II. TINJAUAN PUSTAKA Bligo ( Benincasa hispida Thunb Cogn) Benincasa hispida Thunb Cogn atau sering disebut bligo merupakan tanaman menjalar,
berbatang berkayu, lunak, berbulu, warna hijau. Daun tunggal, bulat, tepi rata, ujung tumpul, tumpul, pangkal membulat, panjang 10-17 cm, lebar 9-15 cm, warna hijau. Bunga tunggal, berkelamin dua, tumbuh di ketiak daun, mahkota berbulu halus, warna kuning. Buah berbentuk seperti buah buni, bulat memanjang, berdaging, panjang 15-20 cm, warna hijau keputih-putihan. Bligo mempunyai banyak nama daerah di Indonesia, antara lain: Kundo (Aceh), Gundur (Gayo), Kudul (Simalur), Undru (Nias), Kundue (Minangkabau), (Minangkabau), Sardak (Lampung),
Butong (Dayak), (Dayak), Leyor (Sunda), (Sunda), Baligo (Jawa),
Bhaligu, Kondur (Madura), Kunrulu (Bugis), Laha (Irian) (Hermanto 1993).
Gambar 1. Buah bligo ( Benincasa hispida Thunb Cogn) (Anonim 2009) Di Indonesia, bligo digunakan sebagai tanaman obat yang dapat digunakan dalam penyembuhan berbagai penyakit antara lain; biji untuk obat: batu ginjal, demam, kencing manis, pelembut kulit, radang paru, radang usus, sembelit, tonik dan wasir. Buahnya untuk pengobatan: disentri, panas dalam, pendarahan pada organ bagian dalam danonik (Hermanto 1993). Benincasa hispida Thunb Cogn. yang merupakan famili Curcubitaceae dikenal dengan
banyak nama antara lain: bhuru kulu atau safet kolu (Gujarat), petha (Hindi), white pumpkin, white gouard atau wax gourd atau ash gourd, chinese preserving melon , hairy melon (English) dan kushmanda (Sansekerta).
Buah ini secara tradisional digunakan sebagai sebagai laksatif, diuretik, tonik,
aphrodisiac, kardiotonik, urynary calkuli, penyakit darah, insanity, epilepsi, dan juga dalam kasus jaundice, dispepsia, demam dan gangguan mentruasi (Kirtikar dan Basu 1975). Buah ini secara umum
digunakan sebagai sayuran di India dan negara tropis lainnya juga merupakan tanaman obat yang sering digunakan untuk menyembuhkan penyakit epilepsi dan gangguan syaraf lainnya (Aslokar et al. 1992). Ekstrak metanolik buah ini dilaporkan memiliki khasiat antiulker (Grover et al. 2001), antiinflamasi (Chandrababu et al. 2001), antihistamin dan aktivitas antidepresant (Anilkumar dan Ramu 2002). Selain itu, ekstrak metanol juga memiliki efek menstabilkan sel mast, aktivitas diuretik dan aktivitas nephroprotektif melawan keracunan merkuri pada tikus (Mingyu et al. 1995). Berdasarkan hasil penelitian (Rukumani et al. 2003) bahwa ekstrak metanol Benincasa hispida Thunb Cogn menunjukkan aktivitas antikanker yang signifikan, perlindungan terhadap bronchospasm (gangguan saluran pernafasan) yang diinduksi histamin, aktivitas neotropic dan antidepresan. Menurut Kumar dan Vimalavathini (2004) bahwa kemampuan ekstrak Benincasa hispida terhadap aktivitas anorektik dimediasi melalui sistem saraf pusat tanpa mempengaruhi pengosongan gastrik. Menurut
4
Qodrie et al. (2009) bahwa Benincasa hispida yang diekstrak dengan etanol secara farmakologi membuktikan manfaatnya sebagai pengontrol suhu tubuh pada saat demam dan menghilangkan nyeri. Pada dosis 250 dan 500 mg/kg bb ekstrak buah ini secara signifikan mampu menurunkan antinociceptive tikus wistar. Menurut Sivarajan (1994) buah ini digunakan untuk pengobatan gastrointestinal, penyakit pernafasan, penyakit jantung, vermifuge, diabetes militus dan penyakit uriner. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Kumar dan Vimalavathini (2004) menunjukkan bahwa buah Benincasa hispida mengandung fitokimia dari golongan triterpen yaitu alunsenol dan multiflurenol yang mempunyai efek menyetabilkan mast sel pada tikus. Selain itu buah Benincasa hispida Thunb Cogn yang diekstrak dengan metanol, mampu melindungi bronchospasm yang diinduksi oleh histamin. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak buah ini mempunyai aktivitas antihistaminik . Kemampuan perlindungan sudah ditunjukkan pada dosis 50 mg/kg bb dan dosis maksimalnya 400 mg/kg bb, karena diatas dosis ini tidak menunjukkan kenaikan perlindungan yang signifikan. Sedangankan perlindungan yang dilakukan oleh obat antihistaminik chlorphrniramine maleate dan atropine sulfat sudah ditunjukkan pada dosis 2 mg/kg bb. Berdasarkan penelitian Shetty et al. (2008) bahwa ekstrak buah Benincasa hispida Thunb Cogn mempunyai kemampuan penyembuhan pada ulcer di tikus percobaan.
Pada penelitian ini
menunjukkan bahwa senyawa aktif pada buah ini seperti terpene, flavonoid c-glikosida, dan sterol memiliki efek antioksidan. Senyawa ini menurunkan malondialdehid (MDA), kadar superoksida dismutase (SOD) di dalam sel darah merah, tingkat homogenat dan vitamin C pada plasma darah, jika dibandingkan dengan tikus kontol yang tidak diberi ekstrak buah Benincasa hispida Thunb Cogn. Mekanisme ini memungkinkan terjadinya penghambatan luka mukosa lambung dengan scavenging radikal bebas dan menekan produksi SOD dan vitamin C dalam tikus. Penurunan kadar SOD dan vitamin C pada tikus percobaan diduga disebabkan tingginya senyawa antioksidan pada ekstrak buah Benincasa hispida sehingga tubuh tikus percobaan menekan produksi SOD.
Hasil penelitian lain menunjukkan bahwa dari hasil eksplorasi bligo mengandung beberapa senyawa fitokimia yang antara lain; triterpenen (alnusenol, multiflasenol, isomultiflasenol), flavon (iso-vitesix) dan sterol (lupeol, lupeol asetat dan β-sitosterol). Beberapa konstituen penting yang diisolasi dari buah Benincasa hispida Thunb Cogn antara lain: triterpen, sterol dan glikosida serta minyak-minyak volatil (Yoshizumi et al. 1998; Wu et al. 1987). Beberapa komponen yang terdapat pada tanaman dan digunakan sebagai produk herbal antara lain: polisakarida (serat) dan pektin dari daun naupal (Reyburn et al. 1998). Daun dan minyak peppermint mengandung asetaldehida, amyl alcohol, methyl ester, limone, pinene, phellandrene, cardinene, pugelone dan dimethyl sulfide. Komponen minornya terdiri dari alpha-pinene, sabinene, terpinolene, ocimene, gamma-terpinene, fenchene, alpha - dan beta-thujone, citronellol dan senyawa
lainnya (Nair 2001; Inoue et al. 2002). Daun bunga dan akar dandelion mengandung quercetin, luteolin, luteolin-7-O-glucoside, p-hydroxyphenylacetic acid, germacranolide acids, clhorogenic acid, chicoric acid. Monocaffeyltartaric acid, scopoletin, aesculetin, aesculin, cichoriin, amidiol, faradiol, caffeic acid, taraxacoside, taraxasterol , inulin dan kandungan kalium yang tinggi (Williams et al.
1995; Hu dan Kitts 2003; Seo et al. 2005). Mullein mengandung harpagoside, harpagide, aucubin, hesperidin, verbascoside, saponin, dan minyak atsiri (Turker dan Camper 2002). Akar dari stinging
nettle mengandung polisakarida, vitamin C, karoten, beta sitosterol, flavonoid quercetin, rutin dan kaempferol (Newall et al. 1996; Schottner et al. 1997; Konrad et al. 2000).
Di Cina, biji dari buah Benincasa hispida Thunb Cogn digunakan dalam pengobatan antihelmitik (anti cacing). Biji dari buah bligo ini berbentuk seperti biji mentimun tetapi sedikit lebih
besar dan berwarna putih kekuningan. Minyak dari biji buah ini memberikan rasa yang pedas, baik
5
untuk otak dan liver dan efektif untuk pengobatan sifilis. Abu dari biji buah ini untuk pengobatan gonorhoea, pengobatan terhadap luka dan bengkak (Nadkarni’s 1995). Hasil penelitian Sugito (2010) menunjukkan bahwa ekstrak biji bligo tidak toksik pada tikus percobaan dengan dosis 5 g/kg bb dengan metode akut, ekstrak biji bligo juga tidak toksik pada tikus percobaan dengan dosis 0.1 g/kg bb dan 1 g/kg bb. Selain itu dari penelitian ini juga didapatkan bahwa ekstrak biji bligo tidak menyebabkan gangguan metabolisme hati, dilihat dari berat hati, SGOT, SGPT, bilirubin, total trigliserida, kolesterol, dan protein total, ekstrak biji bligo secara nyata menurunkan kadar alkali fosfatase, bilirubin total, glukosa, lemak total, dan meningkatkan kadar albumin, dan ekstrak biji bligo tidak menyebabkan gangguan metabolisme ginjal, dilihat dari kadar urea, fosfor, kalsium, dan kalium. Sejumlah tanaman curcubitaceae lainnya juga memiliki aktivitas antikanker dan antioksidan (Yang et al. 2007) seperti Curcubita moscata (buah), Momordica charantia (buah mentah), Cucumis melo (buah matang). Berdasarkan hasil penelitian Rach dan Sunita (2008) bahwa Benincasa hispida
Thunb Cogn yang diekstrak dengan petroleum eter dan metanol mempunyai kemampuan antikanker dan antioksidan yang siknifikan terhadap tikus percobaan, dibandingkan dengan Benincasa hispida Thunb Cogn yang diekstrak dengan metanol, etil asetat, aqueous, dan omoprazol. Kumar dan Vimalavathini (2004) menyatakan bahwa Benincasa hispida Thunb Cogn yang diekstrak dengan metanol memiliki kemampuan antibakteri. Ekstrak ini mampu menghambat pertumbuhan Propionibakterium acne dan Staphylococcus epidermidis , dimana kedua bakteri ini menyebabkan inflamasi pada jerawat. Ekstrak buah ini mampu menghambat kedua bakteri uji baik pada metode difusi disk dan difusi agar. Nilai MIC ekstrak buah ini terhadap Propionibakterium acne dan Staphylococcus epidermidis sebesar 0.049 mg/ml dan nilai MBC nya sebesar 0.049 dan 0.186 mg/ml.
Dari hasil analisa
kimia, ekstrak metanol dari Benincasa hispida Thunb Cogn positif
mengandung triterpenoid, flavonoid, carbohidrat, glikosida, vitamin dan asam uronic.
Dengan
demikian ekstak etanol dari buah ini mampu menghambat inflamasi pada jerawat dengan menghambat pertumbuhan bakteri Propionibakterium acne dan Staphylococcus epidermidis . Berdasarkan uji Toksisitas akut yang dilakukan oleh Qodrie et al. (2009) terhadap ekstrak etanol Benincasa hispida Thunb Cogn menunjukkan bahwa ekstrak ini tidak bersifat lethal sampai penggunaan 5 g/kg bb. Dan tidak menunjukkan adanya gejala keracunan selama dilakukan penelitian.
Tartrazin Tartrazin atau yang juga dikenal sebagai E102 atau FD&C yellow 5 merupakan pewarna sintetik azo dye berwarna kuning lemon yang diperoleh dari coal tar . Tartrazin memiliki nama kimia trinatrium 5-hidroksi-1-(4-sulfonatofenil)-4-[4-sulfanatofenilazo]-H-pirazol-3-karboksilat dengan C.I. No. 19140, nomor CAS 1934-21-0 dan beberapa nama sinonim antara lain acid yellow 23, filter yellow, food yellow 4, C.I. acid yellow 23, dan lain-lain (Burdock 1997).
Tartrazin adalah garam trinatrium dari 4,5-dihidro-5-oxo-1-(4-sulfofenil)-4-[sulfofenil-azo]H-pirazol-3-asam karboksilat, berbentuk bubuk berwarna kuning-jingga yang mudah larut dalam air, dengan larutannya berwarna kuning keemasan. Bila dilarutkan dalam asam sulfat pekat, akan terbentuk larutan berwarna kuning-jingga yang akan menjadi kuning bila diencerkan dengan air. Kelarutannya dalam alkohol 95% hanya sedikit, dalam gliserol d an glikol mudah larut. Tartrazin tahan terhadap cahaya, asam asetat, HCl, NaOH 10%. Mudah luntur oleh adanya oksidator, FeSO 4 membuat larutan zat berwarna menjadi keruh. Adanya tembaga (Cu) akan mengubah warna kuning menjadi kemerah-merahan. Tartrazin memiliki rumus molekul C 16H9 N4 Na3O9S2 (Winarno 2004).
6
Pada umumnya tartrazin digunakan dalam dessert (misalnya puding, custard, gelatin, es krim), permen, minuman (termasuk minuman berkarbonasi dan serbuk minuman perisa), daging olahan, dan sayuran beku yang dikalengkan. Selain itu juga digunakan dalam kosmetik dan obat. Tartrazin diizinkan penggunaanya dalam pangan di Indonesia, Malaysia, Amerika Serikat, Australia, dan Eropa (Burdock 1997). Tartrazin dapat menimbulkan reaksi alergi dan intoleransi seperti halnya pada semua pewarna azo dye, terutama pada orang yang menderita asma dan intoleransi terhadap aspirin. Mekanisme sensitifitasnya tidak diketahui dan biasanya disebut psudoalergi. Prevalensi intoleransi tartrazin diperkirakan kurang dari 0.12% dari populasi umum. Gejala sensitifitas tarhadap tartrazin dapat terjadi jika terpapar melalui kulit atau menelan senyawa yang mengandung tartrazin. Reaksi yang timbul antara lain anxiety (rasa takut dan bingung), migrain, depresi klinis, mata buram, gatal, rhinitis, urtikaria, lemah, panas, jantung berdebar, merasa lumpuh, pruritus, kulit bengkak dengan warna ungu, dan gangguan pola tidur. Pada kasus yang jarang, gejala sensitifitas tartrazin dapat timbul bahkan pada dosis kecil dan dapat berlangsung sampai 72 jam setelah terpapar. Beberapa peneliti menghubungkan tartrazin dengan gangguan obsessive-compulsive dan hiperaktif pada anak-anak. Menurut Depkes (1999) batas penggunaan maksimum tartrazin di Indonesia adalah 18-300 mg/kg. Menurut Inchem (1964), ADI tartrazin adalah 0-7.5 mg/kg bb.
Rhodamin Rhodamin adalah salah satu zat pewarna sintetis yang biasa digunakan pada industri tekstil dan kertas. Zat ini ditetapkan sebagai zat yang dilarang penggunaannya pada makanan melalui Menteri Kesehatan (Permenkes) No.239/Menkes/Per/V/85 dan menurut Inchem (2006) LD 50 rhodamin adalah sebesar 89.5 mg/kg. Namun penggunaan rhodamin dalam makanan masih terdapat di lapangan. BPOM di Makassar berhasil menemukan zat rhodamin B pada kerupuk, sambal botol, dan sirup melalui pemeriksaan pada sejumlah sampel makanan dan minuman. Rhodamin B ini juga adalah bahan kimia yang digunakan sebagai bahan pewarna dasar dalam tekstil dan kertas. Pada awalnya zat ini digunakan untuk kegiatan histologi dan sekarang berkembang untuk berbagai keperluan yang berhubungan dengan sifatnya dapat berfluorensi dalam sinar matahari (Marmion 1991). Rumus Molekul dari rhodamin B adalah C 28H31 N2O3Cl dengan berat molekul sebesar 479000. Zat yang sangat dilarang penggunaannya dalam makanan ini berbentuk kristal hijau atau serbuk ungu kemerah-merahan, sangat larut dalam air yang akan menghasilkan warna merah kebiru biruan dan berfluorensi kuat. Rhodamin B juga merupakan zat yang larut dalam alkohol, HCl, dan NaOH, selain dalam air. Di dalam laboratorium, zat tersebut digunakan sebagai pereaksi untuk identifikasi Pb, Bi, Co, Au, Mg, dan Th dan titik leburnya pada suhu 165ºC (Winarno 2004). Dalam analisis dengan metode destruksi dan metode spektrofometri, didapat informasi bahwa sifat racun yang terdapat dalam rhodamin B tidak hanya saja disebabkan oleh senyawa organiknya saja tetapi juga oleh senyawa anorganik yang terdapat dalam rhodamin B itu sendiri, bahkan jika rhodamin B terkontaminasi oleh senyawa anorganik lain seperti timbal dan arsen (Subandi 1999). Dengan terkontaminasinya rhodamin B dengan kedua unsur tersebut, menjadikan pewarna ini berbahaya jika digunakan dalam makanan. Ciri makanan yang mengandung rhodamin B adalah warna kelihatan cerah (berwarna-warni), sehingga tampak menarik, ada sedikit rasa pahit (terutama pada sirup atau limun), muncul rasa gatal di tenggorokan setelah mengonsumsinya, dan baunya tidak alami sesuai makanannya. Di dalam rhodamin B sendiri terdapat ikatan dengan klorin (Cl) yang dimana senyawa klorin ini merupakan senyawa anorganik yang reaktif dan juga berbahaya. Reaksi untuk mengikat ion klorin
7
disebut sebagai sintesis zat warna. Disini dapat digunakan reaksi Frield-Crafts untuk mensintesis zat warna seperti triarilmetana dan xentana. Rekasi antara ftalat anhidrida dengan resorsinol dengan keberadaan seng klorida menghasilkan fluoresein. Apabila resorsinol diganti dengan N-Ndietilaminofenol, reaksi ini akan menghasilkan rhodamin B (Kusmayadi dan Sukandar 2009). Selain terdapat ikatan rhodamin B dengan klorin terdapat juga ikatan konjugasi. Ikatan konjugasi dari Rhodamin B inilah yang menyebabkan Rhodamin B bewarna merah. Ditemukannya bahaya yang sama antara rhodamin B dan klorin membuat adanya kesimpulan bahwa atom klorin yang ada pada rhodamin B yang menyebabkan terjadinya efek toksik bila masuk ke dalam tubuh manusia. Atom Cl yang ada sendiri adalah termasuk dalam halogen, dan sifat halogen yang berada dalam senyawa organik akan menyebabkan toksik dan karsinogen (Kusmayadi dan Sukandar 2009). Beberapa sifat berbahaya dari rhodamin B seperti menyebabkan iritasi bila terkena mata, menyebabkan kulit iritasi dan kemerahan bila terkena kulit hampir mirip dengan sifat dari klorin yang seperti disebutkan di atas berikatan dalam struktur rhodamin B. Penyebab lain senyawa ini begitu berbahaya jika dikonsumsi adalah senyawa tersebut adalah senyawa yang radikal. Senyawa radikal adalah senyawa yang tidak stabil. Dalam struktur r hodamin kita ketahui mengandung klorin (senyawa halogen), sifat halogen adalah mudah bereaksi atau memiliki reaktivitas yang tinggi maka dengan demikian senyawa tersebut karena merupakan senyawa yang radikal akan berusaha mencapai kestabilan dalam tubuh dengan berikatan dengan senyawa-senyawa dalam tubuh kita sehingga pada akhirnya akan memicu kanker pada manusia. Klorin sendiri pada suhu ruang berbentuk sebagai gas. Sifat dasar klorin sendiri adalah gas beracun yang menimbulkan iritasi sistem pernafasan. Efek toksik klorin berasal dari kekuatan mengoksidasinya. Bila klorin dihirup pada konsentrasi di atas 30 ppm, klorin mulai bereaksi dengan air dan sel-sel yang berubah menjadi asam klorida (HCl) dan asam hipoklorit (HClO). Ketika digunakan pada tingkat tertentu untuk desinfeksi air, meskipun reaksi klorin dengan air sendiri tidak mewakili bahaya utama bagi kesehatan manusia, bahan-bahan lain yang hadir dalam air dapat menghasilkan disinfeksi produk sampingan yang dapat merusak kesehatan manusia. Klorit yang digunakan sebagai bahan disinfektan yang digunakan dalam kolam renang pun berbahaya, jika terkena akan menyebabkan iritasi pada mata dan kulit manusia (Kusmayadi dan Sukandar 2009).
Limfosit Limfosit adalah bagian dari sel darah putih ( leucocytes) yang tidak memiliki granula dalam sitoplasma (Kuby et al. 2007). Limfosit merupakan sel berukuran kecil, memiliki bentuk bulat dengan diameter 7-15 µm dan banyak terdapat pada organ limfoid seperti limfa, kelenjar limfe, dan timus. Sel ini merupakan inti dalam proses respon imun spesifik karena sel-sel limfosit dapat mengenal setiap jenis antigen, baik antigen yang terdapat pada intraselular maupun ekstraselular (Kresno 1996). Guyton dan Hall (2006) mengatakan bahwa limfosit manusia berjumlah sekitar 30% dari jumlah normal sel darah putih. Limfosit dapat membentuk ratusan jenis antibodi dan limfosit sensitif yang berbeda-beda. Masing-masing jenis, sifatnya spesifik untuk suatu antigen yang khusus dan tiap jenisnya dapat menggandakan diri mencapai jumlah yang sangat besar apabila distimulasi oleh antigen spesifik yang jumlahnya cukup. Limfosit dibawa ke hampir semua jaringan dan organ vertebrata tingkat tinggi lewat dua jaringan sirkulasi, darah dan sistem limfa. Limfosit terdapat sebanyak 20-80% dari sel bernukleasi dalam darah dan lebih dari 99% dalam cairan limfatik (limfa) (Weissman et al. 1978). Limfosit dibentuk di dalam sumsum tulang dan berdiferensiasi menjadi sel limfosit B dan limfosit T. Berdasarkan fungsinya terdapat tiga kelompok sel limfosit, yaitu sel limfosit B, sel limfosit
8
T, dan sel limfosit NK ( Natural Killer ). Sel limfosit B dan T memiliki reseptor pada permukaan yang mampu mengenali antigen tertentu, sedangkan sel limfosit NK tidak mempunyai reseptor untuk mengenal antigen. Pada manusia normal, sel limfosit B berjumlah 5-15% dan sel limfosit T berjumlah sekitar 65-80% dari jumlah limfosit dalam tubuh. Kedua sel tersebut berperan sebagai respon spesifik di mana sel limfosit B berperan di dalam respon imun humoral dan sel limfosit T berfungsi dalam sistem imun seluler, sedangkan sel limfosit NK ( Natural Killer ) berperan dalam respon imun nonspesifik (Harris 1991). Sel limfosit B merupakan sel yang berasal dari sel stem dalam sumsum tulang belakang, tumbuh menjadi sel plasma yang menghasilkan antibodi dan sel memori. Limfosit B termasuk sistem perthanan humoral yaitu tidak menggunakan sel dalam melawan antigen tetapi menghasilkan zat yaitu berbagai jenis antibodi yang digunakan untuk melawan antigen (Sheeler dan Bianchi 1982). Sel limfosit B dewasa memiliki imunoglobulin permukaan atau Surface Immunoglobulin (sIg) yang bertindak sebagai reseptor antigen spesifik, terdapat 1.5 x 105 molekul sIg pada permukaan membrane sel limfosit B yang memiliki status peningkatan sesuai dengan antigen tertentu. Sel limfosit B dewasa bergerak ke jaringan limfoid primer dan sekunder untuk dapat memberikan respon terhadap rangsangan antigenik dengan cara pembelahan dan diferensiasi menjadi sel plasma dan sel memori dibawah kontrol sitokin, khususnya limfokin yang disekresi oleh sel limfosit T (Roitt dan Delves 2001). Sel limfosit T merupakan sistem pertahanan seluler termasuk leukosit non fatogenik yang berasal dari stem sel (sumsum tulang belakang), kemudian bermigrasi ke organ timus untuk menjadi dewasa. Sel limfosit T membelah diri di dalam organ timus dengan sangat cepat. Sel limfosit T dalam proses pendewasaannya mengalami diferensiasi menjadi tiga bentuk, yaitu sel T helper (Th), Tsuppresor (Ts), dan Tcytotoxic (Tc). Sel Thelper merupakan sel limfosit T yang berperan dalam stimulasi antibodi dan aktivasi makrofag dengan cara mengsekresikan molekul yang disebut sitokin. Sel Tsuppresor berperan menekan aktivitas sel limfosit T yang lain dan mempunyai aktivitas menurunkan produksi antibodi. Sel T cytotoxic berperan untuk menghacurkan sel alogenik dan sel sasaran yang terinfeksi patogen intraseluler seperti virus (Baratawijaya 2007). Menurut Roitt dan Delves (2001) sel T helper dapat dibedakan dari sel T cytotoxic berdasarkan adanya glikoprotein yang berbeda pada permukaan membran mereka. Sel limfosit T yang memiliki CD4 berfungsi sebagai sel T helper sedangkan sel limfosit T yang memiliki CD8 pada permukaan membrannya berfungsi sebagai sel Tcytotoxic. Sel limfosit T memiliki T Cell Antigen Receptor (TCR) yang dapat mengenali epitop suatu antigen melalui kerjasama dengan molekul protein
permukaan pada Antigen Presenting Cell (APC) yaitu Mayor Histocompatibility Complex (MHC). Sel limfosit T teraktivasi oleh antigen spesifik sehingga terstimulasi untuk berproliferasi dan berdiferensiasi menjadi sel T memori dan berbagai sel T efektor yang mengsekresikan berbagai sitokin. Sitokin ini berpengaruh pada aktivasi sel B, sel Tc, sel-sel fagosit, sel NK, dan sel lain yang terlibat dalam respon imun. Sel limfosit NK atau Natural Killer termasuk sel nul karena tidak memiliki reseptor antigen pada permukaan tetapi memiliki reseptor untuk komplemen (C) dan fragmen molekul antibodi (Kresno 1996). Sel limfosit NK memiliki granula yang banyak seperti granula azurofilik dan ukuran lebih besar dari sel limfosit B dan T sehingga dikenal dengan LGL (Roitt dan Delves 2001). Sel limfosit NK berfungsi sebagai sel efektor sitolitik yang dapat menyerang dan melisis sel target yaitu sel abnormal seperti sel neoplastik, sel terinfeksi virus atau patogen seluler, dan sel normal yang tidak dewasa (Roitt dan Delves 2001).
9
Proliferasi Limfosit Proliferasi limfosit adalah suatu fungsi biologis, yaitu proses perbanyakan sel melalui pembelahan sel atau mitosis sebagai respon terhadap antigen atau mitogen. Proses tersebut menghasilkan sel-sel efektor atau sel-sel plasma yang berperan dalam respon spesifik dan non spesifik. Jika sel dikultur dengan senyawa mitogen, sel limfosit akan berproliferasi secara non spesifik. Respon proliferasi limfosit digunakan untuk menggambarkan fungsi limfosit dan status imun individu (Zakaria et al. 2003). Kemampuan sel limfosit untuk berproliferasi atau membentuk klon, menunjukkan secara tidak langsung kemampuan respon imunologik. Uji aktivitas sel limfosit dapat dilakukan secara in vitro dan merupakan indikator kualitas respon imun. Berbagai jenis bahan pangan seperti jahe, kunyit,
dan bawang putih telah diketahui dan diteliti memiliki aktivitas imunostimulan, yaitu meningkatkan kemampuan proliferasi sel limfosit untuk meningkatkan sistem imunitas (Zakaria et al. 2003). Mitogen adalah agen yang mampu menginduksi pembelahan sel, baik sel T maupun sel B dalam persentase tinggi. Mitogen dikenal sebagai aktivator poliklonal karena dapat mengaktivasi banyak klon sel T atau sel B tanpa tergantung spesifitas antigennya. Stimulasi limfosit dengan antigen atau mitogen mengakibatkan berbagai reaksi biokimia di dalam sel, di antaranya adalah fosforilasi nukleoprotein, pembentukan DNA dan RNA, serta peningkatan metabolisme lemak, dan lain-lain. Aktivitas sel T dan sel B berproliferasi ini dapat diukur melalui Indeks Stimulasi (IS) (Zakaria et al. 2000). Beberapa jenis mitogen yang umum merupakan protein yang mengikat gula yang disebut lektin, yang secara spesifik mengikat glikoprotein pada pada permukaan berbagai sel, termasuk limfosit. Pengikatan molekul lektin ke glikoprotein membran sering memicu aglutinasi, atau pengklusteran sel, yang kemudian memicu aktivasi seluler dan proliferasi (Bartosz 1990). Menurut Tizar (1988), mitogen yang sering digunakan dalam proliferasi limfosit dapat berupa senyawa lektin dan non lektin. Contoh mitogen berupa senyawa lektin adalah PHA (Phytohaemagglutinin), PWM (Pokeweed ), dan contoh mitogen berupa senyawa non lektin adalah Con A (Concanavalin A), dan LPS (Lipopolisakarida). Senyawa Con A berasal dari ekstrak tanaman kacang jaks (Conavalin ensiformis). LPS berasal dari suatu bakteri Gram negatif seperti E . coli dan Salmonella thyphymurium. Menurut Lao et al. (2001) aktivitas mitogen bersifat spesifik, seperti Con
A dan PHA umumnya menginduksi proliferasi limfosit sel T, LPS menginduksi sel B, sedangkan PWM menginduksi sel T dan B. Pengujian proliferasi sel dapat dilakukan dengan pewarnaan MTT (3-[4,5-dimetilthiazol2yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide; thiazolyl blue) yang ditambahkan pada media kultur (5 mg/ml) (Wyllie et al. 1998). Prinsip dari metode MTT ini adalah reduksi enzim suksinat dehidrogenase pada sel dari garam tetrazolium (MTT) yang berwarna kuning menjadi kristal biru formazan yang kemudian dihitung absorbansinya menggunakan microplate reader atau ELISA Reader pada λ 570 nm. Enzim suksinat dehidrogenase merupakan enzim yang disintesis oleh semua sel pada mitokondria. Semakin banyak terbentuk warna formazan, berarti jumlah enzim yang menghidrolisis garam tetrazolium juga banyak dan hal ini menunjukkan jumlah sel yang hidup banyak (Bounous 1992). Selain dengan metode MTT, terdapat juga jenis metode pengujian proliferasi sel lainnya, yaitu dengan menggunakan metode pewarnaan biru trifan dan dilihat menggunakan mikroskop pada perbesaran 400 kali. Prinsip metode ini adalah penyerapan zat warna melalui membran sel, biru trifan hanya dapat mewarnai jika sel tersebut rusak, sehingga digunakan untuk membedakan sel yang mati atau rusak dengan sel yang hidup. Sel yang hidup memiliki bentuk bulat dan berwarna terang,
10
sedangkan sel yang mati memiliki bentuk mengkerut dan berwarna biru. Sel mati tesebut berwarna biru disebabkan pecahnya dinding sel yang mengakibatkan warna biru dari biru trifan dapat masuk dan mewarnai keseluruhan sel (Shaper 1998).
Kultur Sel Kultur sel merupakan teknik mengembangbiakkan sel di luar tubuh ( in vitro). Kultur sel biasanya dilakukan pada sel limfosit. Biakan sel atau jaringan akan diamati untuk mempelajari sifat sel di luar tubuhnya. Pelaksanaan kultur sel secara in vitro ini memerlukan kondisi pertumbuhan yang mirip dengan kondisi di dalam tubuh meliputi pengaturan temperatur, konsentrasi O 2 dan CO2, pH, tekanan osmosis, dan kandungan nutrisi (Davis 1994). Pengaturan kondisi untuk pertumbuhan merupakan suatu keuntungan karena kondisi fisiologis dari kultur sel relatif konstan, sedangkan kekurangannya adalah hilangnya spesifitas sel, karena sel bekerja tidak secara terintegritas dalam suatu jaringan, tetapi selnya terpisah-pisah. Kultur sel dilakukan dalam media yang kondisinya steril, butuh keahlian dan keterampilan khusus dan biaya relatif mahal (Malole 1990). Menurut Freshney (1994), terdapat beberapa perbedaan karakteristik sel dalam kultur ( in vitro) dengan sel di dalam tubuh ( in vivo). Interaksi yang spesifik antar sel pada jaringan secara in vitro hilang karena sel tersebar dan mudah bergerak, laju pertumbuhan sel meningkat karena ada
kemungkinan berproliferasi. Lingkungan kultur kekurangan beberapa komponen yang mempengaruhi pengaturan homeostatik tubuh seperti sistem saraf dan sistem endokrin. Energi yang dibutuhkan dalam metabolisme in vitro berasal dari glikolisis, sedangkan meabolisme sel secara in vivo berasal dari glikolisis, daur Krebs, dan transpor elektron. Media pertumbuhan kultur sel berfungsi mempertahankan pH, menyediakan lingkungan yang baik, sehingga sel dapat bertahan hidup, berkembang dan berdiferensiasi dan menyediakan substansisubstansi yang tidak dapat disintesis oleh sel itu sendiri. Nutrisi yang umumnya terkandung adalah asam amino, vitamin, glukosa atau gula lain, garam, dan protein tertentu. Pemilihan media harus didasarkan pada kebutuhan sel yang ditumbuhkan dan disesuaikan dengan tujuan dari studi penggunaan sel tersebut. Media yang sering digunakan untuk kultur sel limfosit adalah RPMI-1640. RPMI ( Rosewell Park Memorial Institut ). Selain RPMI-1640 terdapat juga RPMI-1630 dan RPMI1629 (Davis 1994). Dalam pembuatan media kultur sel, dilakukan penambahan buffer dan antibiotik. Penambahan buffer bertujuan menjaga keseimbangan pH yaitu memiliki pH 7.4 karena jika pH sedikit lebih rendah dari pH 7, pertumbuhan sel akan terhambat (Freshney 1994). Buffer yang sering digunakan adalah NaHCO3. Penambahan antibiotik bertujuan mencegah kontaminasi media. Antibiotik yang berbeda mempunyai spektrum antimikroba yang berbeda seperti Penicilin merupakan antimikroba untuk bakteri gram positif, Streptomicin untuk bakteeri gram positif dan negatif, sedangkan Gentamicin untuk bakteri gram positif, negatif, dan mikroplasma (Freshney 1994). Selain itu juga ditambahkan serum untuk menunjang pertumbuhan sel di luar tubuh dan pelekatan sel. Serum yang biasanya digunakan sebagai suplemen standar adalah serum janin sapi ( Fetal Calf Serum atau Fetal Bovine Serum), karena kaya dengan faktor pertumbuhan dan rendahnya kandungan gamma
globulin. Penambahan serum berkisar 5-20% (Walun et al. 1990). Disamping medium, jumlah atau konsentrasi sel yang dikulturkan harus diperhatikan. Jumlah sel limfosit yang dikulturkan sekitar 1-4 x 10 6 sel/ml, karena sel limfosit tidak dapat bertahan hidup dan tumbuh pada konsentrasi sel yang rendah atau kurang dari 1.5 x 10 5 sel/ml (Bellanti 1993). Sel limfosit memerlukan O 2 untuk bertahan hidup. Kondisi O 2 yang rendah masih dapat mendorong proses proliferasi, tetapi pertumbuhannya tidak berlangsung lama dalam kondisi anaerob.
11
Temperatur kultur dipertahankan 37 oC. konsentrasi 5 % CO 2 dan 95% udara bertujuan membuat kondisi yang sama dengan kondisi di dalam tubuh. Temperatur dapat mempengaruhi pH melalui peningkatan kelarutan CO2 misalnya pada temperatur rendah akan terjadi perubahan ionisasi sehingga terjadi perubahan pH (Freshney 1994). Kultur sel limfosit dapat digunakan sebagai model uji toksisitas karena limfosit adalah sel yang bertanggungjawab terhadap respon imun spesifik, dimana sel tersebut mempunyai kemampuan untuk mengenal berbagai macam antigen yang berbeda (Cambier 1987). Lebih dari satu juta struktur antigenik dapat dibedakan karena kemampuan pengenalan yang dimiliki limfosit. Limfosit mempunyai fungsi yang paling beragam dibanding semua sel dalam sistem imun. Menurut Kresno (1996), sel limfosit mampu mengenal setiap jenis antigen baik antigen yang terdapat pada intraseluler maupun ekstraseluler misalnya dalam cairan tubuh atau dalam tubuh.
Tikus Percobaan Tikus putih merupakan hewan yang paling banyak digunakan sebagai hewan model untuk percobaan laboratorium. Hal ini disebabkan karena tikus putih sangat produkstif dan mudah dalam pengelolaannya. Selain itu, siklus hidup dari hewan ini relatif pendek, jumlah anak perkelahiran banyak, serta sifat produksi dan reproduksinya menyerupai hewan mamalia (Mariwaki 1987). Tikus putih termasuk dalam Kingdom Animalia, Kelas Mammalia, Ordo Rodentia, Subordo Myomorpha, Superfamili Muroidea, Famili Muridae, Subfamili Murinae, Genus Rattus dan Spesies Rattus sp
(Robinson 1979). Penelitian toksikologi suatu sampel memerlukan serangkaian percobaan in vivo melibatkan hewan uji dengan harapan mendapatkan estimasi keamanan atau tingkat toksisitas suatu sampel pada manusia. Tikus laboratorium berasal dari tikus liar yang sudah didomistikasi. Mencit laboratorium biasanya berwarna putih, matanya berwarna merah dan biasanya tidak terlalu agresif. Secara garis besar, fungsi dan bentuk organ, proses biokimia dan biofisik antara tikus dan manusia memiliki banyak kemiripan. Perbedaan antara tikus dan manusia antara lain terdapat pada struktur dan fungsi plasenta tikus; tingkat pertumbuhan tikus yang lebih cepat dari manusia; kekurangpekaan tikus pada senyawa neurotoksik dan teratogen. Tikus dapat membuat vitamin C sendiri sedangkan sumber vitamin C manusia hanya melalui makanan. Berbeda dengan manusia, tikus tidak mempunyai kantung empedu (Koeman 1987). Terdapat lima galur tikus putih, yaitu galur Sprague Dawley, Wistar, Sherman, OsborneMendel dan Long-Evans. Untuk studi kesehatan dan penyakit pada manusia, tikus Sprague Dawley merupakan model yang sangat bagus untuk toksikologi, reproduksi, farmakologi dan tingkah laku. Galur Sprague Dawley yang umum digunakan untuk penelitian mempunyai ciri berwarna putih albino, berkepala kecil dan ekornya lebih panjang dari badannya (Malole dan Pramono 1989). Berikut ini beberapa karakteristik anatomis dan fisiologis tikus Sprague Dawley: Rumus gigi tikus Sprague Dawley adalah 2 (I 1/1, M 3/3) = 16. Gigi seri tumbuh terus menerus. Tikus akan menggigit atau menjepit dengan gigi serinya yang tajam jika salah penanganan. Esofagus masuk ke lambung melewati lubang yang kecil karena ada lipatan jaringan pada lambung. Karena struktur anatomis tersebut, tikus tidak mampu muntah. Seperti kuda, tikus tersebut tidak mempunyai kantung empedu. Paru-paru kiri terdiri dari satu lobus sementara paru-paru kanan terdiri atas empat lobus. Tikus memiliki lima pasang kelenjar susu. Distribusi jaringan mammae tersebar, dari garis tengah ventral melewati panggul, toraks dan bagian leher. Uretra tikus betina tidak berhubungan dengan vagina atau vulva. Kelenjar membrane niktitasi (kelenjar Harderian) merupakan kelenjar lakrimal terpigmentasi yang teletak di belakang bola mata, melingkari saraf optik. Hasil sekresi dari kelenjar
12
ini kaya akan lemak dan porfirin. Meskipun banyak spesies lain memiliki kelenjar Harderian, pada tikus kelenjar ini memiliki fungsi khusus. Selama masa stress dan atau sakit tertentu, air mata mengalir dan mewarnai wajah di sekitar mata dan hidung. Ketika air mata mengering, pigmen tersebut memberikan warna seperti darah kering. Pigmen tersebut akan berpendar saat dipaparkan pada sinar ultraviolet dan mengandung sedikit darah atau tidak sama sekali. Respon tikus terhadap penurunan suhu ruang/kandang berupa termogenesis tanpa gemetar. Sedangkan saat suhu kandang meningkat, terjadi vaskularisasi pada ekornya yang panjang, yang juga berperan sebagai organ termoregulator. Sebagian besar termogenesis tersebut terjadi pada jaringan lemak yang coklat, konsentrasi yang paling tinggi ditemukan pada jaringan subkutan di antara skapula (Malole dan Pramono 1989). Tabel 1. Data Biologis Tikus Kriteria
Nilai
Berat badan dewasa jantan
450-520 g
Berat badan dewasa betina
250-300 g
Berat lahir
5-6 g
Suhu tubuh
35,9-37,5°C
Harapan hidup
2,5-3,5 tahun
Konsumsi makanan
10 g/100 g/hari
Konsumsi air minum
10-12 mL/100 g/hari
Jumlah pernafasan Penggunaan oksigen
70-115/menit 0,68-1,10 mL/g/hari
Detak jantung
250-450/menit
Volume darah
54-70 mL/kg
Tekanan darah
84-134/60 mmHg
Lama produksi ekonomis Lama bunting
9 bulan 19-21 hari
Umur sapih
21 hari
Umur dewasa kelamin
35 hari
Jumlah anak per kelahiran
6 sampai 15
Kecepatan pertumbuhan
1 gram/hari
Sumber : Malole dan Pramono (1989)
13
