BIOQUÍMICA METABÓLICA MOMENTO PRÁCTICO
ELABORADO POR: GLADIS ELENA JARAMILLO CORREA. C.C.43714242 ALBA ESTELLA SANCHEZ ARISMENDI C.C. 43482132 SANTIAGO CALLE C.C.97101213629 VIVIANA CLAVIJO
GRUPO: 352001_49 TUTORA: HERNAN ALONSO RUIZ
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA ESCUELA DE CIENCIAS AGRÍCOLAS, PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE. MEDELLIN 2015
INFORME PRÁCTICA BIOQUÍMICA METABÓLICA OBJETIVO DE LA PRÁCTICA Reconocer y cuantificar Biomoléculas presentes en el metabolismo de plantas y animales
JUSTIFICACIÓN DE LA PRÁCTICA Bioquímica Metabólica es la ciencia que estudia todo lo relacionado con la estructura y actividad de las diversas biomoléculas, en sus respectivas vías metabólicas, que forman parte de la dinámica d inámica celular de organismos o rganismos animales y vegetales, presentes en todo tipo de agro ecosistemas; por ende, permite comprender la estructura y cinética de los compuestos que intervienen en las diversas reacciones bioquímicas metabólicas aeróbicas y anaeróbicas. Así mismo, teniendo en cuenta que es una ciencia teórico experimental que posee conceptos, leyes, principios y teorías científicas, se constituye en un pilar fundamental para la interpretación significativa de las múltiples reacciones biomoleculares que gobiernan los diferentes procesos exergónicos y endergónicos, enfocados a mantener las funciones vitales de sistemas autótrofos y heterótrofos, los cuales interaccionan permanentemente con el fin de garantizar la bioactividad de nuestro planeta. En consecuencia, la intencionalidad del curso se centra en el estudio de la bioquímica estructural, biotermodinámica, actividad molecular y bioquímica metabólica aplicada, importantes en lo bioactividad de los sistemas biológicos, de tal forma que puedan ser interrrelacionados e incorporados por los estudiantes en su dimensión cognitiva, para lograr un verdadero aprendizaje significativo autónomo de la bioquímica metabólica.
PRACTICA
I. ACTIVIDAD UREÁSICA EN MUESTRAS DE ORIGEN
BIOLÓGICO No se realizó esta práctica por falta de reactivos.
PRÁCTICA II. CARBONO ORGANICO, MATERIA ORGÁNICA Y CAPACIDAD AMORTIGUADORA () DE SUELOS Introducción La capacidad amortiguadora, se refiere al potencial químico que tienen los sistemas edáficos para regular y controlar su pH, cuando son sometidos a procesos de acidificación ó alcalinización; dicha regulación se da por la presencia de sistemas amortiguadores biológicos, existentes en la materia orgánica e inorgánica del suelo.
Objetivos
Cuantificar la capacidad amortiguadora de muestras de suelos mediante técnicas potenciométricas en presencia de los indicadores adecuados.
NOTA: La práctica tenía como objetivos realizar un balance de materia orgánica en muestras de suelo, a partir de la determinación del carbono orgánico por método de titulación volumétrica y técnica espectrofotométrica, además cuantificar la capacidad amortiguadora de muestras de suelo mediante técnicas potenciométricas y de titulación volumétrica pero por falta de algunos reactivos requeridos solo se pudo realizar la cuantificación de la capacidad amortiguadora de muestras de suelos mediante técnicas potenciométricas.
Materiales Erlenmeyer de 125mL , pipetas graduadas de 10mL, espátula metálica , agitador de vidrio, probeta graduada de 100mL , beaker de 250mL, Potenciómetro, balanza analítica, celdas, embudos, papel filtro, muestras de suelo.
Reactivos NaOH 0,6N, agua destilada y solución buffer fosfato
Procedimiento Capacidad amortiguadora (), Método Potenciométrico
Alistar 4 beakers ó erlenmeyers y rotularlos del 1 al 4
Al primer frasco y segundo frasco, adicionar +/- 20 gramos ( Wm ) de suelo y 40 mL de agua destilada , agitar con varilla de vidrio ó en agitador magnético por 5min, introducir el electrodo del potenciómetro, esperar 60 segundos y observar el pH, registrar como pH1 .
Posteriormente , agregar 5 mL de NaOH 0,1N , agitar de nuevo por un minuto y volver a medir el pH2
En el tercer y cuarto beakers, adicionar 5mL de agua destilada y 5 mL de solución buffer pH 7,0, respectivamente, introducir el electrodo del potenciómetro esperar 60 segundos y observar el pH, registrar como pH1 . (en la guía referían 20 mL, se hizo con 5 mL ya que no había suficiente solución buffer para todas las pruebas)
Posteriormente , agregar 5 mL de NaOH 0,1N , agitar de nuevo por un minuto y volver a medir el pH2
Registrar todos los valores en la tabla de datos correspondiente.
MUESTRA DE SUELO 1 Suelo tomado de la vereda Betania, El Carmen de Viboral, Antioquia. Altura sobre el nivel del mar 2150m. Suelo perteneciente a una huerta casera al que se le ha aplicado Roca fosfórica, Micorrizas y compost de origen vegetal.
MUESTRA DE SUELO 2 Suelo tomado del corregimiento de San José, San Roque, Antioquia. Altura sobre el nivel del mar 870m. Suelo perteneciente a un potrero, actualmente tiene ganado en pastoreo y no ha recibido fertilización.
RESULTADOS TABLA
1.
DATOS
POTENCIOMETRICOS
AMORTIGUADORA DE SUELOS
PARA
CAPACIDAD
MUESTRAS
PESO (Wm)
VOLUMEN
pH1
pH2
(mL) Suelo 1
20
40mL
7,66
10,53
Suelo 2
20
40mL
4,9
11,4
5 mL c/u
10 mL
10,7
12,5
Agua destilada +
Solución
Buffer
Cálculos Capacidad amortiguadora Método Potenciométrico Capacidad Amortiguadora β con respecto a NaOH, para muestras de suelos =
0,6 40 (2 − 1)
. =
∗ 1000
5 ∗ 0,6 ∗ 40 (10,53 − 7,66) ∗ 20
1. =
120 57,4
∗ 1000
∗ 1000
1. = 2090 . =
5 ∗ 0,6 ∗ 40 ∗ 1000 (11,4 − 4,9) ∗ 20
2. =
120 130
∗ 1000
2. = 923,076
Capacidad amortiguadora () Con respecto a NaOH, para muestras de agua y solución buffer. =
0,6 20
=
(2 − 1) 10 5 0,6 10 (12,5 − 10,7) 10 =
30 18
x 1000
x 1000
x 1000
= 18000
REGISTRO FOTOGRÁFICO
Pesaje de muestra de suelo
Potenciometro
Reactivo utilizado NaOH0,6 N
Toma de pH.
III. DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS NO ESTRUCTURALES (CNE), EN FORRAJES, POR EL MÉTODO DE FENOL-ÁCIDO SULFÚRICO: Introducción Los carbohidratos no estructurales están formados por el almidón y azúcares solubles. Son degradados por la flora amilo lítico y dan AGV con predominio del propiónico, que es utilizado como precursor de la glucosa. Los CNE son una fuente de energía rápida para La catalasa como biocatalizador de origen proteico, es una enzima óxido-redactase que participa en la degradación del peróxido de hidrógeno (H2O), hasta Oxígeno molecular (O2) y agua (H2O).
Objetivo: Determina la cantidad de carbohidratos totales No estructurales, basándose en su contenido de almidones hidrolizables y azúcares solubles.
PROCEDIMIENTO Materiales y reactivos - vaso de precipitados - Beaker - espectrofotómetro - tubos de plástico - baño termostático - micro pipetas y puntas - 0.9% NaCl - pipetas de vidrio y pipeteado manual - 0.2% HClO4 - tubos de espectrofotómetro
- solución de glucosa estándar 0.2mM
1.1 Extracción:
Pesar +/- 2.0g de muestra en balanza analítica y registrar como: (Wm), depositarla luego en un vaso de precipitado y agregar 50 ml de solución de HCl 0,6N. Agitar constantemente con la varilla de vidrio durante 3 minutos.
Llevar el beaker con la solución al baño termostatado y calentar a 90°C, durante 20 min.
Dejar enfriar por 5 min y filtrar sobre papel filtro. Medir el volumen del
filtrado(Vf) y pasar 5mL a un tubo de ensayo, adicionar a éste 5mL de NaOH 0,6N, agitar por 15 segundos, tapar y rotular así: FFCNE: Filtrado de forraje para carbohidratos no estructurales.
Este experimento se realizó con forraje, pasto y concentrado.
MATARRATON El Matarratón (Gliricidia sepium) es una especie con alto potencial de producción de biomasa para el consumo y elevado valor nutritivo que se presenta como una alternativa práctica y económica para incrementar la productividad animal y contribuir, de esta manera, a disminuir los costos de producción. Esta fue traída del Municipio SAN ROQUE Corregimiento san José del Nuz Altura sobre nivel del Mar 870 Extraído de un cerco vivo sin abonar reproducido por regeneración natural de suelos.
Observación de las reacciones Cuando se agregó 50 ml de solución de HCl 0,6N al contenido de matarraton macerado se observó un cambio inmediato del color material vegetal la cual cambio de verde a café y parecía que se empezaba a desintegrar la partículas, cuando se llevo a una temperatura de 90° rápidamente empezó a hacer burbujas como si estuviese cocinando el material y empezó a oscurecer la solución.
PASTO BRACHARIA Se trata de un cultivo adaptado a condiciones tropicales calientes y húmedas, donde las precipitaciones pluviales sobrepasan los 1,000 mm. Se adapta bien a suelos ácidos e inférlites, sin embargo, posee gran potencial de respuesta con mejoras del nivel de fertilidad del suelo. Tiene la capacidad de formar pastizales que toleran el pisoteo y pasteo intenso y continuo. Procedencia: Corpoica A.S.N.M: 870 Cultivado para pastoreo con planes de fertilización que incluye aplicación de enmiendas y aplicación de urea.
Observación de las reacciones Al agregar los 50 ml de solución de HCl 0,6N al contenido de pasto brachiaria macerado se observa un cambio leve en el color de la solución conservando tratándose de conservar su estado natural al introducirse al baño María a una temperatura de 90° se observa que pasado 4 minutos empieza hervir el contenido haciendo burbujas y nos e noto un cambio notorio en el color de la solución.
CUIDO PARA PRODUCCIÓN DE LECHE
Después de agregar los 50 ml de solución de HCl 0,6N al contenido de concentrado se observo un cambio de color inmediato, se subieron las partículas y luego se precipitaron al introducirse al baño María a una temperatura de 90° a los dos minutos se observo que las partículas estaban precipitadas y empezaron a subir a la superficie, se empezó a tornase más oscura la solución, partículas de cuido se observan en continuo movimiento, suben y bajan , pasado los veinte minutos esta solución tiene un olor dulce lo cual se hace que sea un producto más atractivo a las papilas gustativas de los animales.
1.2 Cuantificación: 1.2.1. Mezcla Reactiva
Alistar 3 tubos de ensayo, rotularlos así: B=blanco; St=Estándar; m =muestra y adicionarles cuidadosamente, los siguientes reactivos en el orden indicado:
Tubos de ensayo Reactivos (ml)
B
St
m
Agua destilada
2,0
0,0
0,0
Glucosa 1%
0,0
2,0
0,0
FFCNE
0,0
0,0
2,0
Fenol 5%
1,0
1,0
1,0
H2SO4
5,0
5,0
5,0
2,0
2,0
2,0
Concentrado H2O destilada
Agitar cuidadosamente 20 seg, incubar a 90°C, por 10min, sacar los tubos, agitar nuevamente 10 seg y dejarlos enfriar completamente
Lectura espectrofotométrica
Alistar el espectrofotómetro a una , calibrar el aparato con el tubo blanco, ajustando a 100% de Transmitancia (%T) y 0,000 de Absorbancia (A)
Leer la Absorbancia (A) de los tubos st y m; registrar en su tabla de datos En caso de que no se pueda determinar directamente la absorbancia, debido al modelo de espectrofotómetro utilizado, entonces, Leer el % de Transmitancia (%T),de los tubos st y m, convertir estos valores a Absorbancia (A), mediante la ecuación : A =2- Log%T , trabajar con 3 cifras decimales, ejemplo:0,023**
Tabla de datos Completar la siguiente tabla: Matarraton Tabla 6.Datos para la cuantificación de CNE INDICADORES DESCRIPCIÓN
VALOR
Wm
Peso de la muestra
2 gramos
Vf
Volumen del filtrado
27.5 ml
Ast
Absorbencia del estándar
0,022 A
Am
Absorbancia del tubo que contenía el 0,191 FFCNE
Tabla Datos para la cuantificación de CNE Bracharia INDICADORES DESCRIPCIÓN
VALOR
Wm
Peso de la muestra
2 gramos
Vf
Volumen del filtrado
24 ml
Ast
Absorbencia del estándar
0,042 A
Am
Absorbancia del tubo que contenía el 0,126 FFCNE
Tabla Datos para la cuantificación de CNE Concentrado Producción Leche INDICADORES DESCRIPCIÓN
VALOR
Wm
Peso de la muestra
2 gramos
Vf
Volumen del filtrado
27.5
Ast
Absorbencia del estándar
0,494 A
Am
Absorbancia del tubo que contenía el 1,637 FFCNE
REGISTRO FOTOGRAFICO
Matarraton
Pasto
Concentrado
Las tres muestras
Muestras calentar a 90°C, durante 20 min.
Imagen 1. Pesa de las muestras
Imagen 2. Muestra con solución fría de buffer fosfato
Imagen 3. Filtrado de las muestras
Imagen 4. Filtrado de las muestras
Imagen 5. Muestras con volumen final, rotuladas.
3. CALCULOS %CNE =
AM Ast
× 0,01 x Fd
=
5 2
×
25
×
100
Mues1 Matarraton
5
=
2
25
×
27.5
×
100 2
= 2.5 × 0.90 × 50 = 112,5 = 112,5
% =
% =
AM Ast
0,191 0,022
× 0,01 x Fd
× 0,01 x 112,5
% = 8,681 × 1,125
% = 9,766
Muestra 2 pasto Brachiaria
=
5 2
×
25 24
×
100 2
= 2.5 × 1.041 × 50 = 130.125 = 130,125
% =
% =
AM Ast
0,126 0,042
× 0,01 x Fd
× 0,01 x 130,125
% = 3 × 1,30 % = 3,9
Muestra 3 concentrado producción de leche
=
5 2
×
25 27.5
×
100 2
= 2.5 × 0.90 × 50 = 112,5 = 112,5
% =
AM Ast
× 0,01 x Fd
% =
, ,
× 0,01 x 112,5
% = 3.313 × 1,125
% = 3,727
REGISTRO FOTOGRAFICO
Filtrado muestras
Reactivos
Calibración Equipo
Absorvancia
DISCUSIÓN DE RESULTADOS Los carbohidratos son las fuentes principales de energía en las dietas de las vacas lecheras. Entre 50 y 80% de la materia seca del forraje y de los granos son carbohidratos. Tres clases principales de carbohidratos existen en los alimentos: 1) Azúcares sencillos (por ejemplo, glucosa y fructuosa); 2) Los carbohidratos de almacenamiento, llamados carbohidratos no estructurales (por ejemplo, almidón y fructuosas); 3) Los carbohidratos estructurales o fibrosos (celulosa y hemicelulosa) (José Alberto Maiztegui) Con el procedimiento realizado en laboratorio y la aplicación de las formulas se pudo calcular la cantidad de carbohidratos no estructurales de la muestra, esta información nos permite realizar diferentes apreciaciones a cerca del material analizado así como sus cualidades en caso de necesitar evaluar sus propiedades alimenticias o de uso.
CONCLUSIONES El contenido de carbohidratos no-fibrosos incrementa la energía en la dieta, y así mejora el suministro de energía y determina la cantidad de proteína bacteriana producida en el rumen. El cálculo de los carbohidratos no estructurales nos permite analizar los materiales de las muestras permitiendo evaluar la importancia de algunos alimentos en cuanto a sus cualidades como fermentación rápida, entre otras. Los carbohidratos no estructurales pueden significar una quinta parte de la composición de un forraje determinado. Conociendo la cantidad de CNE de una especie podemos calcular los demás componentes de la misma y que tan tierna o lignificada esta una planta.
PRACTICA IV. ACTIVIDAD CATALITICA DE LA CATALASA (ACAT)
OBJETIVOS
Determinar la actividad de la catalasa por método permanganométrico.
Cuantificar la cantidad enzimática de la catalasa en muestras de origen vegetal y animal.
INTRODUCCIÓN La catalasa como biocatalizador de origen proteíco, es una enzima óxido-reductasa que participa en la degradación del peróxido de hidrógeno (H2O), hasta Oxígeno molecular (O2) y agua (H2O). La reacción bioquímica enzimática (RBE) que cataliza es la siguiente: Catalasa 1H2O2
pH= 6, 8; T=30°C
1 H2O + ½ O
Dicha biomolécula, está presente en peroxisomas y mitocondrias de células animales y vegetales, protegiéndolas de la toxicidad de los radicales libres peróxido, impidiendo su acumulación y beneficiando el metabolismo celular. También, tiene una participación activa en los procesos de foto-respiración vegetal ,promoviendo la oxidación del glicolato generado a nível del estroma del cloroplasto en una etapa posterior al ciclo de Calvín de la fotosíntesis , hasta el aminoácido glicina (ácido-2-aminoetanoíco), el cual es oxidado finalmente en la mitocondria- por medio de reacciones de desaminación oxidativa-hasta CO2, NH3 y H2O. En las células animales y vegetales, el peróxido hidrógeno H2O2 se produce durante la oxidación de las coenzimas FAD y FMN, biomoléculas importantes en
la oxidación de sustratos a partir del oxígeno molecular. También se genera por la oxidación de ácidos grasos (AG) en los peroxisomas. Molecularmente, la catalasa está codificada como EC 1.11.1.6 por la: enzyme comisión numbers y se clasifica como peróxido de hidrógeno óxidorreductasa, conformada espacialmente en su estructura cuaternaria como una proteína homotetramérica de peso molecular que oscila entre 210 a 280 Kilodaltons (kD) con 4 subunidades idénticas, constituídas por un grupo prostético de protoporfirina y el grupo hemo (Fe- III), representando estos, un 1,1 % y 0,09 % respectivamente del peso molecular total de la enzima. En esta práctica, la actividad de catalasa se determinará por el método permanganométrico, en el cual se titula el peróxido residual, es decir, el que no participó en la RBE, con una solución de permanganato de potasio (KMnO4) de concentración conocida.
METODOLOGIA Materiales: Montaje de titulación (soporte universal, bureta, pinzas, Erlenmeyer), pipeta graduada, probeta graduada, beaker de 400ml; tubos de ensayo con gradilla.
Reactivos: H2O2 0,05m - H2SO42N - KMnO4 0,01m - Extractos de catalasa (ECAT) PROCEDIMIENTO Extracción Frutas, verduras, suelos ó concentrados Pesar más o menos 2g de muestra picada o pulverizada, registrar el valor como: W y colocarla en un tubo de centrifuga, luego adicionar 10mL de solución fría de buffer fosfato 0,05M, pH=6,8-7,0, agitar, con agitador de vidrio (3min) y centrifugar a 2500rpm durante 5min. Sacar el sobrenadante, filtrar y medir su volumen, registrarlo como: V y tomar 5 ml de éste para depositarlo en un tubo de ensayo, taparlo, rotularlo como: EVCAT (extracto de verdura para catalasa) o EFCAT (extracto de fruta para catalasa), o ECCAT (extracto de concentrado para catalasa), o ESCAT, colocarlos inmediatamente en baño de hielo.
Tabla N°1 Muestras
Peso (gramos)
Suelo
2,17
Verdura (Habichuela)
2.0414
Concentrado
2,0438
Fruta (Manzana)
2,02
Imagen 1. Pesa de las muestras
Imagen 2. Muestra con solución fría de buffer fosfato
Imagen 3. Filtrado de las muestras
Imagen 4. Filtrado de las muestras
Tabla N°2 Muestras
Volumen Final
Suelo
8,4mm
Verdura (Habichuela)
8mm
Concentrado
1,5mm
Fruta (Manzana)
9mm
Imagen 5. Muestras con volumen final, rotuladas.
Cuantificación Mezcla Reactiva Alistar 7 tubos de ensayo y rotularlos así: B, 1, 2, 3, 4, 5, 6, colocarlos en baño de hielo y adicionar los siguientes reactivos en el orden dado:
Tabla N°3 Reactivos (ml)
Tubos de ensayo B
1
2
3
4
5
H2O219
4
4
4
4
4
4
Buffer
5
4
4
4
4
4
H2SO4 2N
1
0
0
0
0
0
EVCAT
0
1
0
0
0
0
EFCAT
0
0
1
0
0
0
ECCAT
0
0
0
1
0
0
SSCAT
0
0
0
0
1
0
ESCAT
0
0
0
0
0
1
fosfato
Agitar vigorosamente los tubos por 30 segundos, colocarlos nuevamente en el baño de hielo y dejarlos en reposo durante 5min, para que se desarrolle la RBE.
H2SO4 2N
0
1
1
1
1
1
Agitar los tubos, con cuidado, por 15 segundos, hasta mezclarlos completamente, sacar la solución del tubo blanco y pasarla a un Erlenmeyer o beaker.
Imagen 6. Muestras con los reactivos antes Imagen 7. Muestras después del baño frio del baño frio.
y de la aplicación de ácido sulfúrico.
Titulación permanganométrica REDOX Alistar el montaje de titulación, colocar el erlenmeyer debajo de la bureta y titular adicionando lentamente el KMnO, agitando, hasta que aparezca y permanezca un color
rosado o violeta pálido, por 30 segundos, en la solución reactiva, registrar los ml de permanganato gastados en este proceso. Repetir el procedimiento con los tubos restantes, registrar volúmenes de KMnO, en la tabla de datos.
Tabla N°4 Indicadores
Muestras/Tubos
Wm (g)
Vf (ml)
Blanco
VKMno4 (ml) 0,2
Suelo
2,17
8,4mm
5,5
Verdura (Habichuela)
2.0414
8mm
3,2
Concentrado
2,0438
1,5mm
1,2
Fruta (Manzana)
2,02
9mm
1,8
Imagen 8. Titulación.
Imagen 9. Muestras después de la titulación.
CÁLCULOS
=
( KMnO4() − KMnO4 x 0,01
10 = ( ) 10 22 1
Suelo =
(0,2 − 5,5 2,17 8,4
=
1000
−5,3
1000 18,22
ACAT = -2907,61 gr/ml
Verdura
=
(0,2 − 3,2 2,012 8
=
1000
−3
1000 16,096
ACAT = - 1863,81 gr/ml
Concentrado
=
(0,2 − 1,2 2,043 1,5
=
1000
−1
1000 3,06
ACAT = - 3263,17 gr/ml
Fruta
=
(0,2 − 1,8 2,02 9
=
1000
−1,6
1000 18,18
ACAT = - 880,08 gr/ml
Bibliografía
Granados, J. (2011). Modulo bioquímica metabolica. Bogotá. Universidad Nacional Abierta a Distancia
Granados, J. (2015). Protocolo de prácticas. Universidad nacional abierta y a distancia. Mauricio torres, 2010, glucosa, en línea, 06/03/2011, Saludaría interactiva José Alberto Maiztegui, M. M. LOS ALIMENTOS NUTRICION DE RUMIANTES . http://datateca.unad.edu.co/contenidos/201111/ComposicionAnalisisy_clasificaciondelosAl imentos.pdf.
