penambahan pada B- mercaptoetanol 5 ul dan diinkubasi selama 30 menit dengan suhu 650C. Kemudian ditambahkan chisam sebanyak 500 ul dan ditambahkan 10.000 Rpm selama 10 menit. Setelah itu diambil supernatannya dan ditambahkan chisam lagi sebanyak 1xvolume supernatan. Setelah dilakukan perlakuan diatas, maka perlakuan selanjutnya adalah ditambahkan isopropanol 0,45 x volume supernatan dan diinvertkan dan diinkubasi ke dalam lemari es selama 30 menit untuk melihat hasil dari ada atau tidaknya DNA dalam daun sirkaya tersebut. Setelah itu, disentrifuge kembali sebesar 10.000 Rpm dan dibuang isopropanol kemudian didapatkan DNA pellet. Lalu DNA pellet tersebut dicuci dengan buffer pencuci 200 ul sebanyak 2x serta RNASe 1 ul kemudian diresuspensi dengan plution buffer 20-50 ul dan akhirnya disimpan ke dalam elektroforesis.
11
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Gambar Hasil Elektroforesis
4.2 Analisa Hasil Elektroforesis
BAB IV PENUTUP
4.1 Kesimpulan
4.2 Saran
12
DAFTAR PUSTAKA
Anonymous A, 2012. http://miss-purplepharmacy.blogspot.com/ 2010/01/isolasi-dna.html Anonymous B, 2012. http://catatankuliah-heri.blogspot.com/2011 / 04/isolasi-dna.html Handoyo, Darmo dan Ari Rudiretna. 2000. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction. Pusat Studi Bioteknologi. Universitas Surabaya. Unitas Vol 9 No 1. Surabaya. Heneine, W., R. F. Khabbaz, R. B. Lal, and J. E. Kaplan. 1992. Sensitive and specific polymerase chain reaction assays for diagnosis of human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-I) and HTLV-II infections in HTLV-I/II-seropositive individuals. J. Clin. Microbiol. 30: 1605-1607. Puspita.2010. Manfaat PCR.Http://puspitt.multiply.com/ journal/item/14/ISOLASI-DNA. Diakses pada 24 November 2012 Wongsosupantio.1992. Elektroforesis Gel Protein. Pusat Antar Universitas. UGM.Yogyakarta.p.1-4, 12-13.
13
