Facultad de Ciencias Aplicadas Departamento de Ciencias de la Vida Ingeniería en Biotecnología
Laboratorio de Enzimología INTEGRANTES: Cynthia Andrade Anahí Boada Carlos Ortiz 2015-0505-15 15 FECHA: 2015-
ASIGNATURA: Enzimología
1. TITUL TITUL !E LA "R#CTICA: "R#CTICA: MODIFICACI! DE "A AC#I$IDAD E!%IM&#ICA DE" A #I'O(I!A(A #I'O(I! A(A A )A'#I' )A'#I' DE *!A M*E(#'A M*E(#' A DE C+AM)I,O! C+AM)I, O! $. %&ETI'S %&ETI'S:: $.1 b(eti) b(eti)oo General General Modi.i/ar la a/tiidad enzimti/a de la enzima tirosina resente en 3na m3estra de /hami4n
$.*.$. b(eti)o+ E+,e-íi-o+ Analizar el e.e/to de la temerat3ra so6re la a/tiidad enzimti/a de la tirosina Determinar la elo/idad m7ima y la /onstante de Mi/haelis-Mentel a artir de la aria/in del s3strato Determinar la in.l3en/ia del /ido /inmi/o /omo 3n inhi6idor enzimti/o en la rea//in
*. /ARC /ARC TE TERI RIC C #-id #-idoo Cin0 Cin0mi mi-o -o:: Este /om3esto es /aaz de 3nirse a los gr3os aminos o /ar6o7íli/os8 6lo93eando el a//eso de la tirosina al sitio a/tio de la enzima :Martínez8 200;< Inibi-i2n Enzim0ti-a: "a a/tiidad enzimti/a se 3ede inhi6ir8 es de/ir8 red3/ir o eliminar la a/tiidad enzimti/a o /atalíti/a de enzimas ese/í.i/as :Martínez8 200;< Ee-to de la tem,erat3ra:*n a3mento en la temerat3ra roo/a 3n a3mento de la elo/idad rea//i rea//in n hasta /ierta /ierta temerat temerat3ra 3ra otima otima ya 93e des3=s des3=s de >5? >5?C C se /omienza /omienza a rod3/i rod3/irr la desnat3raliza/in8 la mayoría de las enzimas en mamí.eros tienen 3na temerat3ra otima de @?C y or en/ima en/ima de de esa temerat temerat3ra 3ra la enzima enzima /omienza /omienza a ina/tiarse ina/tiarse y se destr3ye destr3ye :Cam6el :Cam6ell8l8 200< 200< Tiro+ina+ Tiro+ina+a: a: Es 3na enzima 93e /ataliza la hidro7ila/in de mono.enoles y la o7ida/in de odi.enoles a o-93inoles8 rea//iones 93e /onierten a la enzima en /lae ara la síntesis de igmentos8 /omo es el /aso /as o de la melanina8 tanto en e3/ariotas /omo en ro/ariotas. En resen/ia de /ate/ol8 se .orma 6enzo93inona "os hidrgenos e7traídos del /ate/ol se /om6inan /on el
o7ígeno ara .ormar ag3a :)=rez Ortiz8 2010<
Con-entra-i2n del +3+trato: En toda rea//in /atalizada or 3n enzima8 si se mantiene /onstante la /on/entra/in del E8 la elo/idad de la rea//in a3menta e7onen/ialmente al in/rementarse la /on/entra/in del s3strato8 ya 93e al e7istir ms mol=/3las de s3strato es ms ro6a6le el en/3entro /on el enzima y la .orma/in del /omleo E-( Esto es de6ido a 93e el enzima est sat3rada or el s3strato :)=rez Ortiz8 2010< 'elo-idad de Rea--i2n: Es el índi/e de /am6io /on el tiemo de la /on/entra/in de 3n rea/tio o rod3/to Al determinar la elo/idad de 3na rea//in8 lo 93e se o6sera es la aria/in de la /on/entra/in de 3no o ms de los rea/tios o de los rod3/tos de rea//in en .3n/in del tiemo :)=rez Ortiz8 2010< 4. RESULTA!S Medición de la actividad difenolasa Enzima: 0.1 ml de extracto enzimático Buffer: 1 ml de tampón acetato 10 mM Sustrato: 1 ml de catecol 5 mM −1 −1 ε =1050 M cm
#a6la 2 /edi-i2n de la a-ti)idad dienola+a
∆
Tiempo (s)
Abs
Concentración (U/)
30
0,321
305,714
60
0,314
299,048
6,667
90
0,309
294,286
4,762
120
0,305
290,476
3,810
!C
|¿|
ε ∗b ∆ C =¿
( 0,321) C 1=
min M μM = 3.05714∗10−4 ∗106=305.714 −1 min l∗min 1050 M ∗cm ∗1 cm −1
C 1=305.71
U L
( 0,314 ) C 2=
min M μM =2.99048∗10−4 ∗10 6=299.048 −1 min l ∗min 1050 M ∗cm ∗1 cm −1
C 2=299.048
U L
( 0,309 ) C 3 =
min −1
−1
∗cm ∗1 cm
1050 M
=2.94286∗10−4
M μM ∗106=294.286 min l∗min
=2.90476∗10−4
M μM ∗10 6=290.476 min l∗min
U L
C 3 =294.286
( 0,305 ) C 4 =
min −1
1050 M
C 4 =290.476
−1
∗cm ∗1 cm
U L
( 0.321−0.314 ) ∆ C =
min −1
1050 M
∗cm−1∗1 cm
=6.667∗10−6
M μM U ∗106= 6.6667 =6.667 min l∗min L
= 4.762∗10−6
M μM U ∗106= 4.762 =4.762 min l∗ min L
=3.810∗10−6
M μM U ∗106=3.810 =3.810 min l∗min L
(0.314 −0.309 ) ∆ C =
min −1
1050 M
−1
∗cm ∗1 cm
( 0,309−0.305 ) ∆ C =
min −1
1050 M
−1
∗cm ∗1 cm
Concentración "s Tiempo 310.000 305.000 300.000
f(x) = - 0.17x + 310
Concentración (U) 295.000 290.000 285.000 280.000 20
40
60
80
Tíempo (s)
100
120
140
Figura 2.Medicion de la actividad difenolasa
C0l-3lo de 5m 6 'ma7 (e de6e ha/er la reresenta/in de "ineeaer-B3r /orresondiente y eal3ar las magnit3des de M y $MAG ara lo /3al se midi la a/tiidad enzimti/a ariando la /on/entra/in de /ate/ol en la /elda de medi/inH 50M8 ;;M8 100M8 200M8 500M8 1mM y @mM )ara ello se mez/l en 3na /36eta ese/tro.otom=tri/a de 1 /m de eso ti/oH 1m" de /ate/ol :a di.erentes /on/entra/iones<8 l3ego 1m" de tamn de a/etato 10mM de + 5 y se a4adi 01m" de e7tra/to enzimti/o
'ARIACI8N !EL SUSTRAT #a6la @ /edi-i2n de A-ti)idad Enzim0ti-a a dierente+ -on-entra-ione+ de Cate-ol
!ATS Tiem,o
*> > @> 1$> Tiem,o *> > @> 1$>
1 9> ?/ 0 015 015 01; 01;
1 9> ?/ 0 0005J@@@@ @ 0002K1;;; 0001K5555 ; 0001K5555 ;
$ ?/ 0 022 02J1 02J5 02JJ
* 1>> ?/ 0 0@0J 0@2K 0@@5 0@@
4 $>> ?/ 0 0@J 0@K> 0@K 0>
9 9>> ?/ 0 0;5 0; 0;>@ 0;21
1 m/ 0 0>J 01; 0;J 0;;K
; * m/ 0 0@1 0;J5 0;5; 0;>
ACTI'I!A! ENI/ATICA $ * 4 9 ; ?/ 1>> ?/ $>> ?/ 9>> ?/ 1 m/ * m/ 0 0 0 0 0 0 00102;;; 0021;;;; 000K0;;; 0012;;;; 002>K@@@@ 002>@;;; 0005>J@@ 000>;J@@@ @ 000;5;;; 00111;;; 0011K@@@@ 0011>1;; 000@222 0001>>> 000@1;;; 2 000>>1111 > 000;@@@@ 0002JJJK 0002J0J@ 0002> @ 000@@@@@@ 000515 000555 0005@K1; #a6la > !oble+ in)er+o+ 1B' 1B DS 1BDS 1B' JKJ2010 002 @ 51;J5 0015 2 >>JJ215 001 @
@0;5>2 0005 @ 221>0@0 0002 ; 1KK00>> 0001 K 20;@@K1K 0000@@@ >
Comportamiento#ic$aelis%#enten 0.06 0.05 0.04
V (m#/s)
R² = 0.79
0.03 0.02 0.01 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
&' (m#)
Fig3ra *. C3ra de Mi/haelis - Menten ara Cate/ol
Acti"idad enim*tica 0.06 0.05
f(x) = 0x + 0.01 R² = 0.91
0.04
+/V
0.03 0.02 0.01 0 0
10
20
30
40
50
+/'
60
70
80
90
100
Fig3ra 4. 'eresenta/in "ineeaer L B3r Inersos de las elo/idades enzimti/as .rente a los inersos de las /on/entra/iones de s3strato Vmax =71,9424 uM / seg Km= 0.02877 uM
INHI%ICI8N ENI/#TICA CN #CI! CIN#/IC (e de6e reresentar /on el m=todo de Di7on )ara ello se realizaron dos series de medidas de la a/tiidadH 3na /on 1m" de /ate/ol de /on/entra/in de 2 mM y /on/entra/in aria6le de /ido /inmi/o desde 0 hasta 0> mM :1 ml< y otra /on /ate/ol 05 mM y /on/entra/in aria6le de /ido /inmi/o desde 0 hasta 0> mM :1ml<
Cate-ol: $m/ #a6la 5 /edi-i2n de la -on-entra-i2n -on #-ido Cin0mi-o a dierente+ -on-entra-ione+ de Cate-ol CNCENTRACIN AC CIN#/IC 0 081 082 08@ 08> Tiem,o 180;5 08>; 0855; 085>K 08>JK > 180K> 08J;> 08J@ 08J@@ 08J2K *> 1812> 08JJ 08J2 08JK 08J5; > 1812@ 08JJ; 08JJ> 08JJ2 08J;5 @> 181@ 08K01 08JK2 08JK 08J2 1$>
Cate-ol: >.9m/ #a6la 5 /edi-i2n de la -on-entra-i2n -on #-ido Cin0mi-o a dierente+ -on-entra-ione+ de Cate-ol
Tiem,o > *> > @> 1$> "romedio
CNCENTRACIN AC CIN#/IC 0 081 082 08@ 0852 0850J 08501 08>KJ 08;0J 085J 0851 085;> 08;;> 085K 085; 0852 08K 08;2; 085J@ 085J2 08J0> 08;KK 08;;2 08;5J 08;2
08;0@>
085J;
085;5J
08> 08>K@ 0855J 08552 085J 08;@ 085;>
Ab+ 08;>>K52@ 085>;;;; 085510> 085@JJ51 085@1>2J J ;2 > ; 155805082 1>801@8K 1J81>825 1J5858K 1J;81082 0 21 2 >@ 1@
'$ 1B'
DI
1B'1 08K>1>K0 J 1228J08J K 1@081>@8K @K 1@081;81 2J 1@>82@81 K
0 081 082 08@ 08>
1B'$ 155805082 0 1>801@8K 21 1J81>825 2 1J5858K >@ 1J;81082 1@
,-.,-'-/TACI0/ D- DI10/%2-BB 2
f(x) = 0.74x + 1.62 1.5
f(x) = 0.86x + 1.05 1/V
1
0.5
0
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
[I]
Fig3ra 9 Re,re+enta-i2n Lineea)er %3r. EFECT !E LA TE/"ERATURA Tem,erat3ra $9 Grado+ Centígrado+ Tiem,o
Ab+orban-ia
C ABK
0 @0 ;0 K0
081@ 082;J 08@5@ 08>>K
1;>8; 25582> @@;81K >28;2
0.45
120 08502 >J810 Tabla . $alores de a6sor6an/ia y /on/entra/in a 25 grados /entígrados a di.erentes tiemos
Temperatura 34 5rados Centígrados 600.00 500.00 400.00 300.00 Concentración (micro molar) 200.00 100.00 0.00
f(x) = 2.66x + 172.57 R² = 0.99 Line! ()
100 0 200
Tiempo (segundos)
Fig3ra . r.i/a /on/entra/in s tiemo a 25 rados Centígrados Tem,erat3ra *9 Grado+ Centígrado+ Tiem,o
Ab+orban-i C ABK a 0 0820J 1KJ810 @0 08@J @;0800 ;0 08>K; >28@J K0 085>; 520800 120 08;1J 5JJ85 Tabla ;. $alores de a6sor6an/ia y /on/entra/in a @5 grados /entígrados a di.erentes tiemos
Temperatura 64 5rados Centígrados 800.00 600.00
Concentración (micromolar)
f(x) = 3.14x + 239.62 R² = 0.94
400.00
Line! () 200.00 0.00 0
50
100
150
Tiempo (segundos)
Fig3ra ;. r.i/a /on/entra/in s tiemo a @5 rados Centígrados
Tem,erat3ra 9> Grado+ Centígrado+ Tiem,o
Ab+orban-i C AB a K 0 08>>@ >218K0 @0 08;2> 5K>82K ;0 08;5@ ;218K0 K0 08;K ;;@8J1 120 0815 ;J08K5 Tabla . $alores de a6sor6an/ia y /on/entra/in a 50 grados /entígrados a di.erentes tiemos
Temperatura 47 5rados Centígrados 800.00 600.00
Concentración (micromolar)
f(x) = 1.96x + 479.05 R² = 0.81
400.00
Line! ()
200.00 0.00 0 20 40 60 80 100120140
Tiempo (segundos)
Fig3ra . r.i/a /on/entra/in s tiemo a 50 rados Centígrados Tem,erat3ra ;> Grado+ Centígrado+ Tiem,o
Ab+orban-i C ABK a 0 082@ 22581 @0 082@K 228;2 ;0 082>5 2@@8@@ K0 082>; 2@>82K 120 082>; 2@>82K Tabla @. $alores de a6sor6an/ia y /on/entra/in a 0 grados /entígrados a di.erentes tiemos
Temperatura 87 5rados Centígrados 235.00 230.00
Concentración (micromolar)
f(x) = 0.08x + 226.29 R² = 0.85
Line! ()
225.00 220.00 0 20 40 60 80 100120140
Tiempo (segundos)
Fig3ra @. r.i/a /on/entra/in s tiemo a 0 rados Centígrados Tem,erat3r A-ti)idad a Enzim0ti-a Tabla 1>. $alores de a/tiidad enzimti/a a di.erentes temerat3ras
Acti"idad -nim*tica 3.5 3 2.5 2 "#$i%i&& 'ni*$i# 1.5 1 0.5 0 20
30
40
50
60
70
80
Temperatura
Fig3ra 1>. r.i/a de A/tiidad Enzimti/a a di.erentes temerat3ras 9. !ISCUSI8N
/edi-i2n de la a-ti)idad dienola+a Como a.irma :M34oz8 2012<8 "a di.enolasa es 3na enzima monom=ri/a /on .orma elisoidal /3yo /entro a/tio est .ormado or 3n haz de /3atro h=li/es al.a y or lminas 6eta Cada 3no de los tomos de /o6re est /oordinado or tres resid3os de histidina 'aria-i2n del +3+trato (egNn )=rez Ortiz8 :2010< si el )+ y la temerat3ra de 3n sistema enzimti/o se mantiene /onstante ero hay e7/eso de s36strato8 la intensidad de la rea//in es dire/tamente roor/ional a la /antidad de enzima resente "os datos o6tenidos en la r/ti/a nos indi/ 93e a di.erentes /on/entra/iones la aria/in del s3strato s3rge /on.orme i6a aanzando la rea//in en la 93e o/o a o/o .3e s3s a6sor6an/ias rimero se in/rementaron y l3ego .3eron dismin3yendo8 lo 93e e7li/a 93e el s3strato emez a rea//ionar /on la enzima y /on.orme trans/3rría el tiemo emez trans.ormarse a rod3/to y o/o a o/o la elo/idad emez a dismin3ir "os elo/idad m7ima o6tenida .3e de 18K>2> 3Mseg 93e es dire/tamente roor/ional a la /antidad de la enzima lo 93e nos indi/a 93e h36o 3na 63ena a/tiidad enzimti/a Inibi-i2n Enzim0ti-a Como a.irma Martínez :200;< el /ido /inmi/o se ha /ara/terizado /omo 3n inhi6idor no /ometitio de la tirosinasa de /hami4n8 donde =ste o/3a el siti a/tio de la enzima8 estor6ando al s3strato 6lo93eando la rea//in En los res3ltados o6tenidos en la r/ti/a realizada se /omro6 la a//in del /ido /inmi/o .rente a la enzima tirosinasa /on el gr.i/o de Di7nPe668 donde se eiden/i 93e s3s endientes eran di.erentes8 ha/iendo 93e s3 elo/idad m7ima se altere dismin3yendo /on.orme se a3mente el inhi6idor alterando el aan/e de la rea//in Ee-to de la tem,erat3ra (egNn :Cam6ell8 200< 3na rea//in enzimti/a se in/rementa al a3mentar la temerat3ra8 sin em6argo8 or en/ima de /ierta temerat3ra la elo/idad de la rea//in enzimti/a /ae a6r3tamente En la r/ti/a realizada se /omro6 /omo la temerat3ra in.l3ye so6re la elo/idad de la rea//in y /onstatamos gra/ias a la gr.i/a o6sera 93e la temerat3ra tima de la tirosinasa es @5 rados Centígrados
. CNCLUSINES (e modi.i/ la a/tiidad enzimti/a de la enzima tirosina resente en 3na m3estra de /hami4n a tra=s de arias ra/ti/as donde se o6seraros los .a/tores 93e 3eden in.l3ir en la elo/idad de rea//in (e determin la elo/idad m7ima y la /onstante de Mi/haelis-Mentel a artir de la aria/in del s3strato /ono/iendo 93e a di.erentes /on/entra/iones la a/tiidad de la enzia 3ede ariar (e determin la in.l3en/ia del /ido /inmi/o /omo 3n inhi6idor enzimti/o en la rea//in eiden/iando /omo las endientes o6tenidas eran di.erentes y /omro6ando 93e 3ede a.e/tar en la elo/idad de la rea//in (e o6ser la in.l3en/ia de la temerat3ra /omro6ando 93e /3anto mayor es la temerat3ra8 mayor es la elo/idad de rea//in hasta llegar a la temerat3ra tima alrededor de los @5?C8 or medio de la /3al se llega a /ono/er la temerat3ra a la 93e la enzima a/tNa /on m7ima e.i/a/ia
;. REC/EN!ACINES (e re/omienda en la r/ti/a de aria/in del s3strato realizarlo ridamente al momento de llearlo al ese/tro.otmetro de6ido a 93e la sol3/in /ontinNa /on s3 rea//in donde el s3strato se est degradando or lo 93e los res3ltados se 3eden alterar (e re/omienda reoler la sol3/in /on la ieta al momento de /olo/ar en la /elda ara s3 le/t3ra en el ese/tro.otmetro ara 93e la sol3/in se en/3entre 6ien homogenizada y no se altere los rod3/tos (e re/omienda medir la a/tiidad enzimti/a a arias temerat3ras /on el .in de .a/ilitar la determina/in de la temerat3ra tima a la /3al la enzima tra6aa
. ANEMS
Fig3ra: En la $aria/in del s3strato se o6sera di.erente /olora/in de la sol3/in de6ido a la o7ida/in8 y a la degrada/in de la enzima
Fig3ra: En la Inhi6i/in enzimti/a /on /ido /inmi/o se o6sera di.erente /olora/in de la sol3/in de6ido a la o7ida/in8 y a la degrada/in de la enzima @. %I%LIGRAFA 1 Q8 )=rez C8 Ortiz :2010< Factores que intervienen en la Actividad enzimática. @ra Edi/in Editorial Bar/elona Madrid-Esa4a )g 12@-125
$. E8 Martínez :200; ). Inhibidores Enzimáticos competitivos y no competitivos. 1ra Edi/in Editorial Editorial (an Ag3stín M=7i/o-DF M=7i/o )g @5-@;
3. Muoz !., 2012, "aracterización cin#tica de la catáli$i$, inacti%ación $uicida e in&i'ición irre%er$i'le de la tiro$ina$a. (ni%er$idad de Murcia
4. "amp'ell, ). *2007+. iolo-ia. $paa/ ditorial Medica anamericana. pa-154
