UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA
1._ INTRODUCCION: La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección especíca de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc y estado de a!re!ación (sólido, lí"uido, !as. Los fundamentos físico#"uímicos de la espectrofotometría son relati$amente sencillos. La mayoría de los problemas analíticos reales comienzan con una comple%a mezcla a partir de la cual es necesario aislar, identicar y cuanticar uno o más componentes dela misma. Se pueden plantear las si!uientes cuestiones& una, de carácter cualitati$o ('de "ué componente se trata, y otra de carácter cuantitati$o ('cuánto )ay de ese componente.*ara ello, se puede utilizar el método instrumental de análisis, como es la espectrofotometría para medir la absorción de radiación ultra$ioleta y $isible "ue interact+a con la materia (átomos y moléculas, la misma es considerada una técnica cuali y cuantitati$a basándose en la medición del color o de la lon!itud de onda de una radiación e intensidad de la misma. Se )ará una descripción del método espectrofotométrico para dar al lector una idea del empleo del mismo y su utilidad en los ensayos de sustancias.
BIOQUIMICA Y NUTRICION
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA
2.- OBJETIVOS:
onocer el funcionamiento del espectrofotómetro.
onocer la diferencia entre un fotocolorímetro y un espectrofotómetro.
-racar el espectro de luz.
nda!ar la relación matemática entre la absorbancia y tramitación.
BIOQUIMICA Y NUTRICION
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA
3.- Marco Teórico: La espectrofotometría se reere a la medida de cantidades relati$as de luz absorbida por una muestra, en función de la lon!itud de onda. ada componente de la solución tiene su patrón de absorción de luz característico comparando la lon!itud de onda y la intensidad del máximo de absorción de luz de una muestra $ersus soluciones estándar, es posible determinar la identidad y la concentración de componente disueltos en la muestra (solución incó!nita. Los métodos espectrofotométricos se basan en la medida de la radiación electroma!nética emitida o absorbida por la materia/ los métodos de emisión utilizan la radiación emitida cuando un analito es excitado por ener!ía térmica, eléctrica o radiante/ los métodos de absorción están basados en la disminución de la potencia de la radiación electroma!nética como consecuencia de la absorción "ue se produce en su interacción con el análisis. Si se aplica ener!ía a un átomo, esta puede ser absorbida y un electrón externo puede ser promo$ido a una con!uración conocida como estado excitado/ dado "ue ese estado es inestable, el atomo retornara inmediatamente al estado fundamental, emitiendo ener!ía. La absorción de las radiaciones ultra$ioletas, $isibles e infrarro%as depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia "uímica. *or lo tanto se dice "ue la espectrofotometría es fundamental en el estudio de sustancias desconocidas. uando la luz atra$iesa una sustancia, parte de la ener!ía es absorbida. El color de las sustancias se debe a "ue estas absorben ciertas lon!itudes de onda de luz blanca "ue incide sobre ellas y solo de%an pasan a nuestros o%os a"uellas lon!itudes de onda no absorbidas. BIOQUIMICA Y NUTRICION
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA
Ley e Bo!r"!er-La#$er%- Beer: 0our!uer, Lambert y 0eer, a tra$és de sus obser$aciones establecieron relaciones dela $ariación de la intensidad de luz transmitida por una muestra con el espesor de ella o con la concentración de la sustancia, para materiales transl+cidos. Estas relaciones se conocen como la ley de 0our!uer#Lambert#0eer o ley !eneral de la espectrofotometría "ue permite )allar la concentración de una especie "uímica a partir de la medida dela intensidad de luz absorbida por la muestra. Esta ley se puede expresar en términos de potencia de luz o de intensidad de luz, asumiendo luz monocromática, como& t1 23 42#e bc 5onde& t, es la intensidad de la luz transmitida por la muestra. 2, es la intensidad de la luz "ue incide sobre la muestra y "ue pro$iene de la fuente. e, es el coeciente de absorti$idad molar en unidades de 6# 7. cm# b , es la lon!itud de la trayectoria del )az de luz a tra$és de la muestra o el espesor de la celda en cm o lo "ue se conoce como paso óptico.
BIOQUIMICA Y NUTRICION
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA
&.- 'rocei#ie(%o e)*eri#e(%a+ 4.# *reparar la si!uiente batería de tubos&
Bicro#a%o e *o%aio "!a e%i+aa Co(ce(%ra ció( /#" 0 M!e%ra ,
T!$o I
T!$o II
T!$o III
T!$o IV
T!$o ,
2.8 ml
4 ml
4.7 ml
4.9 ml
;.< ml
; ml
8.= ml
8.9ml
:::::: . ; ml
::: :
::::. ::::. :::: . . :
:::::: ..
::: :
::::. ::::. :::: . . :.
4 ml
Solución stoc>& 0icromato de *otasio 82 m!?. alcular la concentración en m!? de bicromato de @ en cada uno de los tubos Standard (###A. Leer las absorbancia de los cuatro tubos a 792 nm de lon!itud de onda ( en el espectrofotómetro contra el B
<. on los datos obtenidos construir en un papel milimetrado la !ráca de absorbancia en el e%e de las Crdenadas $s concentración de bicromato de @ en el e%e de las Dbscisas.
BIOQUIMICA Y NUTRICION
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA
7. na $ez obtenida la cur$a de calibración, medir la absorbancia de la muestra problema (*roblema F. G. Cbtener el factor de calibración (Hc promedio con las soluciones standard y sus Dbsorbancia utilizadas para construir las cur$as de calibración a%ustadas. 9. alcular la concentración de la muestra problema por los si!uientes métodos& D.# -rácamente extrapolando su absorbancia en la cur$a de calibración. 0.# sando Hactor de alibración, multiplicando su absorbancia por el factor de calibración del standard.
9.# 5esarrollo experimental
BIOQUIMICA Y NUTRICION
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA
.- Co(c+!io(e : Se )a lle!ado a la conclusión de "ue la espectrofotometría es un método analítico indirecto por"ue se basa en la medición de la absorbancia o transmitancia de las radiaciones/ es de !ran utilidad en la actualidad para la identicación de un analito en una muestra problema. La espectrofotometría es el método más usado, debido a "ue es sencillo, especíco y sensible.
.- C!e%io(ario BIOQUIMICA Y NUTRICION
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA
1.- E)*+i4!e e+ #eca(i#o e 5!(cio(a#ie(%o e !( e*ec%ro5ó%o#e%ro n e*ec%ro5o%ó#e%ro es un instrumento usado en el análisis "uímico "ue sir$e para medir, en función de la lon!itud de onda, la relación entre $alores de una misma ma!nitud fotométrica relati$os a dos )aces de radiaciones y la concentración o reacciones "uímicas "ue se miden en una muestra. Iambién es utilizado en los laboratorios de "uímica para la cuanticación de sustancias y microor!anismos. Bay $arios tipos de espectrofotómetros, puede ser de absorción atómica o espectrofotómetro de masa y $isuales. Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un )az de luz monocromática a tra$és de una muestra y medir la cantidad de luz "ue es absorbida por dic)a muestra. Esto le permite al operador realizar dos funciones& 4. 5ar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra <. ndicar indirectamente "ué cantidad de la sustancia "ue nos interesa está presente en la muestra
Co#*o(e(%e e !( e*ec%ro5o%ó#e%ro ubetas de espectofotometría. En un primer plano, dos de cuarzo aptas para el traba%o con luz ultra$ioleta/ en se!undo plano, de plástico, para colorimetría (es decir, empleando luz $isible.
BIOQUIMICA Y NUTRICION
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA
6!e(%e e +!7 La fuente de luz "ue ilumina la muestra debe cumplir con las si!uientes condiciones& estabilidad, direccionabilidad, distribución de ener!ía espectral continua y lar!a $ida. Las fuentes empleadas son& lámpara de Jolframio (también llamado tun!steno, lámpara de arco de xenón y lámpara de deuterio "ue es utilizada en los laboratorios atómicos.
Mo(ocro#aor El monocromador aísla las radiaciones de lon!itud de onda deseada "ue inciden o se reKe%an desde el con%unto, se usa para obtener luz monocromática. Está constituido por las rendi%as de entrada y salida, colimadores y el elemento de dispersión. El colimador se ubica entre la rendi%a de entrada y salida. Es un lente "ue lle$a el )az de luz "ue entra con una determinada lon!itud de onda )acia un prisma el cual separa todas las lon!itudes de onda de ese )az y la lon!itud deseada se diri!e )acia otra lente "ue direcciona ese )az )acia la rendi%a de salida.
Co#*ar%i#ie(%o e M!e%ra Es donde tiene lu!ar la interacción, .E.6 con la materia (debe producirse donde no )aya absorción ni dispersión de las lon!itudes de onda. Es importante destacar, "ue durante este proceso, se aplica la ley de Lambert#0eer en su máxima expresión, con base en sus BIOQUIMICA Y NUTRICION
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA
leyes de absorción, en lo "ue concierne al paso de la molécula de fundamental#excitado.
De%ec%or El detector, es "uien detecta una radiación y a su $ez lo de%a en e$idencia, para posterior estudio. Bay de dos tipos& a Los "ue responden a fotones/ b Los "ue responden al calor.
6o%oe%ec%ore En los instrumentos modernos se encuentra una serie de 4M fotodetectores para percibir la seNal en forma simultánea en 4M lon!itudes de onda, cubriendo el espectro $isible. Esto reduce el tiempo de medida, y minimiza las partes mó$iles del e"uipo.
BIOQUIMICA Y NUTRICION
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA
2.-
89!e
i5ere(cia e)i%e( !( 5o%oco+or#e%ro y !( e*ec%ro5o%ó#e%ro; Los espectrofotómetros son espectrómetros "ue permiten medir la relación entre la ener!ía radiante de dos rayos, lo cual es necesario para medir la absorbancia. Los fotocolorímetros emplean ltro para seleccionar las lon!itudes de onda en combinación con un transductor de radiación adecuado, a diferencia de los espectrofotómetros en los "ue la lon!itud de onda se puede modicar continuamente, por lo "ue es posible re!istrar espectros de absorción. Ctra diferencia radica en "ue la mayoría de los modelos de espectrofotómetros pueden cubrir la re!ión A1$isible y a $eces la infrarro%a cercana, mientras los foto colorímetros se emplean más com+nmente en la re!ión $isible.
BIOQUIMICA Y NUTRICION
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA
3.- %a(%o e( e+ ra("o ?ii$+e co#o (o ?ii$+e co( ! re*ec%i?a +o("i%!e e o(a
&.- 89!e reacio #a%e#@%ica#e(%e e)i%e e(%re a$or$a(cia y %ra(#i%a(cia; El lo!aritmo& Dbs 3 #lo! I 3 #lo! (t1o donde Dbs es absorbancia, I es transmitancia, es intensidad transmitida (la intensidad de la luz lue!o de atra$esar la muestra y o es intensidad incidente (la intensidad de luz antes de atra$esar la muestra.
BIOQUIMICA Y NUTRICION
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESINAL DE MEDICINA HUMANA
A.- Co(%r!ya !(a c!r?a e ca+i$arcio( co( +o i"!ie(%e ?a+ore: S%a(a r 1 9 Co(ce(%ra m!1d cio( 2.2<9 $or$a(c ia
S%a(a r 2 42 m!1d 2.292
S%a(a r 3 <2 m!1d 2.422
S%a(a r& 72 m!1d 2.492
E%@( ar A G2 m!1d 2.<22
on la cur$a obtenida )alla la concentración de las si!uientes muestras, sabiendo "ue sus absorbancias fueron& 6uestra D:::::::. 2.249 6uestra 0:::::::.. 2.4<9 6uestra :::::::.. 2.792
BIOQUIMICA Y NUTRICION