Laporan Praktikum Mikrobiologi
Nama NIM Kelas Kelompok Hari/Tgl Waktu PJP Asisten
: Bhisma Damareka : J3L212190 : B-2 :4 : Rabu / 13 November 2013 : 11.10 – 11.10 – 14.30 14.30 : Emil Wahdi, S.Si. 1. Ramdhani 2. Yesi Septiani 3. Yeny Anggraini
UJI AKTIVITAS ENZIMATIS MIKROORGANISME MIKROORGANISME
ANALISIS KIMIA PROGRAM DIPLOMA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
Pendahuluan Enzim adalah protein yang berfungsi sebagai katalisator untuk reaksireaksikimia didalam sistem biologi. Katalisator mempercepat reaksi kimia. Walaupun katalisator ikut serta dalam reaksi, ia kembali ke keadaan semula bila reeaksi telahselesai. Enzim adalah katalisator protein untuk reaksi-reaksi kimia pasa system biologi. sebagian besar reaksi tersebut tidak dikatalis oleh enzim. Berbeda dengan katalisator nonprotein (H+, OH-, atau ion-ion logam), tiap-tiap enzim mengkatalisis sejumlah kecil reaksi, kerap kali hanya satu (Pelczar 1986). Jadi enzim adalah katalisator yang reaksi-spesifik karena semua reaksi biokimia perlu dikatalis oleh enzim, harus terdapat banyak jenis enzim. Sebenarnya untuk hampir setiap senyawa organik,terdapat satu enzim pada beberapa organisme hidup yang mampu bereaksi dengandan mengkatalisis beberapa perubahan kimia. Walaupun aktivitas katalik enzim dahulu diduga hanya diperlihatkan oleh sel-sel yang utuh (karena itu istilah enzyme, yaitu, “dalam ragi”), sebagian besar enzim dapat diekstraksi dari sel tanpa kehilangan aktivitas biologik (katalik) nya. Oleh karena itu, enzim dapat diselidiki diluar sel hidup. Ekstrak yang mengandung enzim dipakai pada penyelidikan reaksi-reaksi metabolik dan pengaturanya, struktur dan mekanisme kerja enzim dan malahan sebagai katalisator dalam industri pada sintetis senyawa-senyawa yang biologis aktif seperti hormon dan obat-obatan (Caesaria 2007). Media adalah substansi yang memenuhi kebutuhan nutrisi mikroorganisme. Pertumbuhan suatu mikroba beserta koloninya dalam suatu media dapat dipercepat dengan menggunakan mikroorganisme lain yang bertindak sebagai enzim atau katalisator. Enzim ini memiliki aktivitas-aktivitas tertentu sesuai dengan media tumbuhnya. Oleh karena itu, pada percobaan kali ini dilakukan beberapa uji aktivitas enzimatis suatu mikroba (Schegel, 1994). Tujuan Menguji aktivitas enzimatis oleh bakteri Escherecia bakteri Escherecia coli dan Bacillus dan Bacillus sp. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan yaitu petri yaitu petri dish steril, dish steril, kawat ose, dan pipet tetes. Bahan-bahan yang digunakan yaitu media Nutrient Agar , suspensi E.Coli dan Bacillus sp., sp., lugol’s iodine, iodine, HCl 10%, dan Skim Milk Agar (SMA). Prosedur E.Coli dan Bacillus sp. sp. Secara Uji Amilolitik. Diinokulasikan bakteri E.Coli terpisaha pada satu cawan oleh media Nutrient media Nutrient Agar (NA) yang mengandung 2g/L pati. Kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 0C. Setelah selesai diinkubasi, diteteskan cawan dengan cairan lugol iodine satu tetes ke seluruh permukaan media. Hidrolisis zat pati terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni, sedangkan hasil negative ditunjukkan warna sekitar koloni tetap biru hitam. sp. dan E.Coli pada media Skim Uji Proteolitik. Diinokulasikan Bacillus sp. dan Milk Agar (SMA). Diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 37 0C. Aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zona z ona jernih di sekeliling koloni setelah ditetesi dengan HCl 10%.
Uji Katalase. Koloni bakteri diambil satu ose secara aseptis dan diinokulasikan pada Object glass.. glass.. dengan menggunakan pipet tetes, 3% H 2O2 diteteskan satu tetes pada Object glass. glass. Diamati adanya gelembung untuk hasil positif dan tidak ada gelembung untuk hasil negatif. Hasil dan Pembahasan Pembahasan Enzim adalah protein yang berfungsi sebagai katalisator untuk reaksireaksikimia didalam sistem biologi. Katalisator mempercepat reaksi kimia dengan menurunkan energy aktivasi reaksi nya (Lehninger 1982). Mikroorganisme adalah sumber enzim yang paling banyak digunakan dibandingkan dengan tanaman dan hewan. Sebagai sumber enzim, mikroorganisme lebih menguntungkan karena pertumbuhannya cepat dan dapat tumbuh pada substrat yang murah. Reaksi-reaksi seperti hidrolisa dan oksidasi berlangsung sangat cepat di dalam sel-sel hidup pada pH kira-kira netral dan pada suhu tubuh.Ini dapat terjadi karena adanya enzim. Enzim disintesa di dalam sel, tetapi setelah diekstraksi di luar sel, enzim masih mempunyai aktivitas(Schelgel 1994) Karbohidrat banyak terdapat dalam bahan nabati, baik berupa gula sederhana, heksosa, pentosa, maupun dengan berat molekul yang tinggi seperti pati, ektin, selulosa dan lignin (Winarno (Wi narno 1992). Polisakarida dapat dihidrolisis ke bentuk yang sederhana dikatalis oleh enzim. Salah satunya adalah adal ah enzim enzi m amilase yang memecah amilum. Enzim amilase bisa sudah berasal dari bahan maupun kontaminasi dari bakteri penghasil amilolitik atau sakarolitik. Amilum terdapat pada pati. Pati merupakan homopolimer glukosa dengan glukosa dengan ikatan α glikosidik (Winarno 1992). Pati, terutama terdapat dalam jumlah tinggi pada golongan umbi, seperti kentang dan pada biji-bijian, seperti jagung (Lehninger 1982). Praktikum kali ini akan menguji aktifitas enzimatis melalui uji amilolitik pada bakteri Escherecia bakteri Escherecia Coli dan Bacillus dan Bacillus.. Hasil pengujian terdapat pada Tabel !.
Tabel 1. Hasil Uji Amilolitik pada E.Coli pada E.Coli dan Bacillus dan Bacillus sp. Perubahan Warna Bakteri Hasil Pengamatan (+/-) (Sebelum-Sesudah + lugol iodine) E Coli Tak berwarna - biru Bacillus sp. Tak berwarna – berwarna – bening, bening, + coklat Ket + = Menghasilkan zona bening - = tidak menghasilkan zona bening
Gambar 1. Hasil Uji Amilolitik bakteri E.Coli (E) dan Bacillus sp. (B). Sebelum (Kiri) Sesudah (Kanan)
Uji ini membutuhkan enzim amilase yang akan menghidrolisis amilum menjadi polisakarida yang lebih pendek (dextrin), dan selanjutnya menjadi maltosa. Mekanisme kerja dari enzim amylase adalah dengan cara memecah ikatan α-1,4 α-1,4 glikosidik rantai glukan pati dari sebelah dalam sehingga menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk kedalam sel. Indikator yang dipakai pada uji amilolitik ini adalah lugol iodin, dimana amilum akan bereaksi dengan iodin membentuk kompleks berwarna biru hitam yang terlihat pada media. Warna biru hitam terjadi jika iodin masuk ke dalam bagian kosong pada amilum yang berbentuk spiral. Sehingga akan terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni (Lehninger 1982). Zona jernih ini menunjukan adanya aktivitas dari enzim amilase dalam menghidrolisis pati. Hal ini sesuai dengan hasil yang diperoleh dalam percobaan ini berdasarkan Tabel 1 pada bakteri Bacillus karena terdapat zona bening pada bakteri, sedangkan pada bakteri E.Coli hasilnya E.Coli hasilnya negatif karena tidak terdapat zona bening. Bakteri Amilolitik merupakan mikroorganisme yang mampu memecah pati menjadi menjadi senyawa yang lebih sederhana, terutama dalam bentuk glukosa. Kebanyakan mikroorganisme Amilolitik tumbuh subur pada bahan pangan yang banyak mengandung pati atau karbohidrat, misalnya pada berbagai jenis tepung. Kebanyakan jenis mikroorganisme amilolitik adalah kapang, tetapi beberapa jenis bakteri juga ada, jenis yang mempunyai spesies bersifat Amilolitik misalnya Clostridium butyricium dan Bacillus subtilis (Fardiaz, 1992). Tujuan petetesan larutan yodium 1% adalah untuk membuktikan apakah bakteri yang tumbuh pada media adalah bakteri amilolitik. Pati yang tidak terhidrolisis akan membentuk warna biru dengan yodium yang menunjukkan tidak terdapatnya enzim amilase yang dihasilkan oleh bakteri selain bakteri amilolitik. Pati yang terhidrolisis di sekeliling koloni akan terlihat areal bening (lihat Gambar 1), sebagai akibat aktivitas enzim amilase. Areal berwarna coklat kemerahan (lihat Gambar 1) di sekeliling koloni menunjukan hidrolisis sebagian terhadap pati . Protease, disebut juga peptidase atau proteinase, merupakan enzim golongan hidrolase yang akan memecah protein menjadi molekul yang lebih sederhana, seperti menjadi menjadi oligopeptida pendek atau atau asam amino, amino, dengan reaksi hidrolisis pada ikatan peptida. peptida. Enzim ini diperlukan oleh semua makhluk hidup karena bersifat esensial dalam metabolisme protein. protein. Peranannya dalam tubuh antara lain membantu pencernaan protein dalam makanan, dalam makanan, menggunakan menggunakan kembali protein-protein intraseluler, koagulasi sel darah, darah, dan akivasi berbagai jenis protein, enzim, hormon, hormon, serta neurotransmiter (Rehm dan Reed 1987). Uji yang dilakukan selanjutnya yaitu yaitu uji proteolitik. Hasil uji terdapat pada Tabel 2. Tabel 2. Hasil Uji Proteolitik pada E.Coli pada E.Coli dan Bacillus dan Bacillus sp. Perubahan Warna Bakteri Hasil Pengamatan (+/-) (Sebelum-Sesudah + HCl 10%) E Coli Tak berwarna - jingga
Tabel 2.1. Lan utan Tabel Hasil Hasil U i Proteolitik Proteolitik Bakteri
Bacillus sp.
Hasil Pengamatan (+/-)
Perubahan Warna (Sebelum-Sesudah + HCl 10%)
Tak berwarna – berwarna – bening, bening, jingga Ket + = Menghasilkan zona bening - = tidak menghasilkan zona bening +
Gambar 2. Hasil Uji Proteolitik, Sebelum (Kiri) Sesudah (Kanan) Aktivitas proteolitik menghasilkan sedikit penggumpalan. Bakteri proteolitik adalah bakteri yang memproduksi enzim protease ekstraseluler, yaitu enzim pemecah protein yang diproduksi di dalam sel kemudian dilepaskan keluar dari sel. Semua bakteri mempunyai enzim protease di dalam sel, tetapi tidak semua mempunyai enzim protease ekstraseluler (Ingnd 1984) Dekomposisi protein oleh mikroorganisme lebih kompleks daripada pemecahan karbohidrat dan produk akhirnya juga lebih bervariasi. Hal ini disebabkan struktur protein yang lebih kompleks. Mikroorganisme melalui suatu sistem enzim yang kompleks, memecah protein menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana (Durham 1987). Berdasarkan Tabel Tabel 2 dan Tabel Tabel 2.1 hasil uji menujukkan hasil negatif untuk E.Coli E.Coli karena saat di tambahan preaksi HCl bakteri tidak berubah warna(lihat Gambar 2) dan tidak terdapat zona bening, sedangkan Bacillus sp. Menghasilkan sp. Menghasilkan hasil positif karena menghasilkan zona bening (lihat Gambar 2) hal itu menandakan bahwa protein dalam susu telah rusak sehinnga bakteri tidak dapat memproduksi enzim protease. Enzim katalase ini terdiri atas 4 gugusan heme. Ia ada pada tulang, ginjal, membran mukosa dan juga hati. Adapun aktifitas enzim katalase ini ditemukan di wilayah mitokondria, peroksosom dan juga sutoplasma (Volk dan Wheeler 1988)
Enzim katalase ini mempunyai 4 rantai polupeptida yang pada masing-masing rantainya tersusun atas kurang lebih 500 asam amino. Selain itu, enzim katalase ini juga mempunyai empat kelompok ehem yang terbentuk dari cincin protoporphyrin. Cincin ini mengandung atom besi yang tunggal. Adapun berat molekul tersebut sekitar 118.054,25 gram/mol. Katalase adalah enzim yang dapat menguraikan hidrogen peroksida yang tidak baik bagi tubuh makhluk hidup menjadi air dan oksigen yang sama sekali tidak berbahaya. Selain itu, enzim ini di dalam tubuh manusia juga menguraikan zat-zat oksidatif lainnya seperti fenol, asam format, maupun alkohol yang juga berbahaya bagi tubuh manusia. Katalase terdapat hampir di semua makhluk hidup. Bagi sel, enzim ini adalah bodyguard yang melindungi bagian dalam sel dari kondisi oksidatif yang bagi kebanyakan orgnisme ekuivalen dengan kerusakan. Selanjutnya dilakukan uji katalase menggunakan kaca objek dengan bakteri Ecolli dan colli dan bakteri Bacillus bakteri Bacillus.. Hasil uji terdapat pada Tabel Tabel 3. Tabel 3. Hasil Uji Katalase pada E.Coli pada E.Coli dan Bacillus dan Bacillus sp. Bakteri
Hasil Pengamatan (+/-)
E Coli Bacillus sp. + Ket + = Menghasilkan gelembung - = tidak menghasilkan gelembung
Gambar 3. Hasil Uji Katalase, E.Coli Katalase, E.Coli (Kiri) (Kiri) Bacillus Bacillus (Kanan) (Kanan) Produksi katalase bisa diidentifikas dengan menambahkan reagen H2O2 pada suspensi bakteri. Jika dihasilkan gelembung gas, berarti bakteri tersebut mampu memproduksi enzim katalase. Jika tidak dihasilkan gelembung gas berarti uji katalase dinyatakan negatif. Dimana reaksi yang terjadi untuk uji positif yaitu : (lihat Gambar 3)
Gambar 3. Hasil Uji Katalase, E.Coli Katalase, E.Coli (Kiri) (Kiri) Bacillus Bacillus (Kanan) (Kanan) (Schegel, 1994).
Dari uji katalase yang dilakukan untuk bakteri Bacillus diketahui bahwa bakteri ini dapat menghasilkan enzim katalase setelah penambahan H 2O2, yang ditandai dengan adanya gelembung gas. Namun pada bakteri E-colli diperoleh hasil yang yang berbeda dengan bakteri bakteri Bacillus. Pada bakteri E-colli tidak ditemui adanya gelembung gas saat ditambahkan H 2O2. Sehingga dapat disimpulkan bahwa bakteri E-colli tidak mampu memproduksi enzim katalase (Widyastuti 2005) Kesimpulan Pada Uji Amilolitik, bakteri yang menghasilkan enzim amylase ialah Bacillus sp ; pada Uji Proteolitik, bakteri yang menghasilkan enzim protease ialah Bacillus sp ; dan pada Uji Katalase, bakteri yang menghasilkan enzim katalase ialah Escherechia ialah Escherechia Coli. Coli. Daftar Pustaka
Buckle, K.A., dkk. 1985. Ilmu Pangan. Pangan. UI – UI – Press Press : Jakarta. Caesaria Solina. 2007. Aktivitas 2007. Aktivitas Antibakteri Campuran Bawang Putih Putih dan Rimpang Kunyit terhadap Salmonella typmurium. typmurium . Skripsi. Biokimia. Institut Pertanian Bogor. Durham, D.R., D.B. Stewart, and E.J. Stellwag. 1987. Novel alkaline and heat stable serine proteases from alkalaphilic Bacillus sp. sp. strain GX6638. J. Bacterial. 169(6):2762- 2768 Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi 1992. Mikrobiologi pangan I . Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Fardiaz, S. 1988. Fisiologi 1988. Fisiologi Fermentasi. Fermentasi. Lembaga Sumber Daya Informasi. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Ingnd. S. Surow.1984. Mempelajari aktifitas proteolitik dan aktifitas penggunaan dan getah pepaya muda pada susu . Laporan Akhir. Fakultas Teknlogi Pertanian. Institut Pertanian Bogor. Lehninger, Albert L. 1982. Dasar-dasar 1982. Dasar-dasar Biokimia. Biokimia. PT. Gelora Aksara Pratama, Jakarta. Pelczar, M. J., and E. C. S. Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Mikrobiologi. Terjemahan: Hadioetomo, R. S., dkk. Jakarta : Penerbit Univesitas Indonesia (UI-PRESS),
Rehm, H. J dan G. Reed. 1987. 1987 . Biotechnology. Biotechnology. Vol 8: enzyme Technology. Technology. VCH Verlags gessell schaff, mbH, Weinhaim. Schegel, H., 1994. Mikrobiologi Mikrobiologi Umum. Umum. Yogyakarta Yogyakarta : UGM-Press. Volk, W. A., and Wheeler, M. F. 1988. Mikrobiologi 1988. Mikrobiologi Dasar . Terjemahan Soenartono Adisoemarto. Penerbit Erlangga, Jakarta. Widyastuti, A. T. 2005. Isolasi 2005. Isolasi dan Uji Kemampuan selulitik baketri Simbian rayap pendegradasi Serat . Skripsi. Jurusan nurisi dan makanan ternak. Fakultas Peternakan. Bogor. Instiut Pertanian Bogor. Winarno, FG., dkk. 1992 . Kimia Pangan dan Gizi. Gizi . PT. Gramedia, Jakarta.
