Preparación de frotis y tinción simple Objetivos de aprendizaje 1.
Preparar un frotis delgado de células bacterianas y teñirlo con una tinción positiva simple.
2.
Entender las razones de usar esta tinción para observar bacterias.
Introducción
Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo ms posible los microorganismos! ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy dif"cil obtener una imagen clara y n"tida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos métodos #abituales de tinción que permiten permiten la observación observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. $a fijación de una extensión bacteriana #ace que las bacterias queden inactivadas y ad#eridas al vidrio alterando lo menos posible la morfolog"a y bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera #aber. $as bacterias se caracterizan por ser microorganismos unicelulares que carecen de membrana nuclear! en las cuales el material nuclear est organizado en una tira continua! a veces circular! contenido en el citoplasma! presentan un actividad metabólica y se dividen por fisión binaria! son organismos sofisticados y altamente adaptables a cambios del medio ambiente. %ebido a su ubicuidad y su alta capaci capacidad dad de adapta adaptació ción n su import importanci ancia a en el campo campo medico medico como como agentes agentes causales de daño es altamente notable. En tamaño y forma las bacterias de importancia médica son microorganismos muy pequeños que se presentan en tres formas generales& esféricos designados como cocos! organismos en forma de bastón designados como bacilos! y de formas espirilas! dentro de estas tres mencionadas anteriormente se encuentran otros microorganismos que adoptan variantes morfológicas designadas como formas pleomórficas. %ebido al pequeño tamaño de la mayor"a de los microorganismos! se requiere de un microscopio óptico! ya sea de campo claro! en el que la observación de células vivas es limitada debido a que las células son incoloras y permiten el paso de una gran cantidad de luz. $a observación de frotis teñidos es ms recomendable. El frotis frotis se prepara prepara #aciendo #aciendo una extensi extensión ón de los microor microorgan ganism ismos os sobre sobre una superficie transparente! en la cual se fijan y se tiñen los microorganismos. %e acuerdo al n'mero de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como lo son& simple! diferencial!
1
negativa y selectiva. $os colorantes ms utilizados son sales formadas por iones coloridos cargados conocidos como cromóforos. Por ejemplo& (loruro de azul de metileno
azul
de metileno ) (l *cromóforo+
Si el cromóforo es un ion positivo el colorante es de tipo bsico! pero si la carga es negativa ser de tipo cido. $a mayor"a de las bacterias son teñidas por colorantes bsicos! que permean la pared celular y se ad#ieren por enlaces iónicos débiles a moléculas con cargas negativas de la célula bacterianas. Materiales
Equipo
(ultivos
/icroscopio de luz compuesto
Bacillus cereus Escherichia coli
$evadura
Otros materiales
-sa de inoculación redonda
Staphylococcus aureus
/arcador de cera
,eactivos
/ec#ero 0unsen
-ceite de inmersión
Portaobjetos
-zul de metileno
Papel seda para limpieza de lentes
Solución Salina isiológica *SS+
2
/etodolog"a Procedimiento Preparación de frotis a partir de un medio sólido 1.2btener los cultivos de la bacteria y la solución salina fisiológica *SS+. 3.$avar un portaobjetos con jabón y agua para remover la suciedad y grasa. $impiarlo con papel para remover el exceso de #umedad y tomarlo por los bordes. 4.Escribir las iniciales del microorganismo en el lado superior izquierdo del portaobjetos con un marcador de cera. 5.lamear un asa de inoculación redonda y dejarla enfriar. 6ransferir una gota de SS mediante una asada en la parte central del lado izquierdo del portaobjetos. Si los cultivos estn suspendidos en caldo! no es necesario adicionar SS para preparar el frotis. 7.lamear el asa de inoculación y dejarla enfriar. 6omar una cantidad pequeña del organismo con un asa de picadura a partir de una colonia aislada! y depositarla en el centro de la gota de SS. %ispersar el organismo sobre el rea del portaobjetos mediante movimientos #acia arriba y #acia abajo para formar una pel"cula delgada. lamear el asa de inoculación antes de guardar. 8.%ejar secar por evaporación del agua a temperatura ambiente. Evite aplicar calor. 9.Pasar el frotis por la parte alta de la llama del mec#ero 0unsen cuatro veces. Evite el calentamiento prolongado del portaobjetos porque se puede romper y el calor excesivo puede ejercer un efecto en la morfolog"a de las células. $a parte inferior del portaobjetos debe sentirse clida al tacto con la piel de su mano. 6inción positiva simple 1.(olocar el frotis en la barra de tinción y cubrirlo con azul de metileno o cristal violeta durante 1 min 3.$avar con agua de grifo! escurrir y dejar secar. 4.,emover cuidadosamente el exceso de agua con papel absorbente. 5.,epetir el procedimiento con el resto de las cepas. 3
7.-ñadir una gota de aceite de inmersión en el centro de la preparación. 2bservar el frotis teñido con la lente del objetivo de inmersión *1::;+ del microscopio compuesto. 8.,egistrar sus observaciones en la sección de resultados. 9.%esec#ar sus preparaciones teñidas por inmersión en solución desinfectante! puede utilizar #ipoclorito de sodio al 1:< *1&=+ por 17 min. $ave sus portaobjetos. >.-l concluir su estancia en el laboratorio! limpie la lente del objetivo de inmersión con papel seda. El microscopio debe almacenarse con el objetivo seco débil acomodado en su lugar! coloque su funda y regréselo al sitio de almacén.
REALIZA UN ESQUEMA CON DIBUJOS
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Tinción Simple
Realizar la fjación del rotis Poner una gota de ss en el porta Tomar una muestra y diluir en la ss Pasar por la párte alta del mecero para fjar
Realizar Tinción simple !ologar azul de metileno en la muestra fjada "sperar de 3#$%#seg &a'ar con agua Retirar el e(edente de agua)
*+ser'ación al microscopio *+ser'ar al microscopio en seco d,+il *+ser'ar al microscopio en seco uerte !olocar una gota de aceite de inmersión y o+ser'ar con o+jeti'o de inmersión)
-
Resultados 1. Dibuje las características de las células observadas con la lente del objetivo de inmersión. 2.
Describa la morfología y agrupación celular.
3.
Describa el color de las células teñidas
Aspecto
inción simple
S. aureus
E. coli
positiva
Amplificación total !orfología celulara. "orma
100x
Cocos agrupados en circulos
b. Agrupación #olor de la célula
Azul
%
Preguntas para revisión 1. $#u%l es la importancia de limitar la cantidad de células usadas para preparar un frotis& 'ue sean m%s visibles las células ya (ue al ser muc)as no se podr%n observar bien o incluso solo se ver% como si fuera una manc)a
2. a* $#u%l es el propósito de fijar un frotis con calor& + b*$'ué problemas pueden presentarse si el frotis es calentado directamente en la flama del mec)ero& A* conservar la morfología general+ pero no las estructuras internas. ,l calor desnaturali-a la en-ima proteolítica y prevenir la autolisis. * 'uemar o calcinar los microorganismos
3. a* $#u%les son las causas de (ue un colorante se ad)iera a la célula bacteriana&+ b* $#u%l es la ra-ón de (ue todos los colorantes no sean /tiles para una tinción simple& A* 0os colorantes son compuestos org%nicos y cada tipo de colorante suele tener afinidad por determinadas estructuras celulares. !uc)os colorantes utili-ados en !icrobiología est%n cargados positivamente catiónicos* y se combinan fuertemente con compuestos celulares cargados negativamente+ como los %cidos nucleicos y los polisac%ridos %cidos * Algunos de los colorantes tienen carga neutra o acida por lo (ue no tienen afinidadpor la célula bacteriana por lo tanto como no se absorben se colorea el fondo en el (ue est%n las bacterias pero la célula (ueda incolora y transparente
. $uede usarse una técnica de tinción simple para identificar otras características adem%s de la morfología del microorganismo& ,4pli(ue. 5o+ ya (ue solo permite visuali-ar forma+ tamaño y disposición de los gérmenes. 6e usa un solo colorante y las bacterias toman el color del colorante usado por lo (ue no es posible ver a través de los microorganismos y reconocer sus órganos internos
7. Durante la reali-ación de un procedimiento de tinción simple positiva+ olvidaste fijar tu frotis de Escherichiacoli con calor. ,n el e4amen microscópico+ $#ómo esperaría diferenciar esta preparación de un frotis preparado adecuadamente& ,l calor de la llama mata las c,lulas micro+ianas por desnaturalización de
sus prote.nas) &as prote.nas coaguladas unen las c,lulas al porta o+jetos por lo /ue si no se fjan al calor no se podrán 'er adecuadamente en el microscopio se podr.an 'er en mo'imiento o incluso ni poder o+ser'arse)
0
8. Durante el receso para el café+ sus amigos derraman café en su bata de laboratorio y la tela tomó el color del café. 0o anterior $es resultado de una tinción biológica o simplemente es un compuesto capa- de impartir color& ,4pli(ue su ra-onamiento. ,s una tinción biológica ya (ue el café est%dentro de las listas de los colorantes m%s comunes a lo largo de la )istoria+ aun(ue no es posible encuadrar dentro de los niveles de m%4ima solide- tintórea o saturación crom%tica se )a utili-ado como colorantes de telas desde )ace muc)o tiempo.
9. $#u%l es la ra-ón de (ue el tamaño de una bacteria sea m%s cercano a la realidad en una tinción negativa (ue en una tinción positiva simple& Ya que no es fijada al calor no se deshidratan las c élulas
:. $#u%l es la ra-ón por la cual el cristal violeta no es /til en la técnica de tinción negativa& Porque es un colorante con carga positiva y para la tinci ón negativa se necesitan neutros o ácidos.
;. $#u%les son las ventajas de< a* la técnica de tinción negativa vs. la de tinción simple. b* la técnica de tinción simple vs. la de tinción negativa& A*5os permiten visuali-ar sobre un fondo oscuro la forma de la bacteria y alguna otra estructura como es la presencia de capsula+ no necesita ser fijada a calor+permite ver partículas m%s pe(ueñas y se usa en el estudio de virus o proteínas+ %cidos nucleicos+ macromoléculas * )ace m%s f%cilmente visibles a las bacterias y permite la visuali-ación la concentración+ morfología y el modo de agrupación bacteriana.
1=.6uponga (ue usó un portaobjetos limpio para esta actividad pr%ctica+ y al observar su frotis teñido apreció bacterias diferentes a las (ue usted depositó para )acer el frotis. $#u%l podría ser la fuente de lo sucedido& El cultivo estaba contaminado o no se tom ó el suficiente cuidado al momento de hacer el frotis
11.$#u%l es la ra-ón por la cual no debe fijar a las bacterias cuando prepara un frotis para una tinción negativa& La tinción negativa sirve para observar capsulas y al intentar fijar al calor se destruya Bibliograf ía http://docsetools.com/articulos-para-saber-mas/article_40931.html http://microbiologiaunvime.wikispaces.com/file/view/Anexo+I+TP+N%C2%BA3.pdf http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Practica_preparaciones_microbiologicas_18855.pdf )ttps<>>riunet.upv.es>bitstream>)andle>1=271>1199:>estudio?2=del?2=caf?#3?A;.pdf&se(uence@1
P,?(6@(- A 6inción de Bram 2bjetivos de aprendizaje 1.Entender la base qu"mica de la tinción de Bram y su importancia en microbiolog"a. 3.Preparar un frotis delgado de células de bacterias Bram positivas y Bram negativas en forma individual y mezcla! teñirlas usando el método de tinción de Bram e interpretar el resultado. 4.Csar la tinción de Bram para visualizar células de sus dientes y boca @ntroducción $a tinción de Bram es un procedimiento diferencial 'til para identificar y clasificar bacterias! en dos grupos& Bram positivas y Bram negativas. Esta técnica fue descubierta por el médico danés Dans (#ristian Bram en 1>>5! durante la tinción de células! él encontró que algunas perd"an su color cuando se eliminaba el exceso de colorante por el lavado. $a técnica de tinción consiste en& 1)
-plicar un colorante primario *cristal violeta+. 6odas las bacterias son teñidas de p'rpura por este colorante bsico.
2)
-plicar un mordiente *lugol para coloración de Bram+. El yodo se combina con el cristal violeta en la célula para formar un complejo cristal violetayodo *(F@+.
3)
-plicar un agente decolorante *etanol o etanolacetona+. El colorante primario ser removido de algunas bacterias! en tanto que otras no sern afectadas.
4)
-plicar un colorante secundario o de contraste *safranina+. Este colorante bsico teñir a las bacterias decoloradas de rojo.
El factor ms importante en el procedimiento es que las bacterias difieren en su velocidad para decolorarse. -quéllas que se decoloran con facilidad se denominan Bram negativas! mientras que las que se decoloran ms lentamente y retienen el colorante primario son Bram positivas. $as bacterias se tiñen de manera diferente debido a las diferencias f"sicas y qu"micas en sus paredes celulares. Gstas 'ltimas son redes de estructuras
1#
complejas de capas de peptidoglicano y otros compuestos. $as paredes celulares Bram positivas contienen capas m'ltiples de peptidoglicano! mientras que las bacterias Bram negativas contienen una capa delgada de peptidoglicano rodeada por una capa externa de lipoprote"nas! fosfol"pidos y lipopolisacridos. El cristal violeta penetra en la célula. El yodo presente en el lugol reacciona con el colorante en el citoplasma para formar un complejo (F@ ms grande que el cristal violeta. El alco#ol como agente decolorante des#idrata la pared celular de la bacteria Bram positiva. El complejo (F@ no puede ser expulsado de las células Bram positivas. En las células Bram negativas! el agente decolorante disuelve la capa exterior de 13 lipopolisacrido! y el complejo (F@ es expulsado a través de la capa delgada de peptidoglicano. $a safranina tiñe de rojo a la bacteria decolorada. $a tinción de Bram es ms consistente con cultivos jóvenes de bacterias *181> #+. (uando las células bacterianas mueren! su pared celular se degrada y puede no retener el colorante primario! lo que conduce a resultados inexactos. $os cultivos Bram positivos o negativos de ms de 35 # pueden presentar una reacción variable a la tinción. 6ambién resulta cr"tico que se preparen frotis delgados para observar las células individuales y su agrupación. El grosor de un frotis afectar la decoloraciónH una preparación gruesa atrapar el colorante primario! que puede no ser removido por el alco#ol o acetona. $as células presentes en los grandes aglomerados pueden aparecer como Bram positivas! lo cual conducir a resultados erróneos. $a decoloración constituye el paso ms cr"tico en este procedimiento! si el colorante se aplica en exceso! el complejo (F@ puede ser removido de las células Bram positivas! #aciéndolas parecer como Bram Iegativas.
/ateriales
$ugol para coloración de Bram
(ultivos
Safranina
Bacillus cereus
Solución salina fisiológica
Escherichia coli
Equipo
Staphylococcus aureus
/icroscopio de luz compuesto
,eactivos
2tros materiales
-ceite de inmersión
-sa de inoculación circular /ec#ero 0unsenPapel seda para limpieza de lentes Portaobjetos
(ristal violeta Etanol al =7< ó etanolacetona Procedimiento
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1.
Preparar frotis individuales de una bacteria Bram positiva y una Bram negativa en un portaobjetos limpio y seco! dejarlos secar a temperatura ambiente con base en las instrucciones de la actividad prctica 1. ijar las preparaciones con calor.
2.
(ubrir cada rea de los frotis con cristal violeta y dejar en contacto por 1 min. $avar con agua de la red municipal! de manera que la presión no favorezca el arrastre de la preparación. %renar el exceso de agua. Io es necesario secar el frotis.
3.
(ubrir cada rea de los frotis con lugol! el cual es una solución de yodo yodurada y dejar en contacto por 1 min. $avar con agua de la red municipal. %renar el exceso de agua. Io es necesario secar el frotis.
4.
%ecolorar los frotis con alco#ol et"lico al =7< o etanolacetona& depositar gotas del alco#ol sobre el frotis y mantener en contacto por 17 s! escurrir el alco#ol. ,epetir este procedimiento por otro periodo de 17 s *,egla general! la decoloración deber"a continuar #asta que el alco#ol et"lico remueva la totalidad del colorante! un indicador es cuando la solución de alco#ol tiende a ser incolora. Sin embargo esto puede ser dif"cil de discernir cuando realizamos el procedimiento por primera vez+. $avar el frotis con agua de la red municipal! pero no seque. El grado de decoloración del frotis depende del grosor del frotis. Cna decoloración excesiva puede causar que una bacteria Bram positiva pierda su color *aparecer como Bram negativa+! y una decoloración insuficiente puede permitir que una bacteria Bram negativa retenga el color p'rpura *aparezca como Bram positiva+.
5.
(ubrir cada rea de los frotis con solución de safranina y dejar en contacto por 4: s. $avar con agua de la red municipal. %renar el exceso de agua. %ejar secar el frotis a temperatura ambiente.
6.
2bservar los frotis con las lentes del objetivo seco débil *1:;+ para localizar el campo microscópico! después mueva la lente del objetivo seco fuerte *5:;+ y finalmente realice las observaciones con la lente del objetivo de aceite de inmersión *1::;+. ,evise la preparación para localizar un campo en donde las células estén separadas. $as células de las bacterias Bram positivas tendrn un color de azul a p'rpura y las células de las bacterias Bram negativas se observarn naranja a rojo. ,evise varios campos para familiarizarse con el color predominante en las células. -seg'rese de preparar frotis con capas delgadas de células! debido a que un frotis con reas gruesas de células puede resistir la decoloración debido a esta concentración.
7.
%esec#ar sus preparaciones teñidas por desinfectante. $ave sus portaobjetos.
inmersión
en solución
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8.
Preparación de un frotis mixto de bacterias Bram positivas y Bram negativas& (olocar una gota de solución salina fisiológica en un portaobjetos limpio y seco. %epositar una asada de una colonia de una bacteria Bram positiva con un asa estéril en el centro de la gota de la solución y distrib'yala en la superficie con movimientos #acia arriba y #acia abajo. Esterilice el asa con el calor seco del mec#ero! deje enfriar y repita el procedimiento para la bacteria Bram negativa. 6iña su frotis con el procedimiento de Bram referido anteriormente. ,egistre sus resultados en la sección correspondiente.
9.
%esec#ar sus preparaciones teñidas por inmersión en una solución desinfectante. $ave sus portaobjetos.
10.
-l concluir su estancia en el laboratorio! limpie la lente del objetivo de inmersión. El microscopio debe almacenarse con el objetivo seco débil acomodado en su lugar! coloque su funda y regréselo al sitio de almacén.
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Resultados Células individuales 1.
Dibuje las características de las células observadas con la lente del objetivo de inmersión.
Aspecto 5ombre del microorganismo
#élulas individuales #élulas individuales #élulas individuales
S. Aurus
E. Coli
E. coli con S. aurus
Dibujo de un campo representativo
Amplificación total !orfología celular a. "orma b. Agrupación
40x y 100x 40x y 100x
Cocos formaciones hexagonales y en linea
#olor de la célula
Azul/morado
eacción al Bram
Gram negativo
40x y 100x Bacilos formaciones circulos
Rosa Gram positivo
en
Bacilos formaciones cí rculos Cocos formaci hexagonales y en linea Rosa y Azul morado Rosa = Gram + Azul = Gram -
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Preguntas para revisión 1. ,scriba el propósito para el uso de cada uno de los siguientes reactivos en un procedimiento de tinción diferencial a. #olorante primario< ad)erir a la pared celular bacteriana y permitir la identificación de bacterias cuya estructura y composición de pared celular se encuentre mayor proporción y distribución de %cido teicoico b. #olorante de contraste< dar a las células decoloradas un color (ue contrasta con el del colorante primario c. Agente decolorante< des)idratante de proteínas y solvente de lípidos. ,l alco)ol disuelve los lípidos de la parte e4terna de la pared celular BramCnegativa+ )aciendo la pared m%s porosa. De esta manera+ el complejo #ristal violetaCyodo es removido de la capa de mureina m%s fina de las bacterias Bramnegativas+ mientras (ue la pared m%s gruesa de las BramCpositivas retiene el tinte en su interior.
d. !ordiente< sustancias /u.micas /ue unidas a los colorantes orman una laca /ue se adiere uertemente a la estructura di.cil de teir 2. $#u%l es la ra-ón de (ue sea esencial elegir colorantes primario y de contraste (ue presenten colores diferentes& ara (ue al momento de observar en el microscopio se f%cil distinguir al microorganismo y no se confunda o camuflaje con el entorno
3. $#u%l es el paso m%s importante en la tinción de Bram& ,4pli(ue. 0a decoloración es el paso m%s importante. ,l tiempo debe ser suficiente para (ue deje de desprenderse cristal violeta de la preparación sin decolorarla c ompletamente
. a* ,nliste ra-ones por la (ue la tinción de Bram es de mayor utilidad (ue la tinción simple en un laboratorio de diagnóstico. b* ajo (ué circunstancias podría ser m%s /til una tinción simple (ue una tinción de Bram& A*1.C pone en evidencia diferencias en la composición (uímica de la pared celular de las bacterias 2.C permite separar las bacterias en dos grandes grupos+ las Brampositivas y las BramC negativas 3.C permite visuali-ar partes internas de la célula .C método r%pido para la identificación inicial de bacterias implicadas en las infecciones * cuando solo se re(uiera visuali-ar forma+ tamaño
7. 6uponga (ue un estudiante est% reali-ando el procedimiento de tinción de Bram y en la etapa de decoloración de células en lugar de cubrir su frotis con alco)ol etílico al ;7?+ usó agua destilada. $de (ué color observaría las células de una bacteria Bram positiva y Bram negativa al observarlas al microscopio con la lente del
1-
objetivo de inmersión&C ,4pli(ue su respuesta. Ambas las vería de color rojo>roji-o. ,l colorante violeta y el yodo lugol* se combinan con las bacterias tiñéndolas de violeta oscuro. 0as (ue retienen este color después del intento de decoloración con el alco)ol son las gram * mientras (ue las gram C* (uedan incoloras+ entonces al agregar la safranina+ las gram * no se tiñeran por(ue éstas ya est%n de violeta mientras (ue las gran C* tomaran el color roji-o pero si no se agrega el lugol (ue es mordiente no se fijara el color violeta por lo (ue al final solo podr% verse como si todas las células fueran gram C*
8. $#u%l sería el valor de la técnica de tinción de Bram en el estudio de la pure-a del cultivo de una bacteria& ,4pli(ue El valor ser í a muy alto ya que gracias a ella se podr í a conocer si ese cultivo de verdad es puro y no est á contaminado con bacterias de otro tipo ya que la tinci ón te permite diferenciar entre gran-positivas y gran-negativas y no solo eso sino tambi én saber o diferenciar de cual microorganismo se trata
9. Al reali-ar la tinción de Bram en el frotis con la me-cla de células usted usó rojo #ongo en lugar de safranina. Dibuje cómo espera (ue se observar%n las células en el microscopio. &as +acterias aparecen incoloras en un ondo azul
:. Debido a (ue e4iste un )urac%n en su localidad se suspendió la actividad pr%ctica en los alumnos en el laboratorio de microbiología general+ en la cual estaba contemplado reali-ar la tinción de Bram de dos cultivos de bacterias. or consiguiente+ el profesor no pudo sacar de la incubadora los cultivos y los dejó 2 ) m%s de incubación. Al día siguiente+ usted fue a reali-ar su actividad pr%ctica y al observar los frotis de la bacteria Bacilluscereus aprecia una gran variabilidad en el color de las células de violeta intenso )asta sombras rosa*. roporcione una e4plicación para estos resultados.
Bibliograf ía http://docsetools.com/articulos-para-saber-mas/article_40931.html
1%
http://microbiologiaunvime.wikispaces.com/file/view/Anexo+I+TP+N%C2%BA3.pdf http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Practica_preparaciones_microbiologicas_18855.pdf Eddie Echandi. 1967. fitopatolog í a general. Lima, Per ú
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