I. TUJUAN Mahasiswa dapat mengamati reaksi enzimatis yang terjadi pada mikroorganisme. II. TINJAUAN PUSTAKA Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan menguji aktivitas enzimatisnya. Enzim merupakan katalis dalam sistem biologi atau di sebut pula dengan biokatalis. Katalis ini berfungsi untuk mempercepat laju reaksi kimia dengan akhir dari reaksi kimia akan diperoleh kembali katalis tersebut. Uji aktivitas enzimatis terbagi menjadi dua yaitu uji aktivitas eksoenzim dan ujiaktivitas endoenzim. Uji aktivitas eksoenzim terdiri dari uji amilolitik, proteolitik, dan lipolitik sedangkan uji aktivitas endoenzim terdiri dari uji katalase dan oksidase (Volk, 1988). Aktivitas enzim disebut juga sebagai kinetik enzim. Kinetik enzim adalah kemampuan enzim dalam membantu reaksi kimia. Kemampuan enzim ini dapat dihitung dengan mengukur jumlah produk yang terbentuk, atau dengan menghitung kurangnya kurangnya substrat dalam satuan waktu tertentu. Selain itu, i tu, dapat juga dihitung dengan peningkatan atau penurunan koenzim. Menghitung jumlah substrat, produk, atau koenzim di laboratorium tidak mudah karena jumlahnya yang sangat sedikit. Oleh karena itu, praktik menghitung aktivitas enzim adalah dengan mengukur perubahan absorbans dalam satuan waktu, pH, dan suhu tertentu sewaktu reaksi berjalan. Aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu suhu, pH, kadar substrat, kadar enzim, inhibitor, dan toksik enzim (Pelczar, 1986).
III. METODOLOGI PERCOBAAN 3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Fermentasi Karbohidrat 3 tabung reaksi berisi medium cair Glucose Phenol Red, dengan tabung durham 3 tabung reaksi berisi medium cair Lactose Phenol Red, dengan tabung durham 3 tabung reaksi berisi medium cair Sucrose Phenol Red, dengan tabung durham Biakan murni B. subtillis, E. coli dan S.aureus pada medium NA 3.1.2 Hidrolisis Pati 2 cawan petri berisi medium agar pati steril Biakan murni B. subtillis, E. coli dan S.aureus pada medium NA 3.1.3 Hidrolisis Kasein 2 cawan petri berisi medium skim milk agar (SMA) 3 tabung reaksi berisi gelatin Biakan murni B. subtillis, E. coli dan S.aureus pada medium NA 3.1.4 Uji Katalase Gelas benda Ose Larutan H2O2 3% Biakan murni B. subtillis, E. coli dan S.aureus pada medium NA 3.2 Cara Kerja 3.2.1 Cara Kerja a. Fermentasi Karbohidrat 1. Satu seri medium (glukosa, laktosa, dan sukrosa) diinokulasikan secara aseptik dengan biakan B. Subtillis. 2. Hal yang sama dilakukan untuk E. Coli dan S. aureus. 3. Satu seri medium tidak diinokulasikan dan digunakan sebagai kontrol. 4. Setiap tabung diberi tanda dengan nama medium, nama bakteri yang diinokulasikan, tanggal inokulasi, dan nomor kelompok.
5. Tabung-tabung tersebut diinkubasikan selama 48 jam, pada suhu kamar. 6. Reaksi yang terjadi diamati dan dibandingkan dengan kontrol. b. Hidrolisis Pati 1. Bagian bawah 2 cawan petri berisi medium agar pati ditandai menjadi 2 bagian menggunakan spidol permanen. 2. Permukaan medium agar pati masing-masing bagian diinokulasikan dengan bakteri yang berbeda secara aseptik dengan cara goresan, diinkubasi pada suhu kamar selama 48 jam. 3. Satu cawan petri berisi medium agar pati yang diinokulasikan dengan mikroba dibiarkan sebagai kontrol.
tidak
4. Larutan I-KI (Gram B) diteteskan di permukaan medium sekitar biakan dan dibiarkan selama 2-5 menit. 5. Adanya bagian medium agar pati berwarna biru dan bening diamati. 6. Hasil yang diperoleh dari masing-masing jenis bakteri yang diinokulasi dicatat. c. Hidrolisis Kasein 1. Bagian bawah 2 cawan petri yang berisi medium skim milk agar ditandai menjadi 2 bagian menggunakan spidol permanen. 2. Permukaan medium skim milk agar masing-masing bagian diinokulasikan dengan bakteri yang berbeda secara aseptik dengan cara goresan, diinkubasi pada suhu kamar selama 48 jam. 3. Satu cawan petri berisi medium skim milk agar yang tidak diinokulasikan dengan mikroba dibiarkan sebagai kontrol. 4. Hasil yang diperoleh dari masing-masing jenis bakteri yang diinokulasi dicatat. d. Hidrolisis Gelatin 1. 3 tabung reaksi berisi medium gelatin diinokulasikan secara aseptik dengan bakteri yang berbeda. 2. Satu tabung reaksi berisi medium gelatin tidak diinokulasikan dan digunakan sebagai kontrol. 3. Setiap tabung diberi tanda dengan nama bakteri diinokulasikan, tanggal inokulasi, dan nomor kelompok.
yang
4. Tabung-tabung tersebut diinkubasikan selama 48 jam, pada suhu kamar.
5. Hasil yang diperoleh dari masing-masing jenis bakteri yang diinokulasi dicatat. e. Uji Katalase 1. Gelas benda dibersihkan dan diteteskan beberapa tetes larutan H202 3% diatas gelas obyek tersebut. 2. Sedikit biakan E. coli dengan ose diambil dan diletakkan di dalam tetesan H202 3%. 3. Hal yang sama dilakukan untuk kultur mikroba lain. 4. Adanya gelembung-gelembung O 2 diamati di dalam larutan H 202 3%
IV. DATA PENGAMATAN Gambar
Hasil uji Glu
Lak
Suk
+
+
+
-
-
-
+
-
+
Pati
Gambar bakteri E.coli pada medium agar cair
Gambar bakteri Bascillus subtilis pada medium cair
Gambar Bakteri S.aureus pada medium cair BS(+) EC(-)
Gambar Bakteri (kanan : Bascillus subtilis, kiri : E.coli) pada media agar pati SA(+)
Gel
Kasein
Katalase
Gambar bakteri (kiri : S.aureus) dan agar kontrol (tidak ditanami bakteri) pada medium agar pati BS(-) SA(+) EC(-)
Gambar bakteri (kiri : E.coli, tengah : Bascillus subtilis, kanan : S.aureus) pada medium agar gelatin cair SA (+) BS (+) EC (-)
Gambar bakteri (kiri : S.aureus, tengah : Bascillus subtilis, kanan: E.coli)
V. PEMBAHASAN Praktikum mikrobiologi dengan acara praktikum Uji Enzimatis Mikroba telah dilaksanakan pada hari Rabu, 3 Mei 2017 bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Sains dan Matematika Universitas Diponegoro yang bertujuan supaya mahasiswa dapat mengetahui reaksi enzimatis yang terjadi pada mikroorganisme. Bakteri yang digunakan pada praktikum kali ini adalah bakteri E. coli, S. aureus dan B. subtillis. Aktivitas metabolisme tidak terlepas dari adanya enzim. Berdasarkan tempat bekerjanya, bakteri memiliki juga jenis enzim yaitu endoenzim dan eksoenzim. Endoenzim yaitu enzim yang berkerja dalam sel sedangkan eksoenzim yaitu enzim yang bekerja di luar sel. Sebagian besar eksoenzim bersifat hidroliktik, yang berarti bahwa eksoenzim menguraikan molekul kompleks menjadi molekul yang molekul-molekul yang lebih sederhana. Molekul-molekul yang lebih kecil ini kemudian dapat memasuki sel dan digunakan untuk kepentingan sel. Karena melibatkan reaksi, eksoenzim sebagian besar berperan sebagai enzim hidrolitik untuk mereduksi bahan yang memilki berat molekul besar ke dalam kompleks yang dibangunnya dengan memasukkan air ke dalam molekul. Molekul-molekul kecil yang terlepas kemudian diangkut kedalam sel dan di assimilasi (dicerna). Pada percobaan ini, akan diuji aktivitas enzimatis mikroba yaitu uji aktivitas eksoenzim yang terdiri atas uji amilolitik dan uji proteolitik. Untuk uji endoenzim terdiri a tas uji katalase. 5.1 Bakteri E.coli Echericia coli adalah suatu bakteri gram negatif berbentuk batang, bersifat anaerobik fakultatif dan mempunyai flagela peritrikat. E. colli merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan maupun manusia. Menurut Pelczar dan Chan (1986), E. colli mempunyai morfologi sel yang berbentuk batang pendek (0,5-1,0 x 1,0-3,0 μm), motil, sel-selnya peritikus yakni flagela secara merata tersebar di seluruh permukaan sel) atau nonmotil, anaerobik fakultatif dan merupakan kelompok bakteri gram-negatif. Habitat dari E. colli yaitu lingkungan aquatik, tanah, makanan, air seni dan tinja serta bersifat patogenik bagi manusia dan hewan (beberapa patogenik pada tumbuhan). (Fardiaz,1988) A. Uji Amilum Amilum merupakan senyawa yang memiliki berat molekul tinggi yang terdiri atas polimer glukosa yang bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik. Degradasi amilum membutuhkan enzim amilase yang akan menghidrolisis menjadi polisakarida yang lebih pendek (dekstrin) yang selanjutnya menjadi maltose. Hirolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk ke dalam sel. Enzim amilase ini dimiliki oleh bakteri yang mengandung enzim amilase sehingga ketika diinokulasikan pada media Nutrient Agar yang mengandung pati maka akan terbentuk zona bening karena warna media ini sedikit putih akibat adanya pati. Indikator yang digunakan pada uji amilolitik adalah iodin. Iodium digunakan sebagai indicator adanya amilum apabila medium yang mengandung pati atau amilum diberi iodium maka akan tampak warna biru. Namun jika pati atau amilum tersebut telah terhidrolisis maka warnanya akan jernih atau bening. Warna jernih tersebut mengindikasikan bahwa pati atau amilum sudah terhidrolisis oleh eksoenzim pada
bakteri (Hadioetomo,1990). Bakteri yang mengandung enzim amilase ketika ditambahkan iodin akan membentuk zona bening. Reaksi yang terjadi ketika pati dihidrolisis menjadi glukosa dengan bantuan enzim α-amilase yang dimiliki oleh bakteri dapat dilihat pada gambar 1(Rehm dan Reed 1987). Uji amilum dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menguraikan amilum menjadi molekul yang lebih sederhana, dengan kata lain untuk mengetahui adanya enzim amilase pada masing-masing bakteri.
Gambar 1 Reaksi uji amilolitik pada pati dengan enzim amilase
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan pada uji amilolitik, tidak didapatkan zona bening pada media yang ditumbuhi bakteri E. coli. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri E.coli tidak memiliki enzim yang dapat mengurai pati dalam medium agar. B. Uji Karbohidrat Fermentasi merupakan salah satu aktivitas biokimia yang dilakukan oleh mikroba. Fermentasi adalah proses penggunaan senyawa makromolekul organik menjadi senyawa yang lebih sederhana oleh aktivitas mikroba pada kondisi anaerob. Fermentasi dapat menghasilkan berbagai senyawa akhir, contohnya fermentasi karbohidrat yang dapat menghasilkan berbagai senyawa asam seperti asam laktat dan propionat, ester-ester, keton dan gas. Sebagian besar mikroorganisme memperoleh energi dari substrat berupa karbohidrat yang selanjutnya di fermentasi menghasilkan asam-asam organik (seperti asam laktat, format, asetat), dengan disertai atau tidak disertai pembentukan gas. Organisme-organisme yang berbeda akan menggunakan karbohidrat/gula-gula yang berbeda tergantung dari komponen enzim yang dimilikinya (McNeil & Harvey, 2008). Gula dalam medium digunakan untuk melihat adanya pembentukan asam yaitu dengan adanya perubahan warna indikator (merah fenol) yang terdapat dalam medium menjadi kuning serta untuk pembentukan gas, yaitu dengan terlihatnya udara di dalam tabung peragian/fermentasi (tabung durham)( Bhowmik 2011). Jenis karbohidrat yang digunakan pada uji asam dari gula dalam paktikum ini yaitu Glukosa, Sukrosa dan Laktosa. Uji asam dari gula digunakan untuk mengetahui apakah inokulum dapat memfermentasi glukosa membentuk asam dan gas. Berdasarkan hasil pengamatan pada tabung reaksi yang telah diberi media cair dengan glukosa, teramati hasil positif pada bakteri E.coli. Hal tersebut ditunjukkan dengan adanya perubahan warna medium dari warna merah menjadi orange buram. Selain itu, diamati juga terdapat gelembung kecil pada tabung durham. Hal ini menunjukkan bahwa E.coli dapat memfermentasi glukosa sehingga menghasilkan gas.
Menurut Vos (2009) terjadinya perubahan warna media dari merah menjadi kuning. Artinya inokulum memfermentasi gula membentuk asam dan gas. Hasil positif juga ditunjukkan pada pengamatan dalam media mengandung gula berupa sukrosa dan laktosa. Medium cair berubah warna dari merah menjadi orange dan juga menghasilkan gelembung pada tabung durham. C. Uji Gelatin Uji hidrolisa gelatin merupakan suatu uji untuk mengetahui ada tidaknya kemampuan suatu mikroorganisme dalam menghidrolisis gelatin. Uji ini menentukan kemampuan suatu mikroorganisme untuk dapat membentuk enzim semacam proteolitik (gelatinase) yang dapat mencairkan gelatin yang akan terurai oleh bakteri yang mensintesis enzim proteolisis. Parameter yang menunjukkan hasil positif pada percobaan ini adalah gelatin tetap dalam keadaan cair walaupun telah didinginkan. Artinya reaksinya bersifat irreversibel (tidak dapat balik), di mana media gelatin akan tetap cair meskipun telah didinginkan dengan es. Dengan kata lain,mikroorganisme dapat membentuk enzim semacam proteolitik (gelatinase) yang dapat mencairkan gelatin (Lehninger,1985) Gelatin adalah protein yang diperoleh dari hidrolisis kolagen, yaitu zat pada jaringan penghubung dan tendon pada hewan. Pada suhu rendah, media gelatin akan memadat sedangkan pada suhu kamar gelatin berwujud cair. Melalui hal tersebut, akan diketahui bagaimana uji hidrolisa ini terjadi. Media gelatin terhidrolisis jika wujudnya menjadi cair, bukan padatan(Stryer,2000). Dalam uji hidrolisa ini, hasil yang diperoleh adalah negatif pada E. coli yang ditunjukkan dengan terbentuknya padatan pada media gelatin atau dengan kata lain bakteri yang digunakan tidak dapat mensintesis enzim proteolisis untuk menguraikan gelatin, sehingga media gelatin memadat. Media gelatin menjadi padat karena ikatan hidrogen yang terdapat didalamnya tidak dapat dihidriolisa (tidak terurai) oleh bakteri, sehingga reaksinya bersifat reversibel dapat balik. Reaksi dikatakan dapat balik jika media gelatin tersebut akan memadat pada suhu rendah dan akan kembali cair pada suhu normal (Stryer,2000). D. Uji Protease Percobaan ini bertujuan untuk mengamati aktivitas enzim protease pada mikroba yang diinokulasikan. Media yang digunakan untuk isolasi mikroorganisme pembentuk protease yaitu media SMA ( Skim Milk Agar). Skim Milk Agar Merupakan media yang terdiri dari PCA steril dan susu skim. Susu skim digunakan sebagi sumber substrat. Susu skim merupakan susu yang mengandung protein tinggi sekitar 3,7% dan lemak sekitar 0,1% . Susu skim mengandung kasein yang dapat dipecah oleh mikroorganisme proteolitik menjadi senyawa nitrogen terlarut sehingga pada koloni dikelilingi area bening, sehingga kejadian tersebut menunjukkan bahwa mikroba tersebut mempunyai aktivitas proteolitik (Fardiaz, 1988) Pada hasil percobaan kami, terdapat zona berwarna bening disekitar bakteri yang tumbuh. Hal ini menunjukkan adanya aktivitas bakteri proteolitik untuk menguraikan protein. Seperti menurut Durham (1987), bahwa aktivitas proteolitik menghasilkan zona jernih. Bakteri proteolitik adalah bakteri yang memproduksi enzim protease ekstraseluler, yaitu enzim pemecah protein yang diproduksi di dalam sel kemudian dilepaskan keluar dari sel. Semua bakteri mempunyai enzim protease di
dalam sel, tetapi tidak semua mempunyai enzim protease ekstraseluler. Dekomposisi protein oleh mikroorganisme lebih kompleks daripada pemecahan karbohidrat dan produk akhirnya juga lebih bervariasi. Hal ini disebabkan struktur protein yang lebih kompleks. Mikroorganisme melalui suatu sistem enzim yang kompleks, memecah protein menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana. Setelah diamati, E.coli, positif merupakan bakteri proteolitik karena disekeliling koloni terdapat area berwarna bening. Medium kontol terkontaminasi oleh mikroba. Hal ini dapat dikarenakan pengerjaan praktikan yang kurang aseptis. Menurut Hadioetomo (1993), bakteri E.coli memiliki enzim protease, sehingga hasil dengan literatur terdapat kecocokan. Reaksi penguraian protein menjadi asam amino adalah sebagai berikut:
Gambar 2 : Reaksi penguraian protein menjadi asam amino
E. Uji Katalase Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat. Dan digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme untuk menguraikan hydrogen peroksida dengan menghasilkan enzim katalase. Bakteri yang memerlukan oksigen menghasilkan hydrogen peroksida yang sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri. Namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya antimetabolit tersebut karena mereka menghasilkan enzim katalase yang dapat mengubah hidogen peroksida menjadi air dan oksigen dengan reaksi sebagai berikut 2 H2O2 ↔ 2 H2O + O2 (Volk dan Wheeler, 1993). Dari hasil pengamatan didapatkan hasil negatif pada bakteri E.coli. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut tidak memiliki enzim katalase. Menurut Naiola (2002), bakteri kelompok Bacillus sp. merupakan bakteri katalase positif, sehingga hasil percobaan sesuai dengan literatur. Reaksi yang terjadi dapat seperti ditunjukkan gambar 3.
Gambar 3 : Dekomposisi peroksida
5.2 Bakteri Bascillus subtilis
Mikroorganisme penghasil enzim protease berasal dari kelompok bakteri yaitu antara lain Bacillus sp. yang memiliki sifat aerobik fakultatif yaitu bakteri yang membutuhkan kadar oksigen tidak terlalu banyak, dan membentuk spora, Endospora merupakan karakter kunci utama genus Bacillus. Endospora merupakan struktur bakteri yang dapat bertahan pada keadaan yang tidak menguntungkan seperti kekeringan, kekurangan nutrien, pembekuan, serta bahan-bahan kimia. Karakteristik lain dari Bacillus adalah motil, katalase positif, kebutuhan O2 positif (Naiola, 2002).
A. Uji Amilum Amilum merupakan senyawa yang memiliki berat molekul tinggi yang terdiri atas polimer glukosa yang bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik. Degradasi amilum membutuhkan enzim amilase yang akan menghidrolisis menjadi polisakarida yang lebih pendek (dekstrin) yang selanjutnya menjadi maltose. Hirolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk ke dalam sel. Enzim amilase ini dimiliki oleh bakteri yang mengandung enzim amilase sehingga ketika diinokulasikan pada media Nutrient Agar yang mengandung pati maka akan terbentuk zona bening karena warna media ini sedikit putih akibat adanya pati. Indikator yang digunakan pada uji amilolitik adalah iodin. Iodium digunakan sebagai indicator adanya amilum apabila medium yang mengandung pati atau amilum diberi iodium maka akan tampak warna biru. Namun jika pati atau amilum tersebut telah terhidrolisis maka warnanya akan jernih atau bening. Warna jernih tersebut mengindikasikan bahwa pati atau amilum sudah terhidrolisis oleh eksoenzim pada bakteri (Hadioetomo,1990). Bakteri yang mengandung enzim amilase ketika ditambahkan iodin akan membentuk zona bening. Reaksi yang terjadi ketika pati dihidrolisis menjadi glukosa dengan bantuan enzim α -amilase yang dimiliki oleh bakteri dapat dilihat pada gambar 1(Rehm dan Reed 1987). Uji amilum dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menguraikan amilum menjadi molekul yang lebih sederhana, dengan kata lain untuk mengetahui adanya enzim amilase pada masing-masing bakteri. Berdasarkan hasil pengamatan, medium agar yang telah ditanami bakteri Bascillus subtilis menghasilkan zona bening setelah masa inkubasi selama 48 jam. Hal ini menunjukkan hasil positif bahwa bakteri Bascillus subtilis memiliki enzim pengurai amilum atau zat tepung. Menurut Sukarminah (2010) Fungsi uji positif hidrolisis amilum pada bakteri ditandai dengan tampaknya area jernih di sekitar pertumbuhan bakteri yang digoreskan. Adanya daerah jernih tersebut disebabkan eksoenzim dan organisme menghidrolisis amilum dalam medium agar. Fungi atau bakteri memproduksi α-amilase sehingga mampu menguraikan amilum dengan eksoenzim amilolitik tersebut amat luas antara mikroorganisme, diantaranya bakteri Bacillus macerans, Bacillus polimexa, dan Bacillus subtilis. B. Uji Karbohidrat Fermentasi merupakan salah satu aktivitas biokimia yang dilakukan oleh mikroba. Fermentasi adalah proses penggunaan senyawa makromolekul organik menjadi senyawa yang lebih sederhana oleh aktivitas mikroba pada kondisi anaerob. Fermentasi dapat menghasilkan berbagai senyawa akhir, contohnya fermentasi
karbohidrat yang dapat menghasilkan berbagai senyawa asam seperti asam laktat dan propionat, ester-ester, keton dan gas. Sebagian besar mikroorganisme memperoleh energi dari substrat berupa karbohidrat yang selanjutnya di fermentasi menghasilkan asam-asam organik (seperti asam laktat, format, asetat), dengan disertai atau tidak disertai pembentukan gas. Organisme-organisme yang berbeda akan menggunakan karbohidrat/gula-gula yang berbeda tergantung dari komponen enzim yang dimilikinya (McNeil & Harvey, 2008). Gula dalam medium digunakan untuk melihat adanya pembentukan asam yaitu dengan adanya perubahan warna indikator (merah fenol) yang terdapat dalam medium menjadi kuning serta untuk pembentukan gas, yaitu dengan terlihatnya udara di dalam tabung peragian/fermentasi (tabung durham)( Bhowmik 2011). Jenis karbohidrat yang digunakan pada uji asam dari gula dalam paktikum ini yaitu Glukosa, Sukrosa dan Laktosa. Uji asam dari gula digunakan untuk mengetahui apakah inokulum dapat memfermentasi glukosa membentuk asam dan gas. Berdasarkan hasil pengamatan, tidak terjadi perubahan warna pada tabung reaksi dengan medium agar cair yang telah ditanami bakteri Bascillus subtilis. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut tidak dapat memecah baik glukosa,sukrosa dan laktosa menjadi senyawa yang lebih sederhana lagi. Pada tabung durham pun tidak teramati adanya gelembung gas. C. Uji Gelatin Uji hidrolisa gelatin merupakan suatu uji untuk mengetahui ada tidaknya kemampuan suatu mikroorganisme dalam menghidrolisis gelatin. Uji ini menentukan kemampuan suatu mikroorganisme untuk dapat membentuk enzim semacam proteolitik (gelatinase) yang dapat mencairkan gelatin yang akan terurai oleh bakteri yang mensintesis enzim proteolisis. Parameter yang menunjukkan hasil positif pada percobaan ini adalah gelatin tetap dalam keadaan cair walaupun telah didinginkan. Artinya reaksinya bersifat irreversibel (tidak dapat balik), di mana media gelatin akan tetap cair meskipun telah didinginkan dengan es. Dengan kata lain,mikroorganisme dapat membentuk enzim semacam proteolitik (gelatinase) yang dapat mencairkan gelatin (Lehninger,1985) Gelatin adalah protein yang diperoleh dari hidrolisis kolagen, yaitu zat pada jaringan penghubung dan tendon pada hewan. Pada suhu rendah, media gelatin akan memadat sedangkan pada suhu kamar gelatin berwujud cair. Melalui hal tersebut, akan diketahui bagaimana uji hidrolisa ini terjadi. Media gelatin terhidrolisis jika wujudnya menjadi cair, bukan padatan(Stryer,2000). Dalam uji hidrolisa ini, hasil yang diperoleh adalah positif pada Bascillus subtilis yang ditunjukkan dengan encernya medium gelatin meskipun sudah didinginkan dalam lemari es. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri dapat mensintesis enzim proteolisis untuk menguraikan gelatin, sehingga media gelatin menjadi cair atau tidak terdapat gumpalan. D. Uji Protease Percobaan ini bertujuan untuk mengamati aktivitas enzim protease pada mikroba yang diinokulasikan. Media yang digunakan untuk isolasi mikroorganisme pembentuk protease yaitu media SMA ( Skim Milk Agar). Skim Milk Agar Merupakan media yang terdiri dari PCA steril dan susu skim. Susu skim digunakan sebagi sumber substrat. Susu skim merupakan susu yang mengandung protein tinggi sekitar 3,7% dan lemak sekitar 0,1% . Susu skim mengandung kasein yang dapat dipecah oleh
mikroorganisme proteolitik menjadi senyawa nitrogen terlarut sehingga pada koloni dikelilingi area bening, sehingga kejadian tersebut menunjukkan bahwa mikroba tersebut mempunyai aktivitas proteolitik (Fardiaz, 1988) Pada hasil percobaan kami, terdapat zona berwarna bening disekitar bakteri yang tumbuh. Hal ini menunjukkan adanya aktivitas bakteri proteolitik untuk menguraikan protein. Seperti menurut Durham (1987), bahwa aktivitas proteolitik menghasilkan zona jernih. Bakteri proteolitik adalah bakteri yang memproduksi enzim protease ekstraseluler, yaitu enzim pemecah protein yang diproduksi di dalam sel kemudian dilepaskan keluar dari sel. Semua bakteri mempunyai enzim protease di dalam sel, tetapi tidak semua mempunyai enzim protease ekstraseluler. Dekomposisi protein oleh mikroorganisme lebih kompleks daripada pemecahan karbohidrat dan produk akhirnya juga lebih bervariasi. Hal ini disebabkan struktur protein yang lebih kompleks. Mikroorganisme melalui suatu sistem enzim yang kompleks, memecah protein menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana. Setelah diamati, bakteri B. subtilis merupakan bakteri yang memiliki proteolitik karena disekeliling koloni terdapat area berwarna bening. Medium kontol terkontaminasi oleh mikroba. Hal ini dapat dikarenakan pengerjaan praktikan yang kurang aseptis. Menurut Naiola (2002), spesies dari Bacillus sp. merupakan kelompok mikroorganisme penghasil enzim protease, sehingga hasil percobaan cocok dengan literatur. Reaksi yang terjadi dapat seperti ditunjukkan gambar 3
E. Uji Katalase Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat. Dan digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme untuk menguraikan hydrogen peroksida dengan menghasilkan enzim katalase. Bakteri yang memerlukan oksigen menghasilkan hydrogen peroksida yang sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri. Namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya antimetabolit tersebut karena mereka menghasilkan enzim katalase yang dapat mengubah hidogen peroksida menjadi air dan oksigen dengan reaksi sebagai berikut 2 H2O2 ↔ 2 H2O + O2 (Volk dan Wheeler, 1993). Setelah diamati, muncul gelembung-gelembung pada bakteri B. subtillis. Menurut Naiola (2002), bakteri kelompok Bacillus sp. merupakan bakteri katalase positif, sehingga hasil percobaan sesuai dengan literatur. 5.3 Staphylococcus aureus Bakteri kelompok Staphylococcus sp. merupakan bakteri gram positif yang dapat menyebabkan berbagai penyakit. Pada saat system imun menurun maka bakteri ini akan masuk ke dalam tubuh baik melalui mulut, inhalasi,maupun penetrasi kulit. Jika bakteri ini masuk ke dalam peredaran darah dan menyebar ke organ tubuh lainnya maka akan merusak organ-organ tubuh tersebut dan menyebabkan berbagai penyakit. Misalnya Staphylococcus aureus dapat menyebabkan penyakit infeksi pada folikel rambut dan kelenjar keringat, meningitis, endocarditis, pyelonephritis, dan osteomyelitis (Entjang, 2003).
A. Uji Amilum Amilum merupakan senyawa yang memiliki berat molekul tinggi yang terdiri atas polimer glukosa yang bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik. Degradasi amilum membutuhkan enzim amilase yang akan menghidrolisis menjadi polisakarida yang lebih pendek (dekstrin) yang selanjutnya menjadi maltose. Hirolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk ke dalam sel. Enzim amilase ini dimiliki oleh bakteri yang mengandung enzim amilase sehingga ketika diinokulasikan pada media Nutrient Agar yang mengandung pati maka akan terbentuk zona bening karena warna media ini sedikit putih akibat adanya pati. Indikator yang digunakan pada uji amilolitik adalah iodin. Iodium digunakan sebagai indicator adanya amilum apabila medium yang mengandung pati atau amilum diberi iodium maka akan tampak warna biru. Namun jika pati atau amilum tersebut telah terhidrolisis maka warnanya akan jernih atau bening. Warna jernih tersebut mengindikasikan bahwa pati atau amilum sudah terhidrolisis oleh eksoenzim pada bakteri (Hadioetomo,1990). Bakteri yang mengandung enzim amilase ketika ditambahkan iodin akan membentuk zona bening. Reaksi yang terjadi ketika pati dihidrolisis menjadi glukosa dengan bantuan enzim α-amilase yang dimiliki oleh bakteri dapat dilihat pada gambar 1. (Rehm dan Reed 1987) Berdasarkan hasil pengamatan, tidak didapatkan zona bening pada medium agar pati yang telah ditanami bakteri S.aureus. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut tidak memiliki enzim amilase yang dapat mengurai amilum menjadi komponen yang lebih sederhana. B. Uji Karbohidrat Fermentasi merupakan salah satu aktivitas biokimia yang dilakukan oleh mikroba. Fermentasi adalah proses penggunaan senyawa makromolekul organik menjadi senyawa yang lebih sederhana oleh aktivitas mikroba pada kondisi anaerob. Fermentasi dapat menghasilkan berbagai senyawa akhir, contohnya fermentasi karbohidrat yang dapat menghasilkan berbagai senyawa asam seperti asam laktat dan propionat, ester-ester, keton dan gas. Sebagian besar mikroorganisme memperoleh energi dari substrat berupa karbohidrat yang selanjutnya di fermentasi menghasilkan asam-asam organik (seperti asam laktat, format, asetat), dengan disertai atau tidak disertai pembentukan gas. Organisme-organisme yang berbeda akan menggunakan karbohidrat/gula-gula yang berbeda tergantung dari komponen enzim yang dimilikinya (McNeil & Harvey, 2008). Gula dalam medium digunakan untuk melihat adanya pembentukan asam yaitu dengan adanya perubahan warna indikator (merah fenol) yang ter dapat dalam medium menjadi kuning serta untuk pembentukan gas, yaitu dengan terlihatnya udara di dalam tabung peragian/fermentasi (tabung durham)( Bhowmik 2011). Jenis karbohidrat yang digunakan pada uji asam dari gula dalam paktikum ini yaitu Glukosa, Sukrosa dan Laktosa. Uji asam dari gula digunakan untuk mengetahui apakah inokulum dapat memfermentasi glukosa membentuk asam dan gas. Berdasarkan hasil pengamatan, terjadinya perubahan warna pada tabung reaksi yang telah ditanami dengan bakteri S.aureus hanya terdapat pada tabung yang berisi media cair sukrosa dan glukosa sedangkan pada media cair laktosa tidak terdapat perubahan warna. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri S.aureus hanya dapat memecah
molekul gula dari glukosa dan sukrosa menjadi molekul yang sederhana, namun tidak dengan gula laktosa. Dari hasil pengamatan juga tidak teramati terbentuknya gas pada masing-masing tabung. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri S. aureus tidak dapat melakukan fermentasi dengan bahan-bahan gula berupa glukosa,laktosa dan sukrosa. C. Uji Gelatin Uji hidrolisa gelatin merupakan suatu uji untuk mengetahui ada tidaknya kemampuan suatu mikroorganisme dalam menghidrolisis gelatin. Uji ini menentukan kemampuan suatu mikroorganisme untuk dapat membentuk enzim semacam proteolitik (gelatinase) yang dapat mencairkan gelatin yang akan terurai oleh bakteri yang mensintesis enzim proteolisis. Parameter yang menunjukkan hasil positif pada percobaan ini adalah gelatin tetap dalam keadaan cair walaupun telah didinginkan. Artinya reaksinya bersifat irreversibel (tidak dapat balik), di mana media gelatin akan tetap cair meskipun telah didinginkan dengan es. Dengan kata lain,mikroorganisme dapat membentuk enzim semacam proteolitik (gelatinase) yang dapat mencairkan gelatin (Lehninger,1985) Gelatin adalah protein yang diperoleh dari hidrolisis kolagen, yaitu zat pada jaringan penghubung dan tendon pada hewan. Pada suhu rendah, media gelatin akan memadat sedangkan pada suhu kamar gelatin berwujud cair. Melalui hal tersebut, akan diketahui bagaimana uji hidrolisa ini terjadi. Media gelatin terhidrolisis jika wujudnya menjadi cair, bukan padatan(Stryer,2000). Dalam uji hidrolisa ini, hasil yang diperoleh adalah negatif pada S. aureus yang ditunjukkan dengan terbentuknya padatan pada media gelatin atau dengan kata lain bakteri yang digunakan tidak dapat mensintesis enzim proteolisis untuk menguraikan gelatin, sehingga media gelatin memadat. Media gelatin menjadi padat karena ikatan hidrogen yang terdapat didalamnya tidak dapat dihidriolisa (tidak terurai) oleh bakteri, sehingga reaksinya bersifat reversibel dapat balik. Reaksi dikatakan dapat balik jika media gelatin tersebut akan memadat pada suhu rendah dan akan kembali cair pada suhu normal (Stryer,2000). D. Uji Protease Percobaan ini bertujuan untuk mengamati aktivitas enzim protease pada mikroba yang diinokulasikan. Media yang digunakan untuk isolasi mikroorganisme pembentuk protease yaitu media SMA ( Skim Milk Agar). Skim Milk Agar Merupakan media yang terdiri dari PCA steril dan susu skim. Susu skim digunakan sebagi sumber substrat. Susu skim merupakan susu yang mengandung protein tinggi sekitar 3,7% dan lemak sekitar 0,1% . Susu skim mengandung kasein yang dapat dipecah oleh mikroorganisme proteolitik menjadi senyawa nitrogen terlarut sehingga pada koloni dikelilingi area bening, sehingga kejadian tersebut menunjukkan bahwa mikroba tersebut mempunyai aktivitas proteolitik (Fardiaz, 1988) Pada hasil percobaan kami, terdapat zona berwarna bening disekitar bakteri yang tumbuh. Hal ini menunjukkan adanya aktivitas bakteri proteolitik untuk menguraikan protein. Seperti menurut Durham (1987), bahwa aktivitas proteolitik menghasilkan zona jernih. Bakteri proteolitik adalah bakteri yang memproduksi enzim protease ekstraseluler, yaitu enzim pemecah protein yang diproduksi di dalam sel kemudian dilepaskan keluar dari sel. Semua bakteri mempunyai enzim protease di
dalam sel, tetapi tidak semua mempunyai enzim protease ekstraseluler. Dekomposisi protein oleh mikroorganisme lebih kompleks daripada pemecahan karbohidrat dan produk akhirnya juga lebih bervariasi. Hal ini disebabkan struktur protein yang lebih kompleks. Mikroorganisme melalui suatu sistem enzim yang kompleks, memecah protein menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana. Setelah diamati, bakteri S. aureus negatif. Medium kontol terkontaminasi oleh mikroba. Hal ini menunjukkan bahwa S. aureus tidak dapat mensintesis enzim protease. E. Uji Katalase Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat. Dan digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme untuk menguraikan hydrogen peroksida dengan menghasilkan enzim katalase. Bakteri yang memerlukan oksigen menghasilkan hydrogen peroksida yang sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri. Namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya antimetabolit tersebut karena mereka menghasilkan enzim katalase yang dapat mengubah hidogen peroksida menjadi air dan oksigen dengan reaksi sebagai berikut 2 H2O2 ↔ 2 H2O + O2 (Volk dan Wheeler, 1993). Setelah diamati, muncul gelembung-gelembung pada bakteri S. aureus. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut memiliki enzim katalase. Reaksi yang terjadi dapat seperti ditunjukkan gambar 3
VI. KESIMPULAN Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan menguji aktivitas enzimatisnya. Enzim merupakan katalis dalam sistem biologi atau di sebut pula dengan biokatalis. Katalis ini berfungsi untuk mempercepat laju reaksi kimia dengan akhir dari reaksi kimia akan diperoleh kembali katalis tersebut. Uji aktivitas enzimatis terbagi menjadi dua yaitu uji aktivitas eksoenzim dan ujiaktivitas endoenzim. Uji aktivitas eksoenzim terdiri dari uji amilolitik, proteolitik, dan lipolitik sedangkan uji aktivitas endoenzim terdiri dari uji katalase dan oksidase VII. DAFTAR PUSTAKA Hadioetomo, R.S. 1990. Mikrobiologi dasar dalam praktek . Jakarta : Gramedia McNeil, B. & L. Harvey. 2008. Practical Fermentation Technology. John Wiley & Sons Ltd., England : 362 hlm. Sukarminah E., Sumanti, D.M. dan Hanidah,I. 2010. Mikrobiologi Pangan. Penerbit Jurusan Teknologi Industri Pangan Fakultas Teknologi Industri Pertanian Universitas Padjadjaran, Jatinangor Vos, P., G. Garrity, D. Jones, N.R. Krieg, W. Ludwig, F.A. Rainey, Karl-Heinz Schleifer, & W. Whitman, W. 2009. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology: Volume 3. Springer Dordrecht Heidelberg, London : 1449 hlm. Bhowmik, G. 2011. Ana Techniqs in Biotechnology. Tata McGraw Hill Education Private Limited, New Delhi : 247 hlm. Lehninger, A.L. 1985. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Erlangga. Jakarta Stryer, L. 2000. Biokimia Vol 2 Edisi 4. EGC. Jakarta.
Durham, D.R., Stewart, D.B., Stellwag E.J. 1987. Nover alkaline and heat stable serine proteases from alkalophilic Bacillus sp. strain GX6638. Di dalam J. Bacteriol . USA: Medline Press. Fardiaz, S. 1988. Fisiologi Fermentasi. Bogor: Lembaga Sumber Daya Informasi Institut Pertanian Bogor. Naiola, E., N. Widhyastuti. 2002. Isolasi, Seleksi dan Optimasi Produksi Protease dari Beberapa Isolat Bakteri. Jurnal Berita Biologi , , 6(3): 467- 473. Pelczar, M.J., Chan, E.C.S. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta:UI Press. Volk, S. 1988. Mikrobiologi Dasar . Jakarta: Erlangga.
Volk dan Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Erlangga: Jakarta.
