NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO
Es importante que el estudiante desarrolle una actitud positiva y respetuosa hacia los microorganismos y su trabajo con ellos. El mal manejo de una técnica puede causar la contaminación en su prueba e infecciones en usted; en particular cuando se trabaja con patógenos en potencia. En el laboratorio de microbiología es necesario observar ciertas normas que harán de su trabajo práctico, una labor efectiva y sin riesgo. •
En cada clase práctica es obligatorio el uso de mandil blanco y limpio, cabello recogido (señoritas).
•
Antes de la realización de una práctica debe leer cuidadosamente el o los procedimientos a desarrollar.
•
Debe mantener la mesa de trabajo libre de materiales no necesarios.
•
Es prohibido fumar, comer o aplicar cosméticos mientras permanece en el laboratorio de microbiología.
•
Al inicio y término de cada trabajo práctico deberá desinfectar cuidadosamente su área de trabajo.
•
Cuando manipule cultivos de microorganismos, trabaje siempre bajo la protección de un mechero y sin corrientes de aire.
•
Esterilice instrumentos de metal (asas de siembra, pinzas, etc.)siempre antes y después de utilizarlos con microorganismos.
•
En caso de accidentes, tales como cortes en las manos, quemaduras, salpicaduras de cultivos vivos o absorción de material contaminado repórtelo inmediatamente al jefe de prácticas de laboratorio.
•
Todo material utilizado en la práctica con posible contaminación deberá ser colocado en recipientes especiales. especiales. Los papeles de desecho serán serán descartados en el tacho disponible.
•
Al término de cada sesión de prácticas y antes de salir del laboratorio lávese las manos con jabón y desinféctelas con alcohol.
Equipos y materiales para el Laboratorio de Microbiología. •
Guía de Laboratorio.
•
Guardapolvo blanco.
•
Gorros para uso en el laboratorio. laboratorio.
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Barbijos.
•
Guantes de latex.
•
Cuaderno de laboratorio
•
Campo de tela y/o descartables
•
Dos juegos de láminas porta y cubre objetos (en estuche)
•
Un asa de siembra (o asa de Kolle)
•
Una pinza simple.
•
Lápiz marcador de vidrio
•
Encendedor o fósforos.
•
Papel toalla
•
Cinta Masking Tape.
•
Algodón
•
Alcohol. PRÁCTICA N° 1 AMBIENTE Y MATERIALES DE LABORATORIO
•
Objetivos: •
Conocer las medidas de bioseguridad y reglas de trabajo en el laboratorio.
•
Reconocer los distintos materiales de laboratorios de microbiología y comprender sus utilidades, así como de los equipos. equipos.
•
Fundamento
El ambiente de laboratorio El laboratorio de microbiología debe ser un ambiente aislado y protegido de contaminación ya sea física química o biológica. En el laboratorio se deberán de ubicar las siguientes microbiológicos, cubículo de análisis, almacén y oficina.salas o ambientes: Aula ó auditorio, sala de ejecución de pruebas y análisis
Los Materiales y Equipos El material utilizado en un laboratorio de Microbiología es muy variado y depende fundamentalmente de de las líneas de trabajo trabajo a las que está está dedicado; evidentemente, evidentemente, no se precisa el mismo equipamiento equipamiento en un centro de investigación con un alto grado grado de especialización que en un laboratorio laboratorio dedicado
a la enseñanza práctica
universitaria. Por tanto, aquí sólo nos referiremos al material básico que se suele encontrar en un laboratorio mínimamente dotado. Es importante, que los materiales y equipos utilizados sean identificados por sus nombres, y puedan ser ubicados, usados y guardados debidamente.
• Materiales y Métodos •
Materiales. • Materiales de Vidrio
Deben poseer las siguientes características: •
Poseer bajo coeficiente de dilatación, de modo que resistan los cambios bruscos de
•
temperatura.
Deben ser de vidrio neutro, o con mínima cantidad de álcali libre de modo que no intervengan en las reacciones.
•
Resistentes a la acción mecánica.
•
Transparentes y sin rayaduras de modo que permitan visualizar los eventos que ocurren en su interior.
• Materiales de acero.
•
Son de alta resistencia física y viene a ser una mezcla de hierro, cromo, níquel, bronce latón, carbón etc.
• Materiales de arcilla. •
Son resistentes a elevadas temperaturas. temperaturas.
• Otros •
Existen otros materiales de plástico, madera, goma y papel. Los que tienen diferentes usos, contenedores, sujetadores o de sostén, dispensadores, etc.
•
Equipos
Uno de los factores que nos permiten obtener un resultado confiable en un Laboratorio de Microbiología, es la utilización de equipos e instrumentos que funcionen correctamente y que de ese modo podamos asegurar la validez de los datos que nos reportan. Entre los equipos indispensables utilizados en el laboratorio de microbiología están: las estufas, autoclave, horno, centrífuga, microscopios, baño maría, balanzas y otros.
• Métodos
Los materiales son presentados y descritos de acuerdo a sus características, c aracterísticas, función y modo de utilización.
• Resultados
Se describen y dibujan los materiales y equipos de que fueron descritos anteriormente y que son utilizados en el laboratorio de microbiología. mic robiología.
•
Discusiones
•
Conclusiones
• Cuestionario •
Mencione cinco materiales y equipos de laboratorio, de uso imprescindible en microbiología, indicando la función de cada uno de ellos.
•
¿Qué son las Campanas de seguridad biológica, explique brevemente su diseño e indique la función que cumplen en los laboratorios de microbiología?
•
¿Qué función cumple el Horno Pasteur en los procedimientos microbiológicos?
• Bibliografía
PRACTICA N°2 PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS
• Objetivos: •
Diferenciar y conocer las técnicas de preparaciones de muestras para observaciones microscópicas.
•
Aprender las técnicas de preparación: frotis, fijación y coloración más utilizadas en el estudio microscópico de cultivos bacterianos.
• Marco Teórico:
La observación de microorganismos con microscopía óptica, en un laboratorio de microbiología, puede realizarse por diferentes procedimientos como son la observación directa de microorganismos “in vivo” o el tratamiento con colorantes mediante tinción
positiva y negativa, procesos dirigidos a incrementar el contraste y por consiguiente a optimizar el resultado. Previo al desarrollo de una técnica de tinción, el material a ser observado debe ser fijado, es decir adherido a una lámina de vidrio sobre la cual ha de realizarse la tinción. Si la preparación no es fijada, la muestra tiende a perderse durante los procedimientos de lavado. El procedimiento de fijación mata al microorganismo, coagula el protoplasma celular y provoca su adhesión a la lámina de vidrio .Un agente de fijación ideal preserva la estructura de la célula en la forma y posición normal sin causar la aparición de otras estructuras no presentes en la célula viviente. Aunque el calentamiento es el agente agente de fijación más común, común, el alcohol y otros agentes químicos también pueden ser usados satisfactoriamente. • Materiales y Métodos
•
Materiales
•
Muestra con microorganismos.
•
Asa de Kolle
•
Lámina porta objeto
•
Mechero de alcohol
• •
Azul de metileno
•
Piseta con agua - Lámina cubre-objeto •
Métodos •
Procedimiento para Observación de Muestras “in vivo” •
Tomar con la pipeta una gota de muestra conteniendo microorganismos viables y colocar sobre la lámina porta objetos.
•
Colocar, realizando un ángulo de 45°, el cubre-objeto o laminilla, sobre la preparación.
•
Colocar la preparación sobre la platina y encender la lámpara del microscopio, enfocando con el objetivo menor aumento (panorámico) bajando el condensador.
•
Cambiar los objetivos de menor a mayor secuencial mente hasta el objetivo de 40X como máximo; simultáneamente elevar el condensador suavemente.
•
Procedimiento para Fijación de Muestras •
Coloque una gota de agua sobre una lámina porta objeto completamente limpia. Con ayuda del asa de Kolle coloque sobre la gota una pequeña porción de la muestra a fijar. Si la muestra que contiene al microorganismo es líquida, puede aplicarse directamente sin la gota de agua.
•
Distribuya la gota cargada con la muestra en la lámina hasta formar una película delgada.
•
Seque la lámina al aire o a una razonable distancia sobre la llama del mechero.
•
Cuando la película este seca, pase la lámina a través de la llama del mechero unas tres veces, cuidando que la película este hacia arriba y que la lámina no se recaliente. La sobre exposición al calor puede alterar la forma y estructura del microorganismo.
•
Procedimiento de Tinción Simple En esta coloración se utiliza un solo colorante para observar principalmente la forma y el ordenamiento de las células bacterianas. Y sigue el siguiente procedimiento:
•
Hacer frotis.
•
Fijar a la llama del mechero.
•
Adicionar el colorante azul de metileno por 10 minutos. No secar.
•
Lavar con agua. Secar
•
Adicionar una gota de aceite de inmersión y observar con objetivo de inmersión. (100X)
•
Resultados
•
Esquematice el resultado de su observación microscópica de los microorganismos “in vivo”, a
mediano y mayor aumento. (cinco tipos de microorganismos). Descripción:
•
Esquematice el resultado de su observación microscópica coloreado con azul de metileno. Descripción:
•
Descripción:
Descripción:
Discusiones •
Enumera al menos 5 tipos de microorganismos observados en la muestra de agua como organismos vivientes, precisando sus características más resaltantes.
•
Calcule los tamaños de los organismos observados y anótelos en forma precisa, compare los tamaños entre ellos.
•
Describe los tipos de movilidad que observó en el examen en fresco
Describa lo que observó en la secreción interdentaria, coloración simple con Azul
•
de Metileno.
•
Conclusiones
VII.Cuestionario Describa cuatro microorganismos diferentes a los que observó en la muestra de
•
aguas estancadas. •
Indaga sobre los diferentes tipos de movilidad de los microorganismos
•
¿Cómo adquieren coloración los microorganismos, cuando usamos las técnicas de tinción?
VIII.
Bibliografía
• Objetivo
PRÁCTICA N°3 MORFOLOGÍA Y AGRUPACIÓN BACTERIANA •
Observar las diferentes formas, tamaños y agrupaciones que presentan los microorganismos aplicando un método simple de tinción.
• Fundamentos
La tinción simple construye una técnica sencilla y directa que a través del uso de un colorante, nos permite contrastar y diferenciar los microorganismos de su entorno. Los colorantes básicos, los cales se utilizan comúnmente para teñir microorganismos, difieren en el grado de reactividad con las células. El azul de metileno reacciona con las células cargadas negativamente a la tasa más baja, tomando de 20 a 30 segundos para teñir apropiadamente una preparación microbiana. El cristal violeta es más reactivo y generalmente requiere sólo 10 segundos. El carbol fucsina es un colorante aún más reactivo y
generalmente requiere solo 15 segundos. Su reactividad es tan grande que ciertamente puede dificultar una tinción apropiada, sobre todo cuando la muestra contiene abundante materia orgánica.
•
Materiales y Métodos
•
Materiales • Láminas fijadas de microorganismos • Aceite de inmersión • Colorantes básicos:
Azul de metileno Cristal violeta Carbolfucsina • Papel secante • Piseta de agua • Soporte para tinción
•
Procedimiento
•
Coloque las láminas fijadas de microorganismos sobre el soporte para tinción.
•
Agregue 5 o 6 gotas de cada colorante dejando que actúen por un tiempo de 30 segundos para el azul de metileno; 10 segundos para el cristal violeta; y 5 segundos para la carbolfucsina.
•
Una vez cumplido el tiempo para los colorantes, lave cada lámina con la piseta de agua.
•
Seque las láminas al aire o dentro del papel secante
•
Examine las preparaciones teñida bajo el objeto de inmersión (100 – 150 x) de un microscopio compuesto.
•
Elabore esquemas de sus observaciones destacando las diferencias en tamaño, forma y agrupaciones que se presenten.
• •
RESULTADOS Esquematice el resultado de su observación microscópica de los microorganismos coloreados y montados en lo referente a su morfología, tipos de agrupación y su relación a la coloración de Gram y Azul de Metileno.
•
En la coloración simple Azul de Metileno ¿cuantos y que tipos morfológicos vio en la secreción interdentaria?
•
DISCUSIONES
•
CONCLUSIONES
•
CUESTIONARIO
•
¿Cuáles son las asociaciones más frecuentes en las bacterias?
•
¿En que rango de tamaño se definen las bacterias?
•
¿Cuáles son las formas bacterianas más frecuentes?
•
¿Qué diferencia a una tinción directa de una tinción negativa?
•
¿Qué importancia le atribuye a las diferencias en reactividad de los colorantes empleados?
PRÁCTICA N°4 TÉCNICAS DE COLORACIÓN BACTERIANA
•
Objetivo •
Demostrar a través de la técnica de tinción diferencial de Gram la existencia de dos grupos principales de bacterias.
•
Distinguir a través de dos técnicas de tinción diferencial la presencia de endosporas bacterianas y diferenciarlas de las estructuras vegetativas normales.
•
Fundamento
Tinción diferencial Gram Los microorganismos no sólo difieren químicamente de su entorno, sino también muestran diferencias físicas y químicas entre ellos. Esto da lugar a que puedan reaccionar diferencialmente ante un procedimiento de tinción. La tinción diferencial por lo tanto, nos permite distinguir entre grupos de microorganismos. En particular, la tinción de Gram, es la más utilizada de las técnicas de tinción diferencial para distinguir entre dos grupos de bacterias: Gram positivas y Gram negativas.
La diferencia entre estos dos tipos de células radica en la variación de capas que conforman sus paredes. La pared de la gram-positivas es principalmente una gruesa capa de peptidoglucano, mientras que las gram-negativas la pared es una multicapa formada por una capa de peptidoglucano rodeada por una capa externa de proteína y lipopolisacárido. La diferente permeabilidad de estas estructuras de superficie ante los reactivos utilizados en la tinción Gram, permite la diferenciación en la coloración final.
La tinción de Gram requiere de cuatro soluciones: Un colorante básico, Un mordiente, un agente decolorante y un contraste (otro colorante básico).
Las propiedades de los colorantes básicos ya fueron discutidas previamente. Un mordiente es una sustancia que incrementa la afinidad entre la célula y el colorante, es decir ayuda a la fijación del colorante en la estructura de interés. Ejemplos de mordientes son ácidos, bases, sales metálicas, y yodo. Bajo la acción de un mordiente una célula se tiñe más intensamente y es más difícil decolorarla. Un agente decolorante es una sustancia que retira el colorante de una estructura teñida. Algunas células teñidas se decoloran más rápidamente que otras, y está variación en la tasa de decoloración es la que diferencia tipos de bacterias cuando la tinción Gram y otras tinciones diferenciales se usan. El contraste es un colorante básico de un color diferente al usado inicialmente. El propósito de su aplicación es da a las células
decoloradas un color contraste con el inicial. Aquellas células que no se decoloran rápidamente retienen el color del colorante básico inicial, mientras que las células que se decoloran fácilmente toman el color del contraste.
La tinción Gram se resume en lo siguiente: El primer paso es teñir la preparación intensamente con un colorante básico, preferentemente el cristal violeta. Esto es seguido de por un tratamiento de las células teñidas con un mordiente, por ejemplo, un compuesto iodado como el lugol. La preparación luego es tratada con un agente decolorante como el alcohol o alcohol-cetona. Las células que retienen el colorante básico después de la decoloración son llamadas gram – positivas, y aquellas que son decoloradas son gramnegativas, y pueden ser reteñidas con un contraste como la safranina.
Figura 1.Tipos de Tinción Gram.
Materiales y Métodos
• •
Materiales
•
Cultivos jóvenes de microorganismos (18-24horas): Bacillus sp; streptococcus sp; Escherichia coli.
•
Colorantes básicos: Cristal violeta; Safranina
•
Decolorante: Alcohol-cetona
•
Láminas porta objeto
•
Mordiente : Lugol
•
Papel secante
•
Piseta de agua
•
Soporte para tinción
•
Asa de Kolle
•
Aceite de inmersión.
• •
Procedimiento. Prepare una lámina fija de cada uno de los cultivos microbianos proporcionados y una lámina fija con la mezcla Streptoccus y Escherichia coli
•
Agregue cristal violeta y deje que actúe por 30 segundos.
•
Enjuague con agua
•
Cubra la película teñida con lugol y deje que actúe por 30 a 60 segundos.
•
Enjuague con agua.
•
Decolore con alcohol acetona. Para una película delgada, la exposición al decolorante por 10-20 segundos es suficiente.
•
Enjuague con agua
•
Aplique el colorante de contraste safranina por 30 segundos.
•
Enjugue con agua y seque la lámina al aire o dentro del papel secante.
•
Examine cada muestra bajo el objeto de inmersión
•
Elabore los esquemas correspondientes.
Figura 2. Procedimiento para hacer tinción Gram.
Tinción Diferencial Ácido-Resistente La tinción ácido-resistente es una tinción diferencial que mide en células teñidas la resistencia a la decoloración mediante ácido. La propiedad de ácido resistencia en ciertas micobacterias y actinomicetos está correlacionada con su salto contenido lipídico. Teñir estas bacterias requiere de un tratamiento de alta temperatura y la utilización de colorantes fuertemente a fines.
El procedimiento consiste en teñir con carbolfucsina caliente, decolorar con una solución de alcohol-ácido y reteñir con un contraste. Las bacteria ácido en comparación a otros microorganismos y retienen el color del colorante inicial.
Este tipo de coloración es utilizada en el estudio y diagnóstico de enfermedades causadas por especies ácido-resistentes como los de la tuberculosis, la lepra, y también para la diferenciación de estructuras resistentes como las endosporas bacterianas.
Tinción De Endosporas Las especies del genero Bacillus y Clostridium producen una estructura denominada endospora. A diferencia de la célula la endospora es una estructura resistente capaz de sobrevivir por largos periodos en ambientes desfavorables, en condiciones extremas de alta temperatura o bajo la acción de agentes desfavorables, en condiciones extremas de alta temperatura o bajo la acción de agentes químicos.
Existen variadas técnicas que se utilizan para la tinción de endosporas. Destacan entre ellas la técnica Dörner y la de Schaeffer & Fulton. En la primera se emplea carbol fucsina para teñir la espora y nigrosina como agente decolorante y de tinción negativa; la espora se tiñe de rojo, la parte vegetativa incolora y toda la estructura aparece sobre un fondo oscuro .La técnica se Schaeffer y Fulton emplea carbolfucsina para teñir la espora, alcohol ácido como decolorante y verde malaquita como colorante de contraste; la espora
se tiñe de rojo y la parte vegetativa de verde. Ambas técnicas emplean fenol y alta temperatura como agentes coadyugantes para lograr la penetración de la Fucsina en la estructura de la espora.
Técnica de Dörner Materiales •
Cultivo de 48 horas: Bacillus_sp; Clostridium sp.
•
Aceite de inmersión
•
Asa de Kölle
•
Baño de agua a 100°C
•
Lámina porta objeto
•
Soluciones colorantes: Carbolfucsina, Nigrosina.
•
Tubos con agua destilada estéril.
Procedimiento. •
Haga una suspensión concentrada del organismo en 2 ó 3 gotas de agua destilada contenida en un tubo pequeño de prueba.
•
Añada igual cantidad de carbolfucsina y coloque el tubo en un recipiente con agua hirviendo por 10 min.
•
Transfiera una gota de la suspensión de células hervidas en un recipiente con agua hirviendo por 10 minutos.
•
Agregue una gota de nigrosina y extienda la mezcla con ayuda de otra lámina hasta obtener una delgada película.
•
Seque la lámina al aire o dentro del papel secante.
•
Examine al microscopio compuesto bajo un objeto en inmersión.
•
Elabore los esquemas correspondientes.
Técnica de Schaeffer y Fulton Materiales. •
Cultivo de 48 horas: Bacillus sp; Clostridium sp.
•
Aceite de inmersión
•
Asa de Kölle
•
Lámina porta objeto
•
Mechero de alcohol
•
Pinzas
•
Soluciones colorantes: Carbolfucsina; verde malaquita.
•
Solución decolorante: Alcohol ácido.
Procedimiento •
Prepare una muestra fija del microorganismo proporcionado.
•
Agregue a la preparación carbolfucsina hasta cubrirla totalmente.
•
Con ayuda de una pinza, caliente la lámina con el colorante haciéndola pasar ligeramente por la llama del mechero hasta que observe el desprendimiento de vapores.
•
Mantenga esta condición durante tres minutos , evitando que el colorante se seque o entre en ebullición
•
Lave con alcohol ácido hasta que este resulte incoloro.
•
Enjuague con agua.
•
Cubra la preparación con unas gotas de verde malaquita dejando que actúe por dos minutos.
•
•
Enjuague con agua.
•
Seque la lámina al aire o dentro del papel secante.
•
Examine al microscopio compuesto bajo un objeto de inmersión.
•
Elabore los esquemas correspondientes.
RESULTADOS 1. Esquematice los resultados de la observación realizada utilizando la técnica de coloración Gram.
•
DISCUSIONES
•
CONCLUSIONES
•
CUESTIONARIO •
¿Bajo qué circunstancia la tinción diferencial de Gram podría resultar errada? Edad de la bacteria Errores del operador. Uso de antibioticos.
A pesar de la gran utilidad de la tincion de gram, este metodo debe ser valorado con precausion, ya que la reaccion puede variar segun la edad de las celulas (cultivos viejos de bacterias gra positivos pueden perder capas de peptidoglicanos y teñirse con gram negativos)y la tecnica empleada (al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tiñan con bacerias gram negativas ), es por esta situacion que junto a la muestra deberian teñirse con bacterias gram positivas.
•
¿Qué función cumple el lugol, en la coloración Gram?
Implementa la afinidad del colorante primario con la celula, formando complejos insoluble con este. El lugol es un agente oxidante.
•
¿Podría usted variar el colorante primario y el de contraste obteniendo los mismos resultados?
No ya que el colorante primario es cristal-violeta que su labor es teñir a todas las bacterias de morado y la constraste es la safrina que tiñe de rojo. Sin estas o el cambio en aquellas varia •
¿Cuál es la influencia del pH? en la reacción Gram?
•
Liste cinco ejemplos de bacterias gram positivas y cinco de Gram negativas, señalando su importancia.
•
¿Cuál de los métodos utilizados le permitió observar mejor las endosporas bacteriana? ¿A qué atribuye la diferencia?
•
¿Qué efecto producirá el reemplazar el alcohol ácido por otro decolorante como el alcohol cetona?
•
¿Qué otros géneros de bacterias pueden formar endosporas?
•
Revise otras técnicas de tinción de esporas y compárelas con las técnicas usadas en este ejercicio. Destaque ventajas y desventajas.
PRÁCTICA N°5 PREPARACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO PARA ESTERILIZAR
•
Objetivo: •
Aprender a preparar los materiales de vidrio para la esterilización como su posterior utilización.
•
Comprender la importancia de la esterilización así como la protección de los materiales contra la contaminación microbiana.
•
Introducción
Existen Varios tipos de medios de acuerdo a las necesidades nutricionales particulares. Al preparar un medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos debe tenerse en consideración el proveer de las fuentes de energía, carbono, nitrógeno, fósforo, azufre y de los factores de crecimiento que sean necesarios. En la formulación de los medios de cultivo podemos distinguir entre medios definidos y complejos.
El medio definido Provee de los nutrientes requeridos para el crecimiento en la forma de compuestos químicos de concentración conocida .Por ejemplo un medio definido para un heterótrofo como Escherichia coli puede ser compuesto de NH 4Cl, MgSO4, KH2PO4, Na2HPO4 y glucosa. Otros elementos como fierro, manganeso y cobre están generalmente presentes como contaminantes de los compuestos químicos en cantidades adecuadas para el crecimiento.
El medio complejo Contiene todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de microorganismos pero ellos están contenidos en ingredientes crudos, es decir, que no todos los componentes del medio ni sus concentraciones exactas son conocidas .Ingredientes de este tipo son los extractos de la levadura, de carne, los hidrolizados de proteínas (peptona, tristona), que constituyen fuentes de polipéptidos aminoácidos, vitaminas, algunos carbohidratos, etc.
De acuerdo al tipo de microorganismo que se quiera cultivar de los medios pueden clasificarse como: •
Comunes: -Permiten el crecimiento indiscriminado de todo tipo de microorganismos. Ejemplo: Agar nutritivo, Caldo nutritivo, Agar gelatina, etc.
•
Especiales: -Son formulados teniendo en cuenta exigencias nutricionales diversas o características bioquímicas determinadas. Pueden considerarse medios enriquecidos o mejorados, selectivos y diferenciales.
•
Medios mejorados o enriquecidos: -Son aquellos a los que se les agrega determinadas sustancias nutritivas (sangre, yema de huevo, suero, etc.) y con ello estimulan las exigencias nutritivas de ciertos microorganismos. Ej. Agar sangre, Caldo selenito, etc.
•
Medios selectivos: -Se caracterizan porque se incluyen sustancias que favorecen el crecimiento de determinadas especies y sustancias que inhiben el crecimiento de otras no deseadas. Ej .Agar salmonella Shigella, Agar Bismuto sulfito, etc.
•
Medios de diferenciación: -Ponen de manifiesto algunas propiedades bioquímicas del microorganismo, como formación de gas, cambios en le pH, etc. Los cambios de pH se evalúan incorporando indicadores en el medio y se determinan de acuerdo al rango en estudio. Ej. .Medios azucarados como: Caldo glucosado, Caldo Lactosado, Kligler, etc.
Frecuentemente los medios selectivos y diferenciales se deben usar juntos para aislar e identificar especies a la vez. Algunos medios tienen incorporados los ingredientes convenientes para este doble propósito y resultan de gran utilidad y economía .Ej. .Agar Manitol salado, Agar Mac Conkey, etc.
Dependiendo de la técnica de cultivo elegido, los medios mencionados anteriormente pueden ser preparados como líquidos o sólidos .Los medios mencionados anteriormente pueden ser preparados como líquidos o sólidos. Los medios líquidos contienen
los
nutrientes y otros elementos en una solución acuosa que generalmente recibe el nombre de caldo; los medios sólidos contienen además un agente solidificante llamado agar que se utiliza para dar parte del nombre del medio e identificarlo como sólido. El agar es un polisacárido complejo derivado de un alga marina y posee características muy útiles para microbiología. Muy pocos microorganismos degradan el agar de tal manera que aún después de un periodo de crecimiento, el medio con agar se mantiene sólido .El agar se funde a 90°C o al punto de ebullición del agua y permanece en estado líquido hasta que la temperatura desciende hasta aproximadamente 40°C.
Una vez preparado el medio de cultivo líquido o sólido debe ajustarse al pH adecuado, disponerse en un recipiente de vidrio resistente al calor, (Tubo o matraz) y protegerlo con un tapón de algodón o material plástico que permita el intercambio de gases y que impida el ingreso de otros microorganismos. El medio de cultivo así dispuesto debe ser esterilizado en autoclave a 121 °C bajo 15 lb. de presión de vapor por 15 minutos. En caso de contener ingredientes termolábiles, pueden emplearse otros métodos de esterilización como la filtración.
Materiales y Métodos
• •
EJERCICIO 1
Objetivo. •
Preparar y esterilizar medios de cultivo de diferentes características para el cultivo de microorganismos.
Materiales. •
Medios de cultivo o ingredientes deshidratados
•
Agua destilada o desionizada
•
Algodón, gasa
•
Balanza
•
Erlenmeyers de 250 y 500 ml
•
Espátulas
•
Lápiz marcador de vidrio
•
Papel indicador de pH
•
Papel aluminio y papel corriente no absorbente
•
Pipetas graduadas
•
Probetas de 100 ml
•
Tubos de ensayo
Procedimiento •
Caldo nutritivo (extracto de carne, 0.3 % y peptona, 0.5 %) •
Utilizando un trozo de papel aluminio pese cuidadosamente la cantidad de medio deshidratado suficiente para prepara 100ml de caldo nutritivo.
•
Coloque el polvo en un Erlenmeyer de 250 ml limpio y seco, y agregue cuidadosamente el agua destilada medida en la probeta.
•
Mezcle la preparación con movimientos giratorios hasta la completa disolución.
•
Elabore tapones de algodón para 15 tubos.
•
Distribuya el medio líquido con una pipeta graduada a razón de 5 ml en cada tubo.
•
Coloque los tubos los tapones de algodón evitando que queden flojos o muy compactos.
•
Disponga los tubos en un contenedor resistente al calor, envuélvalos con papel, identifíquelos con el nombre del medio, la fecha de preparación y el nombre de la persona responsable en la elaboración.
•
Esterilice los tubos con medio en un autoclave a 121 °C (15 lb. de presión) durante 15 minutos.
•
Agar nutritivo (Extracto de carne de 0.3; peptona, 0.5 %; agar, 1.5%)
•
Prepare 200 ml de caldo nutritivo. (repita los pasos 1,2 y 3 del procedimiento anterior con la corrección en el peso para la nueva cantidad solicitada y el erlenmeyer a usar, debe tener unas tres veces el volumen que tendrá el medio).
•
Agregue 3 g de agar (1.5 %), y lleve a licuar en baño de agua a ebullición hasta que el medio luzca transparente a la luz.
•
Elabore tapones de algodón para unos 16 tubos.
•
Una vez licuado el medio, déjelo enfriar ligeramente y distribúyalos en los tubos con una pipeta graduada .Prepare 6 tubos con 12 ml y 10 tubos con 7 ml.
• •
Repita los pasos 6, 7, 8 del procedimiento anterior. El medio restante debe ser acondicionado para su esterilización junto a lo anterior.
•
Agar Mac Conkey (peptona, 1.7 %; proteosa – peptona, 0.3 %; lactosa,1%, sales biliares,0.15%; NaCl, 0.5%; agar, 1.5%, rojo neutro, 0.003%, cristal violeta, 0.0001 %)
•
Agar manitol salado (Extracto de carne 0.1 %; proteosa – peptona, 1.0 %; NaCl, 7.5%; manitol, 1.0%; agar, 1.5%, rojo fenol, 0.0025%) •
Pese la cantidad de medio deshidratado necesario para preparar 100 ml de cada uno. Observando la formulación de cada medio comprobará que los pesos a realizar son distintos.
•
Coloque el polvo de cada medio en Erlenmeyer de 25. ml y llévelos a licuar en baño de agua caliente hasta la completa disolución del agar.
•
Elabore tapones de algodón para cada erlenmeyer.Luego de colocarlos cubra los recipientes con papel e identifique el material con el nombre del medio,
fecha de elaboración y el nombre de la persona responsable de su preparación. •
Esterilice en autoclave a 121 °C por 15 min.
•
Agar almidón (Peptona, 1%; K 2HPO4 ,0.5 %; almidón, 0.3%; agar, 1.5%). •
Pese cuidadosamente el almidón necesario para preparar 100 ml de medio.
•
Coloque el polvo en un Erlenmeyer de 250 ml con un volumen pequeño de agua destilada que ha medido en la probeta.
•
Caliente el recipiente con el almidón agitando constantemente hasta su disolución.
•
Pese el resto de los ingredientes y agréguelos con la cantidad de agua destilada restante.
•
Licue el medio al baño de agua cliente hasta la completa disolución del agar. Deje enfriar ligeramente y ajuste el pH.
•
Coloque en el Erlenmeyer un tapón de algodón a la medida, cubra con papel, etiquete el material y esterilice a 121 °C por 15 min.
•
Agar gelatina (Peptona ,0.1%; extracto de levadura ,0.3%; gelatina, 0.4%; agar, 1.5 %). •
Pese cuidadosamente la cantidad necesaria de cada ingrediente para preparar 100 ml de medio.
•
Coloque los ingredientes en un esrlenmeyer de 250 ml y agregue agua destilada medida en probeta.
•
Lleve el recipiente a licuar en baño de agua en ebullición hasta la completa disolución del agar. Deje enfriar ligeramente y ajuste el pH a 7.0.
•
Acondicione su medio para esterilización como en los procedimientos anteriores. Esterilice en autoclave a 121 °C por 15 minutos.
•
EJERCICIO 2
Objetivo •
Conocer los principios generales de la preparación y técnicas de esterilización de diversos materiales y medios de cultivo, de uso en la microbiología.
•
Conocer el efecto de las condiciones de asepsia en la aplicación de los métodos de control microbiano.
Procedimientos: Preparación de materiales para su esterilización
• Lavar en forma respectiva el material de vidrio y enjuagar con abundante agua
corriente. • Dejar escurrir y enjuagar con agua destilada. Dejar escurrir el material sobre un papel
toalla. • Elaborar tapones y capuchones para tubos y matraces. •
Envolver placas Petri, pipetas, tubos y matraces, siguiendo las indicaciones .
Esterilización de materiales y medios de cultivo
• Las cajas Petri y pipetas envueltas con papel estraza se colocarán en un horno a 150ºC
durante 2 horas. Después de sacarlas, dejar enfriar y abrir los paquetes únicamente en área aséptica (cerca del mechero). • Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo con las siguientes
instrucciones: •
Revisar que el agua en la autoclave esté limpia y el nivel coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario cambiar o añadir agua destilada.
•
Conectarla y poner la perilla de control en calentamiento máximo. Con el uso de guantes de asbesto, acomodar los medios y materiales en la canasta de la autoclave y colocarla dentro.
•
Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y a que salga el vapor por el orificio de purga, después cerrarlo con la válvula.
Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121°C o 15 lbs /in2 de presión
•
y mantener estas condiciones durante 15 minutos. Revisar continuamente el manómetro y regular el control de temperatura a valor medio o mínimo. Apagar la autoclave y dejar que la presión baje al valor de cero. Quitar la
•
válvula y con la ayuda de guantes de asbesto, abrir cuidadosamente la tapa, desde la parte trasera para evitar que el vapor caliente cause quemaduras.
Vertido de los medios en cajas Petri y solidificación
• Cerrar los tubos con tapón de rosca, los que contienen agar se colocarán en una
superficie inclinada para que el medio solidifique a una distancia aproximada de 1- 2 cm de la boca del tubo. • Enfriar los medios de cultivo de los matraces hasta una temperatura aproximada de
45-50°C, que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin quemarse. • Limpiar la mesa con solución de alcohol al 70% (v/v), encender mec heros y colocarlos
a una distancia de 50 cm. Verter entre 20 y 25 mL de cada uno de los medios en tres cajas Petri en esta zona aséptica. Dejar que los medios solidifiquen.
•
EJERCICIO 3 Objetivo •
Comprobar y evaluar los procedimientos, como prácticas asépticas realizadas en los anteriores ejercicios.
Prueba de esterilidad de materiales
•
Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, así como un tubo de CN y PDA durante minuto en zonas no asépticas y etiquetarlas.
•
Abrir una caja Petri de AN, EMB y PDA, así como un tubo de CN y PDA durante 1 minuto en zona aséptica y etiquetarlas.
•
Colocar los tubos y las cajas Petri en una incubadora ajustada a 30ºC durante 24- 48 horas. Las cajas Petri se colocarán con la tapa hacia abajo.
•
Revisar los tubos y cajas Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparición de turbidez, nata superficial y/o depósito de material en el fondo de los tubos con medio líquido, así como la formación de colonias microbianas en la superficie de los medios sólidos.
•
RESULTADOS
• Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco
crecimiento, (++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante. • Describir la morfología de las colonias. • Discutir los resultados con base en la efectividad de la esterilización y manejo de los
materiales.
•
DISCUSIONES
•
CONCLUSIONES
•
CUESTIONARIO
•
¿Cuáles son las ventajas de los medios complejos para el cultivo de microorganismos?
•
¿Por qué no es necesario ajustar el pH en el caldo nutritivo y sí lo es en el agar almidón?
•
Determine la naturaleza química y la función nutritiva de cada uno de los ingredientes que contienen los medios que ha utilizado.
•
Describa el autoclave y su forma de uso.
•
¿Qué otros métodos de esterilización se emplean para los medios de cultivo? ¿Qué ventajas otorgan? PRACTICA N° 6 TÉCNICAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS
•
Objetivo
•
Conocer las diferentes técnicas de aislamiento en medios de cultivos sólidos para la obtención de cultivos puros de bacterias.
•
Identificar las diferentes formas de medios de cultivos de uso general, diferenciales y selectivos para los cultivos de diferentes especies bacterianas.
•
Fundamento Para iniciar un cultivo de microorganismos es necesario que un número de células (inóculo) sea transferido (inoculado) a un medio fresco estéril .Si se quiere cultivar una especie en particular a partir de una mezcla de microorganismos, deben emplearse técnicas de aislamiento que permitan obtenerla en forma pura. Esto involucra un proceso seriado de varias transferencias y la utilización de medios tanto comunes como especiales, mayormente sólidos, seleccionados de acuerdo a la
naturaleza del microorganismo. La técnica d cultivo por aislamiento pueden ser realizada por:
•
Por estrías, que consiste en diseminar los microorganismos en la superficie se un medio sólido dispuesto en placa Petri; si el inóculo inicial se encuentra sólido o en polvo, es recomendable llevarlo a suspensión.
•
Por diluciones sucesivas, que consiste en hacer diluciones seriada de la muestra o del inóculo inicial y disponer alícuotas de ellas en placas petri con medio. Las colonias de varios microorganismos difieren en forma, tamaño, color, consistencia, por lo tanto su apariencia en cultivo es importante para propósitos de identificación. Por otro lado, si se tiene ya aislado un microorganismo, que se asume puro, desde un medio agotado en nutrientes hacia un medio fresco. Las técnicas de transplante se realizan por lo general en tubos de ensayo con medios
líquidos o sólidos, siendo la práctica más común de conservación de cepas (de forma aeróbicas y anaeróbicas facultativas), el realizar estrías en tubos de agar inclinado.
En todo procedimiento de inoculación la aguja o asa de Kölle debe ser calentada “al rojo vivo” por flameo antes y después de la transferencia. El flameo destruye la
formas vivas en la superficie del filamento previniendo la contaminación .Durante la transferencia se debe sostener el tubo de trabajo en la mano izquierda en posición casi horizontal y retirar el tapón sosteniéndolo con los dedos anular y meñique de la mano derecha (asumir la posición inversa en individuos no diestros). La boca del tubo de trabajo (tanto del que se va tomar el microorganismo como del que se va a recibirlo) debe ser flameada antes y después de la transferencia. Aparte de destruir los microorganismos en los bordes del tubo, el flameo crea corrientes convectivas que disminuyen las probabilidades de contaminación.
Las técnicas de cultivo de aislamiento y transplante nos permitirán obtener los microorganismos en forma pura y en estado activo así como el estudio de sus características de crecimiento, el primer registro de datos en la identificación de todo microorganismo.
Figura 1. a) siembra masiva; b) estría simple; c) estría con fin capilar.
•
Materiales y Métodos
EJERCICIO 1. “Técnicas de Cultivo de Microorganismos: Características de crecimiento
•
en medio de cultivo.”
Objetivo •
Observar las características de crecimiento de los microorganismos al trasplante en medios de cultivo líquido y sólido.
Materiales •
Cultivo de Microorganismos de 18 horas.
•
Asa de kolle.
•
Mechero.
•
Tubos
con
agar
nutritivo inclinado.
•
Tubos con agar nutritivo vertical.
•
Tubos con caldo nutritivo.
Procedimiento •
Esterilice el asa de kolle por flameo a la llama.
•
Tome el tubo con el cultivo de 18 horas, retire el tap6n, flamee la boca del tubo al mechero y obtenga una pequeña porción del cultivo con ayuda del asa de kolle. Flamee la boca del tubo antes de volver a taparlo. Tome el tubo con caldo nutritivo, y con los mismos cuidados anteriores
•
introduzca el asa en el líquido para dejar el inóculo. Homogenice la mezcla girando el tubo entre las palmas de la mano. Repita el procedimiento 1 para obtener más inóculo, pero usando esta vez
•
aguja de kolle. Tome el tubo con agar inclinado y realice la siembra depositando el inóculo a
•
lo largo de una sola línea descrita desde la base de la inclinación hasta el extremo. Repita el procedimiento 1 para obtener inóculo, usando nuevamente aguja de
•
kolle.
•
Tome el tubo con agar vertical y realice la siembra por picadura profunda del medio.
•
Rotule los tubos sembrados y póngalos a incubar a 37° C por 24 horas.
•
Cumplido el tiempo de incubación, evalué el crecimiento y anote sus resultados en la hoja adjunta, según lo siguiente:
•
RESULTADOS
• Esquematice los resultados de sus observaciones. • Reporte los resultados anotando las características de los crecimientos
microbianos.
a) Crecimiento en estrías sobre agar inclinado Cantidad: Escasa, moderada o abundante
Distribución en la superficie:
Uniforme o irregular
Forma de crecimiento difuso, etc.
Arborescente, equinulado, rizoide, filiforme.
Consistencia del crecimiento:
Butiroso, viscoso, fibroso
Pigmentación
Coloración del cultivo
b) Crecimiento en agar vertical por picadura profunda Crecimiento: • Limitado a la línea de inoculación o picadura. •
Con propagación fuera de la línea de inoculación.
•
Superficial o en profundidad o ambas a la vez.
c) Crecimiento en caldo nutritivo Cantidad: - Escasa, moderada o abundante Caldo
•
Turbidez, aparición de opacidad en el medio.
Apariencia o tipo:
•
Sedimento, depósito de células en el fondo del tubo;
•
si el tubo se agita el sedimento se re-suspende el y no disgregan aun si el tubo se agita.
•
Formación de película, masa de células en la superficie del caldo.
•
•
DISCUSIONES
•
CONCLUSIONES
•
CUESTIONARIO
Mucosidad, depósito de células que permanecen adheridas.
•
¿Por qué algunos microorganismos desarrollan en caldo un característico crecimiento tipo película? ¿Qué factores ambientales podrían alterar la formación de una película superficial?
•
¿Cuándo utiliza tubos de agar inclinado para el estudio de las características de crecimiento? ¿Es preferible inocular con aguja de kolle y no con asa? ¿Por qué?
•
¿Qué factores influyen en la abundancia del crecimiento en caldo, agar? inclinado y agar vertical
EJERCICIO 2. “Técnicas de cultivo de microorganismos: Aislamiento y Recuento en
•
placas”
Objetivo •
Separar colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismos utilizando técnicas de aislamiento.
Materiales •
Tubos de caldo conteniendo una mezcla de microorganismos (Serratia marceasen, Bacillus sp., Escherichia coli, Mlcrococcus sp., Proteous sp.)
•
Asa de kolle, aguja de kolle
-
Mechero
•
Tubos con 12 ml de agar nutritivo licuado y mantenido a 50° C.
•
Placas petri estériles
•
Placas con agar nutritivo
•
Placas con Agar Mac Conkey
Procedimiento •
Aislamiento por estrías
• Tome el tubo de caldo que contiene la mezcla de microorganismos y con ayuda del
asa o aguja de kolle previamente esterilizada a la llama, retire inoculo. Considere todas las recomendaciones antes dadas para el trabajo en asepsia. • Tome la placa con agar nutritivo con la mano izquierda y con ayuda de los dedos
pulgar e índice levante hacia un lado la tapa, procurando que la parte expuesta se encuentre bajo la influencia de la llama del mechero. No descubra por completo la placa, así evitara mayor contaminación. Con el asa cargada de inoculo, haga estrias sobre toda la superficie del medio, procurando trazar una ultima estría en un espacio libre. Cierre la placa. • Esterilice el asa a la llama nuevamente. • Repita los pasos 2 y 3 para la placa con agar Mac Conkey. • Coloque las placas en incubaci6n a 37° C por 24 horas. • Observe el desarrollo de colonias individuales y describa sus características de forma,
elevación, consistencia, bordes, etc. Diferencie las características de las colonias desarrolladas en el medio selectivo-diferencial.
Figura 2. Aislamiento por estrías.
•
Aislamiento por diluciones • Tome el tubo de caldo conteniendo la mezcla de microorganismos y con ayuda del
asa de kolle retire inóculo. • Tome un primer tubo de agar licuado y mantenido a 50° C y transfiera
asépticamente el inóculo. Esterilice el asa a la llama del mechero. Con el tubo
cerrado mezcle el inoculo con el medio, haciéndolo girar entre las palmas de las manos. • Transfiera una asada del agar mezclado con el inoculo hacia un segundo tubo de
agar licuado. Repita la operación anterior para obtener una mezcla homogénea. • Vierta el contenido de cada tubo por separado en dos placas petri estériles y rótelas
lentamente para distribuir el medio de manera uniforme. Identifique cada dilución. • Incube las placas a 37° C por 24 horas. • Examine el crecimiento de las colonias en las placas. Haga un recuento de colonias, si
el estimado no es inferior a 30 ni superior a 300. Describa las características diferenciales de las colonias observadas.
Figura 3. Aislamiento por diluciones.
Cuestionario •
¿Qué procedimiento seguiría a continuación del desarrollado en estos ejercicios para obtener el cultivo puro de cada cepa contenida en la mezcla? ¿Como podríamos comprobar que estas cepas obtenidas finalmente corr esponden a las colonias aisladas?
•
¿Qué factores limitan el tamaño de las colonias en una placa de cultivo?
•
Suponga que recibe una muestra de suelo y se le pide determinar el número total de colonias por gramo. Plantee una metodología cuantitativa basada en diluciones sucesivas para resolver el problema.
•
¿En qué consiste la técnica del número más probable y que usos tiene?
•
¿De qué manera se pueden preservar cepas puras por largos periodos?
•
¿Qué técnicas de cultivo se emplean para aislar microorganismos anaerobios? PRÁCTICA N°7 AISLAMIENTO DE COLIFORMES
• Objetivos
•
•
Familiarizarse con la técnica de preparación de muestras sólidas.
•
Determinar la prueba positiva sobre la presencia de coliformes en la muestra.
Fundamento
Genero Escherichia. Son enterobacterias, es decir bacterias en forma de bacilos, gram (-), de 2-4
m de largo, con
bordes redondeados, no esporulados. Su metabolismo es respiratorio y fermentativo. Este género contiene más de veinte géneros y más de cien especies.
Por ser la entero bacterias gram (-), su envoltura celular está formada por: Membrana celular, pared celular (contenida en el periplasma) y membrana externa, siendo sus componentes individuales:
•
Fosfolípidos.
•
Peptidoglucano.
•
Lipopolisacárido.
• •
Proteínas de membrana externa.
•
Cápsula.
•
Fimbrias.
•
El antígeno enterobacterial común.
Fisiología y estructura antigénica Esta bacterias crecen de manera abundante en medios de cultivo ordinario, a diferencia de los streptococcus que requieren medios de cultivo complejos (Son bacterias exigentes). El crecimiento se realiza entre temperaturas de 10°C – 46°C, siendo el grado optimo 37°C; la mayor parte de la cepas son destruidas con calentamientos a 60°C x 30 min.
El género Escherichia se caracteriza porque fermenta rápidamente diversos tipos de azucares, como la lactosa, produciendo ácido y gas. El principal ácido formado por ácido láctico, y en cantidades menores ácido acético y fórmico junto con etanol.
Este género tiene una estructura antigénica compleja, habiéndose detectado más de 150 antígenos somático o termoestables (lipopolisacáridos), más de 100 antígenos k termolábiles (capsulares) y más de 50 antígenos H (flagelares).
Este género produce así mismo enterotoxinas y hemolisinas. Las enterotoxinas median el transporte de iones y de agua desde los tejidos hacia el lumen intestinal para originar una secreción neta que se manifiesta en forma de diarreas; existen dos tipos de enterotoxinas: Toxina termolábil (TL) que provoca pérdida de agua y electrolitos, y la toxina termoestable (TS), que produce secreción de agua y electrolitos, y es muy resistente al calor (Soporta 100°C x 10 min) También produce hemolisinas, cuya producción se relaciona con la virulencia, es citóxica para leucocitos.
Importancia del género Escherichia. Dado que las especies de género Escherichia se hallan presentes como comensales en el intestino humano y animal ,particularmente E. Coli, estos microorganismos son utilizados como indicadores de contaminación fecal, aunque no necesariamente indica que un alimento esté contaminado con heces, sino que indica una mala higiene en el procesamiento de los alimentos.
Aunque existe la probabilidad de reemplazar las bacterias coniformes por los virus conocidos como colifagos (que infectan los coliformes), que se hallan presentes constantemente en la heces humanas, desagües, aparte que su detección es fácil y rápida, de modo que la relación coliformes – colifagos es muy estrecha, además los colifagos también serían indicadores de enterovirus en muestras “contaminadas”. Por ello se piensa que los colifagos podrían ser una
alternativa frente a los coliformes
Materiales, reactivos y equipos
• •
Materiales
•
Frasco para licuar.
•
Cucharilla.
•
Tubos de ensayo.
•
Pipeta 1 ml.
•
Papel craft.
•
Agar VRBA.
•
Alcohol.
•
Licuadora.
•
Estufa.
•
Procedimiento • Preparación De Muestra Sólida
•
Balanza mecánica.
•
Mechero Bunsen.
•
Matraz Erlenmeyer.
•
Placas petri.
•
Tapones de algodón.
•
Solución salina peptonada (ssp).
•
Muestras
a
analizar
(suelo, aguas).
Cerca de un mechero Bunsen tomamos 10 g de la muestra y la depositamos en un
•
frasco para licuar estéril. Al frasco se le añade 90 ml SSp estéril provenientes de un matraz el cual no será
•
desechado. Llevamos el frasco una vez tapado con los 10 g de muestra y los 90 ml de ssp a
•
licuar, el tiempo necesario hasta que todo se desmenuce y la mezcla quede uniforme. Retiramos el frasco y su contenido lo vaciamos al matraz del cual extrajimos los 90
•
al ssp. •
Colocamos tapón de algodón. A esta mezcla la llamamos solución madre (sm).
• Preparación del cultivo •
De la SM o de la muestra original (en caso sea líquida de por sí) extraemos con una pipeta de 1 ml cerca del mechero 1 ml y lo depositamos en el tubo de ensayo con 9 ml SSP, lavamos la pipeta. Esta será la dilución 10-1.
•
Realizamos lo mismo con el tubo que contiene la dilución 10 -1 o “-1”: Extraemos 1ml del tubo “-1” y lo depositaos en otro tubo con 9 ml SSP. Lavamos la pipeta, y
tapamos el tubo con tapones de algodón. Siempre cerca del mechero. •
Realizamos la tercera dilución, no olvide lavar la pipeta.
•
A cada placa agregamos una delgada lámina o capa de agar VRVA, esterilizando el autoclave, uniformizamos el contenido de la placa moviéndola en círculos y esperando que el agar solidifique: siembra por incorporación.
•
Luego agregamos una segunda capa y protectora de agar VRBA a las mismas placas(esta ya deberían estar rotuladas al agregar el 1 ml de la dilución)
•
Se espera que solidifique, colocamos papel craf a las placas y rotulamos.
•
Incubamos las placas en la estufa a 37 °C por 24 – 48 horas.
•
Contamos las colonias que están en el fondo de las placas y no en las superficies.
•
RESULTADOS
•
DISCUSIONES
•
CONCLUSIONES PRACTICA N°8
OBSERVACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS Y HONGOS DEL MEDIO AMBIENTE
Objetivo
• •
Observar el desarrollo de hongos misceleares y levaduriformes en sustrato de diferente origen e identificar los géneros más frecuentes.
•
Fundamento Los hongos poseen características muy particulares que los hacen diferentes de las plantas, ya que no elaboran su propio alimento mediante la fotosíntesis como ellas sino que viven a expensas de otros organismos, vivos o muertos. También se diferencian de los animales porque no poseen la capacidad de desplazarse o moverse sobre el medio o superficie en que crecen. Constituyen un grupo de seres vivos que pueden estar formados por una sola célula (unicelulares) o por muchas (pluricelulares). Los hongos se originan a partir de esporas, que son células especializadas que tienen la misma función que las semillas en las plantas. Cuando las esporas encuentran las condiciones adecuadas de humedad, temperatura, luz y nutrientes, entre otras,
germinan y producen hifas, que son unas estructuras filamentosas que constituyen la unidad estructural fundamental de la mayoría de los hongos. Las hifas se ramifican y forman una masa algodonosa llamada micelio, que se extiende sobre el medio o superficie (como tierra o madera, entre otros) y produce los cuerpos fructíferos. En realidad, el hongo lo constituye el micelio, y los cuerpos fructíferos son el equivalente de los frutos en un árbol. Los cuerpos fructíferos son las estructuras que se ven a simple vista sobre un sustrato, medio o superficie y su función es producir esporas (que serán dispersadas por el agua, el viento, insectos u otros elementos), después de lo cual mueren. Los cuerpos fructíferos son
estacionales y aparecen sólo en ciertas épocas del año, pero el micelio permanece sobre el sustrato, incluso durante cientos de años. Los hongos juegan un papel muy importante dentro de sus hábitats naturales, ya que al ser organismos descomponedores y reciclar gran cantidad de desechos orgánicos pueden transformar la materia muerta, devolviendo al medio ambiente elementos y sustancias asimilables por otros seres vivos como plantas y animales, lo cual permite el flujo de energía y nutrientes a través de los ecosistemas naturales. También forman asociaciones de beneficio mutuo (simbiosis) con las raíces de algunas plantas; a esta asociación se le llama micorriza. Como resultado, el hongo absorbe carbohidratos de las raíces, que a su vez obtienen del hongo elementos químicos como nitrógeno y fósforo, necesarios para su crecimiento. Entre las algas y algunas especies de hongos se da otro tipo de asociación simbiótica, ya que mediante ésta se crean los líquenes, que son organismos totalmente diferentes a las plantas y a los mismos hongos.
• •
Materiales Y Métodos Materiales • Material infectado (con evidencias de crecimiento de hongos) • Asa de Kolle o estilete
• Láminas porta y cubre objetos • Solución colorante: azul de metileno
Procedimiento
• •
Observación macroscópica Observe cuidadosamente cada sustrato infectado y determine el tipo de colonia que
•
desarrolla. Describa el aspecto externo de las colonias de hongos.
•
•
Observación microscópica •
Coloque una gota de azul de metileno en un porta objeto limpio y desgrasado.
•
Con ayuda del asa de Kolle en forma de gancho, extraiga una pequeña cantidad de micelio de una muestra y coloque en la gota de colorante.
•
•
Coloque sobre la preparación la lámina cubre objetos.
•
Observe bajo el objetivo de 10 y 40 aumentos.
•
Reconozca las estructuras más características del cuerpo vegetativo del hongo.
•
Elabore los esquemas que correspondan para cada observación.
•
Con ayuda de láminas referenciales trate de identificar el o los géneros que observe.
EJERCICIO 1. “Aislamiento de hongos del medio ambiente”.
Objetivo •
Aislar en medios de cultivos los diferentes géneros de hongos que frecuentan el medio ambiente y determinar sus características.
Materiales -
Placas petri, con medios de cultivos para hongos (Agar sabouraud).
Procedimiento
• Elija u punto determinado en el ambiente que quiera evaluar. • Destape la placa petri exponiendo al medio de cultivo al aire (Se asume que las
esporas de hongos se encuentran suspendidas). El tiempo de exposición puede ser de 5 a 10 minutos. Vuelva a tapar la placa identifiquela con su nombre, grupo y lugar muestreado. • Trabaje de manera similar para cada placa y lugar. • En el laboratorio incube las placas en una estufa de 30 °C por cuatro o cinco días. • Transcurrido el tiempo, examine las placas y realice una descripción detallada de las
mismas. •
RESULTADOS
•
DISCUSIONES
•
CONCLUSIONES
•
CUESTIONARIO •
¿Qué géneros de Hongos abundan frecuentemente en el medio ambiente?
•
¿Qué variaciones medio ambientales modificaría sustancialmente la presencia de hongos? Formule su respuesta tomando en cuenta modificaciones en cantidades y en diversidades de especies.
•
¿Podrían las especies de hongos patógenos estar presentes en el aislamiento de hongos que usted realizo?
PRÁCTICA N°9 DETERMINACIÓN DE BACTERIAS DEL AGUA
Objetivos
• •
Determinar el número de unidad formadora de colonia en un mililitro de agua.
•
Identificar diferencias entre la flora microbiana del agua.
•
Identificar las bacterias presentes en el agua y comparar sus requerimientos nutricionales con el contenido del medio cultivo en el que fueron incubados.
•
Fundamento.
Bacteria de aguas continentales. Entre la flora bacteriana del suelo y las aguas continentales hay ciertas relaciones y esto es particularmente si se trata de aguas que están constantemente expuestas a la contaminación del suelo. No obstante en las aguas y arroyos sólo se pueden desarrollar de las bacterias del suelo menos exigentes. En el caso de microorganismos patógenos más frecuentemente transmitidos por el agua producen infecciones del aparato digestivo, como tifoidea y cólera, cuyos agentes, eteológicos de esta se encuentran en materias fecales y la orina de los infectados.
Agentes patógenos de las aguas. Las aguas residuales domésticas son portadores de bacterias y hongos patógenos conservando su virulencia durante el tiempo, frecuentemente transportan bacteria intestinal, como S. typi y S. Paratipi, más caro es la presencia de Shigella y en países tropicales abunda el vibrión cholerae, aunque también suele encontrarse con frecuencia microbacterium tuberculosis y esporas Clostridium patógeno.
Se pueden encontrar bacterias patógenas en mariscos procedentes de aguas contaminadas. Entre los hongos patógenos se hallan la especie levaduriforme, Cándida albicans (productores de la candidiasis).Así mismo las aguas residuales transportan virus
de la especie humana como es la que produce la poliomilitis, virosis intestinal y gripe de verano. Tanto los virus como las bacterias de agua son más resistentes en agua dulce que en agua de mar.
Determinación de la cantidad sanitaria. Las investigaciones sanitarias de los sistemas productores de agua incluyen la infección de las fuentes de agua sin tratar y sus condiciones que influyen en su calidad, las operaciones de la planta purificadora y el mecanismo de distribución del agua a los consumidores. Entre las pautas microbiológicas está la determinación de microorganismos patógenos en las aguas particularmente. Escherichia coli, otras coliformes fecales (como Clostridium faecalis,) y clostridium prfringes, su presencia indica contaminación fecal.
Entre las características de la E. Colli están. Producción de indol, producción de ácido, producción de acetil metil carbinol en medios con pectona glucosado y utilización de citratos de sodio.
• Materiales Y Métodos •
Materiales • Placas petri • Tubos de ensayo. • Matraz Erlenmeyer. • Muestra suelo. • Agar nutritivo • SSP • Solución alcohol-cetona. • Aceite de inmersión.
• Pipetas de 1 ml. • Gradillas para tubos de ensayos. • Espátulas
• Agar VRBA
• Violeta de Genciana • Zafranina • Agua destilada.
•
Microscopio Óptico.
•
Balanza mecánica.
•
Mechero
•
Estufa
3.2 Procedimiento
• Preparación de la solución madre •
En el platillo del abalanza colocamos un trozo de papel craft.
•
Con ayuda de una espátula depositamos 10 g de muestra (suelo fértil) sobre el papel.
•
Colocamos la muestra sobre el Erlenmeyer con 90 ml de SSP.
•
Agitamos y mezclamos la muestra con los 90 ml de SSP, hemos obtenido la solución madre o a 10-1(SM)
• Preparación de Soluciones e incubación. •
Tomar un ml de la SM y la colocamos en un tubo de ensayo con 9ml SSP. Esta dilución será a la –1 con respecto a la SM o –2 , respecto, a los g/mm. Repetimos este procedimiento extrayendo del tubo “ -1” un ml y lo colocamos en un tubo de ensayo
con 9 ml de SSP, esta dilución será a la –3, así continuamos hasta obtener la solución –4. •
De cada tubo con la dilución extraemos 1ml con ayuda de la pipeta y lo depositamos en una placa petri estéril, comenzando desde el tubo más diluido al menos diluido. Por cada tubo se preparan 2 placas con 1 ml.
•
Cuando todas las placas tienen 1 ml, en una colocamos una capa de agar nutritivo y en la otra placa perteneciente a la misma dilución agregamos una capa de agar VRBA, homogenizamos y dejamos secar: siembra por incorporación.
•
Luego agregamos una segunda capa del mismo agar a cada placa con el fin de proteger el cultivo.
•
Rotulamos y envolvemos cada placa en papel craft.
•
Incubamos a 37 ° C x 24 –48 horas.
• Coloración Gram y conteo •
Luego de la incubación extraemos las placas de la estufa y procedemos a contar el número de colonias presentes en la placa del fondo de la placa, no aquellas que se encuentran en las superficies.
•
Una vez realizado el conteo, con una asa de Kolle extraemos (hacemos un corte) en el medio de cultivo una parte de la primera capa con el fin de extraer una muestra de colonia, si es necesario también se perforará la segunda capa.
•
La muestra de colonia la colocamos y disolvemos en una lámina porta objeto (previamente la lámina tiene gotas de agua destilada) con agua y procedemos a realizar la tinción de Gram.
•
Colocamos la lámina coloreada al microscopio y observamos el resultado. PRÁCTICA N°10 DETERMINACIÓN DE BACTERIAS DEL SUELO
Objetivos
• •
Determinar el número de unidad formadora de colonia en el suelo.
•
Identificar diferencias entre la flora microbiana del suelo.
•
Identificar las bacterias presentes en el suelo y comparar sus requerimientos nutricionales con el contenido del medio cultivo en el que fueron incubados.
•
Fundamento
En la naturaleza los microorganismos se encuentran formando comunidades de diversos géneros y especies, por lo que es casi imposible encontrar un hábitat con un solo género de microorganismos. Por lo que para los estudios en que se requiera el conocimiento de un solo organismo de esa comunidad (estudio autoecológico), es necesario el aislamiento del mismo. Obviamente se debe tener en mente que muchas reacciones fisiológicas, bioquímicas y hasta algunas morfológicas, requieren de la presencia del resto de los integrantes de la comunidad para que se expresen (estudios sinecológicos).
Se han empleado una serie de métodos para la propagación de los microorganismos a partir de células individuales. El cultivo en caja de Petri es un sistema sencillo y rápido para el aislamiento de los microorganismos de una mezcla, permitiendo que a partir de una célula o un conglomerado de células del mismo género y especie, se forme una colonia (clona), que sea visible a simple vista. Los métodos más usados son: a) método de la estría cruzada y b) el método del vaciado en placa.
El método de la estría cruzada, es un método cualitativo que permite trabajar un gran número de muestras en corto tiempo y consiste en tomar una muestra con un asa previamente esterilizada y colocarla sobre una superficie del medio de cultivo
sólido que se encuentra en una caja de Petri, Posteriormente se trazan una serie de estrías pegadas al borde de la caja, esterilizando el asa al final de cada serie. El método de vaciado en placa, es un método cuantitativo, ya que además de aislar a los microorganismos, en un cultivo puro (formado por un solo género y especie), nos permite contar el número de organismos presentes en esa muestra. Esto es posible ya que a partir de una muestra perfectamente medida se realizan una serie de diluciones, lo que nos da la oportunidad de conocer la cantidad exacta de muestra en cada tubo de dilución, si después de sembrar la muestra en nuestro medio conocemos el número de colonias que crecieron, podemos multiplicar este por la inversa de la dilución y por la inversa de la
alícuota que sembramos, dándonos como resultado el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por unidad de volumen o masa de la muestra original. Para el trabajo con ambos procedimientos se requiere procesar las muestras bajo condiciones de esterilidad con objeto de no incorporar microorganismos de otra fuente extraña a la que estamos analizando.
Materiales y Métodos
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Materiales
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Muestra de Suelo.
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5 pipetas de 1 mL estériles
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Frasco de dilución de 90mL con agua destilada estéril
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5 tubos con 9mL de agua destilada estéril.
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Agua destilada
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Capsulas de porcelana
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Pinzas
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Mechero
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Horno o incubadora
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Asa bacteriológica
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Varilla acodada
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Alcohol
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Metanol
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Succionador para pipetas
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Cajas Petri con medio de cultivo para hongos y levaduras (Saboraud)
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Procedimiento
• Método de la disolución.
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Pesar 10g de suelo y colocarlos en condiciones de esterilidad en una botella de dilución conteniendo 90mL de agua destilada estéril.
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Por medio de una pipeta de vidrio, tomar 1mL del sobrenadante de la botella de dilución, teniendo cuidado de no arrastrar sedimento y vaciar en condiciones de esterilidad a un tubo de ensaye con 9mL de agua destilada estéril. Agitar perfectamente para homogenizar la muestra (figura 1).
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A partir del tubo anterior, tomar 1 mL y vaciarlo a otro tubo de ensaye con 9 mL de agua destilada estéril, agitar perfectamente.
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Repita el punto tres, tomando siempre 1mL del último tubo inoculado y vacíelo a un tubo nuevo con 9mL de agua destilada estéril (figura 1).
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Al terminar la serie de tubos, tomar de los tres últimos tubos 0.1mL y colocarlo en el centro de tres cajas de Petri perfectamente marcadas para su identificación.
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Tomar una varilla acodada esterilizarla flameando con alcohol, y una vez fría, distribuir la muestra sobre toda la superficie de la caja, girando ésta y moviendo la varilla en un sentido.
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Colocar las cajas en una canastilla e incubarlas a 35 – 37 °C durante 24 h.
Figura 1. Procedimiento para la preparación de dilución seriada.
• Método de estría cruzada.
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A partir del frasco de dilución en que se realizó la primera dilución del experimento anterior, tomar una asada y colocarla en una porción de la caja, trazando una serie de estrías que cubran aproximadamente 1 cm a partir de la orilla de la caja.
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Flamear el asa, dejar enfriar y trazar una nueva serie de estrías a partir de un extremo de las anteriores.
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Repetir el paso anterior durante dos series de estrías.
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Trazar la última serie de estrías abriendo esta hacia el centro de la caja.
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Incubar a 35 – 37°C durante 24 - 48 h.
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Repetir los pasos anteriores para las diluciones 10 -5, 10-6 y 10-7.
Figura 2. Procedimiento para la preparación de estrías cruzadas.
Transcurrido el tiempo de incubación para las cajas utilizadas en ambos métodos, haga sus observaciones de morfología colonial.
• Determine las UFC/g de suelo seco de la muestra original. •
Pesar una capsula de porcelana, registre el peso.
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Pesar aproximadamente 10 g de suelo en la capsula de porcelana, registre el peso.
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Colóquelos en el horno a 105 °C por
48 hrs. Una vez concluido el tiempo de
secado enfríelo, péselo y registre el peso. Calcular el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de suelo seco:
Determinación del peso del suelo seco:
Determinación del % de humedad del suelo:
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Resultados
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Discusiones
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Conclusiones
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Cuestionario •
Desde el punto de vista práctico, ¿qué ventajas y desventajas encontró al utilizar los dos métodos de aislamiento?
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¿Qué características generales tienen las colonias bacterianas que las distinguen de los hongos?
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¿Por qué reportamos los resultados como UFC/mL ó g en la determinación cuantitativa de microorganismos en lugar de usar el término células/mL ó g?
PRÁCTICA N°11 DETERMINACIÓN DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) DE MICROORGANISMOS POR LA TÉCNICA DE TUBOS MÚLTIPLES OBJETIVOS
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Evaluar la calidad sanitaria en muestras de agua mediante la búsqueda de microorganismos coliformes totales.
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Determinar la presencia de coliformes totales, por el método de tubos múltiples
FUNDAMENTO
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El método del número más probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado (Hurley y Roscoe, 1983). En un principio este método fue empleado para estimar el número de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que también puede ser aplicado para la determinación de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados. La estimación de microorganismos por el método del Número Más Probable (NMP) es muy adecuado para determinar bacterias anaerobias, porque permite mantener un ambiente anaerobio dentro de los tubos, sin necesitar de sistemas anaerobios más complejos como cámaras o jarras anaerobias. El método consiste en la estimación del número de microorganismos viables a partir de diluciones sucesivas (1/10) partiendo de 1 g de suelo o sedimento en base húmeda o 1 ml de agua; posteriormente, de tres o más de las diluciones se inoculan tubos con medio de cultivo con sustratos y aceptores de electrones específicos. En este método se asume que en las series de diluciones los microorganismos se encuentran distribuidos al azar y que al menos un microorganismo generará crecimiento, produciendo una respuesta positiva (turbidez, cambio de color del medio, producción de algún metabolito específico). Esta técnica se basa en la estimación de la densidad bacteriana por el método estadístico de máxima probabilidad, utilizando la teoría de las diluciones.
MATERIALES Y MÉTODOS
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Materiales
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3 Tubos con 9ml de agua destilada estéril.
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Pipetas estériles de 1 ml
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Mechero Bunsen.
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Agitador
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3 tubos para cada dilución, 9 en total, con 10ml del medio de cultivo (BGBL)
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Campanas de Durham
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Pipetas de 1ml
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Estufa
Procedimiento Para preparar las diluciones, transferimos 1 ml, de la muestra a analizar a un tubo que contiene 9ml de agua destilada estéril. La que vendría a ser la dilución 10 -1 dilución 1/10.
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De la dilución 10-1 , tomamos 1 ml a otro tubo que contiene 9ml de agua estéril, y esta sería la dilución 10-2 ó la dilución 1/100.
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Repetimos este proceso y obtenemos la dilución 10 -3, ó 1/1000.
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Inoculamos 1ml de la dilución 1/10, en cada uno de los 3 tubos pertenecientes a la primera serie, con medio BGBL y campanas de Durham.
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Inoculamos 1ml de la dilución 1/100, en cada uno de los 3 tubos pertenecientes a la segunda serie, con medio BGBL y campanas de Durham.
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Inoculamos 1ml de la dilución 1/1000, en cada uno de los 3 tubos pertenecientes a la tercera serie, con medio BGBL y campanas de Durham.
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̊ Incubar las tres series a 3 7 C/24 h.
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Pasado el tiempo de incubación, si los tubos presentan turbidez y gas en la campana, estos significan crecimiento y fermentación de la lactosa con formación de ácido y gas, respectivamente.
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Finalizamos realizando la lectura del NMP, haciendo uso de las tablas para diluciones: 1/10; 1/100 y 1/1000.
