EXTRACCIÓN ENZIMÁTICA Para la extracción de enzima de microorganismos o de tejidos anim animal ales es !ege !egettales ales las las c" c"l# l#la lass se des esin inte tegr gran an$$ a se sea a %or %or &rota &rotamie miento nto$$ agitac agitación ión$$ #ltras #ltrasoni onido$ do$ etc' etc' Antes Antes del ais aislam lamien iento$ to$ se de(en entender las %ro%iedades de la enzima$ como la es%eci)cidad de s#strato$ condiciones de %*$ tem%erat#ra el m"todo de ensao +,#& +,#&er era$ a$ -../ -../0' 0' Exis Existe ten n di&e di&errente entess &#en &#ente tess %ara %ara la extr extrac acci ción ón de enzi enzim mas co como mo lo so son n a %ar %artir de mater ateria iall anim nimal$ al$ %lant lantas as o microorganismos' En la ta(la I se aj#ntan di&erentes ti%os de enzima$ con las res%ecti!as &#entes de las c#ales se recomienda s# o(tención1 Tabla I. Fuente para aislamiento de acuerdo al tipo de enzima Tipo de enzima
Fuente
Meta(ólicas *2gado Ins#lina P3ncreas ATPasa Mitocondria 42ntesis de %rote2nas Ri(osomas 42ntesis de car(o5idratos Material !egetal Ind#striales comerciales$ en en ge general Microorganismos +Ac5ara$ Ac5ara$ 6 Modi$ 78890
:as condiciones %ara extraer enzimas %asarlas a sol#ción son a men# me n#do do cr2t cr2tic icas as re;#ie e;#ierren el es est# t#di dio o de m#c5 m#c5as as !ari !aria( a(le les' s' En general$ el %rimer %aso consiste en la o(tención de #n 5omogenizado$ ;#e im%lica la destr#cción de la c"l#la el %asaje de las enzimas a sol# so l#ci ción ón o s#s% s#s%en ensi sión ón'' Para ara ello ello se toma toma en c#en c#enta ta dos dos gran grande dess gr#%os de enzimas1 intracel#lares extracel#lares' extracel#lares' En las %rimeras se de(e de(e realiz realizar ar el rom%i rom%imie miento nto cel#la cel#lar$ r$ %ara %ara lo c#al c#al exist existen en di!ers di!ersos os m"todos
;#2micos$
&2sico coss
enzim3ticos$
%ara
las
enzimas
extracel#lares tan solo se re;#iere la se%aración de la (iomasa con el so(renadante so(renadante de la &ermentación +
M>T?@?4 B4IC?4 *?M?ENIZACIÓN MECÁNICA P#ede #tilizarse #n 5omogeneizador de !idrio$ mortero o lic#adora$ a !eces con la a#da de a(rasi!os como alDmina$ arena o (olitas de !idrio' :as c"l#las de(en s#s%enderse en #n sol!ente isotónico adec#ado +%#ede ser sacarosa 8$7/ M$ NaCl 8$.$ FCl 8$-/ M0 o ligeramente 5i%ertónico$ en #n (#Ger adec#ado %ara controlar el %*' :a 5omogenización a altas %resiones es m# &rec#ente %ara rom%er c"l#las est#diar la acti!idad de enzimas +Aala$ 788/0'
*?M?ENEIZACIÓN 4ÓNICA Esto
se lo realiza con
el c5o;#e de ondas sónicas o
#ltrasónicas %ro!ocando cam(ios de %resión de miles de atmós&eras$ ;#e rom%en la %ared cel#lar' 4e #sa generalmente con (acterias$ le!ad#ras a !eces %ara determinados tejidos animales como el (azo$ riHón o eritrocitos +Aala$ 788/0' 4i se realiza el rom%imiento cel#lar %or m"todo de sonicación$ se de(e considerar los e&ectos ;#e se tendr3 en la esta(ilidad enzim3tica$ ;#e de%ender3 de &actores asociados como el %*$ tem%erat#ra$ ti%o de <#Ger$ tiem%o$ entre otros' 4e 5a re%ortado #na dismin#ción del 8 de la esta(ilidad enzim3tica de la gl#cosaJ=J&os&ato des5idrogenasa +=P@*0 #n -/ de la Alco5ol des5idrogenasa +A@*0 %or la extracción con sonicación +lae5ter$ 78-70'
@E4INTERACIÓN T>RMICA El congelamiento descongelamiento r3%idos re%etidos s#elen #sarse %ara desintegrar (acterias eritrocitos' Por congelación se &orman cristales de 5ielo intracel#lares$ ;#e -
destr#en la estr#ct#ra' Al descongelarse$ las c"l#las se destr#en osmóticamente de(ido a la %resencia de ag#a %#ra se li(era s# contenido +Aala$ 788/0'
PRECIPITACIÓN 4A:INA :as enzimas son &raccionadas al red#cirse s# sol#(ilidad 5asta el %#nto en ;#e %reci%itan' Esto se logra %or adición de sales a cierto %* a ele!ada concentración iónica o %or sol!entes org3nicos +alco5ol$ acetona$ iso%ro%anol0 a (aja tem%erat#ra' :a sal m3s #sada es el s#l&ato de amonio %or s# alta sol#(ilidad$ (ajo costo$ n#la toxicidad %ara la enzima %or no a&ectar maormente la !iscosidad de la sol#ción +,#&era$ -../0' :a
maor2a
de
las
%rote2nas
son
menos
sol#(les
a
concentraciones ele!adas de sal' :as concentraciones de sal en las ;#e %reci%ita #na %rote2na !ar2an de #na %rote2na a otra' Por ejem%lo$ el s#l&ato amónico 8$9 M %reci%ita el )(rinógeno$ mientras ;#e se necesita #na concentración 7$K M %ara %reci%itar la al(Dmina del s#ero' Para eliminar la sal$ c#ando sea necesario se %#ede #tilizar la di3lisis +4trer$ et al'$ 78890'
CENTRILACIÓN @IERENCIA: :a centri&#gación es #n m"todo ;#e #tiliza la %ro%iedad de sedimentación de %art2c#las con (ase en la masa de las mol"c#las %ara la se%aración de %art2c#las de #na sol#ción' Es el %aso inicial m3s comDn en la %#ri)cación de %rote2nas sol#(les a %artir de material insol#(le'
Al sedimentar
en
condiciones s#a!es +%oco tiem%o$ %oco &#erza de aceleración0 sedimentar2a %art2c#las con maor densidad' 4e %#ede realizar #na centri&#gación del so(renadante donde ig#almente se sedimentar3n las %art2c#las m3s densas as2 s#cesi!amente' 4e %#eden a%licar condiciones crecientes de se!eridad en la 7
T2t#lo del doc#mento centri&#gación o(tener #na colección de sedimentos ;#e corres%onden s#cesi!amente a &racciones de %art2c#las de di&erente tamaHo Oo densidad' +:odis5$ et al'$ 788=0'
CENTRILACIÓN P?R Z?NA4 @E E:?CI@A@ 4e %#ede se%arar %rote2nas %or centri&#gación a tra!"s de #na sol#ción con densidad creciente llamado gradiente de densidad' Por lo general el gradiente #sado es sacarosa' Al colocar #na mezcla de %rote2nas so(re la %arte s#%erior de #n gradiente de sacarosa en #n t#(o someti"ndolo a centri&#gación$ las %rote2nas ;#edan en la %arte in&erior del t#(o a #na !elocidad controlada %or &actores ;#e controlan la constante de sedimentación$ se%ar3ndose %or (andas o zonas de %rote2nas con distintas masas' +Foolman$ et al$ 788K0 :a m#estra se a%lica en #na ca%a delgada so(re el medio de centri&#gación$ ;#e es #n gradiente de densidad'
=
velocidad de sedimentación aceleracióncentrífuga
;#e se mide en #nidades s!ed(erg +- 4 -8−-S seg#ndos0' :a centri&#gación de(e terminar antes de ;#e alg#na de las %art2c#las se%aradas lleg#e al &ondo del t#(o' :os com%onentes se%arados se recogen indi!id#almente as%irando con m#c5o c#idado las di&erentes (andas o$ mejor$ %er&orando el &ondo del t#(o recogiendo en &racciones el l2;#ido ;#e cae'
S
Figura1. Centrifugación zonal. Fuente: +Foolman$ et al$ 788K0
M>T?@?4 LBMIC?4 L4? @E 4?:ENTE4 ?RÁNIC?4 @is#el!en la %ared cel#lar &#ndamentalmente %or la disol#ción de l2%idos asociados a mem(rana' Existen !arios sol!entes am%liamente #tilizados como1 etanol$ acetona$ (#tanol$ etc'Q %ero dic5os sol!entes modi)can la constante diel"ctrica del enzima %rod#ciendo algo de desnat#ralización$ %or ello no s#ele ser m# recomenda(le la im%lementación de este m"todo c#ando se ;#iere #n enzima totalmente &#ncional son necesarias (ajas tem%erat#ras %ara %rod#cir #na se%aración +,#&era$ -../0'
RLPTLRA CE:L:AR LBMICA :os detergentes &a!orecen la lisis cel#lar rom%iendo la (arrera li%2dica$ sol#(ilizando las %rote2nas e interr#m%iendo la interacción l2%idoJl2%ido$ l2%idoJ%rote2na %rote2naJ%rote2na$ %ermitiendo la salida del material intracel#lar' 4in em(argo$ la %resencia de detergentes %#ede a&ectar en la eta%a de %#ri)cación %or %reci%itación %roteica o %or tratamiento con sales$ a ;#e estos interaccionan con las mismas +4trer$ et al'$ 78890'
K
T2t#lo del doc#mento @ERA@ACIÓN CE:L:AR Es necesario el im%lemento de #na enzima$ la lisozima la c#al ataca la ca%a de %"%tidogl#cano de la %ared cel#lar' Es extra2da de l3grimas$ sali!a comercialmente de la clara de 5#e!o donde se enc#entra en grandes cantidades' Esta enzima da (#enos res#ltados a la 5ora de #na extracción en (acterias gram +U0$ %ero de%ender3 de la %resión osmótica del medio lo c#al conlle!a a la r#%t#ra de la mem(rana cel#lar' En el caso de (acterias gram +J0 %ara originar la lisis cel#lar se necesitar3 el #so de #n agente ;#elante de iones como el E@TA' Estos %rocedimientos no se realizan a gran escala de(ido al costo de la lisozima +*eld$ 788S0'
4*?CF ?4MÓTIC? :as c"l#las se 5acen estallar al someterlas
a #n medio
5i%otónico$ lo c#al 5ace ;#e la mem(rana no resista la %resión osmótica' P#ede ocasionar el daHo a las mem(ranas de alg#nas organelas' Es #tilizado %ara el aislamiento1 Mitocondria Cromosomas Mitóticos' Este m"todo es #sado %ara la extracción de enzimas 5idrol2ticas %rote2nas ligadas del es%acio %eri%l3smico de (acterias gram +J0 como en el caso de la +M#Hoz$ 788.0'
/
E. coli
4ELN@? CAPITL:? PLRIICACIÓN ENZIMÁTICA :a %#ri)cación enzim3tica es #n %rocedimiento !ital en la caracterización de las enzimas$ &acilitando el est#dio de la &#nción de la enzima$ s# acti!idad catal2tica' :a %#ri)cación es #na t"cnica ;#e re;#iere m#c5o c#idado$ necesita 5a(ilidad %r#e(as de ensaoJ error' C#ando se ;#iera %#ri)car #na enzima %artic#lar$ de(e seleccionarse la &#ente de la c#al se la o(tendr3$ es decir si ser3 de #na %lanta$ animal o microorganismo' @es%#"s de seleccionar la &#ente$ #n %rocedimiento de ensao adec#ado tam(i"n de(e seleccionarse' 4i este no es correcto$ entonces se tendr3 #na extracción %#ri)cación errónea$ los res#ltados no %odr3n ser con)a(les +lae5ter$ 78-70'
En la %#ri)cación de #na enzima$ c#a metodolog2a es Dnica %ara cada %rote2na$ cada %aso sistem3tico el %roceso total de la %#ri)cación de%ende de tres as%ectos1 +i0 la nat#raleza (io;#2mica +esta(ilidad acti!idad enzim3tica0$ +ii0 la #tilización del enzima +anal2tica$ ind#strial0 +iii0 la com%lejidad del %roceso de %#ri)cación +costos tecnológicos0' :a com%lejidad del %roceso de %#ri)cación incide en el res#ltado )nal en c#anto al !alor económico total$ entre m3s %#ri)cada sea #na enzima maor es el costo de %rod#cción$ %or ejem%lo /88 ml de c#ajo ind#strial +;#imosina0 %ara /888 litros de lec5e %osee #n costo %romedio de -8 L4$ mientras ;#e #na ta; A@N %olimerasa con!encional %ara am%li)cación en PCR$ 7ml %osee #n !alor de -K/ L4'
Existen !ariadas t"cnicas metodolog2as %ara la %#ri)cación de %rote2nas$ %ero cada #na de ellas consiste en se%arar la enzima de =
T2t#lo del doc#mento inter"s de otras %rote2nas macromol"c#las$ manteniendo la maor acti!idad enzim3tica %osi(le entre estos m"todos tenemos1
E:ECTR??RE4I4 @#rante la electro&oresis la &#erza ;#e %ro!oca la migración de las %rote2nas es #n cam%o el"ctrico el gel actDa como )ltro molec#lar$ ralentizando la migración de las %rote2nas en &#nción de s# relación cargaOmasa' A di&erencia de lo ;#e oc#rr2a en la cromatogra&2a de )ltración$ en las electro&oresis las %rote2nas maores son retardadas se m#e!en m3s lentamente a tra!"s del gel +Viseman$ -..-0'
@E4A:INIZACIÓN Este %roceso !aria el %* de la sol#ción o adiciona agentes ;#2micos ;#e lle!an a ca(o la %reci%itación'
En el %*
isoel"ctrico las %rote2nas dismin#en la sol#(ilidad se %reci%itan como cristales %#ros' Este %roceso es %osi(le tam(i"n %or la adición de ;#2micos como s#l&ato de amonio$ acetona$ etc' El agente ;#2mico #tilizado la %rote2na se sol#(ilizan en #na %rimera eta%a$ %ero al alcanzar #n l2mite cr2tico$ la interacción %rote2naJ %rote2na s#%era la interacción ag#aJ %rote2na$ as2 como el agente des%laza las mol"c#las de ag#a$ esto da l#gar al des%lazamiento salino %rote2nas o enzimas +Anand$ 78--0'
CR?MAT?RABA Ln m"todo cromatogr3)co siem%re consta de dos &ases$ #na &ase estacionaria #na &ase mó!il +:a m#estra a %#ri)car0' :a &ase estacionaria est3 constit#ida %or %art2c#las de %ol2meros
con %oros de distinto tamaHo' :a se%aración se da de%endiendo del tamaHo de las mol"c#las +lae5ter$ 78-70'
Cromatogra&2a de Excl#sión molec#lar o T"cnica de iltración en gel A;#ellas %rote2nas m3s grandes no %#eden %enetrar los %oros de la matriz de )ltración %or lo tanto caen m#c5o m3s r3%idamente ;#e a;#ellas %art2c#las de menor tamaHo ;#e %enetran
los
%oros
sig#iendo
#n
camino
m#c5o
m3s
o(stac#lizado' El tamaHo de los %oros internos de%ende de la nat#raleza misma de los %ol2meros #tilizados$ %or lo ;#e %ermiten la entrada a %rote2nas %or de(ajo de #n determinado %eso molec#lar +lae5ter$ 78-70'
ig#ra 71 Cromatogra&2a )ltración %or gel
Lna !ez ;#e W#e la m#estra con el sol!ente em%ieza a salir %or la (o;#illa se recogen m#estras consec#ti!as del mismo !ol#men en t#(os se%arados$ %ara ser analizadas en el es%ectro&otómetro$ midiendo as2 la concentración de %rote2na en cada t#(o' Esto %ermite realizar #n Cromatograma$ ;#e consiste en #na gr3)ca de las concentraciones de &racciones %roteicas en cada t#(o +@e!a#x$ -.9K0'
9
T2t#lo del doc#mento Cromatogra&2a de Intercam(io Iónico1 Esta t"cnica es similar a la anterior$ sin em(argo en esta la &ase estacionaria cargados
est3
&ormada
%ositi!amente
negati!amente
%or
intercam(iadores
+intercam(iadores
+Intercam(iadores
iónicos
aniónicos0$
catiónicos0'
o
Estos
intercam(iadores interact#ar3n con las mol"c#las cargadas contrariamente al intercam(iador$ dejar3n el li(re W#jo de las %rote2nas cargadas ig#almente ;#e el intercam(iador +Parra$ 78870'
Cromatogra&2a *idro&ó(ica1 Es similar al intercam(io iónico con di&erencia en la nat#raleza de la &ase estacionaria' En esta t"cnica$ el intercam(iador est3 &ormado %or mol"c#las a%olares$ ;#e atra%aran a otras mol"c#las a%olares$ mientras ;#e a;#ellas mol"c#las de nat#raleza %olar seg#ir3n s# %aso a tra!"s de la col#mna +lae5ter$ 78-70'
.
