!I"#RSIDAD MA$OR D# SA! ni%ersidad del Per&' D#CA!A D# (M#RICA
)ACLTAD D# *+MICA' I!,#!I#R+A *+MICA # I!,#!I#R+A A,ROI!DST RIAL
Dra.
#.A.P D# *+MICA
P#RIODO #L#CTI"O ADICIO!AL -/01O MARIA ROSARIO
CALIXTO COSTOS
LIMA 2 P#R3 -/0 Elaborado por Rosario Calixto Cotos
Practica 02
Procedimiento
Preparar Preparar una gradilla de 9 tubos de ensayo de acuerdo a la siguiente tabla
Tubos mL de caseína 5%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
1
1
1
1
1
1
1
1
mL de agua destilada mL de Ácido acético 1. !
4.5
6.4
4.4
4.0
4.
6.
0. /. 6.5 1 . 6
mL de Ácido acético .1 ! mL de Ácido acético .1 ! "# te$ico "# e&"eimental 'bse(a la "eci"itaci$n de la caseína a los 15 minutos )*+
Reactivos
Tubo de Ensayo 1
. 2 . 6
1 . 2
. 5
1 .
2 .
4 .
8 .
Tubo de Ensayo 2
Tubo de Ensayo 3
Tubo de Ensayo 4
Tubo de Ensayo 5
Tubo de Ensayo 6
Tubo de Ensayo 7
Tubo de Ensayo 8 Tubo de Ensayo 9
•
•
agito
• • • •
suavemente los tubos con la precaución de no formar espuma, luego se procedió a tapar los tubos. Se prosiguió a determinar los pH teóricos de cada uno de los tubos con los datos dados. Luego se determinó el pH experimental usando un pH metro. Los tubos se dejaron en reposo durante 15 minutos y observar el grado de turbide o precipitación. !eterminamos el punto isoel"ctrico de la case#na.
Se
PRACTICA 09
HIDROLISIS DE LAS GRASAS POR ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA
I.
O!ETI"O
Deter7inar la acti%idad de la lipasa pancre8tica 7ediante la or7aci:n de 8cidos grasos libres por titulaci:n. II.
INTROD#CCIÓN
#n el organis7o de los ani7ales casi todos los l;pidos se encuentran en co7ple
se encuentran en estado libre. Los 7a7;eros los acu7ulan en or7a de grasa' los peces en or7a de ceras y en las plantas se al7acenan en or7a de aceites ?ue adicional7ente tienen unciones de protecci:n y pro%een aro7as y sabores caracter;sticos. Los acilgliceroles @constituido por una 7olcula de glicerol y 8cidos grasosB pueden eistir co7o 7onoacilglicridos' diacilglicroles y triacilglicridos @TA,B #n los ali7entos los 78s co7unes son los TA,' los otros son usados co7o aditi%o por sus propiedades e7ulgentes. La presencia de 8cidos grasos en la estructura de los l;pidos deter7ina sus propiedades. Aun?ue se considera ?ue no todos los l;pidos tienen 8cidos grasos' s; tienen por lo 7enos alguno de sus deri%ados. Los tr7inos grasas y l;pidos no pueden ser usados indistinta7ente' ya ?ue al =ablar de grasas se reeren a un tipo especial de l;pidosE Los triacilgliceroles' ?ue general7ente son s:lidos a te7peratura a7biente y constituyen la principal reser%a energtica en algunos organis7os. Los 8cidos grasos naturales poseen un n&7ero par de 8to7os de carbono' producto del 7ecanis7o de bios;ntesis' iniciada a partir AcetilCoA. Su n&7ero de 8to7os de C %aria de 5 @8cido but;rico de l;pido de la lec=eB a F4 @cerasB Los acilgliceroles se =idroli>an para or7ar glicerol libre y los 8cidos grasos ?ue los constituyenG en las clulas' las en>i7as lla7adas Lipasas reali>an la =idr:lisisG sta =idr:lisis catali>ada por lipasas se caracteri>a por cierto grado de especicidad' de 7odo ?ue las distintas lipasas act&an de 7odo preerencial sobre dierentes enlaces ster.
La en>i7a principal de la =idr:lisis de los TA, es la lipasa pancre8tica' ?ue preere 8cidos grasos de cadena larga de 78s de / 8to7os de carbonoG =idroli>a a los TA, en diacilgliceroles' liberando el (cido graso de la posici:n / : F del glicerol. Los diacilgliceroles son =idroli>ados r8pida7ente =asta glicerol y 8cidos grasos libres. Los productos son 8cidos grasos libres @A,LB o -17onoacilglicero @-1MA,B. #ste <i7o puede ser =idroli>ado por 7edio de la transerencia del grupo acilo en posici:n - =acia la posici:n / o F por 7edio de las is:7eras lipasa y ser nal7ente =idroli>ado a glicerol y A,L
La lipasa pancre8tica es un polipptido de 559 a7ino8cidos y PM de 0' daltons ?ue =idroli>a los enlaces ster en posici:n / y F de los triacilglicridos. La acci:n coni7as pancre8ticas y de las sales biliares lle%a a la or7aci:n de 7icelas' ?ue progresi%a7ente se enri?uecen en productos =idrol;ticos 78s polares ?ue sus precursores. La %elocidad de absorci:n de los 8cidos grasos depende de la longitud de su cadena @n&7ero de 8to7os de carbonoB y de su grado de saturaci:n. As;' los insaturados de cadena larga son absorbidos 78s eca>7ente ?ue los saturados.
$%ndamento La acti%idad de la en>i7a se e%al&a 7idiendo los 8cidos grasos libres ?ue se liberaron en el curso de la =idr:lisis de la grasa por acci:n de la lipasa pancre8tica. La concentraci:n de los 8cidos grasos libres se deter7ina 7ediante la titulaci:n con !aOH '0!. La acci:n de lipasa se %e potenciada por las sales biliares ?ue al e7ulsicar las grasa las transor7a en pe?ueas 7icelas
III. &ATERIALES ' REACTI"OS
Aceite' buJer osato ./ M pH 4' sales biliares' lecitina y glicerol' pancreatina /K ureta' probeta' tubos de ensayo' gradilla' %asos de 0 7L' pipetas' bo7billas' papel parana' alan>a anal;tica' bao 7ar;a. I". PROCEDI&IENTO
HIDROLISIS D# LAS ,RASAS POR ACCIO! D# LA LIPASA Tubos Aceite 7l uJer osato ./ M pH 4' 7l Sales biliares en buJer' 7l Lecitina aceite 7l
/ Sales /
- blanco 1
F Sin sales /
5 blanco 1
1
1
-
-
1
-
1
1
1
1
1
1
Agua destilada' 7l
-
F
-
F
#l color rosa del aceite no debe desaparecer en caso contrario' agregar !aOH '0! =asta ?ue apare>ca el color @S:lo a los tubos /' - y FB. Agregar 0 7l de pancreatina /K a cada tubo @los 0B. La Pancreatina es un etracto de en>i7as ?ue contiene a la Lipasa pancre8tica. Incubar por 50 7inutos a F6C. Agitar por /0 ser cada / 7inutos. Titular cada tubo con !aOH '0! =asta coloraci:n ligera7ente rosa' anotar el gasto en 7l' agitar constante7ente durante la titulaci:n.
Reacti%os
0 7L de uJer osato '/ Sales M PH biliares 4 0 7L de Aceite en uJerLecitina Aceite
Tubo de ensayo / Sales
Sales biliares en buJer Aceite
Agua destilada
Reacti%os
0 7L de uJer osato '/ Sales M PH biliares 4 0 7L de Aceite en uJerLecitina Aceite Tubo de ensayo - lanco 0 7L de Aceite N Sales biliares en buJer N Agua destilada F 7L de Aceite N Sales biliares en buJer / 7L Aceite Sales biliares en buJer Agua destilada
- 7L de Sales biliares 0 7L deenSales buJer biliares en buJer N agua destilada
Tubo de ensayo F Sin sales Aceite
uJer osato '/M PH 4
Agua destilada
/ 7L Aceite F 7L de Aceite 0 7L N uJer de Aceite osato N uJer '/M PH osato 4 '/M
PH 4 N Agua destilada
Tubo de ensayo 5 lanco uJer osato '/M PH 4
Agua destilada
0 7L de uJer - 7L de uJer osato '/M PH 4osato '/M PH 4 N agua destilada
Ad=erencia de Pancreatina al /K
Pancreatina al /K @Lipasa Pancre8ticaB
Incubaci:n y Agita7iento
5 Tubos de ensayo con 0 7L de 7e>clas
5 Tubos de ensayo con / 7L de 7e>clas N 0 7L de Pa
Agitar por /0 seg cada / 7inutos
#l color rosado del aceite no debe desaparecer en caso contrario' agregar !aOH '0 ! =asta ?ue apare>ca el color !aOH .0 !
Titulaci:n de los 0 tubos
!aOH '0 !
Tubos /' - y F !aOH '0 !
/ 7L de las 7e>clas Coloraci:n Transparent Me>cla titulada Coloraci:n Rosada
". RES#LTADOS
C8lculosE Los gastos en 7l de !aOH .0 ! ,asto ,asto Con sales Sin sales biliares Ml 7l Tubo / 4'F Tubo F 9'U Tubo U' Tubo 5 9'5 -'F '∆ gasto ∆ gasto Deter7inar la concentraci:n de los A,L en unci:n de la acide>E /./
Milie?ui%alentes de Acide> con sales biliares
,asto 7l Tubo 0 Tubo 5 ∆ gasto
/.
gasto .0 !
∆
AE Milie?ui%alentes de acide> con sales biliares -.F.0 .//0/1F Qe?1gsto /.-
Milie?ui%ales Acide> sin sales biliares
gasto .0 !
∆
E Milie?ui%alentes de acide> sin sales biliares .-.0 ./ /1F Qe?1gsto /. Cu8l de los tubos presento 7ayor acti%idad en>i78tica #n la acti%idad en>i78tica de cual?uier en>i7a' el sustrato =ace contacto con el centro o sitio acti%o de la en>i7a .Se or7a un co7plei7a1 sustrato. La 7olcula de sustrato se transor7a por reorgani>aci:n de los 8to7os' por rotura' o por co7binaci:n de %arias 7olculas de sustrato. #l sustrato transor7ado' los productos de reacci:n' se liberan de la 7olcula de en>i7a .La en>i7a' a=ora libre puede reaccionar con otras 7olculas de sustrato. #ntonces co7o se tu%o a los tubos de ensayo por 50 7inutos en incubaci:n con la 7ano a F6C' lo ?ue se puede %er en este caso son los posibles actores ?ue aecten la acti%idad en>i78ticaE te7peratura' pH' concentraci:n e in=ibidores.
Te7peraturaE la acti%idad en>i78tica se incre7enta al au7entar la te7peratura' =asta ?ue la en>i7a se desnaturali>a.
PHE en este caso la en>i7a es 78s acti%a alrededor de pH U.
Concentraci:n de sustratoE al au7entar la concentraci:n de sustrato' la %elocidad de reacci:n se incre7enta' =asta ?ue se ocupan todos los centros acti%os.
#l tubo ?ue presento 7ayor acti%idad en>i78tica es el tubo n&7ero F' donde el gasto de %olu7en de !aOH ue 9.U 7l tornando a una coloraci:n rosadaG 7ientras 7ayor sea el gasto de !aOH a .0 ! 7ayor ser8 la acti%idad en>i78tica.
-. Mencione cinco propiedades de la lipasa pancre8tica
La lipasa pancre8tica es una en>i7a del tipo ster =idrolasas carbo;licas ?ue se encarga de =idroli>ar enlaces esteres propios de las l;pidos 7ediante la adici:n de una 7olcula de agua dando lugar a 8cidos grasos libres y glicerol.
#s una en>i7a ?ue catali>a reacciones con una ele%ada especicidad de sustrato as; co7o de or7a regio o enantioespec;ca.
Se secreta en or7a acti%a @y no co7o proen>i7aB y unciona a un pH :pti7o de U 2 6 en presencia de colipasa.
Act&a r8pida7ente en interace =idro:bica=idro;lica de la e7ulsi:n de la grasa.
Se estabili>a en la interace agua 2 aceite por acci:n de la colipasa y 8cidos grasos libres.
F. *ue unci:n cu7plieron las sales biliares La unci:n ?ue cu7plen las sales biliares en la =idrolisis de las grasas @aceiteB es la de e7ulsicar y solubili>ar las grasas' transor78ndolas en pe?ueas 7icelas con lo cual dis7inuye la tensi:n supercial producindose la ruptura de los enlaces esteres. 5. Por ?u se neutrali>o el aceite utili>ado en la pr8ctica Co7o la =idrolisis del aceite por 7edio de la lipasa pancre8tica %a liberando 8cidos grasos en la soluci:n y al e7plear =idr:ido de sodio en la %aloraci:n 8cido 2 base para la deter7inaci:n indirecta de la cantidad de 8cidos libres liberado' lo ?ue pro%oca una reacci:n acido base debido a la 7e>cla entre un 8lcali y los 8cidos grasos libres dando la or7aci:n de ar la acide> del aceite residual debido a los 8cidos grasos libres
0. Cu8l ue la utilidad de la enoltale;na La enoltale;na es un indicador 8cido 2 base ?ue indic: el ca7bio de pH dada por la neutrali>aci:n del aceite residual obtenida por los 8cidos grasos libres. ".
C#STIO!ARIO
/. #s?ue7atice la estructura de un triestearina y tripal7itina. Triestearina o ta7bin lla7ada #stearina o ,licerol triestearato de 7anera tri%ial. Su no7bre IPAC es /'F1Di@octadecanoiloiBpropan1-1iloctadecanoato es un gliceril ster de 8cido este8rico' deri%ado de la grasa ani7al creada co7o producto deri%ado del procesa7iento de la carnes y es utili>ado co7o sebo en la 7anuactura de %elas y
Tripal7itina es un glicrido de 8cido pal7;tico' o es Tripal7itato de glicerol. #s un aceite ?ue se encuentra en el aceite de pal7a y otros aceites o grasas. A dierencia con la Triestearina es en %e> de 8cido pal7;tico @C/UEB posee' 8cido este8rico @C/4EBB. Su :r7ula 7olecular es C0/H94OU
-. Cu8les son los productos liberados por acci:n de la lipasa pancre8tica S;ntesisE P8ncreas eocrino SustratoE Triacilgliceridos con 8cidos grasos de cadena larga. Acci:n en>i78ticaE Hidrolisis 8cidos grados C/ y CF ProductosE -17oniacilgliceridos y dos 8cidos grasos libres. Re?uiereE Colipasa' osol;pidos' osolipasa A-' Sales biliares y los 8cidos grasos libres pro%enientes de la de las lipasasE Lingual y g8strica.
La lipasa pancre8tica ' la en>i7a principal de la =idr:lisis de los TA, es la lipasa pancre8tica ' ?ue preere 8cidos grasos de cadena larga de 78s de / 8to7os de carbonoG =idroli>a a los TA, en diacilgliceroles' liberando el 8cido graso de la posici:n / o F del glicerol. Los diacilgliceroles son =idroli>ados r8pida7ente =asta glicerol y 8cidos grasos libres. Los productos son 8cidos grasos libres @A,LB o -1 7onoacilglicero @-1 MA,B. #ste <i7o puede ser =idroli>ado por 7edio de la transerencia del grupo acilo en posici:n - =acia la posici:n / o F por 7edio de las is:7eras lipasa y ser nal7ente =idroli>ado a glicerol y A,L. F. Cu8les son los 8cidos grasos poliinsaturados' 7onoinsaturados y saturados presentes en los ali7entos. (cidos grasos saturados !o poseen dobles enlaces en su cadena. Son general7ente s:lidos a te7peratura a7biente. Se encuentran en ali7entos de origen ani7al' y las ecepciones son el aceite de coco y de pal7a. La grasa saturada au7enta el colesterol 78s ?ue cual?uier otro tipo de grasa. #l eceso de grasas saturadas puede au7entar la bios;ntesis de colesterol y tiene eecto tro7bognico. (cidos grasos 7onoinsaturados ,eneral7ente son l;?uidos a te7peratura a7biente. Presentan un doble enlace en su estructura.
Su principal representante es el 8cido oleico @C1/4B' presente en el aceite de oli%a. Pueden dis7inuir el colesterol total y LDL' cuando ree7pla>an parcial7ente a los 8cidos grasos saturados.
(cidos grasos poliinsaturados #n>i7a
)uente
,l8ndula Sustrato Pared Pepsina Wugo g8strico esto7acal Prote;nas Wugo A7ilasas pancre8tico P8ncreas Al7id:n Wugo Prote;nas y Proteasas pancre8tico P8ncreas pptidos Wugo Lipasa pancre8tico P8ncreas Triglicridos Wugo Pared Peptidasa entrico duodeno Pptidos Wugo Pared Maltasa entrico duodeno Maltosa Wugo Pared Sacarasa entrico duodeno Sacarosa Wugo Pared Lactasa entrico duodeno Lactosa Sales iliares ilis H;gado ,rasa Poseen uno o dos enlaces en su estructura.
Productos Pptidos y A7ino8cidos Maltosa Pptidos y A7ino8cidos (cidos grasos y glicerina A7ino8cidos ,lucosa ,lucosa y )ructuosa ,lucosa y ,alactosa #7ulsi:n
Se encuentran principal7ente en ali7entos de origen %egetal' a ecepci:n de los pescados y 7ariscos. Son co7ponentes i7prescindibles de las 7e7branas celulares y precursores de las prostaglandinas @7olculas 7ediadoras en la inVa7aci:nB. Son esenciales por?ue no se sinteti>an en el organis7o' as; ?ue debe7os aportarlos a tra%s de la ali7entaci:n. Los 8cidos grasos poliinsaturados se di%iden en dos gruposE O7ega1U @n1UBE representado por el 8cido linoleico Presente unda7ental7ente en aceites de se7illas y cereales.
y
ara?uid:nico.
O7ega1F @n1FBE representado por el 8cido linolnico pro%eniente de se7illas y cerealesG y por el 8cido eicosapentaenoico y docosa=eaenoico presentes en las grasas de pescados y 7ariscos. 5. Cu8les son las en>i7as ?ue digieren las grasas en el siste7a digesti%o de un 7a7;ero Indi?ue la unci:n de cada una. La grasa del ali7ento es =idroli>ada en el intestino delgado a 8cidos grasos y glicerina por la acci:n con
La grasa no absorbida en el intestino delgado es ecretada en las =eces' produciendo =eces grasientas ?ue dicultan la li7pie>a de las instalaciones. 0. Cite cuatro sales biliares y co7o inter%ienen en la e7ulsicaci:n de las grasas #l 8cido tauroc:lico procede del 8cido c:lico @uno de los 8cidos biliaresB con
#l 8cido glicoc:lico procede del 8cido c:lico @uno de los 8cidos biliaresB con
Las sales biliares ?ue se segregan en la bilis al intestino para contribuir a la digesti:n de los l;pidos se sinteti>an en el =;gado a partir de colesterol en una ruta en la ?ue inter%iene el citocro7o P50' ?ue origina el 8cido c:lico' con la posterior incorporaci:n de los a7ino8cidos glicina o taurina. Las principales sales biliares son glicocolato y taurocolato' ?ue son las sales de sodio y potasio de los 8cidos tauroc:lico y glicoc:lico' respecti%a7ente' los cuales son con
Los 8cidos biliares glicoc:lico y tauroc:lico interaccionan con iones de sodio o de potasio para dar los resultados nalesE glicocolato y taurocolato' ?ue se ecretan por %;a biliar al intestino. #stas sales tienen car8cter =eteropolar @o anpolarB' debido a sus cargas @NB y @1B y a su gran n&cleo =idro:bico de anillos de carbono' en el otro etre7o de la 7olcula. Por ello son solubles en agua y ta7bin pueden interaccionar con las grasas. As; act&an co7o detergentes' o solubili>adores' pro%ocando y estabili>ando la e7ulsi:n de las grasas para ?ue puedan ser digeridas por las en>i7as digesti%as en el 7edio acuoso del intestino @?ui7oB. Ta7bin all; producen la e7ulsi:n de otros co7puestos liposolubles co7o las %ita7inas A' D' # y \' y ta7bin contribuyen a la absorci:n de colesterol.
#s?ue7a si7plicado de las rutas de s;ntesis de los 8cidos biliares sales biliares
"I. R#)#R#!CIAS ILIO,RA)ICAS /. ]a7ora #spitia. Mtodos selectos de bio?u;7ica eperi7ental. ni%. nacional de Colo7bia. / edici:n. -/-. Ca7pbell io?u;7ica Uta edici:n' #ditorial Cengare Learning' -9' Mico. F. )educ=i' lasco' Ro7ero' $ae>. io?u;7ica Conceptos esenciales. #ditorial Moderno. / edici:n. -//.
