Informe N°01 - Bioquimica.docx

Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Facultad de Quimica – Ing. Quimica e Ing. Agroindust Agroindustrial rial E.A.P. Quimica Departamento de Quimica Orgánica

Bioquímica Informe de Lab. N°01 Cabanillas Silva, Helga Tananta Gómez, Diego Ruiz Bocanegra, Jessica De La Cruz Vicente, Hayro Setiembre de 2012

Lab. De Bioquímica 2012-II

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TABLA DE CONTENIDO

II. INTRODUCCIÓN................................................ ...........Error! ...........Error! Bookmark not defined. III. RESUMEN ...................................................................Error! ...................................................................Error! Bookmark not defined. IV. PARTE TEÓRICA ............................................... .......................................................... ...........Error! Error! Bookmark not defined. V. DETALLES EXPERIMENTALES ...................................................................................... 7 VII. RESULTADOS .................................................. ...........Error! ...........Error! Bookmark not defined. VIII. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ................................................................................. 15 IX. CONCLUSIONES CONCLUSIONES ............................................... .................................................................................................... .......................................................... ..... 16 X. RECOMENDACIONES ................................................................................................. ................................................. ................................................ 16 XI. APENDICE.................................................................................................................... 0 XII. BIBLIOGRAFÌA .......................................................................................................... 17


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INTRODUCCION

Las proteínas son compuestos orgánicos constituidos por aminoácidos unidos por enlaces peptídicos que intervienen en diversas funciones vitales esenciales, como el metabolismo, la contracción muscular o la respuesta inmunológica; sus moléculas van desde las largas fibras insolubles que forman el tejido conectivo y el pelo, hasta los glóbulos compactos solubles, capaces de atravesar la membrana celular y desencadenar reacciones metabólicas. Tienen un peso molecular elevado y son específicas de cada especie y de cada uno de sus órganos. Las proteínas sirven sobre todo para construir y mantener las células. Los aminoácidos son sustancias cristalinas, casi siempre de sabor dulce; tienen carácter ácido como propiedad básica y actividad óptica; químicamente son ácidos carbónicos con, por lo menos, un grupo amino por molécula, 20 aminoácidos diferentes son los componentes esenciales de las proteínas. Aparte de éstos, se conocen otros que son componentes de las paredes celulares. Las plantas pueden sintetizar todos los aminoácidos, nuestro cuerpo solo sintetiza 16, aminoácidos, éstos, que el cuerpo sintetiza reciclando las células muertas a partir del conducto intestinal y catabolizando las proteínas dentro del propio cuerpo.


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RESUMEN Se realizo el análisis cualitativo de coloración de las proteínas y aminoácidos sobre los grupos funcionales y así mismo se reconoció las reacciones específicas para cada tipo de aminoácido. Igualmente se procedió a efectuar las pruebas de reconocimiento sobre una solución proteica de clara de huevo de gallina. Con lo cual se encontró que la reacción de Biuret fue específica sobre el grupo peptídico de las proteínas y así mismo también se encontró reacción positiva en los aminoácidos. De igual forma se encontraron encontraron resultados satisfactorios en las pruebas de análisis en la reacción de la ninhidrina sobre el grupo alfa amino, donde la mayoría de aminoácidos reaccionaron a excepción del beta aminoácido b-alanina. Se encontró de igual forma que la prolina e hidroxiprolina dan un producto de color amarillo. Así mismo se realizó en ensayo de la reacción xantoprotéica para detectar el grupo aromático de los aminoácidos, donde se encontró resultados positivos en el ensayo sobre triptófano, tirosina y fenilalanina. De igual forma se realizó la reacción de Millon sobre la tirosina donde también se encontró resultados satisfactorios al observar la formación de la sal de mercurio de la nitrotirosina de color rojo púrpura. De igual forma se realizó la determinación de Hopkins Cole sobre triptófano de forma específica, al observarse la formación del compuesto rojo violeta bis-2triptofanilmetano. Además se realizará la reacción de coloración de la prolina con ninhidrina encontrándose la formación de un compuesto de color amarillo, y así mismo se realizó la determinación de aminoácidos que contienen azufre débilmente unido en la cisteína y cistina, donde se encontró que ambos aminoácidos reaccionan en medio básico y en presencia de una sal de plomo forman un precipitado de color negro produciendo PbS. De igual forma se pudo comprobar lo mismo con la reacción de nitroprusiato de sodio, formando un complejo inorgánico al que reaccionó la metionina por tener azufre en su estructura. Finalmente se realizó la reacción de Sakaguchi característica del grupo Guanidino, presente en la arginina donde se observó que en presencia de alfa naftol e hipobromito de sodio, se produjo un compuesto coloreado amarillo rojizo (naftoquinonimina)


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PARTE TEORICA LAS PROTEINAS: Las proteínas son macromoléculas; son biopolímeros , es decir, están constituidas por gran número de unidades estructurales simples repetitivas (monómeros ). Debido a su gran tamaño, cuando estas moléculas se dispersan en un disolvente adecuado, forman siempre dispersiones coloidales , con características que las diferencian de las disoluciones de moléculas más pequeñas. Por hidrólisis, hidrólisis, las moléculas de proteína se escinden en numerosos compuestos relativamente simples, de masa pequeña, que son las unidades fundamentales constituyentes de la macromolécula. macromolécula. Estas Estas unidades son los aminoácidos, los aminoácidos, de de los cuales existen veinte especies veinte especies diferentes y que se unen entre sí mediante enlaces mediante enlaces peptídicos. Cientos y miles de estos aminoácidos pueden participar en la formación de la gran molécula polimérica de una proteína. FUNCIONES: Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas constituyentes de los seres vivos (biomoléculas). (biomoléculas). Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de moléculas. Bastan algunos ejemplos para dar idea de la variedad y trascendencia de las funciones que desempeñan. Son proteínas: casi todas las enzimas, catalizadores de reacciones químicas en organismos vivientes; muchas hormonas, hormonas, reguladores de actividades celulares; la hemoglobina la hemoglobina y otras moléculas otras moléculas con funciones de transporte en la sangre; la sangre; los anticuerpos, anticuerpos, encargados de acciones de defensa natural contra infecciones o agentes extraños; los receptores los receptores de las células, las células, a a los cuales se fijan moléculas capaces de desencadenar una respuesta determinada; la actina y la miosina, miosina, responsables finales del acortamiento del músculo durante la contracción; el colágeno, el colágeno, integrante integrante de fibras de fibras altamente resistentes en tejidos en tejidos de sostén. ESTRUCTURA: Es la manera como se organiza una proteína para adquirir cierta forma. Presentan una disposición característica en condiciones fisiológicas, pero si se cambian estas condiciones como temperatura, pH, etc. pH, etc. pierde la conformación y su función, proceso denominado desnaturalización. La función depende de la conformación y ésta viene determinada por la secuencia la secuencia de aminoácidos.


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Conformaciones o niveles estructurales de la disposición tridimensional:

PROPIEDADES: Solubilidad: Se mantiene siempre y cuando los enlaces fuertes y débiles estén presentes. Si se aumenta la temperatura la temperatura y el pH, el pH, se se pierde la solubilidad. Capacidad electrolítica: Se electrolítica: Se determina a través de la electroforesis, la electroforesis, técnica técnica analítica en la cual si las proteínas se trasladan al polo positivo es porque su molécula tiene carga negativa y viceversa. Especificidad: Cada proteína tiene una función específica que está determinada por su estructura primaria. Amortiguador de pH (conocido como efecto tampón): tampón) : Actúan como amortiguadores de pH debido a su carácter anfótero, es decir, pueden comportarse como ácidos (aceptando electrones) o como bases (donando electrones). Lab. De Bioquímica 2012-II

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DETALLES EXPERIMENTALES EXPERIMENTALES 1) Materiales y Reactivos: Reactivos:    

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Solución de proteína de huevo fresco de gallina Proteína de huevo fresco no diluido Soluciones al 1% de glicina, α-alanina, β-alanina. Soluciones al 0,01% de tirosina, triptófano, histidina, hidrocloruro de cisteína, metionina, acido aspartico y acido glutamico, α -alanina, β-alanina y arginina. Reactivo de Biuret (NaOH y Cu 2+ ) Ninhidrina, solución acuosa al 0,5%. HNO3 (cc) NaOH al 10% Reactivo de Millon. Acido acético glacial. H2SO4 (cc) Acetato de plomo al 5% Nitroprusiato de sodio al 5%. α-naftol al 0,2% hipobromito de sodio. Acido sulfanilico al 1% en acido clorhídrico al 5% KNO2 al 0,5% Na2CO3 al 10% Sulfato de cobre al 0,04 M

Materiales:       

Tubos de ensayo, goteros, pipetas, probetas, baño de agua, bagueta, papel filtro.


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2) Procedimiento Experimental: 

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE ALBÚMINA:

Se separa la clara de la yema de un huevo; la clara se mide en una probeta y se añade igual cantidad de agua destilada. Se bate hasta que este algo espumosa, luego se filtra. De esta solución se tomaran para los siguientes ensayos.

REACCIÓN DE BIURET SOBRE EL GRUPO PEPTÍDICO En un tubo de ensayo se colocan 5 gotas de solución de proteína de huevo, en otro tubo glicina. A cada tubo se le agrega 2 gotas del reactivo Biuret, agitar suavemente y observar la aparición de la coloración. coloración. 

Presenta una coloración azul violácea, ya que el reactivo de Biuret reacciona en un medio básico

Las proteínas (poli péptidos) en solución alcalina en presencia de sulfato de cobre (II) forman compuestos complejos de cobre, de coloración azul violeta con matices rojizo o azulado. Esta reacción por provocar una coloración en función a la formación de un complejo bioinorgánico permite emplearse en análisis por espectrofotometría. La reacción se caracteriza por la formación de un enlace de coordinación entre el cobre y los átomos de nitrógeno adyacentes del enlace peptídico de la proteína.


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REACCIÓN DE LA NINHIDRINA SOBRE EL GRUPO α-AMINO En un tubo de ensayo colocar 5 gotas de solución de huevo, en otro α-alanina, y en un tercer tubo colocar β-alanina. Luego agregar a cada tubo 2 gotas de solución de Ninhidrina, calentar hasta ebullición y después observar la aparición de coloración. 

Albumina – Clara de huevo

α-alanina

β-alanina

Presentan coloración azulado.

El reactivo Ninhidrina interacciona con el grupo α-amino de los aminoácidos, péptidos y proteínas con la formación de un complejo de color azul o violeta, llamado azul violeta de Ruemann. Químicamente por calentamiento, en presencia de ninhidrina se produce la desanimación oxidativa del grupo α-amino de los aminoácidos y péptidos y reducción de la molécula de ninhidrina en el proceso se forma una base de Schiff (C=N), luego se forma una reagrupación con descarboxilación y descomposición a aldehído y aminodicetohidrindeno.

REACCIÓN XANTOPROTEICA SOBRE EL ANILLO AROMATICO DE AMINOACIDOS CICLICOS En un tubo de ensayo colocar 5 gotas de solución de proteína de huevo, en otro tirosina y en un tercer tubo colocar histidina. A cada tubo añadir 3 gotas de ác. Nítrico concentrado y calentar hasta ebullición. 

Albumina – Clara

Tirosina

Histidina

de huevo

En los dos primeros dan coloración anaranjada y en el último da una coloración ligeramente anaranjada. Lab. De Bioquímica 2012-II

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La reacción se basa en la capacidad de los aminoácidos y restos de de poli péptidos que tienen un anillo aromático para formar, por interacción con ácido nítrico concentrado, compuestos dinitroderivados de color amarillo. Esto es, la nitración del anillo aromático. En medio alcalino, estos compuestos forman grupos cromóforos con estructuras quinoideas que tienen coloración anaranjada.

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REACCIÓN DE MILLON SOBRE LA TIROSINA

En un tubo de ensayo colocar 5 gotas de solución de proteína de huevo, en otro tirosina. A cada uno de ellos añadirle 3 gotas de reactivo de Millón y cuidadosamente calentar en baño de agua, observar la aparición aparición de la coloración. coloración.

Presenta una coloración coloración rojo púrpura

La reacción se basa en la capacidad de la tirosina de formar sal de mercurio de nitrotirosina de color rojo púrpura. Esto se presenta en la tirosina ya sea en forma libre o en la composición de las proteínas.


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REACCIÓN DE HOPKINS-COLE (ADAMKIEWICZ) SOBRE TRIPTÓFANO En un tubo de ensayo colocar 2 gotas de proteína no diluida de huevo fresco, en otro –solución de triptófano. A cada tubo agregar 10 gotas de acido acético glacial, y calentar cuidadosamente ambos tubos hasta disolución del precipitado formado en el primer tubo, después de lo cual, enfriar el contenido de este tubo. Con mucho cuidado, después de inclinar el tubo, agregar por la pared de este, cerca de 1 mL de H 2SO4 (cc), cuidando de que los líquidos no se mezclen. 

En el límite de las dos capas surge un anillo coloreado característico que se difunde por toda la solución. Presenta una coloración rojo violeta

La reacción de Hopkins Cole es específica para el triptófano, y se basa en la capacidad que este tiene para reaccionar en medio ácido con el ácido glioxílico (que está presente en el ácido acético glacial), con la formación del compuesto de color rojo violeta. REACCIÓN DE FOLY EN AMINOACIDOS QUE CONTIENEN AZUFRE A ZUFRE En tres tubos de ensayo se colocar 10 gotas de solución de acetato de plomo y, por gotas, a cada uno de ellos añadir NaOH hasta la disolución del precipitado formado al principio. A uno de los tubos, agregare 5 gotas de solución de proteína de huevo, al segundo- cisteína, y al tercero metionina. Hervir de 1 a2 minutos y observar los cambios de color y formación del precipitado. 

Albumina – Clara

Cisteína

Metionina

de huevo

Presenta una coloración negro pardusco


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El método de la reacción de Foly es específica para los aminoácidos que contienen azufre débilmente unido ya sea cisterna o cistina. El método se basa en la capacidad que tienen las proteínas, en la composición de formar por calentamiento en medio alcalino, sulfuro de sodio, el mismo que con plumbito de sodio genera color negro pardo proveniente del sulfuro de plomo obtenido. 

REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS QUE CONTIENE AZUFRE CON NITROPRUSIATO DE SODIO.

En un tubo de ensayo colocar 5 gotas de albúmina fresca no diluida, en otro- solución de cisteína, y en un tercero metionina. A cada tubo agregar 10 gotas de solución de NaOH y hervir por 3 minutos, luego enfriar el contenido. Después a la mezcla de cada tubo añadir 2 a 3 gotas de solución de nitroprusiato de potasio y observar la aparición de la coloración.

Albumina – Clara

Cisteína

Metionina

de huevo

Presenta una coloración rojo violeta que es un complejo coloreado

La reacción se basa en la capacidad del sulfuro de sodio, proveniente de la hidrólisis alcalina de aminoácidos que contienen azufre forman nitroprusiato de sodio un compuesto coloreado coloreado rojo violeta. Lab. De Bioquímica 2012-II

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REACCIÓN DE SAKAGUCHI

En un tubo de ensayo colocar 2 mL. De solución de arginina agregar 2mL de NaOH al 10% y algunas gotas de solución alcohólica de alfa naftol al 0.2%. Agitar bien el contenido del tubo y añadir 0.5mL de solución de hipobromito y nuevamente mezclar. Observar la coloración. Anaranjada

La reacción de Sakaguchi es una reacción específica para el grupo Guanidino, donde el α-naftol se une al grupo Guanidino de la arginina en presencia de hipodromito de sodio. La oxidación posterior de naftilarginina se forma un compuesto de tipo quinonimina, donde el hidrógeno del grupo imino está sustituido por un radical alquilo o arilo. 

PRUEBA DE PAULY – CARACTERISTICA DE LA HISTIDINA

A 1mL. De solución al 1% del Acido Sulfanilico en Acido Clorhídrico al 5% le agregan 2 mL de solución de KNO2 al 5%. Agitar fuertemente la mezcla e inmediatamente añadir 2mL de histidina al 0.01% y luego, agitar el contenido del tubo. Observar la coloración. Presenta una coloración rojo guinda


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RESULTADOS Reacciones N°

Muestra problema

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N

S

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Glicina

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2

Prolina

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3

Arginina

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+

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4

Tirosina

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+

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5

Triptófano

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+

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+

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6

Histidina

+

+

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+

7

Fenilalanina

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+

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8

Ac. Glutamico

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Metionina

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10

Cisteína

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Lisina

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+

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α-alanina

+

+

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β-alanina

+

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Leucina

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Isoleucina

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Serina

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Tabla 1: Resultados de las reacciones cualitativas de las pruebas bioquímicas realizadas.


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DISCUSION DE RESULTADOS 

La reacción de Biuret será positiva en el caso de que la ovoalbúmina, dando una coloración violeta clara; esto debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu +2 y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídico; pero pero en el caso de la glicina no hubo reacción. reacción.

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Reaccionan con la Ninhidrina, la ovoalbúmina, α-alanina, β-alanina, al ser calentados con exceso de la misma. Pero la intensidad de sus coloraciones coloraciones y el tiempo en que reaccionan fueron distintos, puesto que con la ovoalbúmina la reacción fue bien rápida (coloración violeta) violeta) en comparación con con casos de de la con la α-alanina (coloración morado-azul) y β-alanina (en esta reacción la coloración fue un violeta más claro y además tubo que durar más tiempo su calentamiento para que reaccione).



La reacción xantoprotéica es una prueba característica de los aminoácidos aromáticos. Esta reacción se debe a la presencia de un grupo fenilo en la molécula proteica. Por lo cual da una reacción positiva para la ovoalbúmina (precipitado color amarillo y este al calentarlo se disuelve dando una coloración amarilla), en la tirosina da una solución amarilla más clara, en el caso de la histidina reacciona dando un precipitado amarilloclaro en menor proporción que en el caso de la ovoalbúmina. Por lo tanto, la positividad de estas reacciones se reconoce por la aparición del color amarillo (se puede notar las diferencias de las intensidades en la coloración en cada caso) debido a la formación de nitrocompuestos.



La reacción de Millón: La tirosina da una reacción característica al calentarse con nitrato de mercurio en ácido nítrico produciendo una coloración rojo-naranja oscuro (solución). La reacción fue negativa en el caso de la ovoalbúmina ovoalbúmina (puesto que también contiene sales inorgánicas) por lo cual hace que el mercurio del reactivo del Millón sea precipitado (se va a producir un precipitado blanco que después cambia a color rosado claro y finalmente toma una coloración marrón claro).

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La reacción de Foly da positiva tanto para los aminoácidos que contiene azufre, tal es el caso de la cistina y la metionina, también da una reacción positiva con la ovoalbúmina debido a que se forma un precipitado color color negro-marrón oscuro (tal como como el caso de la cistina y metionina) por lo cual me indica la presencia de estos aminoácidos en la solución de la proteína de huevo.



La reacción de aminoácidos que contienen azufre con nitroprusiato de potasio (también llamado ensayo de nitroprusiato) da positivo con la cisteína, produciendo unas coloración rojo-naranja, esto es debido a que posee libre al grupo sulfidrilo. Con la ovoalbúmina se da una solución de color marrón oscura y en el caso de la metionina una solución amarilla más intensa.

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En la prueba de Pauly, es característica de la histidina puesto que reacciona con el Acido Sulfanilico en Acido Clorhídrico con KNO 2 para formar un compuesto de coloración intensa (rojo-naranja) debido a la formación de un compuesto AZO fuertemente coloreado.


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CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

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Los péptidos y proteínas producen una reacción coloreada muy usada para la valoración de los mismos, llamada reacción del Biuret. Las proteínas por sus uniones peptídicos reaccionan con los iones cúpricos del reactivo en medio alcalino formando un complejo de color violeta. Se necesitan 2 ó más uniones peptídicos para que se forme el complejo coloreado. coloreado. Esta prueba sirve para la identificación identificación de tripéptidos en adelante.

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En la reacción de la Ninhidrina, el grupo alfa-amino de los aminoácidos forma complejos complejos de color violeta con la ninhidrina. Esta reacción también identifica los grupos alfa-amino libres presentes en péptidos y proteínas.

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En esta prueba Xantoprotéica se produce la nitración del anillo bencénico presente en los aminoácidos como la tirosina, fenilalanina y triptófano, obteniéndose nitrocompuestos de color amarillo, que se vuelven anaranjados en medio fuertemente alcalino (formación del ácido pirámico o trinitrofenol).

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El anillo fenólico (presente en la tirosina) tiene un comportamiento característico frente a las sales de mercurio a pH ácido, formando complejos color rojo ladrillo con el anillo fenólico de la tirosina y las proteínas que la contienen. Esta característica se reconoce mediante la prueba de Millón.

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Debido a que el Hg trae consecuencias nocivas a la salud por cuanto daña el tejido nervioso, debe emplearse con extremo cuidado la reacción de Millon, pues la sal de mercurio y el nitrito presente en dicha sal con muy tóxicos (uso necesario de guantes, gafas), así mismo debe emplearse mascarilla y trabajar en campana extractora ante la posibilidad de contaminación con vapores mercúricos

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El α-naftol crea molestias a la piel así mismo es un alcohol aromático, por dicha razón

debe emplearse con extremo cuidado y el uso de guantes de nitrilo es importante. Así mismo, experimentalmente se obtienen buenos resultados al seguir la secuencia de la reacción, donde primero debe colocarse la muestra de análisis, luego el hidróxido de sodio y finalmente la solución alcohólica de α -naftol al 0.2%. Se observará la formación de una coloración naranja rojiza.


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BIBLIOGRAFIA

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Bioquímica, Mary K.Campbell, Shawn O.Farrell. 4ta edicion,2004,editorial Thompson, pág. 91,92.

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Bioquímica. Peña, Arroyo, Gomez.2da edición,2004, editorial Limusa Mexico.pag 6567,87.

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Fundamentos de bioquímica estructural, José María Teijon Rivero, Armando Garrido Pertierra. Editorial Alfa Omega, pág. 27-37

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www.wikipedia.com

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Bioquímica de Harper, Robert K.Murray. K.Murray. Editorial El Manual Moderno S.A. C.V.Mexico D.F Santa Fe de Bogota.13 edición, 1994.pag 51-69.


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