AÑO DE LA UNION NACIONAL FRENTE A LA CRISIS EXTERNA UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA FACULTAD DE INGENIERIA PESQUERA
INFORME DE PRÁCTICAS PRE-PROFESIONALES EN EL LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD DE LA FACULTAD DE INGENIERIA PESQUERA – UNP
EJECUTOR:
QUINDE RIVERA PEDRO YASMANI
PERIOD PERIODO: O: del 07 de Diciem Diciembre bre del 2008 al 19 de Junio del 2009.
CASTILLA, Setiembre del 2009 PIURA - PERÚ
““ANÁLISIS DE ALIMENTOS EN EL LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD DE LA FIP ” .
Jefe del Departamento Departamento Académico Académico Ing°
César
Ramos
Chunga
--------------------------
Asesor de Informe Prácticas Ing° Edgardo Quinde Rentaría. --------------------------
Ejecutor Quinde Quinde Rivera Rivera Pedro Pedro Yasmani Yasmani
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““ANÁLISIS DE ALIMENTOS EN EL LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD DE LA FIP ” .
Jefe del Departamento Departamento Académico Académico Ing°
César
Ramos
Chunga
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Asesor de Informe Prácticas Ing° Edgardo Quinde Rentaría. --------------------------
Ejecutor Quinde Quinde Rivera Rivera Pedro Pedro Yasmani Yasmani
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El siguiente documento, es un fiel reflejo de todo lo observado y aprendido durante mi permanen permanencia cia como parte del analista analista del laborator laboratorio io de control de Calidad Calidad de la Facultad de Ingeniería Pesquera. De antemano agradezco por la oportunidad brindada a los señores:: Ing. Edgardo Quinde Rentería actual Jefe del Laboratorio de Control de Calidad y Tec. Melecio Pintado Erazo. A continuación se describen describen de manera detallada, detallada, de acuerdo al formato requerido por la Facultad Facultad,, aspectos aspectos concerni concernientes entes a los métodos métodos microbio microbiológi lógicos cos utilizad utilizados os en alimentos dentro del laboratorio de control de calidad de la FIP.
INDICE
INTRODUCCIÓN I. BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO: (BPL) 1.1. BIOSEGURIDAD 1.2. DEFINICIÓN DE TERMINOS 1.3. ACREDITACIÓN DE LABORATORIOS: II. PROTOCOLOS DE ANÁLISIS 2.1. PREPARACIÓN Y TOMA DE MUESTRA DE ALIMENTOS III. CULTIVOS PUROS 3.1. METODOS PARA AISLAR CULTIVOS PUROS 3.1.1. TECNICA DE SIEMBRA POR ESTRIAS EN PLACA Y TECNICAS DE SIEMBRA POR DIFUSION EN PLACA 3.1.2. TECNICA DE LA PLACA VERTIDA 3.1.3. TECNICAS DE ENRIQUECIMIENTO ENRIQUECIMIENTO DEL CULTIVO IV. TÉCNICAS DE CULTIVO USADOS EN EL L.C.C. DE LA FIP: 4.1. MÉTODOS DE RECUENTO: 4.1.1. RECUENTO POR PLACA: 4.1.2. RECUENTO POR EL MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE V. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS 5.1.
ANALISIS
MICR ICROBIOLOGICO
DEL
PESCADO
FRESCO,
REFRIGERADO Y CONGELADO. 5.2. ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL PESCADO SALADO. 5.3.ANALISIS MICROBIOLOGICO DE DE EMBUTIDOS DE PESCADO. PESCADO. 5.4. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS ENLATADOS VI. ALGUNOS MÉTODOS PARA DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS 6.1. METODO RAPIDO PARA LISTERIA SP. 6.2. MÉTODO RAPIDO GLISA PARA SALMONELLA SALMONELLA SP 6.3. ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES EN AGUAS 6.4. MÈTODO RÀPIDO PARA LA DETECCIÓN SIMULTÁNEA DE COLIFORMES TOTALES TOTALES Y E. coli coli EN ALIMENTOS ALIMENTOS VII. BIBLIOGRAFIA ANEXOS
INTRODUCCIÓN: Históricamente, la extremada caducidad del pescado ha restringido su consumo, en un estado razonablemente fresco, el entorno cercano al lugar donde era desembarcada la captura. Esto ha menoscabado solo ligeramente el hecho de que el pescado desempeñase u papel importante en la alimentación humana ya que, en todo el mundo, se desarrollaron las técnicas tradicionales del curado basadas en la combinación de la salazón, del secado y del ahumado que permitieron un consumo mas extendido del pescado. Después de su captura en el mar los peces son invariablemente almacenados en hielo o en agua de mar refrigerada hasta el momento en el que se descargan del barco en el puerto. Es importante que se utilice un agente refrigerante recién preparado y limpio pues su reutilización originará el crecimiento rápido de los microorganismos contaminantes psicrótrofos y la alteración del pescado almacenado. Varios son los factores que coadyuvan en la caducidad sin igual del tejido muscular de los pescados. No obstante, en la mayoría de los casos la alteración es de origen microbiológico. Para estudiar debidamente a los microorganismos se necesita como requisito previo el cultivarlos en condiciones de laboratorio. Para conocer cuales son los nutrientes y las condiciones físicas que requieren. Mediante investigaciones extensas se han determinado las necesidades nutricionales de las bacterias varían de manera muy amplia existen diferencias muy importantes e cuanto a la composición de los medios mas empleados. Por ese motivo he creído conveniente tratar los siguientes puntos que los veremos más adelante, incluyendo la aplicación de la microbiología.
I. BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO: (BPL) Las buenas prácticas de laboratorio identifican, definen y describen los principios que deben regir los procesos de organización y las condiciones bajo las cuales se lleva a cabo la planificación y ejecución de los análisis de laboratorio para control de calidad, incluyendo el registro de datos, la preparación de los informes de análisis y los procedimientos de control y garantía de calidad de sus actividades que permiten decidir si los resultados son lo bastante fiables para ser reportados. Siendo necesario dar cumplimiento a los siguientes acápites: 1. Recomendaciones de carácter organizativo. 2. Recomendaciones de carácter personal. 3. Recomendaciones de trabajo. 4. Relativas a la vestimenta. 5. Relativos al material de vidrio. 6. Relativos a limpieza del ambiente de trabajo. 7. Relativas al empleo de fuentes de calor.
Dentro del laboratorio está prohibido fumar
Es obligatorio el uso de ropa de protección en el ambiente de trabajo
El laboratorio debe estar extremadamente limpio
El material de vidrio antes de ser esterilizado se debe secar adecuadamente
1.1.
BIOSEGURIDAD
Es un conjunto de medidas preventivas para proteger la salud y la seguridad del personal que trabaja en el laboratorio, frente a diferentes riesgos producidos por agentes biológicos. Complementariamente se deben incluir normas contra los riesgos producidos por agentes físicos, químicos y mecánicos. Los agentes de riesgo pueden ser : •
Agentes Biológicos: Transmitidos por ingestión, inhalación. Inoculación por contacto directo a través de piel o mucosas.
•
Agentes Químicos: Que pueden ser: - Corrosivos que causan destrucción o alteración de los tejidos. - Tóxicos cuyos efectos se manifiestan según la vía de exposición por inhalación, ingestión o contacto directo con piel o mucosas. - Carcinogénicos o mutagénicos - Inflamables - Explosivos.
1.2. Definición de términos: Limpieza: Es indispensable para la preparación del material antes de someterlo a desinfección o esterilización. Colonia: Una colonia esta formada por microorganismos que comparten características fisiológicas y bioquímicas, y en microbiología se emplean algunas características para identificar la morfología colonial, las cuales son : Forma, tamaño, color, olor, aspecto, consistencia, borde, luz transmitida, luz reflejada, elevación y producción de pigmento en el caso de la morfología colonial bacteriana, en la morfología colonial de los hongos se consideran las características de color, micelio aéreo, producción de pigmento anverso y reverso, entre otras. Desinfección: Se efectúa mediante el uso de agentes químicos, líquidos, pasteurización a 750C e irradiación ultravioleta. El grado de desinfección depende de la calidad y concentración y el agente antimicrobiano, la naturaleza de la contaminación y el tiempo de exposición. Algunos procedimientos de desinfección utilizados a la concentración requerida y en periodo de tiempo no menor de 30 minutos producen la destrucción de todos los microorganismos. Exceptuando las esporas resistentes. Esterilización: Su objetivo es la destrucción de toda forma de vida. Se realiza preferentemente por medio del vapor saturado a presión (autoclave), por calor
seco (horno), incineración (mechero de gas) y en algunos casos mediante el uso de agentes químicos determinados en forma líquida o de gas. 1.3. ACREDITACIÓN DE LABORATORIOS: Como consecuencia de cuanto ya ha sido expuesto, debe quedar claro que puede haber formas diferentes de detectar el mismo organismo en una muestra de alimento. La elección del método a utilizar puede estar regida por varios factores y las excelencias de los distintos métodos constituyen un tema de investigación y debates constantes. Sin embargo, esto puede abocar a una situación en la que las diferencias en cuanto a un resultado facilitado por dos laboratorios refleja simplemente que han sido utilizados métodos diferentes. Además de los problemas derivados de las diferencias intrínsecas en cuanto a la ejecución de métodos diferentes, el mismo método en laboratorios diferentes puede estar sujeto a una variación introducida por factores tales como diferencias en las técnicas, en el material y en su contratación. Algunos ejemplos posibles comprenderían el perfil de la temperatura del autoclave cuando se esterilizan los medios, el tiempo y la temperatura de incubación, las procedencias de los componentes de un medio y, desde luego, la competencia y experiencia del personal del laboratorio. Para soslayar estos problemas posibles se adoptan varias medidas. Varios organismos nacionales e internacionales sancionan varios métodos estándar para realizar determinados análisis debiéndose adoptar uno de éstos en el trabajo de rutina y debiéndose ceñir estrictamente al mismo siempre que sea posible. Los laboratorios de análisis también participan con f recuencia en programas de garantía de la calidad en los que un organismo central distribuye muestras estándar para su análisis especificando con frecuencia el plazo en el que se debe realizar aquel y el método a utilizar. Se comunican los resultados al organismo central, el cual los coteja y remite un informe conjunto a los laboratorios participantes que después juzgan su ejecución con respecto a la de los demás. Finalmente, los laboratorios pueden solicitar alguna forma de reconocimiento independiente. Existen sistemas de calidad, como por ejemplo el programa denominado Good Laboratory Practice, y patrones, como por ejemplo el BS 5750 (ISO9000), que se refieren a calidad de la gestión dentro de la organización pero que no fijan el nivel de calidad o la competencia concretos que se deben alcanzar.
También existen programas de acreditación de los laboratorios que se refieren más a la calidad programas de acreditación de los laboratorios que se refieren más a la calidad o a la ejecución de pruebas concretas. En el RU esta acreditación se solicita a través del Nacional Measurement Accreditation Service (NAMAS) que acredita a los laboratorios sobre una serie total de actividades no precisamente de análisis microbiológico. La mayoría de los países tiene su propia organización equivalente, por ejemplo las designadas con las siglas NATA (Australia), DANAK (Dinamarca), ILAB (Irlanda) y STERLAB (Holanda). El organismo acreditador
inspecciona el laboratorio y sus técnicas para
asegurarse de que las pruebas se llevan a cabo conveniente y correctamente utilizando métodos sancionados acompañados de las medidas adecuadas de control de la calidad establecidas. Entre las características investigadas se encuentran el adiestramiento y las calificaciones del personal, la adecuación del material y de las técnicas en cuanto a contraste y mantenimiento, la participación en un programa de perfeccionamiento de los análisis y la existencia de la documentación completa que dicta los procedimientos de funcionamiento de los laboratorios. La obtención de la acreditación de un laboratorio puede resultar una empresa costosa pero, si se consigue, proporciona una declaración independiente de la pericia del laboratorio y dará mayor confianza a los posibles clientes.
II. PROTOCOLOS DE ANÁLISIS PREPARACIÓN Y TOMA DE MUESTRA DE ALIMENTOS PARA ANALISIS MICROBIOLOGICO: Cuando se trata de los procedimientos de análisis microbiológicos en general, es tácito mencionar la cuidadosa asepsia del lugar de trabajo, la esterilización del material de cultivo y la manipulación adecuada de los utensilios por parte del personal de laboratorio. Para la toma de muestra de piel es recomendable preparar una lámina metálica a la que se ha cortado una ventana (una especie de marco metálico), cuya área interior sea conocida (puede ser de 10 cm 2) que si se dobla ligeramente en las esquinas podría incrustarse fácilmente en la superficie del pescado. Con un bisturí se corta la piel a lo largo de la ventana y luego se le desprende utilizado pinzas. Es importante retirar solo la piel que se desmenuza para proseguir con su análisis. La toma de muestra de músculo de pescado se realiza retirando la piel del lugar de toma de muestra desprendiendo asépticamente 10 gr. De carne cortada en trozos pequeños con ayuda de tijeras y pinzas estériles, para ser pesados en un recipiente estéril (vaso del homogenizador). En el caso de productos secos, salados o similares la toma de muestra se hace simplemente cortando y triturando una cantidad determinada de producto. Cuando se desee analizar productos congelados empacados (por ejemplo filetes de pescado, mariscos, en bolsas plásticas), dejar descongelar al ambiente asépticamente y cuando el producto se halle semi-descongelado, desinfectar la parte externa del envase con un poco de algodón empapado en alcohol de 70 O C , dejar secar y abrir el envase asépticamente con tijeras estériles (bisturí si es necesario) y pesar 10 gr. En trozos pequeños en un frasco estéril (vaso del homogenizador). Cuando se trata de embutidos, frote la parte externa del envase con alcohol d 70oC para su desinfección, deje secar por un momento y retire la película del envase en forma aséptica. Corte el embutido en pequeños trozos desde la parte del centro e incorpore en el frasco.
Debe recordarse que existen considerables diferencias en el recuento, dependiendo de la posición o parte que se tome de una muestra. En cualquier caso, las muestras deben ser siempre bien desmenuzadas. Es importante recalcar que en el caso de no realizar el control microbiológico en forma inmediata a la toma de muestra, como sería lo óptimo, deberá refrigerarse la muestra y analizarse en un lapso máximo de 6 horas. La relación diluyente y muestra es la siguiente la cantidad del diluyente deberá ser igual a 9 veces el peso de la muestra previamente pesada en el frasco del homogenizador estéril (100 ml. De capacidad mínima), coloque la respectiva cuchilla estéril y mezcle bien usando homogenizador o licuadora para obtener una suspensión de muestra 10 veces diluida (dilución 10 -1). En el caso de no contar con un homogenizador ésta operación puede llevarse a cabo triturando la muestra en u mortero con un mazo estéril agregando poco a poco la solución salina estéril y ayudando la trituración con arena limpia estéril. Si se homogeniza 10 cm 2 de piel en 50 ml de solución salina (ó 100 ml), 1 ml. De ésta suspensión es equivalente a 0.2 cm 2 (ó 0.1 cm2) de área de piel. Cada rango de dilución debe registrarse de tal forma de poder calcular la unidad original de peso o área de la muestra al como 1 gr. Ó 1 a 10 cm 2. La solución utilizada para suspender la muestra y efectuar las diluciones correspondientes es una solución de cloruro de sodio al 0.85% (8.5 gr. De cloruro de sodio en 100 ml de agua destilada) de Ph. 7.o a 7.2, posteriormente esterilizada en autoclave a 121 oC por 15 minutos. A 1 litro de ésta solución puede también agregársele 1 gr. De peptona como elemento nutriente en el momento de su preparación. Se recomienda también agregar a 800 ml. De la solución anterior, 1 ml de una solución tampón (solución madre) que se prepara de la siguiente manera: Pesar 34 gr. De fosfato monopotásico (PO 4H2K) y disolverlo en 500 ml. De agua destilada, adicionar 175 ml. De hidróxido de sodio (Na OH) 1.0 N (40 gr. Para 1 litro), agregar agua destilada hasta completar 1 litro y ajustar el Ph A 7.2. El agua de mar esterilizada puede sustituir a las soluciones salinas y a las soluciones de dilución decimal mencionadas.
III. CULTIVOS PUROS El cultivo puro representa las condiciones artificiales para el desarrollo de las bacterias y otros microorganismos y las condiciones impuestas a los microorganismos mediante el manejo del laboratorio. A pesar de esto, para determinar las características de especies concretas de microorganismos, es imperativo que el microorganismo se aísle y se desarrolle en el laboratorio como un cultivo puro. Existe gran variedad de técnicas por medio de Las cuales las diferentes especies en una muestra natural pueden ser aisladas y desarrollarse como cultivo puro. Para marcar bien las definiciones podemos decir que un cultivo puro es aquel que esta formado por microorganismos del mismo género y especie, comúnmente se le llama cepa pura; en cambio un cultivo mixto es aquel en el que están dos o más microorganismos. 3.1. METODOS PARA AISLAR CULTIVOS PUROS 3.1.1. Técnicas de siembra por estrías en placa y técnicas de siembra por difusión en placa. Con un asa bacteriológica, se pasa una porción de la muestra a la superficie de un medio de cultivo hecho a base de agar y se siembra en el medio ya sea por estrías o por difusión. Para sembrar por difusión en placa, por lo común se usa una varilla de cristal estéril para esparcir la muestra. Esta operación hace posible adelgazar la muestra de tal manera en la superficie del agar quedan las bacterias separadas unas de las otras. Cuando se raya adecuadamente el agar con el asa de siembra, las células bacterianas quedan lo suficientemente separadas en algunas áreas de la placa lo que permite estar seguros que la colonia que se desarrolla a partir de una célula no se junte con la que esta desarrollándose a partir de otra célula. Cabe suponer que cada colonia aislada es la descendencia de una sola célula, y por tanto un cultivo puro. En las especies donde las células se agrupan de forma característica, por ejemplo, Staphylococcus y Streptococcus, la colonia se desarrolla a partir de un grupo de células del mismo tipo e igualmente representa un cultivo puro. Una porción de una colonia que se pase a un medio de cultivo en tubo viene a ser un cultivo puro. Después de una incubación apropiada, el desarrollo de cada cultivo de observa en el microscopio o mediante cultivo para verificar que es puro.
Las técnicas de siembra en placas por estrías o por difusión se pueden hacer
convenientemente
y
con
equipo
mínimo;
estos
son
procedimientos de rutina que se efectúan para aislar bacterias o cultivo puro. Aunque una de sus limitaciones es que solo pequeñas cantidades de la muestra pueden ser esparcidas sobre la superficie del medio de cultivo. 3.1.2. Técnica de la placa vertida: El principio de la técnica de la placa vertida es la dilución (adelgazamiento) de la muestra en tubos con agar fundido y enfriado. Se necesita hacer diluciones en más de un tubo fundido para obtener colonias bien aisladas, si es que no se conoce la magnitud de la población bacteriana de la muestra antes de manejarla. El medio se mantiene al estado liquido a una temperatura de 45 0C para permitir que el inoculo se distribuya adecuadamente en el medio. Una vez sembrado el medio se pone en placas de petri, se deja solidificar y después se incuba. Como algunos microorganismos quedan atrapados entre el agar se observaran colonias tanto en la superficie como entre el medio cuando este solidifica. Esta técnica se hace en forma cualitativa y cuantitativamente. Cuando se emplea el procedimiento cuantitativo, podremos determinar el número de bacteria de un tipo particular en la muestra, así como aislarlas en cultivo puro. Las técnicas de siembra por estrías(o por diseminación) y las de placa vertida para aislar cierta clase de bacterias, pueden mejorarse con medios de cultivos selectivos o diferenciales. También es posible tratar el medio para eliminar otro tipo de bacterias diferentes de las que se desean aislar, antes de sembrar en las placas. Por ejemplo, supóngase que la tarea es aislar bacterias formadoras de esporas. Como las esporas son resistentes al calor, la muestra se someterá a temperatura de 850C durante 5 minutos antes de sembrar las placas. El tratamiento de calor destruirá todas o la mayoría de las formas de bacterias no esporuladas. 3.1.3. Técnicas de enriquecimiento del cultivo: Para mejorar las posibilidades de aislamiento de algunos tipos fisiológicos poco frecuentes de bacterias, los procedimientos de siembra
en placa deberán estar precedidos de desarrollo de bacterias en un cultivo de enriquecimiento. Esta afinación en el aislamiento de microorganismos fue introducida por dos de los grandes precursores de la bacteriología. Beijerinck y Winogradsky entre 1890 y 1900. El principio de esto es procurar un ambiente de cultivo diseñado (medio de composición conocida y condiciones especificas de incubación) que pueda favorecer el desarrollo de cierto tipo concreto de bacterias que necesitaremos pero que no sea adecuado para las demás. Las técnicas de aislamiento bacterianos son diversas, la más usada es la técnica de la estría cruzada ( agotamiento por estría) y en esta el propósito o el uso es el de obtener colonias aisladas que puedan ser identificadas posteriormente. En este método se requiere solamente de una o unas placas de medio de cultivo (acordes al proceso de la muestra), en el que se deposita la muestra y se realizan las estrías con un asa microbiológica, es la técnica mas usada en la determinación microbiológica médica. El método de diluciones se emplea principalmente para cuantificar la carga microbiana presente en una muestra, es la técnica mas empleada en la microbiología sanitaria o de alimentos, y consiste en realizar diluciones seriadas de la muestra y colocarlas en las placas de cultivo.
IV. TÉCNICAS DE CULTIVO USADOS EN EL LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD DE LA FIP: Aunque evidentemente existen para el examen de un alimento para descubrir la posible presencia microorganismos, el examen microbiológico completo requiere que cada uno de los propágadores viables sea estimulado para que se multiplique en medios líquidos o en la superficie, o en la matriz de un medio solidificado con agar. El Agar es un polisacárido con varias propiedades interesantes que se obtiene de especies de algas rojas. Aunque es un material complejo y de composición variable, el componente mayoritario del agar es la azarosa que está constituida por unidades alternantes de 3,6-anhidro-1-galactosa (o de 1-galactosa) unida en posición 1,4 y de D-galactosa (o de 6-O-metil-D-galactosa) unida en posición 1,3.
Las propiedades del agar que le hacen útiles para los microbiólogos incluyen la capacidad para formar un gel a bajas concentraciones (1,5-2%) que no influye de modo significativo en el potencial de agua del medio. Éste gel es muy estable a temperaturas muy elevadas por lo que, para “fundirlo”, se necesita un baño de agua en ebullición, o las temperaturas del autoclave. Sin embargo, una vez fundidas, las soluciones de agar permanecen líquidas cuando se enfrían a temperaturas relativamente bajas (aprox. 40 0C) haciendo posible mezclarlo con muestras que contienen organismos viables antes de, o durante su distribución. Otra propiedad útil del agar es su estabilidad frente a la hidrólisis microbiana, a pesar de ser un polisacárido. Únicamente un grupo relativamente reducido de microorganismos es capaz de degradar el agar, presuntamente debido a la presencia de la insólita forma L de la galactosa en el polímero. 4.1. MÉTODOS DE RECUENTO: 4.1.1. Recuento por Placa: En un laboratorio convencional normal el método mas sensible para descubrir la presencia de una bacteria viable consiste en permitir que aumente de tamaño por si sola para formar una colonia visible. Esto constituye la base de la siembra en placa por difusión, de la siembra en placa por estría o del método de Miles y Misra de siembra en placas de gotas de agar, todavía muy utilizados en los laboratorios de microbiología. En el método de siembra en placa por difusión, la muestra (generalmente 1ml) se pipetea directamente a una placa de petri estéril y se mezcla con un volumen apropiado de agar fundido. Aun cuando el agar fundido es entibiado cuidadosamente a 40450C, el choque térmico inflingido a las organismos psicrótrofos puede dar como resultado que éstos no produzcan colonias visibles. El recuento en placa mediante siembra por estría soslaya este inconveniente y también garantiza un medio aerobio pero el volumen de la muestra suele estar limitado a 0.1 ml. El diluyente, para la preparación de la muestra y las diluciones decimales, que se utilice no debe causar daño alguno, por ejemplo choque osmótico, a loa microorganismos. Por ésta razón el agua destilada no es apropiada. Un diluyente que s utiliza corrientemente, conocido como diluyente de recuperación
máxima, contiene un 0,1% de peptona y un 0.85% de cloruro sódico. Los métodos tradicionales de recuento en placa son caros utilizando placas de petri y medios de agar, de modo especial si se lleva a cabo la duplicación adecuada de las placas. 4.1.2. Recuento por el Método del Número Más Probable: El método alternativo para efectuar el recuento de cifras bajas de microorganismos viables es el denominado método del número más probable (NMP). El método se suele basar en la inoculación de series dobles de tubos (generalmente 3,4 o 5) que contienen un medio líquido apropiado y se siembran con tres volúmenes diferentes de muestra o con tres diluciones diferentes del material a examinar (por ej., 10g, 1.0g y 0.1g). el medio que se utiliza tiene que estar ideado para hacer posible juzgar si ha habido o no ha habido crecimiento y el número de positivos en cada volumen o dilución de la muestra se determina después de la incubación de los tubos. El NMP se obtiene recurriendo a una tabla como la que se muestra en la siguiente tabla:
Número
de
tubos NMP
Niveles de confianza del
positivos 000
95% <0.30
100
0.36
0.02 a 1.7
200
0.92
0.15 a 3.5
210
1.5
0.4 a 3.8
300
2.3
0.5 a 9.4
310
4.3
0.9 a 18.1
311
7.5
1.7 a 19.9
320
9.3
1.8 a 36
321
15
3.0 a 38
330
24
4.0 a 99
331
46
9.0 a 198
332
110
20 0 a 400
333
>110 Tabla del Número Más Probable
V. ANALISIS MICROBIOLOGICO 5.1. ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL PESCADO FRESCO, REFRIGERADO Y CONGELADO. I. Objetivos: •
Determinar el grado de frescura y calidad microbiológica en el pescado fresco.
•
Conocer la metodología de análisis microbiológicos para fresco.
II. Materiales – Equipos: Erlenmeyer de 250 ml estériles Pipetas estériles Bisturí estériles Mortero estériles Incubadora
pescado
Balanza analítica Placa petri estériles Tubos de ensayo estériles Cuenta colonias Mecheros Campanas de Dirham. Medios de cultivo Agar Nutritivo Agar Mc conkey Agar T.C.B.S. Agar Baird Parker Caldo E. coli III. PRUEBAS MICROBIOLOGICAS A REALIZARSE •
Numeración total de aerobios mesófilos (30 0C)
•
Presencia total de Vibrio parahaemolyticus
•
Recuento total de Staphylococcus coagulasa (+); St. Aureus.
•
Presencia de Vibrio cholerae
•
Numeración más probable de Escherichia coli.
•
Numeración de Enterobacteriaceas
IV. PROCEDIMIENTO 4.1. Preparación de las soluciones salinas peptonadas 1. 90 ml. De solución salina peptonada, para la solución 10 -1. 2. En dos tubos colocar 9 ml. De solución salina peptonada para las diluciones (10-2 y 10-3). 4.2. Preparación de la muestra (pescado fresco) Piel: cortar con un bisturí esterilizado 10 cuadrados de 1 cm 2 aproximadamente colocar en un Erlenmeyer estéril que contenga 90 ml. De S.S.P. (Solución salina peptonada) homogenizar bien agitando con cuidado; considerar a esta solución como dilución 10 -1. de esta preparación sacar 1 ml. Con una pipeta estéril y colocar en uno de los dos tubos que contiene 9 ml de s.s.p. homogenizar bien, esta seria la dilución 10 -2, homogenizar, y luego sacar 1 ml. Para agregar al otro tubo que contiene 9 ml de s.s.p. considerarla como solución 10 -3.
Músculo: cortar de diferentes partes del pescado (músculo) y triturar en un mortero estéril luego pesar 10 g. y colocarlos en la solución de 90 ml. 10-1. homogenizar y dejar sedimentar por un lapso de 15 minutos. De esta dilución sacar con una pipeta estéril 1 ml. Y colocar en el tubo de 9 ml. (10-2) a partir de esta solución preparar la dilución 10 -3. V. SIEMBRAS MICROBIOLOGICAS APTITUD MICROBIOLOGICA PARA CONSUMO HUMANO Los alimentos pesqueros serán considerados microbiológicamente aptos para el consumo humano cuando cumplan en toda propiedad con los criterios microbiológicos establecidos en la norma técnica sanitaria de MINSA-DIGESA. 5.1. PLAQUEO El agar que ha sido previamente preparado colocarlo en baño maría para que se licue colocar con cuidado en placas estériles en una cantidad que cubra toda la superficie del fondo aproximadamente un cuarto de la altura de la placa. Dejar enfriar para luego efectuar las siembras microbiológicas por superficie.
1. NUMERACIÓN TOTAL DE AEROBIOS MESOFILOS (30 0 C) Siembra por incorporación: Colocar 1 ml De cada dilución o muestra en tres placas estériles por duplicado y luego agregar el medio de cultivo agar nutritivo en una cantidad que cubra el fondo de la placa aproximadamente un cuarto de su altura. Incubación: las placas sembradas incubarlas a 37 0C por 24 horas. Lectura: tomar para el recuento aquellas placas que contengan entre 30 y 300 colonias. 2. NUMERACION DE Vibrio parahaemolyticus Siembra por superficie: colocar 0.1 ml. De cada muestra preparada o muestra en placas por duplicado que contienen medio de cultivo y esparcir bien la muestra con la espátula de Driglasky. Incubación: las placas sembradas incubarlas a 37 0C por 24 horas.
Lectura: tomar para el recuento las placas que contengan colonias entre 30 y 300. 3. RECUENTO TOTAL DE Staphylococcus coagulasa (+) Características: Típicos Gram +, son fermentativos pero no producen gas. Son catalasa +. Se distinguen staphylococcus+ (si producen coagulasa) de los staphylococcus- (no producen coagulasa). Los que producen coagulasa son los más virulentos y patógenos. CULTIVO: sembrar por agar Baird Parker por superficie una asadla de cada dilución en la superficie de agar solidificado por medio de estrías o agregando 0.1 ml de cada muestra preparada. Estas bacterias crecen bien en agar y caldo, pero se usan medios selectivos y diferenciales (agar 110, agar manitol-sal). Estos medios llevan un 5-10% de sal que impide el crecimiento de otras bacterias. También se usa el agar-chapman, agar TPEY, agar Baird Parker. LA PRUEBA DE COAGULASA: Consiste en poner en un tubo de ensayo suero de conejo en contacto con una gota del cultivo. Se incuba durante 4 horas y si se coagula es porque la bacteria produce coagulasa (coagulasa+) si no, es porque no la produce (coagulasa-) Incubar: las placas a 37 0C por 24 horas. Lectura: observar y contar colonias negras lustrosas rodeadas de halo claro. 4. NUMERACION DE Vibrio cholerae Siembra en superficie colocando sobre una placa que contenga agar TCBS 0.1ml de cada dilución o muestra a analizar. Incubar: colocar las placas sembradas en posición normal en la incubadora a 370C x 24 horas. Lectura: observar y contar colonias que muestran un halo oscuro. 5. RECUENTO DE Escherichia coli Sembrar por superficie y por duplicado 1ml de cada dilución en caldo E coli. Incubar: a temperatura 41.5 por 18 a 24 horas. Lectura: observar si hay colonias rojas.
6. NUMERACION TOTAL DE ENTEROBACTERIACEAS Siembra por superficie: colocar 0.1 ml de cada dilución en placas que contengan medio de cultivo Agar Mc. Conkey sólido expandir la muestra con la espátula de driglasky. Incubación: colocar las placas invertidas en la incubadora a 37 0C X 24 horas. Lectura: contabilizar las colonias rojizas rodeadas por un halo del mismo color o rosado claro.
5.2. ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL PESCADO SALADO I. Objetivos. •
Conocer la metodología de análisis microbiológicos para pescado salado.
•
Reconocer la microflora propia del pescado salado.
II. Materiales – Equipos: Erlenmeyer de 200 ml, etc Pipetas Bisturí Mortero Incubadora Balanza analítica Placa petri Tubos de ensayo Cuenta colonias
Campanas de Dirham MEDIOS DE CULTIVO Agar Nutritivo al 15% y al 20% Agar Manitol Salado Agar XLD Agar Sabouraud Agar Baird Parker Caldo Lactosado y CLBVB III. PRUEBAS MICROBIOLOGICAS A REALIZARSE
Numeración total de microorganismos halófilos viables
Numeración total de Micrococáceas
Numeración de Serratia salinaria
Numeración total de hongos y levaduras
Recuento total de Staphylococcus coagulasa (+)
numeración de Streptococcus faecalis
Numeración más probable de coniformes totales.
IV. PROCEDIMIENTO 4.1. Preparación de las soluciones salinas peptonadas 1. colocar 90 ml. De solución salina peptonada en un erlenmeyer, para la solución 10 -1. 2. E n dos tubos colocar 9 ml. S.S.P. para las soluciones (10 -2 y 10-3). 4.2. Preparación de la muestra (pescado salado) Piel: cortar con un bisturí esterilizado 10 cuadrados de 1 cm 2 aproximadamente colocar en un erlenmeyer estéril que contenga 90 ml. De S.S.P. (Solución salina peptonada) homogenizar bien agitando con cuidado; considerar a esta solución como dilución 10 -1. de esta preparación sacar 1 ml. Con una pipeta estéril y colocar en uno de los dos tubos que contiene 9 ml de s.s.p. homogenizar bien esta seria la dilución 10 -2, homogenizar, y luego sacar 1 ml. Para agregar al otro tubo que contiene 9 ml de s.s.p. considerarla como solución 10 -3.
Músculo: cortar de diferentes partes del pescado salado (músculo) para una representatividad y triturar en un mortero estéril luego pesar 10 g. y colocarlos en la solución de 90 ml. 10 -1. homogenizar y dejar sedimentar por un lapso de 5 minutos. De esta dilución sacar con una pipeta estéril 1 ml. Y colocar en el tubo de 9 ml. (10 -2) a partir de esta solución preparar la dilución 10 -3. V. SIEMBRAS MICROBIOLOGICAS 5.1. PLAQUEO El agar que ha sido previamente preparado y colocarlo en baño maría para que se licue colocar con cuidado en placas estériles en una cantidad que cubra toda la superficie del fondo aproximadamente un cuarto de la altura de la placa. Dejar enfriar para luego efectuar las siembras microbiológicas por superficie. •
NUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS HALÓFILOS Sembrar por incorporación: Colocando 0.1 ml. De cada dilución (muestra) en placas estériles y luego agregar el agar nutritivo al 15% y 20% de ClNa. Extender cuidadosamente el medio y dejar solidificar. Incubar: a 370C por 1, 2, 3,4 semanas. Lectura: tomar para el recuento de microorganismos halófilos viables aquellas placas que contengan entre 30 y 300 colonias.
•
NUMERACION DE MICROCOCCACEAS Sembrar por superficie: colocar 0.1 ml. De cada muestra preparada
sobre las placas que contiene agar Manitol salado
extender bien sobre la superficie del agar sólido. Incubar : a 370C por 24 horas. Lectura: tomar para el recuento de bacterias aquellas placas que contiene colonias que presentan halo amarillo luminoso. •
NUMERACION TOTAL DE Serratia salinaria
Siembra por superficie: sembrar por estrías con el asa de Kolle a partir de cada dilución o muestra preparada en la superficie en agar sólido de XLD. Incubar : las placas a 370C por 24 – 48 horas. Lectura: para la lectura observar y contar colonias que muestran un halo oscuro. •
NUMERACION TOTAL DE HONGOS Y LEVADURAS Siembra por superficie: sembrar por el modo de superficie, es decir, primero plaque el medio (Agar saboraud), luego siembre en la parte superficial agregando 0.1 ml. De cada dilución. Incubar: al medio ambiente con placas en oposición normal. Lectura: para la lectura tomar placas que contengan colonias entre 30 – 300.
•
NUMERACION TOTAL DE Staphylococcus coagulasa (+) Sembrar 0.1 ml. De cada dilución sobre la superficie en placas que contenga el medio Baird Parker sólido esparcir bien la muestra con el asa de Kolle. Incubación: las placas sembradas colocarlas en la incubadora en posición normal a 37 0C x 24 horas. Lectura: observar y contar colonias negras lustrosas rodeadas de halo claro.
•
NUMERACION MAS PROBABLE DE COLIFORMES TOTALES Siembra: agregar 1 ml de cada dilución en caldo Mc conkey hacerlo por triplicado. Incubación: colocar los tubos sembrados a temperatura de 37 0C X 24-28 HORAS. Lectura: observar si hay producción de gas dentro de la campana Dirham. (Gas+). Considera lectura positiva y luego sembrar una asada de cada tubo positivo en C.L.B.V.B. para la confirmación.
5.3.ANALISIS MICROBIOLOGICO DE EMBUTIDOS DE PESCADO . I.Objetivos •
Prepara muestras microbiológicas de embutidos de pescado.
•
Efectuar análisis microbiológicos a embutidos de pescado.
•
Determinar la calidad microbiana de los embutidos
•
Conocer la flora microbiana de los embutidos de pescado.
II. Materiales – Equipos: Erlenmeyer de 250 ml estériles Pipetas estériles Bisturí estériles Mortero estériles
Incubadora Balanza analítica Placa petri estériles Tubos de ensayo estériles Cuenta colonias Mecheros Medios de cultivo Agar Nutritivo Agar Mc conkey Agar Baird Parker Canamicina Esculina Azida Caldo infusión cerebro corazon (ICC). III. PRUEBAS MICROBIOLOGICAS A REALIZARSE o
Numeración total de microorganismos viables
o
Numeración total de Enterobacteriaceas
o
Numeración total de Vibriones
o
Recuento de Listeria
o
Recuento de Bacillos
IV. PROCEDIMIENTO 4.1. Preparación de las soluciones salinas peptonadas 1. 90 ml. De solución salina peptonada, para la solución 10 -1. 2. E n dos tubos colocar 9 ml. De solución salina peptonada para las soluciones (10-2 y 10-3). 4.2. Preparación de la muestra (embutidos): Cortar longitudinalmente los embutidos y observar la presencia de poros o huecos, efectuar un análisis físico organoléptico a los embutidos. Luego triturar una determinada muestra representativa de los embutidos en un mortero de porcelana, pesar 10 gramos de muestra y colocar en un erlenmeyer estéril que contenga 90 ml. De S.S.P. (Solución salina peptonada) homogenizar bien agitando con cuidado; considerar a esta
solución como dilución 10 -1. de esta preparación sacar 1 ml. Con una pipeta estéril y colocar en uno de los dos tubos que contiene 9 ml de s.s.p. homogenizar bien, esta seria la dilución 10 -2, homogenizar, y luego sacar 1 ml. Para agregar al otro tubo que contiene 9 ml de s.s.p. considerarla como solución 10 -3. V. SIEMBRAS MICROBIOLOGICAS 5.1. PLAQUEO El agar que ha sido previamente preparado colocarlo en baño maría para que se licue colocar con cuidado en placas estériles en una cantidad que cubra toda la superficie del fondo aproximadamente un cuarto de la altura de la placa. Dejar enfriar para luego efectuar las siembras microbiológicas por superficie. VI. SIEMBRA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO •
NUMERACIÓN TOTAL DE MICROORGANISMOS AEROBIOS FACULTATIVOS VIABLES. Siembra por incorporación: Colocando 1 ml De cada dilución o muestra en tres placas estériles por duplicado y luego agregar el medio de cultivo agar nutritivo en una cantidad que cubra el fondo de la placa aproximadamente un cuarto de su altura. Incubación: las placas sembradas incubarlas a 37 0C por 24 horas. Lectura: tomar para el recuento aquellas placas que contengan entre 30 y 300 colonias.
•
NUMERACION DE ENTEROBACTERIACEAS. Siembra por superficie: colocar 0.1 ml. De cada muestra preparada o muestra en placas por duplicado que contienen medio de cultivo AGAR Mc conkey sólido y
expandir la muestra con
cuidado tratando de no destruir el medio con el asa de kolle. Incubación: las placas sembradas incubarlas a 37 0C por 24 horas. Lectura: contabilizar las colonias rojizas rodeadas por un halo del mismo color o rosado claro. •
DETERMINACIÓN DE Enterococos y Estreptococos faecalis.
Se utilizaran tres series de diluciones de tres o cinco tubos de caldo azida dextrosa (AD) a los cuales se les inocula: 0.1 ml de cada una de las diluciones 10 -1 10+2 10-3 de las muestra homogenizadas y se incubarán a 35.5 0C por 24 -48 horas. De los tubos de AD positivos, se introduce un asa estéril y luego se siembra por estrías, en agar KF-Estreptococos y se incuban a 37 0C por 24 horas. De las colonias amarillas que crezcan en este agar, se toma una asada y se trasfiere a tubos que contengan 9 ml de caldo infusión cerebro corazon (ICC) con 65% de NaCl que se incuban luego a 450C con agitación por 24 horas. Transcurrido ese tiempo, se efectuaran comparaciones con los tubos positivos de AD que crecieron en agar KF-Estreptococos y de los tubos de ICC se apuntan resultados y se compararon estos resultados con las tablas del Número más probable para determinar el calculo de Enterococos y Estreptococos presentes en las muestras. •
NUMERACION DE Streptococcus faecalis. Siembra en superficie colocando sobre una placa que contenga agar canamicina esculina azida 0.1ml de cada dilución o muestra a analizar. Incubar: las placas a 370C x 24 horas. Lectura: observar colonias negras o que muestran un halo oscuro.
•
DETERMINACIÓN DE Listeria. o
Características: Bacilo no esporulados, Gram (+), con extremos muy redondeados. Son relativamente polimórficos pueden presentar
flagelos.
Son
bacilos,
facultativos,
móviles
(movimiento tambaleante característico). o
Cultivo: sembrar en Agar Sangre (hemólisis) en superficie una asada de cada muestra preparada o en otros en medios de enriquecimiento como suero (de caballo) , o el medio PALCAM.
o
Incubar: a temperatura de 370C. Desprenden colonias muy desagradables. En agar las colonias son de color rojo con halo transparente.
•
DETECCIÓN DE BACTERIAS ANAERÓBICAS. o
Sembrar en dos series por triplicado 3-5g a cada tubo en 30 ml de BHI + Medio Carne Cocida.
o
Cubrir con parafina e incubar una serie a 37 0C por 24 horas y a 550C por 24 horas. Observar la aparición de turbidez.
o
Transplantar una azada de cada tubo al Medio Carne Cocida e incubar a 370C por 24 horas y a 55 0C por 24 horas.
5.4. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS ENLATADOS CONSERVAS I.
OBJETIVOS: •
Efectuar un análisis físico organoléptico en conservas de pescado.
•
Determinar la calidad sanitaria microbiológica de un producto hidrobiológico en conservas.
•
Conocer y evaluar conservas de productos hodrobiológicos en estado normal y alterado.
II.
MATERIALES Y EQUIPOS: Incubadora Balanza analítica
Placas Petri Tubos de ensayo Erlenmeyer Pipetas Cuchillo Algodón Medios de cultivo •
Caldo de infusión Cerebro Corazón (BHI) + 0.1% de almidón soluble.
•
Caldo Infusión Cerebro Coraazón (BHI) + Carne Media Cocida + Parafina.
•
III.
Agar Carne Hígado
PRUEBAS A REALIZARSE A. CONSERVAS NORMALES. 1. Efectuar un análisis físico organoléptico al envase externo e interno, y luego al contenido 2. análisis microbiológico •
Determinación de bacterias aerobias típicas y facultativas (Mesófilas y Termófilas)
•
Determinación de bacterias anaeróbicas estrictas (Mesófilas y Termófilas)
B. CONSERVAS ALTERADAS. 1. Aislamiento de microorganismos aeróbicos 2. Aislamiento de microorganismos anaeróbicos. IV.
PROCEDIMIENTO 4.1. Pre – Incubación de Conservas: •
Llevar cuidadosamente las conservas a analizar con agua jabonosa.
•
Séquelas colocándolas sobre hojas de papel filtro a fin de detectar durante el periodo de incubación cualquier fuga del producto.
•
Efectúe una Pre incubación, colocando las conservas a temperatura de 370C durante 4 semanas y otra a 55 0C por 10 días.
4.2. Apertura de Latas •
Efectúa la apertura en ambiente estéril.
•
Desinfecte la cubierta del envase con un algodón impregnado de alcohol.
•
Las latas que no presentan hinchamiento flaméelas en el mechero, abra la lata eliminando toda la tapa que contenga todo el código de producción.
•
Vierta el contenido de cada envase en un depósito estéril, tome muestras de la parte central y bordes del contenido de la conservas.
4.3. Siembra en los Medios de Cultivo a. Conservas Normales •
DETECCIÓN
DE
BACTERIAS
AERÓBICAS
TÍPICAS
Y
FACULTATIVAS (MESÓFILAS Y TERMÓFILAS) •
Sembrar en dos series por triplicado 5 g. en 30 ml de caldo de infusión cerebro corazón (BHI) + 0.1 % de almidón soluble.
•
Incubar a 370C y 550C.
•
Observar si aparece turbidez para transplantar de cada tubo una azada agar Carne Hígado e incubar una serie a 370C por 24 horas y otra a 55 0C por 24 horas.
•
Lectura: observar si hay crecimiento en agar Carne Hígado. DETECCIÓN DE BACTERIAS ANAERÓBICAS
•
•
Sembrar en dos series por triplicado 5 g en cada tubo en 30 ml de BHI +Medio Carne Cocida.
•
Cubrir con parafina e incubar una serie a 37 0C por 24 horas y a 550C por 24 horas. Observar la aparición de turbidez.
•
Transplantar una azada de cada tubo al Medio Carne Cocida e incubar a 37 0C por 24 horas y a 55 0c por 24 horas.
b. Conservas Alteradas
1. Aislamiento de Microorganismos Aeróbios •
Sembrar una porción de la muestra en Medio Carne Cocida.
•
Incubar a la misma temperatura de pre – incubación (37 0C – 550C )
2. Aislamiento de Microorganismos Anaeróbicos •
Extender una porción de la muestra en Agar Caldo Carne Cocida.
•
Incubar en condición anaeróbica a la misma temperatura de preincubación ( 37 0C – 550C)
•
•
Lectura A partir de las colonias aisladas realizar el conteo en cuenta colonias, si el germen es Gram negativo o Gram positivo efectúe pruebas bioquímicas a fin de identificar el tipo de microorganismos.
VI. ALGUNOS MÉTODOS PARA DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS 6.1. Método rápido para Listeria sp.
10-1 Muestra: 25 g/ml
Caldo Fraser suplementado a 1/2concentración 225 ml Incubar 18 h a 24 h / 35 0C Suplemento antimicrobiano : Acriflavina y Ac. Nalidixico. Suplemento de citrato férrico de amonio
Caldo Fraser suplementado completo 10 ml 0 Incubar 24 h / 30 C Suplemento antimicrobiano: Acriflivina y Ac. Nalidixico
Tomar una alícuota 2 ml y hervir x 15 min. En baño de agua.
Aplicar en el dispositivo Singlepath Listeria o Singlepath L mono.
Expresión de resultados: Presencia / Ausencia de Listeria sp. X 25 gr. De alimento.
6.2. Método rápido GLISA para Salmonella sp. (RI AOAC validado)
Agua peptonada tamponada 225 ml Incubar 18h a 24 h / 35 0C
10-1 Muestra: 25 g/ml
Caldo Rappaport Vassiliadis 10 ml Incubar 24 h / 41.5 0C
Tomar una alícuota 2 ml y hervir x 15 min. En baño de agua.
Aplicar en el dispositivo Singlepath Salmonella.
Expresión de resultados: Presencia / Ausencia de Listeria sp. X 25 g de alimento. •
Agua peptonada tamponada: peptona de caseina 10 g cloruro de Na. 5 g dihidrogeno fosfato de potasio 1.5 g hidrógeno fosfato disódico 9 g.
6.3. ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TOTALES EN AGUAS (Standard Methods) Muestra original 1 ml
9 ml de agua peptona 0.1 %
10-1
10 ml a cada tubo
1 ml a cada tubo
10 10 ml caldo Laurel Doble ml caldo Laurel Simple
1 ml a cada tubo
10 -1 10
1 10 ml caldo Laurel Simple
Incubar a 35 +/- 0.50C x 24-48 h
Seleccionar los tubos positivos (presencia de gas) Tomar 1 asada de cada tubo positivo e inocular en caldo Brila
Incubar a 35 +/- 0.50C X 24-48 H
Para el resultado final verificar la tabla de NMP.
6.4. MÈTODO RÁPIDO PARA LE DETECCIÓN SIMULTÁNEA DE COLIFORMES TOTALES Y E. coli EN ALIMENTOS CON AGAR CHROMOCULT COLIFORMES. 9 ML Agua peptona 0.1% 90ml A.P. 0.1 %
10-2 Muestra: 10g/10ml
10-3
PLACAS ESTÉRILES
Una vez colocado 1 ml de cada dilución (por duplicado) verter el agar chromocult coniformes a cada placa, previamente licuado (a 45 0C). Incubar a 350C x 24 h
Elegir las placas con 20 – 200 colonias Colonias Rojas o Salmón y Colonias Azul Violetas Solo colonias azules: Escherichia coli
Prueba de confirmación “in situ” Reacción de Indol Agregar 1 gota de reactivo De Indol a la colonia: +: Color Rojo
Expresión de resultados: Ufc / g alimento.
BIBLIOGRAFIA:
Enlaces de Internet:
ANEXOS:
Balanza analítica donde se pesa la muestra
Estufa para determinación esterilización de materiales.
Medios de
cultivo utilizados en microbiología
Cocina con 6
hornillas para calentar los medios de cultivo
Incubadora: para incubación de microorganismos
Autoclave para esterilización de medios.
Cuentacolonias
Desarrollo de E.coli en medio de cultivo TBX
Desarrollo de salmonella sp. En medio de cultivo XLD
Desarrollo de salmonella sp. En medio de cultivo BPLS
Esterilización de los materiales usados para la siembra.
Forma correcta
de hacer la siembra cerca del mechero.
Preparación de medios de cultivo, baño maría.
Crecimiento de hongos y levaduras en medio de cultivo.
Tubos con
Medio de cultivo MMGM para determinación de E coli.
Midiendo el Ph adecuado de los medios de cultivo.
