15
LAB. N°3: DETERMINACIÓN DE LA CALIDAD DEL AGUA POR SU CONTENIDO BACTERIA B ACTERIAL L 1. OBJETIVO IVO(s) a) GENERAL: i) Determinar la cantidad de colonias de bacterias de una muestra de agua, utilizando como medio de cultivo agar nutritivo fundido estéril. b) ESPE ESPEC C!I !ICO COS: S: i) Determinar la cantidad de colonias de bacterias obtenidas de las muestras de: baño FIA, estanque de Arquitectura y lavadero del comedor del Teatro. ara cada muestra se analizar! tres "#$% cantidades distintas: (1) &uestra de agua de 'ml (") &uestra de agua "diluida en agua de disoluci(n estéril% de #.' ml "'# ) ' ml% (3) &uestra de agua "diluida en agua de disoluci(n estéril% de #.#' ml"'# ) * ml% ii) +alcular las nidades Formadoras de colonia -or mililitro "F+'ml% de cada muestra.
". !UND !UNDAM AMEN ENT TO TEÓR TEÓRIC ICO O ".1.
CALIDAD DEL AGUA /s un factor que incide directamente en la salud de los ecosistemas y el bienestar 0umano: de ella de-ende la biodiversidad, la calidad de los alimentos, las actividades econ(micas, etc. or tanto, la calidad del agua es también un factor influyente en la determinaci(n de la -obreza o riqueza de un -a1s. 2e refi refier ere e a las las cara caract cter er1s 1stitica cass qu1m qu1mic icas as,, f1si f1sica cas, s, biol biol(g (gic icas as y radiol(gicas del agua. /s una medida de la condici(n del agua en relaci(n con los requisitos de una o m!s es-ecies bi(ticas o a cualquier necesidad 0umana o -ro-(sito. 2e utiliza con mayor frecuencia -or referencia a un con3unto de normas contra los cuales -uede evaluarse el cum-limiento. 4os est!ndares m!s comunes utilizados -ara evaluar la cali calida dad d del del agua agua se rela relaci cion onan an con con la salu salud d de los los ecos ecosis iste tema mas, s, seguridad de contacto 0umano y agua -otable.
15
".".
INDICADORES DE CONTAMINACIÓN DEL AGUA
".".1. I#$i%a$&'s *si%&+,-*i%&s: +S/0i$&s &a0s "residuo de eva-oraci(n%: com-rende la materia "org!nica e inorg!nica% disuelta, coloidal y en sus-ensi(n5 el residuo seco del agua -otable debe ser igual o inferior a '6## mglitro. +C&0&': el agua -otable debe ser incolora5 las aguas residuales domésticas tienen un color entre gris y negro5 las aguas residuales industriales -ueden tener colores muy variados. +O0&' : el agua -otable debe ser inodora "la desinfecci(n con derivados del cloro confiere cierto olor caracter1stico%5 las aguas residuales domésticas tienen un olor desagradable5 las aguas residuales industriales -ueden tener olores desagradables5 el sabor del agua est! relacionado con su olor. +T2'a-'a: influye en el desarrollo de la vida acu!tica, el o71geno disuelto y la velocidad de las reacciones qu1micas y bioqu1micas. +T-'bi$: de-ende de la cantidad de s(lidos en sus-ensi(n5 es mayor cuanto mayor es la contaminaci(n del agua. +24: mide la concentraci(n de 0idrogeniones5 -8 del agua -otable entre 9,6),65 un -8 elevado "su-erior a ;% indica ba3a +C&#$-%i5i$a$: var1a con la tem-eratura y de-ende de la concentraci(n de sustancias disueltas5 las sales minerales aumentan la conductividad y la materia org!nica la disminuye5 se mide en microsiemens -or cm "<## -ara el agua -otable%. ".".". I#$i%a$&'s $ 0a %&#ai#a%i/# &'67#i%a: +Ca'b&#& &'67#i%& &a0 "+=T%: mide la cantidad de com-uestos org!nicos, naturales o sintéticos5 e7-resa en mglitro la cantidad de di(7ido de carbono -roducido en la combusti(n de una muestra a >6# ?+. +Da#$a bi&,-*i%a $ &8*6#& (DBO%: mide la cantidad de materia org!nica biodegradable5 se determina midiendo la cantidad de o71geno consumido -or los microorganismos cuando utilizan la materia org!nica como fuente de energ1a -ara su metabolismo5 los ensayos se realizan durante 6 d1as a una tem-eratura constante de *# ?+ y el resultado se e7-resa en mglitro5 la D@= del agua -otable no debe e7ceder los * mglitro5 se trata de un método biol(gico cuyos resultados -ueden alterarse -or la -resencia de sustancias reductoras "sulfuros, sulfitos, 0ierro ferroso, etc.% y de t(7icos -ara la flora microbiana. +Da#$a ,-*i%a $ &8*6#& (D9O): indica la cantidad de contaminantes que -ueden o7idarse mediante un o7idante qu1mico "dicromato -ot!sico, etc.%5 estos contaminantes -ueden ser materia org!nica e inorg!nica5 se e7-resa en mg de o71geno -or litro. +Ni'/6#& &a0 (NT): mide el nitr(geno de los com-uestos org!nicos nitrogenados naturales "-roteinas, -é-tidos, amino!cidos% y sintéticos
15
"o7inas, 0idracina, etc.% y el nitr(geno de nitratos y nitritos5 se e7-resa en mglitro. )=tros indicadores: nitr(geno amoniacal, nitratos y nitritos "en mglitro.% ".".3. I#$i%a$&'s i%'&bi&0/6i%&s: +C&0i&'s: bacterias aer(bicas y anaer(bicas facultativas gram) negativas, no es-oruladas, con forma de bacilo, que fermentan la lactosa formando !cido y gas a las < 0 de ser cultivadas en caldo lactosado a $6 ?+5 en este gru-o se encuentran bacterias no entéricas y entéricas "-rinci-almente /sc0eric0ia coli%5 los coliformes sirven como indicadores de contaminaci(n fecal y del nivel de saneamiento de las aguas "un agua -otable tendr! # -ara el >6 de las muestras analizadas%. +Es'2&%&%&s %a0s: con3unto de estre-tococos que -oseen el ant1geno D de 4ancefield "2tre-tococcus faecalis, 2. durans, 2. bovis, etc.% conocidos también como enterococos al formar -arte de la flora intestinal5 son indicadores de la contaminaci(n fecal "# -or '## en el agua -otable%. +O'as $'i#a%i&#s: es-oras de +lostridium sulfito)reductores, -resencia de +lostridium -erfringens, bacteri(fagos fecales, microorganismos -at(genos "cuando se -roducen brotes de enfermedades de transmisi(n 01drica%5 la -resencia de bacterias del gen. 4e-tos-ira "-at(genas -ara el 0ombre y los animales% indica contaminaci(n -or deyecciones animales. ".".. O'&s i#$i%a$&'s: )/lementos no deseables yo t(7icos: Al, As, @, +u, Fe, &n, Ti, Bn, 2b, Ag, @a, +r, 2n, F, 8g, Ci, b, 2e, etc. )&icrocontaminantes org!nicos: 0idrocarburos clorados, 0idrocarburos arom!ticos -olic1clicos, aceites y grasas "-ueden ser mayoritarios%, merca-tanos, -esticidas, detergentes, cianuros, fenoles, etc. ".3.
PRINCIPALES CONTAMINANTES MICROBIOLÓGICOS
4as enfermedades infecciosas se transmiten -rinci-almente a través de las e7cretas de seres 0umanos y animales, en -articular de las 0eces. As1 si el agua usada -ara beber y -re-arar los alimentos est! contaminada, -uede -roducir enfermedades infecciosas. Al res-ecto la =&2, en sus gu1as -ara la calidad de agua -otable, señala que el riesgo m!s comn y difundido que lleva consigo el agua -otable son las enfermedades infecciosas causadas -or bacterias, virus, -rotozoarios y 0elmintos. "a% 4A2 @A+T/EIA2: "i% 2A4&=C/44A: género de bacterias que -ertenece a la familia /nterobacteriaceae, formado -or bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, con flagelos -er1tricos y que no desarrollan c!-sula "e7ce-to la es-ecie 2. ty-0i ni es-oras. 2on
15
bacterias m(viles que -roducen !cido sulf01drico "8*2%. /m-lean glucosa -or -oseer una enzima es-ecializada, -ero no lactosa, y no -roducen ureasa ni tienen metabolismo fermentativo. 2e -resenta en al agua cruda, -ero solo ocasionalmente se le 0aya en aguas tratadas, ya que la cloraci(n es altamente efectiva -ara controlar esta bacteria. 21ntomas t1-icos: astroenteritis aguda con diarrea, dolores abdominales, fiebres, n!useas v(mitos y dolor de cabeza. "ii% 28I/44A: es un género de bacterias con forma de bacilo ram negativas, inm(viles, no formadoras de es-oras e inca-aces de fermentar la lactosa, que -ueden ocasionar diarrea en los seres 0umanos. Tiene ba3a resistencia al cloro, -or lo que la cloraci(n acaba con el -eligro de ser afectado -or esta bacteria. "iii% /2+8/EI+8IA +=4I: 2e trata de una enterobacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, y -or ende en las aguas negras, -ero se lo -uede encontrar en todos lados, dado que es un organismo ubicuo. +ausa gastroenteritis en seres 0umanos y animales. Diarreas, Causeas y des0idrataci(n "iv% GI@EI& +8=4/EA/: /s una bacteria ram negativa con forma de bast(n "un bacilo% curvo que -rovoca el c(lera en 0umanos. "v% +A&H4=@A+T/E: 4as es-ecies de este género son bacilos gram negativo con forma de coma y m(viles -or la -resencia de uno o dos flagelos -olares. 21ntoma m!s notorio es la diarrea. "b% @A+T/EIA2 +=4IF=E&/2: 4a denominaci(n genérica coliformes designa a un gru-o de es-ecies bacterianas que tienen ciertas caracter1sticas bioqu1micas en comn e im-ortancia relevante como indicadores de contaminaci(n del agua y los alimentos. +oliforme significa con forma de coli, refiriéndose a la bacteria -rinci-al del gru-o, la /sc0eric0ia coli, descubierta -or el bacteri(logo alem!n T0eodor von /sc0eric0 en '9#. Gon /sc0eric0 la bautiz( como bacterium coli "bacteria del intestino, intestino%. +on -osterioridad, la microbiolog1a sistem!tica nombrar1a el género /sc0eric0ia en 0onor a su descubridor. +=&= ICDI+AD=E/2: Tradicionalmente se los 0a considerado como indicadores de contaminaci(n fecal en el control de calidad del agua destinada al consumo 0umano en raz(n de que, en los medios acu!ticos, los coliformes son m!s resistentes que las bacterias -at(genas intestinales y -orque su origen es -rinci-almente fecal. or tanto, su ausencia indica que el agua es bacteriol(gicamente segura. Asimismo, su nmero en el agua es directamente e inversamente -ro-orcional al grado de contaminaci(n fecal5 mientras m!s
15
coliformes se aislan del agua, mayor es la gravedad de la descarga de 0eces. +aracteres bioqu1micos: /l gru-o contem-la a todas las bacterias entéricas que se caracterizan -or tener las siguientes -ro-iedades bioqu1micas: • • •
ser aerobias o anaerobias facultativas5 ser bacilos ram negativos5 no ser es-or(genas5
/l gru-o de los coliformes incluye bacterias en forma de bacilo, gram negativos, con las siguientes -ro-iedades bioqu1micas: o7idasa negativo y ca-acidad de fermentar lactosa, con -roducci(n de gas en < 0oras a una tem-eratura de $; J+. /l gru-o coliforme est! formado -or los siguientes géneros: • • • •
/sc0eric0ia Klebsiella /nterobacter +itrobacter
1 Vibrio Cholerae 2 E. Coli
".. CONTEO BACTERIANO
4 Shiguella
3 Salmonella
a. C&#& # 20a%a PETRI: &étodo m!s usado -ara contar bacterias. n caldo de cultivo con microorganismos es diluido y -osteriormente muestras del mismo son distribuidas en la ca3a de etri contenedora de agar. /s de su-onerse que cada célula se dividir! en sus mlti-les alrededores -ara -roducir colonias se-aradas en el agar. +ada célula es llamada unidad formadora de colonias "F+%. Des-ués de la incubaci(n, el nmero de colonias se refle3ar! en el nmero de células F+ originalmente -resentes. /s im-ortante considerar un nmero limitado de colonias -ues de no ser as1, éstas -ueden sobre-oblarse y dificultar el conteo de las mismas "rango sugerido de *6)*6# colonias%. /l conteo se facilita utilizando un contador de colonias. /ste método es deseable -orque arro3a el total de células viables "s(lo células vivas%5 en contraste con el conteo microsc(-ico y el conteo de -eso seco. na desventa3a radica en el tiem-o que requiere -ara
15
-roducir las colonias, ya que se necesitan como m1nimo veinticuatro 0oras o m!s. or otra -arte, no es cien -or ciento fiable -orque generalmente las colonias crecen unidas en cadenas o en gru-os. =L=: Cosotros usaremos como rango sugerido $#)$## F+ a.1 U#i$a$s !&'a$&'as $ C&0&#ias: nidades Formadoras de +olonias es un valor que indica el grado de contaminaci(n microbiol(gica de un ambiente. /7-resa el nmero relativo de microorganismos de un ta7(n determinado en un volumen de un metro cbico de agua. F+ es el nmero m1nimo de células se-arables sobre la su-erficie, o dentro, de un medio de agar semi)s(lido que da lugar al desarrollo de una colonia visible del orden de decenas de millones de células descendientes. 4as F+ -ueden ser -ares "di-lococos%, cadena "estre-tococos% o racimos "estafilococos%, as1 como células individuales nidad formadora de colonias. na diluci(n 0ec0a con bacteria y agua -e-tonada se coloca en el -lato de agar "+uenta de -lato agar -ara muestras alimenticias o Agar try-ticase de so3a -ara muestras cl1nicas% y e7-andida en el -lato siguiendo este -atr(n. 2/ &ID/ :
UFC/ml
3. MATERIALES
Tres frascos de dilución y dos
Tres frascos estériles y Pipetas (06)
REJ!!"# Tres mec$eros %unsen
; =TE=2 &AT/EIA4/2: )AA D/2TI4ADA
)/EA
)AT=+4AG/
)GA2= D/ E/+IITAD=: *## ml y <## ml
15
)8=EC=
)4A+A2 /TEI "#9% /2TMEI4/2
)ACT/2 D/ A2@/2T=
)T/E&N&/TE=
)FN2F=E=2
,"'"#T!!"#
""R 'TRT*& (en
,"'"#T"
PEPT&'"
15
.
PROCEDIMIENTO 1) PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO 1.1) 2e desea -re-arar una muestra de '$6 ml de agar nutritivo, -ara luego ser distribuidos en nueve "#>% tubos de -rueba. Tres "#$% tubos de agar nutritivo -ara cada gru-o. 2e sabe que: +oncentraci(n del agar: *$g4
T%&# .E PRE%" (0/) ,&,'!!" E!-,TR," or regla de tres sim-le: *$g ))))))))) ' 4 O)))))))))) '$6 ml OP$.'#6 g es la masa de agar que se debe -esar -ara -re-arar '$6 ml.
5 PASO
1.")
2e mezcla los $.'#6 gramos de agar con '$6 ml de agua destilada en un vaso de -reci-itado de *## ml, remover 0asta que la soluci(n sea 0omogénea.
1.3)
2e calienta la soluci(n de agar nutritivo en la cocinilla eléctrica 0asta alcanzar los # J+ "medido con term(metro%
1.2
6 PASO
1.)
1.3
2e -rocede a vaciar el contenido la soluci(n de agar nutritivo -re-arado en los nueve tubos de -rueba, distribuyéndose as1 '6 ml a cada tubo.
15
Eecordar que des-ués de vaciar el agar en los tubos se debe colocar algod(n en la boquilla de cada tubo con el ob3eto de evitar su e7-osici(n al medio. 1.<)
4uego los tubos son colocados en una canastilla -ara ser llevados al autoclave a-ro7imadamente ' 0.
7 PASO 8 PASO
1.5
1.4
") PREPARACIÓN EST=RIL(a6-a $si0a$a > 22&#a)
DEL
AGUA
DE
DISOLUCIÓN
".1)
2e desea -re-arar *>; ml de agua de disoluci(n ">> ml -ara cada gru-o%. /l agua de disoluci(n ser! utilizada -ara lograr obtener muestras de agua de '# )' ml y '#)* ml.
".")
2e sabe que : +oncentraci(n de e-tona es ' g4 'g)))))) '4 O ))))))) *>; ml )Q OP #.*>; gramos deben ser -esados en la balanza electr(nica.
".3)
8ec0o esto -rocedemos a disolver los #.*>; gramos de -e-tona en *>; ml de agua destilada, agitamos la soluci(n 0asta notar que sea 0omogénea.
".)
4uego vaciamos el agua de disoluci(n en tres "#$% frascos >> ml cada uno.
15
9 Agua
de disolución ( ml!. "#$PO 1
3) TOMA DE MUESTRAS DE AGUA 3.1) LUGARES: Pa'a 0a 8'a%%i/# $ 0a -s'a: (a) tilizamos un frasco estéril "vac1o% -ara la e7tracci(n de la muestra de agua. (b) Abrir el grifo o caño del cual se va realizar la toma, medimos la tem-eratura del agua, es-eramos unos cinco minutos y anotamos la marca del term(metro (%) 4uego abrimos el frasco y r!-idamente lo colocamos en el grifo 0asta que la cantidad de la muestra de agua llegue a la mitad a-ro7imadamente, cerramos 0erméticamente. Anotamos la fec0a y 0ora de la toma.
15
10 %ues&ra
de agua 'AO )*A (gru+o 1!
) CULTIVO DE LA MUESTRA DE AGUA i. ii.
rimero retiramos los tubos de -rueba que contienen el agar nutritivo, es-eramos unos minutos a que se enfr1en "sin de3ar que se solidifique%. Gaciamos el contenido de cada tubo "nueve tubos% a las res-ectivas -lacas -etri estériles "nueve -lacas%.
11 Paso
iii.
i. , ii.
Teniendo listo las -lacas -etri con el agar nutritivo. Eealizamos lo que muestra el siguiente esquema: "ara cada gru-o% *aciamos 1 ml etrado en el a2ua de disolución
Etraemos 1 ml y 031 ml de muestra con una
12 %ues&ra de agua 13 Agua
de disolución (ml!
P!","# PETR con a2ar nutriti+o 4'..&
1
101
10
15
iv. 5.
+uando se tienen listas las -lacas, moverlas circularmente -ara que e7ista una distribuci(n uniforme de la mezcla na vez lista las nueve -lacas con muestra de agua "$ -or cada gru-o%, las colocamos en forma invertida en la incubadora durante < 0oras a-ro7. H es-eramos los resultados.
<. RESULTADOS
-abla 1 Cuadro resumen de la e&racción de la mues&ra de agua.
GRUP O MUESTRA 1 %"7& 4"
E#T"';E .E 3 "R;TE,TR" 5 !"*".ER& .E P!"T&# .E! TE"TR&
PLACAS
PLACAS GRUPO 3
FECH A HORA T (°C) 1680/80 19 1680/80 19 1680/80 19
11:00 a3m3 11: a3m3 1:00 a3m3
1/ 1 1<35
GRUPO 1
15
PLACAS GRUPO
<
-abla 2 Cuadro de los resul&ados de $)C /ml , obser0aciones
GRU PO
MUESTRA
DILUCIÓN
1 ml <=
10 1 ml 11<
10 ml (>)
UFC/ ml
1
%"7& 4"
<=
2
!"*".ER& .E P!"T&# .E! TE"TR&
96
11
1A
96
3
E#T"';E .E "R;TE,TR"
<
9
5
90
OBSERVACIÓN
Tama?o: 031mm@@Amm Tiempo de incuBación: C9 $rs (5 $rs) ,olor: crema Tama?o:035mm@@Am m Tiempo de incuBación:5 $rs min ,olor: crema Tama?o: C035mm Tiempo de incuBación: 5A $rs ,olor: amarillo
?. OBSERVACIONES
/n la -laca del gru-o ' "'# )* ml% se observa una distribuci(n anormal de las colonias de bacterias, lo cual no debe ocurrir ya que es la -laca de menor concentraci(n. /sto se debe a que el frasco de diluci(n no era estéril. 2e observa que el tiem-o de incubaci(n es -romedio 6* 0oras en los tres gru-os, esto sugiere que e7ista en algunas -lacas una mala distribuci(n de las colonias, ya que el tiem-o normal de incubaci(n es *< 0oras en el que las bacterias forman '## generaciones.
@. CONCLUSIONES
15
4as muestras arro3an resultados que se encuentran dentro del rango sugerido -ara el conteo de colonias de bacterias "$#)$##%, -or tanto se -uede decir que: o +antidad de unidades formadoras de colonias -or mililitro: @AR= FIA )Q *; F+ml 4AGAD/E= D/ 4AT=2 )Q<9 F+ml /2TACS/ D/ AESIT/+TEA)Q <*# F+ml A medida que la concentraci(n disminuya las colonias de bacterias disminuyen en cantidad y est!n distribuidas con mayores es-acios entre ellas. /sto no se evidencia en los resultados del gru-o 6 ya que en la -laca de '#)'ml 0ay m!s colonias de bacteria "<*% que la -laca de ' ml "%. G/E TA@4A.* /ste método de determinaci(n de la cantidad de colonias de bacterias en una muestra de agua resulta ser estad1stico, -or lo que es necesario realizarlo re-etidas veces -ara as1 encontrar un resultado m!s fiable, en nuestro caso con los resultados obtenidos no -odemos afirmar con e7actitud la calidad del agua, -ero si fuese as1 com-arar1amos con los 4&s del AC/O= I. 8aciendo esto las tres muestras se encuentran dentro del rango 6## F+ml "bacterias 0eterotr(ficas%.
. RECOMENDACIONES
Eealizar cuidadosamente la e7tracci(n de la muestra de agua, cerrarlo 0erméticamente -ara evitar la intrusi(n de otros microorganismos. Al momento de -asar el agar nutritivo a las -lacas no olvidar foguear la boquilla de los tubos de -rueba -ara as1 mantenerlo estéril. or -recauci(n usar los guantes de asbesto al usar el autoclave y el 0orno y la cocinilla eléctrica. Co olvidar lavar con desinfectante los materiales.
. ANEOS
15
15
1. BIBLIOGRA!A •
http://www.upct.es/~minaeees/analisis_microbiologico_aguas.pdf
15
•
• •
•
• •
http://cdam.minam.gob.pe:8080/bitstream/12345!8"/10"/3/#$%&0000012 '3.pdf (a calidad del agua potable en el *er+, -%--/ pg. 43'4" eglamento de la calidad del agua para consumo humano / &-% D $ireccin eneral de -alud %mbiental/ (ima *er+/ 2011/ %67 , pg. 38. http://www.psa.es/webesp/pro9ects/solarsafewater/documents/libro/02_#api tulo_02.pdf http://www.ecured.cu/inde.php/#alidad_del_%gua http://es.wi;ipedia.org/wi;i/3n_de_colonias_?nidad@
