procesar tecnicas bacteriologicas

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

CAPACITACIÓN DE LABORATORISTA CLÍNICO MODULO II

Cuadernillo de Prácticas PROGRAMA TEÓRICO – PRÁCTICO

SUBMÓDULO I PROCESAR TÉCNICAS BACTERIOLÓGICAS BÁSICAS

Agosto de 2013

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo Procesar técnicas bacteriológicas básicas

ÍNDICE

BLOQUE I. Realizar la Toma De Muestras Biológicas del Cuerpo Humano

Práctica 1. “Esterilización De Materiales Utilizados En Microbiología Práctica 2. “Preparación Medios De Cultivo Mixtos Y Puros” Practica 3. “Técnicas De Aislamiento Bacteriano” Practica 4. “Coprocultivo Practica 5. “Urocultivo” Practica 6. “Observación De Microorganismos, Coloraciones Simples, Tinción De Gram Y Ácidos Resistentes”.

6 13 21 27 29 35

BLOQUE II. Aplicar los Métodos de Tinción de Bacterias Practica 7. “Preparación De Bioquímicas E Identificación De Los Grupos Bacterianos” Practica 8. “Antibiograma”

39 45

BLOQUE III. Determinar las Técnicas para Identificar Cocos y Bacilos Gram Positivos de Interés Medico. Practica 9. “Técnica De Tinción De Sheaffer Y Fulton” Práctica 10. “Técnica De Tinción De Knaysi

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Practica 11. “Identificación De Cocos Gram Positivos En Diversos Cultivos Bacteriológicos”

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CB-DAC-DOC-CP -QUI-05


PRESENTACIÓN

Este módulo contribuye a la adquisición de los conocimientos necesarios para la operación de diversos equipos de laboratorio, así como habilidades en el manejo de reactivos, material y equipos de acuerdo a técnicas y procedimientos de competencia laboral, para el funcionamiento de laboratorios clínicos ya sea en escenarios nacionales como internacionales. Referentes normativos para la elaboración del módulo  CSSA0359.01 Dictamen de muestras citológicas. Nivel de competencia 2.  NOM-166-SSA1-1997 Organización y funcionamiento del laboratorio clínico.  NOM-005-STPS-1998.- Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para el manejo, transporte y almacenamiento de reactivos químicos peligrosos.  NOM-087-ECOL-2002.- Norma oficial mexicana para la eliminación y tratamiento de RPBI.  ISO-15189:2003 .- Estandarización internacional para la acreditación de laboratorios clínicos.  Resultado de aprendizaje del módulo Adquirir habilidades y destrezas para el manejo de material, equipo y reactivos, así como la obtención, manejo y conservación de muestras biológicas de acuerdo a las normas oficiales mexicanas (NOM), internacionales (ISO) y de competencia laboral (CONOCER) establecidas para el laboratorio clínico.

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UBICACIÓN CURRICULAR  Mapa de la capacitación: El mapa de la capacitación está compuesto por submódulos, los cuales se dividen de la siguiente manera: 3ro Semestre

4 Semestre

APLICAR FUNCIONES BÁSICAS DEL LABORATORIO CLÍNICO BAJO NORMAS QUE RIGEN SU OPERACIÓN, ATENDIENDO AL PACIENTE CON BIOÉTICA. MATERIAL LABORATORIO.

DEL

OPERARA EQUIPO LABORATORIO

DE

CARACTERÍSTICAS Y FUNCIONAMIENTO DEL CUERPO HUMANO

5 Semestre

6 Semestre

REALIZAR LA TOMA DE MUESTRAS BIOLÓGICAS DEL CUERPO HUMANO

DESARROLLAR TÉCNICAS PARASITOLÓGICAS.

PROCESAR TÉCNICAS BACTERIOLÓGICAS BÁSICAS.

APLICAR LAS MICOLÓGICAS.

TÉCNICAS

La presente asignatura se ubica en el 4º semestre del bachillerato y dentro de la Capacitación para el Trabajo denominado Laboratorista Clínico. Esta asignatura tiene como antecedentes Química I y II, en relación horizontal con el mismo semestre con Biología I. Asimismo, el Submódulo I sirve de antecedente a las asignaturas del 4º, 5 º y 6 º semestre como Temas Selectos de Química I y II, Temas Selectos de Biología I y II, Ciencias de la Salud I y II, Submódulos III, IV, V, VI, VII y VIII.

LINEAMIENTOS DIDÁCTICOS Y EVALUACIÓN. Dado que la asignatura es eminentemente práctica, es decir, que se desarrolla básicamente en el laboratorio, se han elaborado once prácticas con el fin de apoyarla. Es importante que el docente presente los fundamentos teóricos que sustentan las prácticas antes de realizarlas con los alumnos, aclarar las competencias y recomendaciones pertinentes del Submodulo. Es conveniente que los alumnos preparen por anticipado todas las disoluciones que requiere cada práctica antes de desarrollarlas, a fin de obtener mejores resultados. Se sugiere que el profesor presente a los alumnos ejemplos de aplicación de lo considerado en las prácticas, apoyando en situaciones de la industria. En lo concerniente a la evaluación el profesor designará los rubros y aspectos a evaluar de las prácticas de laboratorio, así como las estrategias de operatividad de las mismas. JUSTIFICACIÓN DEL MÓDULO

Este módulo contribuye a la adquisición de los conocimientos necesarios en el manejo de equipos, reactivos y material de laboratorio de acuerdo a técnicas y procedimientos de competencia laboral, para el funcionamiento de laboratorios clínicos ya sea en escenarios nacionales como internacionales.

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COMPETENCIAS PROFESIONALES DE EGRESO Durante el proceso de formación de los dos módulos, el estudiante desarrollará las siguientes competencias profesionales, correspondientes a la capacitación en Laboratorista Clínico:

  REGISTRAR OPERACIONES BÁSICAS DEL LABORATORIO CLÍNICO CON BASE A LAS NORMAS ESTABLECIDAS.

  PROCESAR LAS TÉCNICAS PARA EL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO. Además se presentan las 11 competencias genéricas, para que usted intervenga en su desarrollo o reforzamiento, y con ello enriquezca el perfil de egreso del bachiller. Se considera que el egresado de la capacitación en Laboratorista Clínico está en posibilidades de desarrollar las competencias genéricas número uno, tres, cuatro, ocho y diez. Sin embargo se deja abierta la posibilidad de que usted contribuya a la adquisición de otras que considere pertinentes, de acuerdo con el contexto regional, laboral y académico: 1. Se conoce y valora a sí mismo y aborda problemas y retos teniendo en cuenta los objetivos que persigue. 2. Es sensible al arte y participa en la apreciación e interpretación de sus expresiones en distintos géneros. 3. Elige y practica estilos de vida saludables. 4. Escucha, interpreta y emite mensajes pertinentes en distintos contextos mediante la utilización de medios, códigos y herramientas apropiados. 5. Desarrolla innovaciones y propone soluciones a problemas a partir de métodos establecidos. 6. Sustenta una postura personal sobre temas de interés y relevancia general, considerando otros puntos de vista de manera crítica y reflexiva. 7. Aprende por iniciativa e interés propio a lo largo de la vida. 8. Participa y colabora de manera efectiva en equipos diversos. 9. Participa con una conciencia cívica y ética en la vida de su comunidad, región, México y el mundo. 10. Mantiene una actitud respetuosa hacia la interculturalidad y la diversidad de creencias, valores, ideas y prácticas sociales. 11. Contribuye al desarrollo sustentable de manera crítica, con acciones responsables. Es importante recordar que, en este modelo educativo, el egresado de la Educación Media Superior desarrolla las competencias genéricas a partir de la contribución de las competencias profesionales al componente de formación profesional, y no en forma aislada e individual, sino a través de una propuesta de formación integral, en un marco de diversidad.

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BLOQUE I. REALIZAR LA TOMA DE MUESTRAS BIOLÓGICAS DEL CUERPO HUMANO. No. DE PRÁCTICA: 1 “ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES DE LABORATORIO”. INDICADOR DE DESEMPEÑO   Nombra el material y equipo para análisis microbiológico.   Conoce y aplica los métodos para la esterilización de materiales de microbiología. Actividades Específicas  Opera y esteriliza adecuadamente el material utilizado en Microbiología.  Higieniza, prepara y envuelve correctamente el material que se someterá a esterilización.  Selecciona los métodos de esterilización adecuados para las diversas necesidades del laboratorio de microbiología.  Comprueba la efectividad del proceso de esterilización. INTRODUCCIÓN. Por su minúsculo tamaño, los microorganismos no pueden estudiarse como individuos, sino que es necesario manejarlos como poblaciones. Para ello es necesario cultivarlos, es decir, favorecer su multiplicación in Vitro, en ambientes especiales que proporcionen las condiciones semejantes a las de sus hábitats naturales. En estos ambientes se debe eliminar a todos aquello microorganismos que interfieren en el estudio del microorganismo de interés, al que además de proporcionar los nutrientes necesarios para su crecimiento multiplicación.  La esterilidad es un término utilizado para indicar la ausencia de cualquier forma de vida en un objeto determinado, la esterilización es el proceso para llegar a este fin.  Un requisito indispensable en el laboratorio de Microbiología es que los materiales y medios de cultivo estén estériles y protegidos adecuadamente para conservar esterilidad durante su uso y almacenamiento.  Existen varios métodos de esterilización, los más utilizados en el laboratorio son: calor húmedo, calor seco, incineración, substancias químicas, filtración. La esterilización La esterilización es un proceso a través del que se puede lograr la destrucción total de los microorganismos viables presentes en un determinado material. Este procedimiento es de gran utilidad dentro del campo farmacéutico, ya que existen muchos procesos que requieren la utilización de materiales estériles. Entre éstos podemos destacar: La esterilización de equipos quirúrgicos y otros materiales de uso médico con el propósito de reducir de infecciones en pacientes. El acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas, etc.) que va a ser utilizado laboratorios de microbiología.

el riesgo

en los

La preparación de medios de cultivo que serán empleados con diferentes propósitos (cultivo de microorganismos, control de ambiente, equipos o personal, análisis microbiológico de medicamentos, cosméticos, alimentos, etc.) Existen diversos métodos de esterilización. La selección del método a aplicar en cada caso está determinada por el tipo de producto a esterilizar.

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Clasificación de los métodos de esterilización: En la siguiente página se presenta un esquema de los principales métodos de esterilización, clasificados de acuerdo al tipo de agente que actúa. 1) Agentes físicos El calor se puede aplicar como agente esterilizante de dos formas: el calor húmedo el cual destruye a los microorganismos por desnaturalización de las proteínas y el calor seco que destruye a los microorganismos por oxidación de sus componentes celulares. El calor es considerado como el método de esterilización por excelencia siempre y cuando el material a esterilizar soporte altas temperaturas sin sufrir ningún tipo de daño. La radiación, o emisión y propagación de la energía a través de un medio, puede ser utilizada como agente para la eliminación de microorganismos. Así tenemos que las radiaciones ionizantes se pueden utilizar para la esterilización de materiales termolábiles, como por ejemplo materiales plásticos, y las radiaciones no ionizantes, como la luz ultravioleta, puede ser empleada en el control de áreas cerradas.

a) Esterilización por calor: El calor es el método de elección para esterilizar el material de laboratorio resistente a las altas temperaturas. La temperatura y el tiempo requeridos para esterilizar un material dependen de que se esté utilizando calor seco o calor húmedo. Esterilización con calor seco: La acción bactericida del calor seco se debe a la oxidación física de un procedimiento lento o coagulación de la proteína bacteriana por quemadura. En ausencia de humedad se necesita una temperatura más alta, ya que en esta forma los microbios son destruidos al absorber el calor. Pueden ser dos tipos: Directa: flameado o incineración más utilizada en laboratorios y en algunos hospitales pequeños. Indirecto: aire caliente u horno de Pasteur con temperatura de 160ºC a 180ºC por 1 a 2 horas siendo el más eficaz y seguro el eléctrico. Ventajas: El aire caliente penetra ciertos materiales que no se pueden esterilizar en el autoclave Puede utilizarse en laboratorios para la esterilización de artículos de vidrio El calor seco da protección en esterilización de instrumentos delicados con punta o filo al que dañaría el vapor El acero no se corroe o decolora Desventajas: Se requiere más tiempo de acción, porque el aire penetra con lentitud y uniformidad El tiempo y la temperatura varían según el tipo de material La sobre exposición puede dañar algún producto Destruye telas o material de caucho

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Esterilización con calor húmedo: El calor húmedo es la forma de vapor saturado a presión es eficaz para la destrucción de todas las formas microbianas, incluso espora. La muerte de las bacterias es causada por la desnaturalización y coagulación de su proteína o su sistema intercelular enzima-proteína. Estas reacciones son catolizadas por medio del agua. Estas pueden de dos tipos: Calor húmedo discontinuo: algunos medios de cultivo que contiene carbohidratos como la Gelatina, leche, etc. no soportan temperaturas elevadas y se realiza mediante los siguientes Procedimientos:  Tindalización: hace uso del calor húmedo, para una buena esterilización se debe realizar a 100ºC por ½ hora (por tres veces discontinuas) durante 1 día.  Ebullición: es el paso de un líquido al estado de vapor. El agua en ebullición representa en forma eficaz y práctica de proporcionar una desinfección de alto nivel de instrumentos y guantes que entren en contacto de las membranas mucosas, si bien al hervirlos por 20 minutos se aniquilan todas las formas vegetativas de las bacterias, los virus, las levaduras y los hongos, pero no destruye a las esporas.  Pasteurización: elimina a todos los microorganismos no esporulados se puede variar las temperaturas por ejemplo: 62ºC por 30 min.; 70ºC por 15 min. Se utiliza para preservar alimentos como ser leche, cerveza.  Vapor a presión: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables como grados de temperatura y tiempo de exposición, que junto con el tamaño del autoclave y el flujo del vapor, la densidad y el tamaño de la carga en la cámara aumentan la tasa se muerte de los microorganismos, en una temperatura de 121ºC – 132ºC durante 15 minutos o más. Ventajas:  Es más fácil segura y eficaz El uso del vapor es el procedimiento más rápido, el ciclo total de tiempo es más corto Es más barato y de obtención más fácil La mayoría de las autoclaves poseen controles automáticos y dispositivos de control Desventajas:  Se requiere mucho cuidado en la preparación y confección de bultos, en la carga y manejo del autoclave, así como el secado de los artículos  Los artículos a esterilizar deben estar limpios, sin grasa ni aceite El vapor tiene que estar en contactó directo con todas las partes de los artículos Los ciclos de tiempo se ajustan según el tipo de material y tamaño de la carga El vapor puede no ser puro

La cámara presurizada utilizada normalmente en el laboratorio es el autoclave. En muchos aspectos una autoclave se parece a una olla de presión casera. De hecho, en algunos pequeños laboratorios de microbiología se utilizan estas ollas en lugar de autoclaves. Ambos son recipientes de metal con paredes suficientemente fuertes para resistir la presión de vapor.

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Las autoclaves son grandes cámaras de acero inoxidable que funcionan automáticamente. Los objetos deben ser colocados de manera que el vapor de agua entre en contacto con todas las partes de cada uno de ellos, y el aire no quede atrapado en su interior. El aire que no es reemplazado por vapor crea una bolsa seca, donde la esterilización no será efectiva. b) Esterilización por radiación: La ionización por radiación genera iones al liberar electrones de los átomos, estos se desprenden violentamente con átomos adyacentes y se une a ellos, o bien se desprenden del segundo átomo. La energía liberada se transforma en energía térmica o química la cual causa la muerte de los microorganismos al romper la molécula del ADN e impide la división molecular y la propagación de la vida. Las principales fuentes de radiación ionizante son las partículas Beta y rayos gamma. Ventajas:  Penetra la morí parte de todos los materiales para esterilizarlos con confiabilidad  Es el método de esterilización más eficaz  No genera radiación residual  Penetran en objetos grandes y voluminosos 2) Agentes mecánicos La filtración permite la remoción de todos los microorganismos presentes en un líquido o un gas reteniéndolos sobre la superficie de un material. Filtración: Las células microbianas pueden retirarse de los líquidos o gases por filtración. La filtración es lenta y cara (debe usarse un filtro nuevo cada vez); por esta razón, se utiliza sólo para los líquidos termolábiles, que no se pueden esterilizar en el autoclave. Los sólidos termolábiles también se pueden esterilizar por filtración, si previamente se disuelven en un líquido. Técnicamente, la filtración no esteriliza porque los virus pueden pasar a través de los filtros, pero el proceso es suficiente para la mayoría de los estudios de rutina que se llevan a cabo en el laboratorio. Los filtros utilizados se denominan filtros de membrana. Estas membranas están compuestas de nitrocelulosa, con un poro de diámetro constante. La nitrocelulosa es un derivado químico de la celulosa, que también se utiliza como explosivo. El diámetro de poro es aproximadamente 0,45 µm; este tamaño es lo suficientemente pequeño como para eliminar todos los microorganismos, con excepción de los virus y algunas bacterias muy pequeñas. Un líquido se filtra haciéndolo pasar a través de un filtro de membrana acoplado a un matraz especial. Para hacer pasar el líquido por el filtro se utiliza una bomba de vacío; los microorganismos quedan en la superficie de la membrana. La filtración es el método de elección para esterilizar soluciones de vitaminas, antibióticos v otros compuestos termolábiles, que son añadidos a los medios. 3) Agentes químicos Algunas sustancias químicas pueden ser usadas como agentes esterilizantes porque tienen la capacidad de promover una o más reacciones químicas capaces de dañar los componentes celulares de los microorganismos (proteínas, membranas, etc.) Esterilización por gas oxido de etileno: Este es un gas incoloro, soluble en agua y en solventes comunes, se emplea para esterilizar objetos sensibles al calor, este proceso es relativamente lento. El poder bactericida depende de la concentración del mismo gas, temperatura, humedad y tiempo de exposición. La actividad esporicida se produce por aniquilación de los grupos terminales hidroxilo, carboxilo, amino y sulfridrilo. Ventajas: Es un buen sustituto eficaz cuando los artículos no pueden ser esterilizados por calor Es anticorrosivo y no daña el material Penetra totalmente todo el material poroso No deja película sobre los instrumentos

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Desventajas:  Es un proceso complicado por lo que se debe usarse indicadores biológicos  La esterilización lleva más tiempo, es un proceso lento y largo  Necesita equipo especial y costoso  Puede formar productos secundarios tóxicos  Necesita ser ventilado por lo menos 24 horas  Por frecuentes esterilizaciones pueden formar y aumentar residuos totales de gas en artículosporosos  En contacto con la piel produce vesículas y aún quemaduras se inhala puede ser irritante para las mucosas. Esterilización por glutaraldehido: La solución acuosa de glutaraldehido activado y amortiguado al 2%, destruye a los microorganismos por desnaturalización de la proteína. Es preferida para esterilizar instrumentos que no pueden esterilizarse al vapor o no se cuenta con otro método de esterilización. No es absorbible por caucho ni plástico  Es poco volátil de modo que puede reutilizarse  Es eficaz a la temperatura ambiente  Es anticorrosivo, no mancha y eficaz para esterilizar instrumentos  Tiene una tensión superficial baja Desventajas:  Puede ser irritante, por lo tanto se debe enjuagar exhaustivamente con agua estéril  Es una solución con olor  Es costoso Control del proceso de esterilización: Todos los procesos de esterilización se deben controlar para poder asegurar que han sido efectivos. Para ello se pueden utilizar indicadores físicos, químicos y/o biológicos, los cuales deben ser colocados en cada carga de esterilización. Indicadores físicos Entre los principales indicadores físicos se encuentran los medidores de presión y los termómetros los cuales permiten constatar las condiciones físicas dentro de la cámara de esterilización. También existen los termógrafos los cuales, además de registrar la temperatura alcanzada en el proceso, permiten conocer durante cuánto tiempo ésta se mantuvo

La mayoría de estos indicadores son cintas adhesivas que se adhieren al material a esterilizar. Estas cintas están impregnadas con una sustancia química que cambia de color cuando el material ha sido sometido al proceso de esterilización. Este tipo de cintas no son completamente confiables debido a que muchas veces sólo indican que se llegó a la temperatura deseada, pero no indican por cuanto tiempo ésta se mantuvo. También existen cintas diseñadas de manera que el cambio de color es progresivo, estas cintas son un poco más seguras porque permiten estimar si el tiempo de esterilización fue el adecuado. Indicadores biológicos Son preparaciones de una población específica de esporas de microorganismos, las cuales son altamente resistentes a un proceso de esterilización en particular. Estos indicadores se deben colocar junto con la carga de esterilización, en el sitio que se considera que es más difícil que llegue el vapor y después del proceso, se deben incubar durante 24 horas en condiciones adecuadas. Si después de este periodo hay evidencia de crecimiento microbiano (por ejemplo cambio de color del medio de cultivo), el proceso de esterilización no fue satisfactorio.

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Cuando se utilizan indicadores biológicos se debe verificar:  Tipo de microorganismo  Tipo de proceso de esterilización  Número de lote  Fecha de expiración  Medio de cultivo utilizado  Condiciones de incubación del indicador después de aplicado el proceso de esterilización.  Métodos de descontaminación para evitar la diseminación de esporas en el medio ambiente Con este tipo de indicadores se controlan la esterilización por vapor a presión, por calor seco y la esterilización con óxido de etileno. Almacenamiento del material estéril: Una vez que un material está estéril puede mantener esta condición si está protegido en la forma apropiada. Es decir, la duración de la esterilidad de un material no está relacionada directamente con el tiempo, sino con factores que comprometen su exposición al medio ambiente. Los materiales estériles pierden su esterilidad: Cuando se produce cualquier ruptura, accidental o no, del material que lo recubre durante su transporte o almacenamiento. Al humedecerse el material de empaque. Es importante no manipular los materiales estériles con las manos húmedas, ni colocarlos sobre superficies mojadas. Al almacenar los materiales estériles se deben tomar una serie de precauciones, tales como:        

Controlar el acceso a las áreas de almacenamiento de materiales estériles. Mantener el área de almacenamiento limpia, libre de polvo, sucio e insectos. Controlar la temperatura y la humedad de las áreas de almacenamiento. La temperatura ideal debe estar por debajo de los 26ºC y la humedad relativa entre 30 y 60%. Los periodos prolongados de almacenamiento en lugares tibios y húmedos, pueden producir condensación de humedad sobre el material de empaque. Utilizar, preferiblemente, estantes cerrados para colocar el material. Dejar que los materiales que salen del horno o el autoclave alcancen la temperatura ambiente antes de ser almacenados; de esta forma se evita la condensación dentro del empaque.

MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS

Cantidad 7 100 7 2 Bolsa 5 Mtros 90

MATERIALES Y EQUIPO Capacidad Y Nombre Descripción Matraz Erlenmeyer 250 ml Tubos de ensaye Pipetas 1, 5, 10 ml. Material Algodón proporcionado por el alumno Material Papel estraza proporcionado por el alumno Cajas de Petri 60 X15 mm

*Bata laboratorio.

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de

Cantidad

SUSTANCIAS Nombre Y Descripción

Fórmula Química

Manga Larga

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MÉTODOS. A) Siguiendo las instrucciones del profesor preparar el siguiente material: 1. Poner un filtro de algodón a cada pipeta y envolverla con papel. Marcar el volumen de cada pipeta y la fecha de preparación. 2. Tapar con algodón los tubos de ensayo y colocarlos en un bote. Tapar el bote con papel. 3. Envolver con papel las cajas de Petri, en grupos de 10. Colocarlas con la tapa hacia abajo. 4. Poner un tapón de algodón a cada matraz y cubrirlo con un gorro de papel. 5. Este material se esterilizará en autoclave a 120ºC durante 20 minutos a 15 libras de presión.

INFORME. Será presentado en forma individual en el formato de la UVE de Gowin al titular. CUESTIONARIO 1.- ¿Por qué es importante en el área de microbiología la esterilización?

2.- ¿Qué tipos de esterilización conoces?

3.- ¿Que método de esterilización crees que sea el mejor y por qué?

CONCLUSIONES.

NOMBRE DEL ALUMNO: Apellido Paterno GRADO Y GRUPO:

Apellido Materno FECHA:

Nombre(s) CALIFICACIÓN:

FIRMA DEL ALUMNO

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FIRMA DEL PROFESOR

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BLOQUE I. APLICAR TÉCNICAS BACTERIOLÓGICAS BÁSICAS PRÁCTICA No. 2

“PREPARACIÓN DE DIVERSOS MEDIOS DE CULTIVOS MIXTOS Y PUROS”. INDICADOR DE DESEMPEÑO:   Conoce el uso y aplicación de algunos medios de cultivo útiles para el cultivo de microorganismos, así como la técnica para su esterilización.   Identifica y prepara los medios de cultivo para microbiología.   Conoce y obtiene cultivos microbiológicos mixtos y puros. Actividades Específicas  Conoce los pasos necesarios para una correcta preparación de los medios de cultivo.  Elabora adecuadamente los medios de cultivo deshidratados y por componentes.  Envasa los medios de cultivo de manera adecuada en los diferentes recipientes de acuerdo al uso que se les dará.  Relaciona la composición de los diversos medios de cultivo con sus características y aplicaciones. II. INTRODUCCIÓN. Un cultivo es cualquier preparación en la que ha habido crecimiento artificial de microorganismos. Suele emplearse el término para denotar el desarrollo artificial de microorganismos en el laboratorio. Un cultivo puro incluye un tipo único de microorganismos. Pocas veces fuera del laboratorio se encuentran cultivos puros porque en la naturaleza los microorganismos suelen asociarse. En las poblaciones mixtas un tipo de microorganismos puede ayudar, destruir o no tener efecto en otros; su actividad “social”, en consecuencia, se asemeja a la de plantas y animales superiores, incluyendo el hombre. Un medio de cultivo es un substrato o solución de nutrimentos en que se cultivan los microorganismos en el laboratorio. Los microorganismos necesitan distintos materiales nutritivos, y se emplean ciertos medios para finalidades específicas como por ejemplo: precisar la capacidad de digestión de proteínas de un microorganismo, carbohidratos, etc. Medios de cultivo Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas

óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en el Laboratorio de Microbiología por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. Clasificación de los medios de cultivo En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel. Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en:  Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.  Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química definida cualitativa y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación. (Para bacterias como: Echerichia coli y Leuconostoc citrovorum)

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De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en:  Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.  Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. (Para bacterias como Salmonella typhi y Clostridium botulinum)  Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos. ( para bacterias como: Streptococcus pyogenes y Escherichia coli) Por su composición los medios de cultivo se clasifican en:  Líquidos: conocidos como caldos, estos son especialmente útiles para hacer diluciones, para homogenizar mezclas de microorganismos, para enriquecer cultivos y para rehidratar cepas liofilizadas.  Sólidos: Para separar microorganismos y favorecer el desarrollo de las colonias aisladas en las que es posible observar las características típicas de un solo tipo de microorganismo.  Semisólidos: Son aquellos medios líquidos a los que se adiciona agar en concentraciones de 0.4 a 0.8%. Estos se emplean para determinar la movilidad de los microorganismos microaerofílicos.  Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles. Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:  Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad.  Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.  Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.  Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización.  Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.

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Cantidad

MATERIALES Y EQUIPO Capacidad Y Nombre Descripción

1 paquete

Algodón

1

Autoclave

1

Balanza

90

Cajas de Petri

60 X 15 mm

7

Espátula

Metálica

14

Gasa

7 7 7 7 100

Matraz Erlenmeyer Mechero de Tela Tripie Tubos de bioquímica

250 gr 40 lt

Cantidad


Fórmula Química

2 de 500 gr

Agar Salmonella- Sigella

2 de 500 gr

Agar hierro de Kliger

2 de 500 gr

Agar Muller Hinton

2 de 500 gr

Agar MacConkey

250 ml Bunsen de asbesto Metálico

Recomendaciones: Antes de servir en las cajas de petri, se realiza la asepsia del área limpiando meticulosamente la mesa de trabajo y después eliminando impurezas restantes con alcohol prendido. Después se colocaron 2 mecheros (uno en cada lado, paralelamente) para por medio del calor eliminar cualquier impureza proveniente del aíre, para servir el medio en las cajas de petri esterilizadas colocando la boca del matraz en el fuego (antes de servir) y después sirviendo en las cajas una cantidad considerable, para después semitaparlas y dejando las muestras cerca de los mecheros sobre la mesa de trabajo. Esto se realizó para todas las cajas de petri.

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Preparar un Medio de cultivo

Pesar 9gr y colocar en un M atraz

MEDIO EMB

Esterilizar: (en matraz y autoclave) a no más de 121ºC

Hidratar agregar 250 ml de agua destilada

Homogenizar:

Con calor y agitación (ya que contiene Agar); mezclar y dejar en reposo 5min. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante 1min. Aprox.

Durante 15 min.

Servir en área aséptica en cajas de petri , previamente esterilizadas

IV. MÉTODOS. 1. Utiliza un matraz lo suficientemente grande para que permita una agitación y un mezclado correctos. La capacidad del matraz deberá ser alrededor de 2 a 2.5 veces el volumen del medio a prepararse. Por ejemplo, si se van a preparar 500 ml de medio de cultivo, use un matraz de un litro. Siga cuidadosamente las instrucciones impresas en la etiqueta de cada medio.

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2. Destape el frasco que contiene el medio de cultivo lejos de ventanas y de las zonas húmedas del laboratorio y una vez tomada la cantidad requerida, vuélvalo a tapar muy bien e inmediatamente. Evite la inhalación del polvo y el contacto prolongado del mismo con la piel, especialmente cuando el medio de cultivo contiene colorantes, a fin de prevenir la aparición de manifestaciones alérgicas y la inhalación de sustancias tóxicas como sales biliares, salenito, etc. 3. Los medios que carecen de agar, generalmente se disuelven por agitación continua y ebullición suave pero suficiente. En cambio, los medios sólidos que si llevan agar es necesario humedecerlos totalmente y enseguida dejarlos en contacto con el agua de 10 a 15 min., agitándolos de vez en cuando para que se hidraten bien las partículas sólidas del agar y se forme un gel correcto y uniforme. Una vez que el agar ha absorbido una buena cantidad de agua, calentar la suspensión del medio de cultivo agitándolo siempre hasta que comience a hervir. Al llegar a este punto, disminuya la altura de la flama y procure sostener la ebullición lentamente durante un minuto, agitando continuamente el matraz para evitar que el medio se derrame y para lograr que todo el agar se disuelva. Evite el sobrecalentamiento. 4. Los medios que no requieren ser esterilizados en la autoclave, como el SS, el XLD, Caldo Tetrationato, Caldo Selenico, por la sola ebullición ya estarán listos para ser utilizados. Otros medios que son la mayoría, es necesario esterilizarlos en el autoclave; generalmente la esterilización se hace a 15 libras, durante 15 min. NOTA: Siempre debe utilizarse en la preparación de los medios agua destilada de buena calidad, libre de cobre, cloro y otros metales pesados. El material de vidrio deberá estar escrupulosamente limpio y libre de huellas de sustancias tóxicas que puedan absorberse en la superficie del vidrio, tales como telurito, selenito, ácidos biliares, etc. 5. Una vez esterilizado el medio de cultivo, se deja enfriar y posteriormente se vierten en cajas de Petri o tubos de bioquímica, según el medio de cultivo. Se deja gelificar a temperatura ambiente. 6. Una vez gelificados, se procederá a guardar los medios de cultivo entre 2 y 8ºC a menos de que se vallan a utilizar el mismo día. Sin embargo algunas veces se guardan a 30ºC, primero para asegurarse de que estén estériles y segundo para estimular el crecimiento del pequeño número de microorganismos que lleva el producto en estudio. Las placas de medios de cultivo deberán almacenarse en el refrigerador, en posición invertida dentro de bolsitas cerradas de plástico, para impedir pérdida de humedad. Según el medio de cultivo de que se trate y del hecho de que esté preparado en placas o en tubos, guardados en bolsas, es posible conservarlos entre 2 semanas y 4 meses. Cuando se va a utilizar estos medios, se deben dejar calentar a la temperatura del ambiente.

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PROBLEMAS Y ERRORES MÁS COMUNES QUE SE PRESENTAN DURANTE LA RECONSTITUCIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DESHIDRATADOS Y SUS POSIBLES CAUSAS.

FALLA

CAUSA PROBABLE

Cambio de pH y cambio de color en el medio de cultivo.

Sobrecalentamiento, mezclado inadecuado, esterilización prolongada, empleo de material de vidrio con álcali, recipientes contaminados, agua destilada impura, por fundir el medio en varias ocasiones por mantener el medio a temperaturas altas durante mucho tiempo, hidrólisis de los ingredientes. Calentamiento inadecuado, mezclado incompleto por lo que se sobrecalienta algunas porciones del medio, agua destilada de mala calidad, insuficiente hidratación del agar, recipiente demasiado pequeño por lo que no es posible homogeneizar el líquido. NOTA:En algunos casos existe un pequeño precipitado después de esterilizar el medio, por lo que es necesario agitar suavemente el matraz antes de vaciarlo en las cajas de Petri. Ejemplo: agar EMB, agar de Mueller-Hinton. Sobrecalentamiento al disolver el agar o por esterilización prolongada. Grumos de agar no solubilizados, mezclado e hidratación incompletas, proporción incorrecta entre la cantidad del medio y el volumen de agua (pesado erróneo del polvo), pH del medio demasiado ácido. Por fundir el agar en varias ocasiones, calentamiento excesivo o prolongado, mezclado e hidratación incompletas, “medios acaramelados” o quemados parcialmente, daños causados a la fórmula del medio por el inoculo. Ejemplo: La adición de soluciones azucaradas y de electrolitos; detergentes, antisépticos, venenos metálicos, materiales proteicos, etc.

Solubilidad incompleta.

Oscurecimiento. Falta de dureza en el agar (gel blando).

Pérdida de las propiedades nutricionales para promover el desarrollo y alteraciones en las propiedades diferenciales del medio.

PROCEDIMIENTO: Almacenamiento de los medios de cultivo deshidratados  Los frascos con el polvo deshidratado deben almacenarse en un lugar fresco y seco, evitando la luz directa.  Todos los medios de cultivo son higroscópicos, por lo que una vez que han sido abiertos, tienden a tomar la humedad del medio ambiente.  Es particularmente importante cerrar lo antes posible el tapón interior y la tapa exterior firmemente después de usar cada frasco.

-

Es necesario también colocar los frascos lejos de lugares en donde se encuentren aparatos de calentamiento o ventanas, ya que esto puede provocar reacciones inexactas y un desarrollo adecuado.

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 Es necesario tener un estricto cuidado en el momento de preparar nuestros medios de cultivo para evitar errores, como los antes mencionados y uno muy importante: el de contaminación de los medios, y es este el error que nosotros cometimos en las primeras preparaciones, debido a la desorganización con la que llevamos a cabo estas preparaciones. Cabe notar que es conveniente hacerles el control de calidad a los medios que preparemos, ya que de esto depende el buen resultado de nuestros cultivos.  Realizar videos y tomas fotográficos del evento. INFORME. Será presentado en forma individual en el formato de la UVE de Gowin al titular.

CUESTIONARIO 1. ¿Qué tipos de medios de cultivos existen?

2. ¿Cuál es el fundamento de los medios de cultivo?

3. ¿Qué error consideras que sea de mayor importancia a la hora de hacer los medios de cuItivo?

4. ¿Por qué se deben almacenar los medios de cultivo en posición invertida?

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5. ¿Por qué se tapan los tubos y matraces que contienen los medios para esterilizar?

6. ¿Cómo creas área estéril para vaciar los medios de cultivo ya esterilizados a las cajas de petri? ¿Y por qué es necesario?

CONCLUSIONES NOMBRE DEL ALUMNO: Apellido Paterno GRADO Y GRUPO:



FIRMA DEL ALUMNO

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FIRMA DEL PROFESOR

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BLOQUE I APLICAR TÉCNICAS BACTERIOLÓGICAS BÁSICAS PRÁCTICA No.3 “TÉCNICA DE AISLAMIENTO BACTERIANO” INDICADOR DE DESEMPÉÑO:   Conoce y obtiene cultivos microbiológicos puros Actividades Específicas  Aplica técnicas para aislamiento de bacterias aerobias por las técnicas más comunes. II. INTRODUCCIÓN La identificación de bacterias puede hacerse de manera exacta solamente con cultivos puros, ya que las características empleadas para clasificarlas dependen de la actividad, población y no de las células individuales, aún cuando, algunas propiedades bacterianas cambian cuando se toman los microorganismos de su medio natural y se cultivan en el laboratorio. La realidad es que la clasificación suele basarse en las propiedades de bacterias en cultivos de laboratorio. El aislamiento de un cultivo puro, se lleva a cabo tomando en cuenta las características específicas de los microorganismos por aislar; por ejemplo si se desea obtener en forma pura una bacteria esporógena se calentará a 85ºC y se tratará con un desinfectante adecuado que destruya todas las células excepto las esporas. Al hacer la siembra se obtendrá fácilmente el crecimiento de la bacteria esporógena. Si se toma un asa bacteriológica cargada con una muestra que contenga bacterias y se van haciendo estrías de ésta sobre una placa de agar nutritivo de tal manera que el material se vaya “diluyendo” sobre la superficie (Fig. 12.1), llegará un momento en que las bacterias depositadas en la estría estén bien separadas unas de otras, reproduciéndose cada una en progresión geométrica (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, etc.). Dependiendo del tiempo de generación, que varía según la especie bacteriana, después de cierto tiempo, cada una se habrá multiplicado muchas veces, formando sobre la superficie del medio un pequeño promontorio constituido por células bacterianas llamado Colonia, que se obtiene generalmente en unas 24-48 horas. Las colonias de cada especie bacteriana son diferentes ya sea en tamaño, color, consistencia etc., y pueden ser diferenciadas sobre estas bases. Las colonias de cada especie bacteriana son diferentes ya sea en tamaño, color, consistencia etc., y pueden ser diferenciadas sobre estas bases. Cada colonia aislada está constituida de un solo tipo de bacterias, ya que se supone que es la descendencia de una sola célula y por tanto, un cultivo puro. Para estudiar las características físicas, químicas, fisiológicas, etc., de una bacteria, se necesita que ésta sea aislada en cultivo puro y el aislamiento en caja Petri es el primer paso para ello, siendo el segundo paso la siembra de una porción de una colonia en un medio de cultivo en tubo, verificando su pureza después de la incubación apropiada, mediante observación al microscopio. La morfología de las colonias es importante por lo anteriormente expuesto y debe familiarizarse el alumno con ella. (Fig. 12.2). La terminología mencionada a continuación sobre algunas de las características más constantes de una colonia bacteriana es muy útil:

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         

FORMA: Puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa, rizoide, etc. TAMAÑO: Estimar el diámetro en mm. SUPERFICIE: Lisa, rugosa, cerebriforme, en anillos concéntricos, etc. ELEVACION: Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, umblicada, etc. BORDE: Continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festoneado, filamentoso, etc. ESTRUCTURA INTERNA: Amorfa o granulosa. COLOR: Según sea observado por la luz reflejada o por la luz transmitida, puede ser de color blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc. OPACIDAD: Transparente, opaca, etc. CONSISTENCIA: Dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa, etc. Usar el asa bacteriológica para determinar la consistencia.

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90

MATERIALES Y EQUIPO Capacidad Y Nombre Descripción Cajas de Petri con gelosa simple 60 X 15 mm

7

Matraz Erlenmeyer

14

Pipetas

de 250 ml de 10 ml (1 x 10) estériles

14

Pipetas

de 1 ml (1 x 100) estériles

100

Tubos de ensaye

de 16 x 150 mm estériles

Cantidad

Cantidad 30 ml

SUSTANCIAS Nombre Y Fórmula Descripción Química Muestras de suelo y agua Material proporcionado por el alumno

7

MÉTODOS A) AISLAMIENTO POR EL MÉTODO DE LAS DILUCIONES. 1. Marcar una serie de 10 tubos (de 16 x 150 mm estériles) del 1 al 10. 2. Adicionar a cada tubo 9 ml de agua destilada estéril en condiciones de esterilidad (seguir instrucciones del profesor). 3. Agregar al primer tubo 1 gramo ó 1 ml de la muestra. En el caso de suelo, homogeneizar la suspensión y dejar sedimentar las partículas gruesas. 4. Efectuar diluciones decimales de cada muestra, como se indica a continuación. TUBO DILUCIÓN 1 1 g. ó 1 ml de muestra + 9 ml de agua 10 -1 2 1 ml del tubo 1 + 9 ml de agua 10 -2 3 1 ml del tubo 2 + 9 ml de agua 10 -3 4 1 ml del tubo 3 + 9 ml de agua 10 -4 5 1 ml del tubo 4 + 9 ml de agua 10 -5 6 1 ml del tubo 5 + 9 ml de agua 10 -6 7 1 ml del tubo 6 + 9 ml de agua 10 -7 8 1 ml del tubo 7 + 9 ml de agua 10 -8 9 1 ml del tubo 8 + 9 ml de agua 10 -9 10 1 ml del tubo 9 + 9 ml de agua 10 -10 NOTAS: a) Homogeneizar la suspensión en cada tubo antes de transferir el volumen indicado al siguiente tubo. b) Cambiar de pipeta al efectuar cada dilución. c) Introducir la pipeta usada en la envoltura original. 5. Seleccionar cinco diluciones según instrucciones del profesor. 6. Colocar 0.1 ml de cada dilución en la superficie de cada una de cinco placas de gelosa simple, previamente marcadas con la dilución correspondiente. 7. Homogeneizar el inóculo en la placa con una varilla de vidrio acodada, según las instrucciones del profesor. 8. Envolver las cajas en papel de estraza, de tal manera que la tapa quede abajo.

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AISLAMIENTO POR EL MÉTODO DE LAS DILUCIONES.

B) TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS (Bacterias Aerobias) El alumno aislará diferentes tipos de bacterias. 9. Incubar a 37°C por 24-48 horas. 10.Observar si hubo o no, aislamiento de colonias.B) Aislamiento por el método de estría cruzada. 1. Esterilizar el asa bacteriológica por incineración. 2. Dejar enfriar el asa a un lado del mechero. 3. Tomar una asada de la muestra (tubo 1 de la serie de diluciones) y colocar en los bordes de la placa, haciendo estrías continuas hacia el centro de la caja . 4. Esterilizar el asa nuevamente y enfriarla. 5. Hacer una segunda serie de estrías tocando la porción final de la anterior. 6. Esterilizar el asa nuevamente y enfriarla. 7. Repetir los pasos 4 y 5 para hacer las series de estrías que se indica. 8. Esterilizar el asa y enfriarla. 9. Incubar el material a 37ºC durante 24 horas.

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Observe los pasos en el ejemplo siguiente: 1. Con el lápiz graso dividir la caja Petri en 3 sectores, de tal manera que al destaparla para proceder a la inoculación, se tenga como se indica en la figura:

2 1 3

El sector No. 1 es más pequeño y sirve para descargar el asa. 2. Usando la técnica ya conocida, tomar el cultivo bacteriano y en condiciones asépticas obtener una asada del material. 3. Una vez cerrado el tubo, colocarlo en una gradilla. 4. Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la caja de Petri y descargar el material en el sector 1, trazando una serie de zig-zags muy cerrados a todo lo ancho del sector. Cerrar la caja. 5. Esterilizar el asa flameándola y mientras que se enfría, girar la caja 90° hasta que el sector 1 quede a la izquierda y el 2 hacia arriba a la derecha. 6. Trazar unos 5 zig-zags en el sector 2 invadiendo el sector 1 para llevar un poco de material al sector 2 y las siguientes estrías no deben tocar el sector 1. En esta forma se diluye el material quedando unas bacterias separadas de las otras. 7. Esterilizar de nuevo el asa, girar la caja 90° y ahora el sector 2 estará a la izquierda y el 3 a la derecha. 8. Trazar unos 5 zig-zags en el sector 3 invadiendo el sector 2 y el resto sin tocar el sector 2, como se muestra en el dibujo:

9. Incubar a 37°C por 24-48 horas. 10. Observar si hubo o no, aislamiento de colonias. NOTA: En el sector 1 generalmente no se obtienen colonias aisladas, pero en 2 y 3 sí.

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CUESTIONARIO 1) Asilamiento por el método de diluciones. a) Indicar hasta que dilución encontró colonias aisladas a partir de las muestras estudiadas. MUESTRA DILUCIÓN _______________________________ ____________________________ _______________________________ ____________________________ _______________________________ ____________________________ _______________________________ ____________________________ _______________________________ ____________________________ _______________________________ ____________________________ b) Escribir en la tabla siguiente, el número de colonias encontradas en cada una de las diluciones indicadas por el profesor. 2.- DILUCIÓN ___________________ ___________________ ___________________ ___________________

No. DE COLONIAS / 0.1 ml __________________________ __________________________ __________________________ __________________________

No. DE COLONIAS / ml ___________________________ ___________________________ ___________________________ ___________________________

2) Describir una técnica de aislamiento bacteriano a partir de una fuente natural.

3) Consultar dos técnicas de aislamiento en tubo.

4)

¿Qué es un cultivo asténico o puro?

5) ¿Qué importancia tiene la obtención de un cultivo puro?

6) Mencionar 5 Colecciones de Cultivos suministradoras de cultivos microbianos puros.

INFORME. Será presentado en forma individual en el formato de la UVE de Gowin al titular. CONCLUSIONES.




FIRMA DEL ALUMNO VO1/08/13

FIRMA DEL PROFESOR 26



BLOQUE I APLICAR TÉCNICAS BACTERIOLÓGICAS BÁSICAS PRÁCTICA No. 4 “COPROCULTIVO”” INDICADOR DE DESEMPEÑO:   Obtiene cultivos microbiológicos puros. Actividad Específica Identifica Enterobacterias por medio del coprocultivo. INTRODUCCIÓN Es de reconocer la importancia de la técnica, recalcando que las enterobacterias representan la mayor parte de la flora microbiana del tracto intestinal del hombre. En ella se incluyen gérmenes comensales (Proteus y bacilos coliformes), así como patógenos del género Salmonella y Shigella . Pueden estar presentes también estreptococos intestinales (enterococos), Clostridium, levaduras (incluso Candida albicans) y ocasionalmente estafilococos patógenos. El Vibrión colérico puede ser aislado en casos de cólera; ocasionalmente es necesario tratar de aislar Mycobacterium tuberculosis en materia fecal. CONCEPTOS PREVIOS Tracto intestinal Flora bacteriana patógena


Cantidad


21

Cajas de petri

con agar ss

21

Asas

de platino

7

Mecheros

de bunsen

7 7 1

Telas Soportes Alcohol

asbesto universales 1 lt

1

Paquete algodón

7

Hisopos

de

Cantidad 2 de 500 gr

7

SUSTANCIAS Nombre Y Descripción Salmonella y Shigella agar

Fórmula Química

Muestras de copro ( 1 por equipo)

500 gr de algodón

a) Raspado rectal con hisopo, conservando éste en medio de caldo simple o solución gliceral salina de Feague-Clurman modificada por Sachs en tubo de 13 por 100 mm. Este será el método de elección, particularmente en niños menores de cinco años.

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b) Materia fecal evacuada recientemente y llevada al laboratorio en frasco de boca ancha. c) Papel filtro impregnado de material fecal. 1.- Con el hisopo se inoculará directamente en el medio S-S agar. 2.- Arrastrar a muestra con el asa de platino haciendo la forma del pentágono en el medio de cultivo. 3.- Se introducen las cajas de petri previamente inoculadas en la incubadora bacteriológica de 48 a 72 horas. 4.- Se observa la flora bacteriana aislada. INFORME. Será presentado en forma individual en el formato de la UVE de Gowin al titular. CUESTIONARIO 1. Mencione los errores comunes que se presentaron durante el cultivo

2. Describa las características coloniales que se observaron durante el cultivo de cada medio inoculado.

3. ¿Cuáles son las características de las enterobacterias, y porqué se les denomina como tal?

4. Mencione el nombre de la bacteria resultante de este cultivo, además de las características propias de ella y las afectaciones que origina.

5. ¿Cuáles son las principales bacterias patógenas que pueden ser aisladas por medio del coprocultivo? ¿Qué enfermedades producen cada una de éstas?

CONCLUSIONES NOMBRE DEL ALUMNO: Apellido Paterno GRADO Y GRUPO:



FIRMA DEL ALUMNO

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FIRMA DEL PROFESOR

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BLOQUE I APLICAR TECNICAS BACTERIOLÓGICAS BÁSICAS PRÁCTICA No. 5 “UROCULTIVO”

INDICADOR DE DESEMPEÑO:

  Obtiene cultivos microbiológicos puros. Actividad Específica: Identifica la diferente flora patógena que puede desarrollarse en el tracto urinario.

INTRODUCCIÓN Las infecciones urinarias pertenecen al grupo de los procesos infecciosos más frecuentes de la patología médica. Su importancia radica en el daño que pueden ocasionar sobre la función renal. Las vías urinarias normalmente son estériles por encima del nivel de la uretra distal. Los microorganismos que infectan las vías urinarias altas son comensales localizados en áreas vecinas. En esta colonización intervienen varios factores predisponentes que pueden ser de origen local o general. Los primeros incluyen la contaminación fecal del meato urinario, el cateterismo, la patología urinaria congénita o adquirida y el reflujo vesical. Entre los factores generales están la diabetes mellitus, el embarazo y la terapia con fármacos de amplio espectro. Las bacterias que con mayor frecuencia se aíslan de la orina de pacientes ambulatorios con infección urinaria son:Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticcus, Proteus sp, Klebsiella sp, Enterococcus faecalis etc. Para lograr que el cultivo de orina realmente sea veraz, requiere que las muestras sean obtenidas en condiciones óptimas. La orina de pacientes con pielonefritis tiene mayor número de leucocitos que el normal, y el número de bacterias viables de la porción media de la micción excede de 100 000 en un mililitro. El uso de la sonda para obtener la muestra de orina, aun bajo las mejores condiciones de asepsia, puede producir infecciones en las vías urinarias.

CONCEPTOS PREVIOS  Aparato genito-urinario.  Flora bacteriana en vías urinarias.

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Cantidad


21

Asas calibradas

7

Cubrebocas

2 pares por mesa 1

(de 4 mm. de diámetro da 0.01ml., de 1.5 mm. de diámetro da 0.001 ml.)

Cantidad

2 de 500 gr


Fórmula Química

Agar Mac Conckey.

Guantes.

Alcohol

21

Cajas de petri con agar Mac Conckey

21

Tubos de centrífuga

o

96

60 X 15 mm De 7 ml.

MATERIAL PROPORCIONADO POR EL ALUMNO: El material biológico es la orina, obtenida del modo siguiente: se dan instrucciones a la persona para que se presente en el laboratorio sin haber orinado al levantarse. Se asean con agua y jabón los órganos genitales externos y en seguida se aplica en la región que rodea al meato urinario una solución de merthiolate o de cloruro de benzalkonio. Una vez que empieza la micción, se desecha la primera orina que arrastrará los organismos contaminantes; se interrumpe la micción para recoger en un matraz estéril unos 10 ml. de orina de la porción media de la micción, se desecha el resto de la orina. En los niños también se asean los órganos genitales externos y regiones vecinas, se aplica después el dispositivo de Machuca o bolsas de plástico adhesivas. El urocultivo debe hacerse dentro de la hora siguiente a la recolección de la orina, o bien si esto no es posible, debe guardarse la orina en el refrigerador a 4º C hasta que pueda cultivarse.

PROCEDIMIENTO El número de leucocitos se determina en el sedimento urinario; para ello se depositan 10 ml. de orina en un tubo de centrífuga graduado; se centrifuga a 2 000 r.p.m. durante 5 minutos, se desecha el sobrenadante y se resuspende en la gota de orina residual el sedimento. De éste se toma una gota, la cual se deposita en un portaobjeto limpio y se cubre con un cubreobjeto. Se observa con el microscopio con objetivo seco fuerte y se cuenta el número de leucocitos por campo. Observe 10 campos y saque el promedio. VO1/08/13

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a) Cuenta de leucocitos:

b) Cuenta de Bacterias: Métodos con asa calibrada. El método cuantitativo que se utiliza de rutina es el de la asa calibrada, el método de diluciones sólo en casos especiales. Como su nombre lo indica, en el primero se usa una asa calibrada para inocular, dicha asa es de 4 mm. de diámetro y de 0.01 ml. de capacidad. Se toma una asada de la orina y se hace una siembra por estrías en toda la superficie de la placa. Como en las infecciones del tracto urinario pueden encontrarse bacterias grampositivas (estretococos y estafilococos) y bacilos Gram negativos. (E. coli Paracolobactrum y Proteus), es conveniente sembrar la orina en una placa de agar sangre y en uno de los medios selectivos para las bacterias Gram negativas, tales como el medio EMB o el de Mac-Conkey. En ambas placas la orina debe sembrarse del modo descrito anteriormente, incubarlas a 37º C y examinarlas después de 24 a 48 horas. Se multiplica por 100 el número de colonias que aparecen en la placa, para determinar el número de bacterias que existen en un mililitro de orina. Si no hay desarrollo en las primeras 24 horas, se reincuba otras 24 y si tampoco esta vez hubo desarrollo se informa que “no hubo desarrollo después de 24 horas de incubación”. Ordinariamente se hace antibiograma a las bacterias encontradas en el urocultivo. Además de la siembra se hace un frotis con orina bien mezclada, para estudio microscópico directo. La orina se deposita en la lámina con la misma asa calibrada y se usa la tinción de Gram para el frotis; éste será positivo cuando contenga por lo menos unas cuantas bacterias por campo. Si en el frotis directo se encuentran cocos Gram positivos, se sembrará la orina en una capa con medio de S-110. El resultado del frotis está en relación con la contaminación o la infección. La correlación entre los resultados de frotis y cultivo es de 75 a 95 por ciento. c) Método de diluciones: Con solución salina al 0.85 por ciento se hacen diluciones 1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10 000 de la orina. En tubos que contienen 13 o 15 ml. de BHI, triptosa-agar o cualquier otro medio nutritivo, el cual se fundirá y cuando se encuentre de 45 a 47ºC de temperatura poner un mililitro de cada una de las diluciones de orina; agitar por rotación y practicar la técnica de vaciado en placa, incubar a 37º C durante 24 horas y hacer la cuenta de las colonias que desarrollaron al cabo de este tiempo, se multiplica por la dilución, y así se obtendrá el número de bacterias por mililitro de orina. Observaciones:

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Estimación cuantitativa de colonias: en general, cuentas de menos de 10 000 bacterias por mililitro de orina indican contaminación; cuando el número está entre 10 000 y 100 000, se sospechará infección, y si es mayor de 100 000, se confirmará la sospecha. Hay casos de pielonefritis en los que el número de bacterias es menor de 100 000 en un mililitro de de orina. Esos casos se presentan cuando el volumen de orina es muy grande y por lo tanto disminuye la concentración de bacterias en la unidad de volumen, cuando el paciente tiene micciones frecuentes, y cuando está siendo tratado con agentes antimicrobianos o cuando el pH de la orina es menor de 5. Microorganismos presentes en el tracto urinario: Las infecciones bacterianas del tracto urinario pueden presentarse en pacientes de cualquier edad y cualquier sexo pueden variar desde infecciones inaparentes hasta enfermedades sistemáticas severas. El diagnóstico clínico de pielonefritis frecuentemente pasa inavertido, debido a la ausencia de sintomas en el tracto urinario. La relación entre bacteriuria y pielonefritis activa inaparente sólo ha sido demostrada recientemente en autopsias. La demostración de los microorganismos por cultivos apropiados es, por lo preciso, la única manera posible de hacer el diagnóstico. Debido a que las muestras de orina frecuentemente se contaminan en su recolección, el desarrollo de microorganismos, aun de los patógenos conocidos, no establece necesariamente el diagnóstico de infección del tracto urinario. Las publicaciones recientes de Kass, Sanford, McDonald, Beeson y otros, constituyen una bibliografía extensa y contienen una revisión actual de este tema indican que la cuenta de bacterias en orina fresca de pacientes con infección de las vías urinarias es, habitualmente, mayor de 100 000 en un mililitro, mientras que las muestras de personas no infectadas y normales o son estériles o no contienen más de 10 000 bacterias en un mililitro. Por lo tanto, para valorar el significado clínico de un cultivo de orina, se recomienda tomar en cuenta el número de bacterias presentes en la muestra. 3. Valores normales: Leucocitos en orina: Adultos: hasta 100 en un mm. Niños: hasta 50 en un mm. La flora bacteriana de las orinas normales difiere de la de las orinas con microorganismos patógenos. En el primer caso, los microorganismos encontrados más frecuentemente son: En personas normales, generalmente no hay desarrollo de gérmenes o tienen menos de 10,000 en 1 ml., sin aumento de leucocitos en la orina. Medidas de seguridad y Control: Las generales para efectuar las pruebas de microbiología. INFORME. Será presentado en forma individual en el formato de la UVE de Gowin al titular.

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CUESTIONARIO 1. Mencione las características distintivas del Urocultivo.

2. Mencione porqué se consideran características cuantitativas en éste cultivo

3. ¿Cuáles son las características cualitativas detectadas durante la técnica?

4.

Apoyándose en el cuadro para Urocultivo anexo señale las características resultantes de la bacteria sospechosa

5. Mencione el nombre de las bacterias resultantes en las prácticas, además de las características propias de ellas y sus patologías que origina; esto es del trabajo colaborativo.

CONCLUSIONES




FIRMA DEL ALUMNO

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FIRMA DEL PROFESOR

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ANEXO.

Cuadro para urocultivo PATOGENA

GRAM POSITIVA

NO PATOGENA

Estreptococo betahemolítico Estafilococo coagulasa positiva Cándida albicans

Escherichia coli Aerobacter Proteus

GRAM NEGATIVA

BAAR

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Difteroides Bacillus subtilis Estafilococo coagulasa negativa Levaduras saprófitas

Mycobacterium

tuberculosis

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BLOQUE I. APLICA TÉCNICAS BACTERIOLÓGICAS BÁSICAS PRÁCTICA No.6 “OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS, COLORACIONES SIMPLES, TINCIÓN DE GRAM Y DE ACIDORRESISTENTES” INDICADOR DE DESEMPEÑO.   Prepara tinciones microbiológicas.. Actividades Específicas    

Prepara correctamente su mesa de trabajo. Identifica claramente el material adecuado para el desarrollo de la práctica. Realiza la obtención de la muestra adecuada. Ejecuta correctamente el método adecuado de coloración para la identificación de diversas estructuras bacterianas, como apoyo en el diagnostico de enfermedades.  Higieniza adecuadamente su área de trabajo y su persona, después de concluida la práctica. II. INTRODUCCIÓN El mundo microscópico, al igual que el macroscópico, presenta gran diversidad entre sus individuos. Los microorganismos se caracterizan en parte por su morfología, aunque algunos sean pleomorfos. Para observar a los microorganismos en ocasiones basta ponerlos debajo del objetivo del microscopio y afocar (caso de las algas, protozoarios y algunos hongos), ya que su tamaño, presencia de pigmentos, etc., hace fácil la observación. Las bacterias en cambio, por su pequeñez y por estar constituidas en su mayor parte por agua, requieren de ser teñidas. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS

Cantidad

21 pzas

7 cajas

20 pzas

7 pzas

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MATERIALES Y EQUIPO Capacidad Y Nombre Descripción Capacidad de 0.5mm de Asa y alambre para diámetro. Colocar siembras en cada mesa de trabajo. Caja con 30 cerillos. Cerillos Proporcionar en cada mesa de trabajo. 22 x 22 mm Laminillas de Cubreobjetos vidrio, colocar en cada mesa de trabajo. Mechero

Colocar en cada mesa de trabajo.

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Cantidad


Fórmula Química

120ml

Cristal violeta, colocar 5 ml en frasco gotero, para cada mesa de trabajo.

120 ml

Azul de metileno, colocar 5 ml en frasco gotero, para cada mesa de trabajo.

1 kit de colorantes para tinción de Gram

Incluye 4 de los colorantes: cristal violeta, alcohol-cetona, sol. de lugol, safranina con capacidad de 50 ml por cada reactivo.

1 kit de colorantes para tinción de BAAR

Incluye 3 de los colorantes: fucsina fenicada, alcohol-acido, azul de metileno, con capacidad de 50 ml por cada reactivo.



7 pzas

Paño que no deje pelusa

7 pzas

Papel filtro

7

Pinzas de crisol

20 pzas

Portaobjetos

7 pzas

Tela de alambre

7 pzas

Tripie

7 pzas

Varilla doblada en U

Colocar en cada mesa de trabajo

20 ml

Aceite de inmersión. Proporcionar en frasco gotero a cada mesa de trabajo.

Colocar en cada mesa de trabajo Colocar en cada mesa de trabajo 25 x 75mm Laminillas de vidrio. Colocar en cada mesa de trabajo. Colocar en cada mesa de trabajo. Colocar en cada mesa de trabajo. Colocar en cada mesa de trabajo.

MATERIAL BIOLOGICO: Muestra de diversos charcos de agua. PROCEDIMIENTO 1. OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS. A) Colocar una gota de infusión de paja o agua de charco en un portaobjetos limpio y desengrasado. Cubrir con un cubreobjetos siguiendo las indicaciones del profesor de prácticas. Para la observación hacer uso PRIMERO del objetivo seco débil y después del seco fuerte. Hacer un esquema de los microorganismos que observe anotando sus características más sobresalientes. 2. COLORACIONES SIMPLES. A) Preparación de Frotis. 1. Con el asa previamente esterilizada y enfriada de manera conveniente, siguiendo las indicaciones del profesor de prácticas, tomar una pequeña gota de cultivo en caldo o pulque y colocarla sobre un portaobjetos limpio y desengrasado en el que se habrán puesto las iniciales del cultivo que se va a teñir y todo lo que indique el profesor de prácticas. Si se toma el cultivo de un medio sólido, se coloca una pequeña gota de agua sobre el portaobjetos y en ella se emulsiona el cultivo (una cantidad muy pequeña). 2. Extender con el asa o el alambre la emulsión sobre el portaobjetos a fin de tener una película muy delgada. 3. Dejar secar la película al aire o dentro de una estufa. 4. Una vez seco el frotis fijarlo haciéndolo pasar rápidamente, tres veces, con el frotis hacia la llama, por en medio de la llama, siguiente las indicaciones del profesor.

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B) Tinción de Frotis. 1. Teñir el frotis con alguno de los colorantes que se proporcionen, dejándolo actuar, si se trata de cristal violeta o fucsina fenicado 30 seg., si de azul de metileno 5 min. 2. Lavar con agua de la llave. 3. Escurrir, secar suavemente con papel filtro. 4. Dejar secar perfectamente al aire o bien pasando varias veces el frotis, con la preparación hacia arriba, sobre la llama. 5. Una vez perfectamente seco, colocar una pequeña gota de aceite de inmersión. 6. Observar a inmersión. 7. Dibujar lo que se observa. 3. TINCIÓN DE GRAM 1. Teñir el frotis con cristal violeta 1 min. 2. Lavar con agua de la llave 3. Cubrir el frotis con lugol y dejar actuar 1 min. 4. Lavar con agua de la llave. 5. Decolorar con alcohol-acetona (o con alcohol de 95%) durante 10 seg. o gota a gota hasta que la última salga clara sin colorante. 6. Lavar con agua de la llave. 7. Teñir con safranina 1 min. 8. Lavar con agua de la llave y quitar el exceso de agua con papel filtro (por la parte suave y sin frotar). 9. Dejar secar al aire. 10. Observar a inmersión y dibujar lo que se observa. NOTA: Los microorganismos positivos al Gram tomar el primer colorante y aparecen teñidos de color violeta o azul obscuro. Los que aparecen en rojo toman la safranina y son negativos al Gram. Existen microorganismos variables al Gram, conviene, por tanto, hacer los frotis de cultivos jóvenes. Si apareciera dentro de la célula una parte sin teñir puede tratarse de endosporas que no toman fácilmente los colorantes. 4. TINCIÓN DE ÁCIDORRESISTENTES. A) Técnica de Ziehl-Neelsen. 1. Preparar un frotis del cultivo que se proporcione o de saliva. 2. Colocar encima del frotis un pedazo de papel filtro que cubra toda su superficie e impregnarlo con colorante de Ziehl-Neelsen. 3. Colocar encima de una tela de alambre sobre un baño de agua o sobre una platina calentadora. 4. Dejar actuar el colorante en forma de vapor 3-5 min sin permitir que se seque el colorante adicionando más o manteniendo con agua húmedo el papel constantemente. 5. Lavar con agua de la llave. 6. Decolorar un alcohol-ácido hasta que la última gota salga sólo ligeramente rosa. 7. Lavar con agua de la llave. 8. Teñir con azul de metileno. 9. Lavar con agua de la llave. 10. Secar y observar a inmersión.

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NOTA: Los ácidorresistentes aparecen en rojo los demás en azul.

INFORME. Será presentado en forma individual en el formato de la UVE de Gowin al titular.

CUESTIONARIO 1.- Menciona las diferentes formas que presentan las bacterias.

2.- ¿Cuál es el fundamento de la tinción de gram?

3.- ¿Cuál es el fundamento de la tinción de Zielh- Neelsen?

4.- Menciona los antibióticos que se utilizan para bacterias gram + y para bacterias gram –.¿ Y por qué?.

CONCLUSIONES.




FIRMA DEL ALUMNO

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FIRMA DEL PROFESOR

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BLOQUE II. APLICAR LOS METODOS DE TINCION DE BACTERIAS PRÁCTICA No.7 “PREPARACIÓN DE BIOQUÍMICAS E IDENTIFICACIÓN DE GRUPOS BACTERIANOS” INDICADOR DE DESEMPEÑO. .   Conoce las técnicas de identificación de bacterias a través de métodos de tinción y pruebas bioquímicas.  Aplica experimentalmente métodos de tinción y bioquímicas para identificar bacterias de acuerdo a su  metabolismo.

Actividades Específicas    

Prepara correctamente su mesa de trabajo. Identifica claramente el material adecuado para el desarrollo de la práctica. Conoce e identifica claramente los medios de cultivo para las pruebas bioquímicas. Ejecuta correctamente el método adecuado de preparación y esterilización en la preparación de las pruebas bioquímicas.  Identifica claramente a través de los cambios de coloración el resultado de las pruebas bioquímica e identificación de la bacteria como apoyo en el diagnóstico medico de diversas enfermedades.  Higieniza adecuadamente su área de trabajo y su persona, después de concluida la práctica. INTRODUCCIÓN Los medios de cultivo especiales también denominados bioquímicas son peculiares y necesarios para poder determinar la especie bacteriana del cultivo realizado, es decir, nos permite tener un resultado mas específico. Por ello, se debe tener atención desde la forma de preparación, siembra y lectura de resultados. Nos apoyaremos en tablas de bioquímicas y reactivos adecuados para su mejor observación

CONCEPTOS PREVIOS          

Preparación de medios de cultivos Lectura de bioquímicas Siembra de bioquímicas Análisis de resultados Técnicas de muestreo Características coloniales Requerimientos nutricionales bacterianos Identificación bacteriana Esterilización Medidas de seguridad

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Cantidad 21 pzas 21 pzas

7 pzas 130 pzas

MATERIALES Y EQUIPO Capacidad Y Nombre Descripción Asa y aguja Proporcionar 3 bacteriológica pzas en cada mesa de trabajo Hisopos esteriles Proporcionar 3 pzas en cada mesa de trabajo Material comúnmente empleado en bacteriología Mechero de Fisher Proporcionar en cada mesa de trabajo Tubos con tapa de Proporcionar 18 rosca para pruebas tubos en cada bioquímicas mesa de trabajo

200 ml

SUSTANCIAS Nombre Y Descripción citrato de Simmons

200ml

Agar hierro de Kligler

Cantidad

200ml

7 pzas

Proporcionar en cada mesa de trabajo

Medio MIO

Caldo de Urea 200 ml 200 ml 200ml

Gradilla para tubos de ensaye .

Agar de hierro y triple azúcar Medio SIM Reactivo de Erlich

50 ml

Reactivo de Kovacs 50 ml

1 equipo 7 equipos

Olla de esterilización o autoclave. Parrillas de calentamiento. Agitadores de vidrio

7 pzas

Fórmula Química

Proporcionar 0.5 ml en tubos de ensaye para cada mesa de trabajo Proporcionar 0.5 ml en tubos de ensaye para cada mesa de trabajo

Proporcionar 1 pza en cada mesa de trabajo Proporcionar 1 pza en cada mesa de trabajo

PROCEDIMIENTO La siembra de las pruebas bioquímicas se realiza después de la resiembra, con la finalidad de realizar la prueba a un organismo ya aislado y poder contribuir a su correcta identificación. Medios para estudiar la fermentación de los azucares por las bacterias: Las enterobacterias fermentan numerosos azúcares. En el trabajo de rutina se emplean sólo algunos y que nos servirán para diferenciarlas.

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Los medios para bioquímicas más comunes son: AGAR CITRATO DE SIMMONS: Se puede emplear para la prueba de utilización de Citrato como una de las pruebas del IMVIC. Pueden hacerse en placa o si se prefiere, inclinado, donde se inocula picando el fondo y estriando la superficie, los cultivos se incuban hasta por 4 días a temperatura de 35 a 37´C. La aparición de un crecimiento visible vá por lo general acompañado ce un cambio alcalino (azul del indicador bromotimol). Negativos Escherichia Shigella Listeria

Positivos Arizona Enterobacter Citobacter Klebsiella Salmonella serratia

AGAR HIERRO DE KLIGLER Es un medio para diferenciar bacilos entéricos gramnegativos con una forma similar al TSI (hierro y triple azúcar) y se basa en las mismas propiedades de fermentar la glucosa y lactosa junto con la formación de sulfuros, éste medio se debe inocular por picadura en el fondo y estría en la superficie. Los gérmenes fermentadores de la lactosa acidifican totalmente el medio, comunicándole a este un color amarillo, los microorganismos que no la fermentan acidifican el fondo del medio permaneciendo del color rojo cereza inicial y por último los formadores de ácido sulfhídrico ennegrecen el medio. Se recomienda usar el medio el mismo día de su preparación. En este medio se pueden observar las fermentaciones de la glucosa, lactosa y la producción del sulfuro de hidrógeno y gas. Se siembra por picadura y estrías en su superficie, se incuba 24 horas a 37º C. Fondo amarillo: Fermenta la glucosa. Superficie amarilla: Fermenta la lactosa. Trayecto de la picadura negro: Produce sulfuro de hidrógeno. Formación de burbujas en el medio y elevación del mismo: produce gas.

Organismos Enterobacter Hafnia Klebsiella Escherichia coli Shigella Salmonella tiphy S. paratiphy S. choleraesuis Otras salmonellas Citrobacter Edwardsiella Serratia Proteus

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Superficie inclinada ácido alcalino ácido Ácido (alcalino) Alcalino Alcalino Alcalino Alcalino Alcalino Alcalino (ácido) Alcalino Alcalino (ácido) ácido (Alcalino)

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Fondo alcalino Ácido Ácido Ácido ácido Ácido Ácido Ácido Ácido Ácido Ácido Ácido Ácido

Gas ++ + ++ +(-) + + + + + -

H2S + (-) +++ +++ (-) +++ -



P. vulgaris P. mirabilis P. morganii P. rettgeri Providencia

Alcalino (ácido) Alcalino Alcalino Alcalino Alcalino

Ácido Ácido Ácido Ácido ácido

+ + +ó-

+++ +++ -

MEDIO MIO: Se usa para la identificación de Enterobacterias sobre la base de miovilidad, ornitina descarboxilasa y de Indol. Los cultivos son inoculados por punción preparados en tubos por 18 a 24 horas a 35- 37´C, se leen las características de movilidad y ornitina antes de agregar el reactivo de Kovacs para la prueba de indol. La movilidad es apreciada por la turbiedad del medio o por crecimiento extyendido a partir de la línea de inoculación. La ornitina es indicada por el color púrpura del medio y la prueba negativa produce un color amarillo, que puede ser púrpura al final. Para la prueba del indol se agregan 3 o 4 gotas del reactivo de Kovacs y se agita suavemente el tubo, la aparición del color rosa o rojo del reactivo, se interpreta como prueba positiva del indol y siempre se deberá comparar con un tubo testigo. MEDIO SIM: Sirve para diferenciación e identificación de enterobacterias, es un medio semisólido, de rutina y que detecta la producción de sulfuros, indol y movilidad de las mismas. En este medio se puede observar la producción de sulfuro de hidrógeno, de indol y la movilidad del germen. Se siembra por picadura y se incuba 24 horas a 37º C. Trayecto de la picadura negro: produce sulfuro de hidrógeno. Cuando se añade el reactivo de Kovac y da color rojo: produce indol. Cuando el germen se desarrolla en el trayecto de la picadura y se exiende a los lados: es móvil. Urea sacarosa (surraco): en este medio se puede observar la fermentación de la sacarosa y la hidrólisis de la urea. Color morado: Hidroliza la urea. Color amarillo: Fermenta la sacarosa.

bacteria Salmonella tiphy Salmonella Shigella E. coli Klebsiella Enterobacter Citrobacter

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ProducciónProducción de de indol H2S + ó + ó +o– + +ó– + -

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Movilidad + + +ó– + +



CALDO DE UREA Se emplea para la identificación de bacterias, particularmente para diferenciar los miembros del género Proteus de la Salmonella y Shigella. También puede usarse para la determinación de la actividad de la ureasa en microorganismos de la familia Brucella, Bacillus, Sarcina y Mycobacterium..

Batería de pruebas incluidas y tablas de lectura con coloraciones positivas y negativas Las reacciones bioquímica:

Prueba Glucose

Dulcitol PA

Reacción / Enzimas fermentación de glucosa producción de gas en la fermentacion de la glucosa lisina descarboxilasa ornitina descarboxilasa producción de H2S producción de indol producción de adonitol fermentación/oxidación de lactosa fermentación/oxidación de arabinosa fermentación/oxidación de sorbitol producción de acetoína (VogesProskauer) utilización del dulcitol fenilalanina descarboxilasa

Urea

ureasa

Citrate

utilización del citrato

Gas Lysine Ornithine H2S Indole Adonitol Lactose Arabinose Sorbitol VP

Negativo rojo (a naranja) sin desprendimiento de cera amarillo amarillo de beige a ámbar claro incoloro rojo (a naranja) rojo (a naranja) rojo (a naranja) rojo (a naranja) de incoloro a ámbar claro verde cualquier tono de verde de incoloro a ámbar claro verde

Positivo amarillo (a dorado) sin desprendimiento de cera morado morado negro rojo o rosa amarillo (a dorado) amarillo (a dorado) amarillo (a dorado) amarillo (a dorado) rojo amarillo (a dorado) de negro a gris oscuro de rosa claro a rosa azul

INFORME: Será presentado en forma individual en el formato de la UVE de Gowin al titular

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CUESTIONARIO: 1) Mencione las características de las enterobacterias patógenas en el medio de AHK (agar hierro de Kligler)

2) Mencione la función del reactivo de Kovacs, y en qué pruebas en específico se utiliza.

3) ¿Cuáles son las características en común que se leen en el medio AHK SIM y MIO?

4) Apoyándose en el cuadro para pruebas bioquímicas anexo, señale las características resultantes de la bacteria sospechosa:

5)

Mencione el nombre de las bacterias resultantes en las prácticas, además de las características propias de ellas y sus patologías que origina; esto es del trabajo colaborativo.

CONCLUSIONES




FIRMA DEL ALUMNO

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FIRMA DEL PROFESOR

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BLOQUE II. APLICAR LOS METODOS DE TINCION DE BACTERIAS PRÁCTICA No.8 “PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)” INDICADOR DE DESEMPEÑO. .   Aplica experimentalmente métodos para la reproducción y crecimiento de bacterias   Realizará la Práctica de susceptibilidad de los gérmenes a los antimicrobianos, mediante la técnica de Bondi, probando la sensibilidad a diferentes antibióticos, para el reporte de resultados confiables en un ambiente de seriedad y respeto Actividades Específicas     

Prepara correctamente su mesa de trabajo. Identifica claramente el material adecuado para el desarrollo de la práctica. Conoce e identifica claramente los medios de cultivo para la prueba de sensibilidad a los antibióticos. Ejecuta correctamente el método adecuado para la prueba de sensibilidad a los antibióticos. Identifica claramente a través de mediciones los niveles de sensibilidad y resistencia de la bacteria a diversos antibióticos.  Desinfecta adecuadamente su área de trabajo y su persona, después de concluida la práctica.

INTRODUCCIÓN El método consiste en sembrar el germen en un medio en el que se desarrolle perfectamente y en ponerlo en contacto con discos de papel impregnados con los antimicrobianos. En el caso de Mycobacterium tuberculosis los medios en los que se siembra este germen contienen distintas concentraciones de los antimicrobianos que se utilizan para tratar las infecciones producidas por él.

1. División de los gérmenes según la constancia de su susceptibilidad a los antimicrobianos. 2. Indicación de la prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos según la muestra de donde se les aisló. 3. Grupos de antibióticos que deben usarse, según sean su afinidad a los colorantes de la tinción de Gram. 4. Podemos dividir a los gérmenes en dos grupos según su susceptibilidad a los antibióticos: a) Gérmenes con susceptibilidad constante a un antibiótico. b) Gérmenes con susceptibilidad variable a los antibióticos.

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Sólo haremos pruebas de susceptibilidad a los gérmenes que pertenecen al segundo grupo y que se hayan aislado de sitios donde normalmente no se encuentran, o si se les encuentra predominan en forma importante sobre los demás (cultivo puro). A los gérmenes cuya sensibilidad es constante a determinado antibiótico es innecesario practicar pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos. Como son:  Diplococcus pneumoniae (neumococo).  Streptococcus pyogenes (streptococo beta hemolítico).  Neisseria gonorrhoeae (gonococo).  Neisseria meningitidis (meningococo).  Haemophilus influenzae.  Bordetella pertussis.  Brucellas.  Treponemas.  Staphylococcus epidermidis A los gérmenes cuya sensibilidad es constante a determinado antibiótico, pero que algunas de sus cepas son resistentes, puede ser útil la determinación de la susceptibilidad.  Streptococcus viridans (streptococo alfa hemolítico).  Shigellas.  Mycobacterium tuberculosis (bacilo de Koch).  S. faecalis (estreptococo gama no hemolítico).  Salmonella typhi. Hay gérmenes a los que es necesario hacer pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos debido a la gran variabilidad de cepas sensibles o resistentes que se observan dentro de la misma especie:  Staphylococcus aureus.  Escherichia coli, cuando se aísla de muestras que no sean fecales o cepas patógenas aisladas de materias fecales de niños de menos de diez años.  Proteus, cuando se aísla de muestras que no sean fecales.  Paracolon (Citrobacter y Arizona), cuando se aísla de muestras que no sean fecales, Klebsiella (aerobacter), cuando se aísla de muestras que no sean fecales.

 Pseudomonas (piociánico), cuando se aísla de muestras que no sean fecales o en materias fecales cuando desarrollan en cultivo puro o casi puro.

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Cantidad 21

MATERIALES Y EQUIPO Capacidad Y Nombre Descripción Proporcionar 3 Hisopos esteriles pzas en cada mesa de trabajo

7 pzas

Mechero

Proporcionar 1 pza en cada mesa de trabajo

7 cajitas

cerillos

Proporcionar 1 cajita en cada mesa de trabajo

1 equipo

Estufa bacteriologica

Cantidad 21 pzas

21 pzas


Fórmula Química

Medio de Müller-Hinton Sensi-Disc (12) Dispenser (B.B.L.) Discos de papel impregnados con antibióticos.

PROCEDIMIENTO a) Sembrar con un hisopo toda la superficie del medio. b) Poner los discos de papel impregnados con los antimicrobianos según el germen. Ejemplo: Grupos de antibióticos según el germen. Antibióticos para Gram positivos

Antibióticos para Gram negativos

Cloxacilina Eritromicina Leucomicina Kanamicina Gentamicina Penicilina Tetraciclina Ampicilina Rifamicina Cloranfenicol Isoxasolil penicilina Cefalosporina Dicloxacilina Rifamicina Ácido oxilínico Carbecin

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Ácido nalidíxico Furadantina Polimixina B y E (colimicina) Cloranfenicol Gentamicina Kanamicina Sulfadiazina Estreptomicina Ampicilina Tetraciclina Neomicina Noxibiol Sulfisoxazole Cefalosporina Rifamicina Ácido oxolínico Carbecin

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Lectura: El germen que es susceptible al antimicrobiano no crece alrededor del disco de papel impregnado con él, y se observa un halo claro de inhibición. El informe se da: susceptible o resistente, según el caso. El siguiente cuadro contiene los gérmenes, los lugares donde se les aísla y a cuáles debe hacérseles prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos. Debe recordarse que el resultado de la prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos (antibiograma) es sólo una orientación al tratamiento, cuando un germen se informa que es resistente a todos los antimicrobianos es conveniente dar el antibiótico al que habitualmente es susceptible. 4. Resultados habituales: Antimicrobianos específicos y los que se suponen útiles en la práctica diaria. Cocos Gram positivos: Streptococcus pyogenes

Penicilina G. cristalina Fenoximetil-Penicilina Sulfadiazina Eritromicina

Estreptococcus anaerobio (Peptostreptococcus) Streptococcus viridans Streptococcus faecalis

Penicilina G cristalina (Dosis altas) Tetraciclina Cloramfenicol Ampicilina (en relación con la forma clínica y la evolución)

(Enterococo) Staphylococcus aureus

Penicilina G. cristalina Rifamicina Isoxasolil penicilina Dicloxacilina Cefalosporina, cuando los otros antimicro-bianos no han sido eficaces.

Diplococccus pneumonaie

Penicilina G. cristalina Fenoximetil-penicilina

Cocos Gram negativos: Neisseria meningitidis N. gonorrhoeae Bacilos Gram positivos: Corynebacterium diphtheriae

Sulfadiazina y cloranfenicol Penicilina G. cristalina Eritromicina Penicilina Penicilina G. cristalina Tetraciclina Eritromicina

Listeria monocytogenes

Bacilos Gram negativos: Brucella

Estreptomicina Tetraciclina

Salmonella

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Cloranfenicol (hay cepas resistentes) Ampicilina

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Shigella

Enterobacteriaceae

Cloranfenicol Tetraciclina Sulfadiazina

Sólo en casos de infección severa.

Penicilina (Grandes dosis) Cefalosporina Cloranfenicol Tetraciclina

En relación con la forma clínica del padecimiento y la eficacia terapéutica.

Pseudomona aeruginosa

Polimixina B Polimixina E (Colimicina) Penicilina (Grandes dosis) Otros antimicrobianos como tetraciclina, cloranfenicol, solos o combinados con la estreptomicina, según la forma clínica y la evolución, Gentamicina y carbencin.

Bordetella pertussis

Cloranfenicol

Treponema

Penicilina benzatina Penicilina G. procaína Eritromicina Sólo en casos de Tetraciclina alergia a la penicilina Cefalosporina. Formas especiales en que no fueron eficaces la penicilina, la eritromicina o la tetraciclina

Rickettsias

Cloranfenicol

Bacilo tuberculoso

H.A.I.N.

Mycobacterium tuberculosis

Estreptomicina

Tuberculosis

Uso combinado de antimicrobianos H.A.I.N. Estreptomicina

Brucelosis

Tetraciclina Estreptomicina

Grangrena gaseosa

Penicilina G. cristalina Tetraciclina (solas o combinadas)

Meningitis purulenta

Penicilina G. cristalina y sulfadiacina, en tanto se conoce el germen que la produce. Si hay sospecha de infección por H. influenzae: ampicilina o cloranfenicol.

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E. Medidas de Seguridad y Control: Las generales para efectuar las pruebas de microbiología. ANEXO 19 Grupos de antibióticos según el germen. Antibióticos para Gram positivos

Antibióticos para Gram negativos

Cloxacilina Eritromicina Leucomicina Kanamicina Gentamicina Penicilina Tetraciclina Ampicilina Rifamicina Cloranfenicol Isoxasolil penicilina Cefalosporina Dicloxacilina Rifamicina Ácido oxilínico Carbecin

Ácido nalidíxico Furadantina Polimixina B y E Cloranfenicol Gentamicina Kanamicina Sulfadiazina Estreptomicina Ampicilina Tetraciclina Neomicina Noxibiol Sulfisoxazole Cefalosporina Rifamicina Ácido oxolínico Carbecin

INFORME.

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CUESTIONARIO, 1. Mencione la importancia de realizar un antibiograma y en qué casos, puede dar resultados falsos

2. Mencione algunos errores que se cometen a menudo en los trabajos que se realizaron

3. ¿Cuáles son las afectaciones que se pueden tener al reportar un resultado erróneo?

4. Defina los conceptos de sensibilidad, resistencia y mencione como afecta darle un uso indiscriminado a los antibióticos.

5. Explique la manera en que el estafilococo dorado ha logrado ser resistente a la penicilina y

INFORME. Será presentado en forma individual en el formato de la UVE de Gowin al titular.

CONCLUSIONES.




FIRMA DEL ALUMNO

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FIRMA DEL PROFESOR

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BLOQUE III. DETERMINAR LAS TECNICAS PARA IDENTIFICAR COCOS Y BACILOS GRAM POSITIVOS DE INTERES MEDICO PRÁCTICA No.9 “TÉCNICA DE TINCIÓN DE SHEAFFER Y FULTON” INDICADOR DE DESEMPEÑO.

   

Probará la importancia de la técnica de tinción de Sheaffer-Fulton, por medio de su realización tomando consciencia de su utilidad, con actitud de interés y solidaridad Aplica experimentalmente métodos de tinción y bioquímicas para identificar Actividades Específicas  Prepara correctamente su mesa de trabajo.  Identifica claramente el material adecuado para el desarrollo de la práctica.  Ejecuta correctamente el método adecuado de coloración para la identificación de diversas estructuras bacterianas, como apoyo en el diagnostico de enfermedades.  Desinfecta adecuadamente su área de trabajo y su persona, después de concluida la práctica.

INTRODUCCIÓN Dado que la clasificación de las bacterias dependen principalmente de su tamaño, forma y propiedades de coloración, el microscopio ha sido durante mucho tiempo el instrumento principal del microbiólogo. Las preparaciones no teñidas pueden ser observadas al microscopio de contraste de fases, pero en general se utilizan preparaciones fijadas al calor y teñidas. CONCEPTOS PREVIOS  Tipos de tinciones  Pasos de las tinciones  Características de los Colorantes por usar  Mordentes  Características de las esporas, formación , tipos y su clasificación  Enfermedades producidas por esporas MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS MATERIALES Y EQUIPO Capacidad Y Cantidad Nombre Descripción Asas bacteriológicas Proporcionar 3 21 pzas pzas en cada mesa de trabajo

Cantidad

50 ml

Cubre objetos Proporcionar 3 pzas en cada mesa de trabajo.

21 pzas

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Proporcionar 1 pza en cada mesa de trabajo.

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Alumbre potasio

de

Verde malaquita

de

50 ml

Mecheros 7 pzas

SUSTANCIAS Nombre Y Descripción Ácido tánico

50 ml

Capacidad y descripción Proporcionar 5 ml en frasos goteros para cada mesa de trabajo Proporcionar 5 ml en frasos goteros para cada mesa de trabajo Proporcionar 5 ml en frasos goteros para cada mesa de trabajo



Portaobjetos

Safranina Proporcionar 3 pzas en cada mesa de trabajo.

21 pzas

50 ml

Varillas de tinción 7 pzas

Fucsina básica Proporcionar 1 pza en cada mesa de trabajo.

50 ml

Fenol 50 ml

Etanol 50 ml

Proporcionar 5 ml en frasos goteros para cada mesa de trabajo Proporcionar 5 ml en frasos goteros para cada mesa de trabajo Proporcionar 5 ml en frasos goteros para cada mesa de trabajo Proporcionar 5 ml en frasos goteros para cada mesa de trabajo

PROCEDIMIENTO Técnica de Shaeffer y Fulton, (Tinción de Esporas). 1. Hacer un frotis de Bacillus sp. de la manera usual. 2. Cubrir el frotis con verde de malaquita y dejarlo actuar durante un minuto. 3. Calentar la preparación a emisión de vapores durante 5 minutos. El colorante no debe hervir ni secarse. 4. Lavar la preparación con agua de la llave. 5. Cubrir la preparación con safranina y dejarla actuar durante un minuto. 6. Lavar la preparación con agua de la llave, dejar secar al aire y observar al microscopio rojo. con el objetivo de inmersión. Las esporas se observan de color verde y las bacterias de color contrastante

INFORME: Será presentado de manera individual en forma de uv de Gowin al titular.

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CUESTIONARIO

1. ¿Cuántos tipos de esporas existen? , ¿Cuáles son?

2. ¿Cómo se clasifican las esporas bacterianas según su posición? Dibuje y nómbrelas

3. Dibuje el desarrollo de una endospora

4. ¿Cuáles son las partes de una espora bacteriana?

5. ¿Se puede obtener el mismo resultado de cualquier muestra bacteriana? Justifique su respuesta

CONCLUSIONES




FIRMA DEL ALUMNO

VO1/08/13

FIRMA DEL PROFESOR

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BLOQUE III. DETERMINAR LAS TECNICAS PARA IDENTIFICAR COCOS Y BACILOS GRAM POSITIVOS DE INTERES MEDICO PRÁCTICA No.10 ““TÉCNICA DE TINCIÓN DE KNAYSI” INDICADOR DE DESEMPEÑO.

   

Realizará la técnica de tinción de Knaysi, por medio del quehacer analítico y mesurado de la prueba y tomando consciencia de los beneficios de su determinación Aplica experimentalmente métodos de tinción y bioquímicas para identificar

Actividades Específicas  Prepara correctamente su mesa de trabajo.  Identifica claramente el material adecuado para el desarrollo de la práctica.  Ejecuta correctamente el método adecuado de coloración para la identificación de diversas estructuras bacterianas, como apoyo en el diagnostico de enfermedades.  Higieniza adecuadamente su área de trabajo y su persona, después de concluida la práctica. INTRODUCCIÓN Dado que la clasificación de las bacterias dependen principalmente de su tamaño, forma y propiedades de coloración, el microscopio ha sido durante mucho tiempo el instrumento principal del microbiólogo. Las preparaciones no teñidas pueden ser observadas al microscopio de contraste de fases, pero en general se utilizan preparaciones fijadas al calor y teñidas De ahí la importancia de distinguir la pared celular a partir de tinciones diferenciales como la es de Knaysi. CONCEPTOS PREVIOS Tipos y constituyentes de paredes bacterianas Pasos de las tinciones Características de los Colorantes por usar Características de las paredes, sus componentes Constitución del peptidoglucano MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS MATERIALES Y EQUIPO Capacidad Y Cantidad Nombre Descripción Asas bacteriológicas Proporcionar 3 21 pzas pzas en cada mesa de trabajo

Cantidad

50 ml

Cubre objetos 21 pzas

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Proporcionar 3 pzas en cada mesa de trabajo.

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SUSTANCIAS Nombre Y Descripción Ácido tánico

Alumbre potasio 50 ml

de

Capacidad y descripción Proporcionar 5 ml en frasos goteros para cada mesa de trabajo Proporcionar 5 ml en frasos goteros para cada mesa de trabajo



Mecheros Proporcionar 1 pza en cada mesa de trabajo.

7 pzas

Verde malaquita 50 ml

Portaobjetos

Safranina Proporcionar 3 pzas en cada mesa de trabajo.

21 pzas

50 ml

Varillas de tinción 7 pzas

de

Fucsina básica Proporcionar 1 pza en cada mesa de trabajo.

50 ml

Fenol 50 ml

Etanol 50 ml

Proporcionar 5 ml en frasos goteros para cada mesa de trabajo Proporcionar 5 ml en frasos goteros para cada mesa de trabajo Proporcionar 5 ml en frasos goteros para cada mesa de trabajo Proporcionar 5 ml en frasos goteros para cada mesa de trabajo Proporcionar 5 ml en frasos goteros para cada mesa de trabajo

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES a) Mordente de Knaysi Alumbre de potasio a saturación 70.0 ml. Ácido tánico a saturación 30.0 ml. Preparación: Mezclar ambas sustancias en el momento de usarse b) Solución de fucsina fenolada Fucsina básica 5.0 g. Fenol 25.0 g Etanol al 95% 50.0 ml. Agua destilada 500.0 ml. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS:  Colocar en un recipiente 100 ml. de agua destilada y añadir 25 g. de fenol.  Colocar la solución en un baño de agua hirviendo.  Agregar 5 g. de fucsina básica y disolver.  IV Añadir 50 ml. de etanol al 95% y mezclar.  Aforar la solución a 500 ml. con agua destilada.

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PROCEDIMIENTO Técnica de Knaysi (Tinción de la Pared Celular) 1. Hacer un frotis de Bacillus sp. en la forma usual y fijarlo al calor. 2. Cubrir el frotis con el mordente de Knaysi y dejarlo actuar durante 10 minutos. 3. Lavar la preparación con agua. 4. Colocar con el asa una gota de fucsina fenolada sobre la preparación. 5. Poner un cubreobjetos sobre la preparación y observar al microscopio con el objetivo de inmersión. La pared se observa de color rojo intenso alrededor de la bacteria cuyo citoplasma se ve de un color rosa o rojo tenue. Se dibujarán las observaciones, las cuales irán posteriormente en el reporte INFORME: Será presentado de manera individual en forma de UV de Gowin al titular. CUESTIONARIO

1. ¿Cómo se clasifican los microorganismos según sus tipos de paredes? , ¿Cuáles son?

2. ¿Cuáles son las partes de las paredes bacterianas? Dibuje y nómbrelas

3. ¿Cómo funcionan cada uno de los reactivos en esta técnica?

4. ¿Qué otra tinción apoya en la identificación de las paredes bacterianas?

5. ¿Se puede obtener el mismo resultado de cualquier muestra bacteriana? Justifique su respuesta

CONCLUSIONES




FIRMA DEL ALUMNO

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FIRMA DEL PROFESOR

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BLOQUE III. DETERMINAR LAS TECNICAS PARA IDENTIFICAR COCOS Y BACILOS GRAM POSITIVOS DE INTERES MEDICO PRÁCTICA No.11 “IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS EN DIVERSOS CULTIVOS BACTERIOLÓGICOS” INDICADOR DE DESEMPEÑO.

   

Se realizarán cultivos bacteriológicos diversos para la identificación de cocos gran positivos de interés medico Aplica experimentalmente métodos de tinción y bioquímicas para identificar Actividades Específicas  Prepara correctamente su mesa de trabajo.  Identifica claramente el material adecuado para el desarrollo de la práctica.  Ejecuta correctamente el método adecuado para la identificación de cocos gran positivos en diversos cultivos bacteriológicos par el diagnostico oportuno de diversas enfermedades.  Higieniza adecuadamente su área de trabajo y su persona, después de concluida la práctica.

INTRODUCCIÓN A la microbiología médica corresponde el aislamiento e identificación de los microorganismos que están causando una infección en el paciente. En la mayoría de los casos el diagnóstico debe basarse en la demostración del agente etiológico, aunque a veces sea posible hacer el diagnóstico presuntivo exclusivamente sobre bases clínicas. Los microorganismos desempeñan un papel importantísimo que requiere entenderse a cabalidad para garantizar que en simbiosis con ellos un manejo sanitario e higiénico apropiado, que si bien nos proteja de su acción nociva en el caso de las especies patógenas, permita preservar y enfatizar el efecto protector de las especies amigables que conviven con nosotros en una verdadera simbiosis. La piel contiene un flora residente, constante y bien definida, que varía dependiendo de la zona anatómica, es especial dependiendo de las secreciones o de la proximidad de las membranas mucosas. Los factores más determinantes en eliminación no residente son: pH bajo, Ácidos grasos, lavado diario, sudor Flora normal: los microorganismos que normalmente colonizan la piel y las membranas mucosas de las personas sanas. La piel y las mucosas siempre están colonizadas de manera dinámica, sin embargo, de una forma general, se pueden dividir en 2 poblaciones: Flora residente: Consiste en un número relativamente fijo de especies. Están formados por Microorganismos comensales que se reproducen en una zona del cuerpo (no son esenciales para la vida) Patógenos oportunistas: son microorganismos de la flora normal alterados o que han tenido acceso a lugares normalmente estériles produciendo una infección. Flora transitoria: son microorganismos que colonizan en período corto de tiempo.

Estos pueden estar formados por Microorganismos no patógenos: no producen enfermedad Microorganismos patógenos : La colonización de estos producen infecciones.

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El Staphylococcus aureus, conocido comúnmente como estafilococo áureo o dorado, es una bacteria anaerobia facultativa grampositiva productora de coagulasa y catalasa que se encuentra ampliamente distribuida por todo el mundo, estimándose que una de cada tres personas se hallan colonizadas, que no infectadas, por ella. Puede producir una amplia gama de enfermedades, que van desde infecciones cutáneas y de las mucosas relativamente benignas, tales como foliculitis, forunculosis o conjuntivitis, hasta enfermedades de riesgo vital, como celulitis, abscesos profundos, osteomielitis, meningitis, sepsis, endocarditis o neumonía. Además, también puede afectar al aparato gastrointestinal, ya sea por presencia física de Staphylococcus aureus o por la ingesta de la enterotoxina estafilocócica secretada por la bacteria. En la actualidad, este microorganismo se erige como el principal causante de las infecciones nosocomiales. Esta situación se ve favorecida por el hecho de que esta especie habita tanto en las mucosas como en la piel de los seres humanos, lo que permite que a través de las heridas quirúrgicas pueda penetrar en el torrente sanguíneo del paciente por medio del contacto directo o indirecto con el personal sanitario, con un objeto contaminado, o incluso, con otro paciente. Las cepas habituales de Staphylococcus aureus son resistentes a la penicilina, siendo los antibióticos más eficaces para combatirlos los aminoglucósidos, las cefalosporinas, la oxacilina o la nafcilina. Además de la administración del tratamiento antimicrobiano correspondiente, puede ser conveniente, en función del caso, la eliminación de puertas de entradas como catéteres venosos permanentes o drenajes quirúrgicos. Este microorganismo fue descrito por vez primera en el año 1880, concretamente en la ciudad escocesa de Aberdeen, por el cirujano Alexander Ogston en el pus que drenaba un absceso infectado CONCEPTOS PREVIOS         

Tipos de flora Preparación de medios Cultivo Medios de cultivo, clasificación, tipos, componentes Características coloniales Requerimientos nutricionales bacterianos Identificación bacteriana Tablas de características bioquímicas Esterilización Medidas de seguridad


Cantidad


21 pzas

Matraz erlenmeyer de 300ml

21 pzas

Agitadores de vidrio

35 pzas

Cajas de petri

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Proporcionar 3 pzas en cada mesa de trabajo Proporcionar 3 pzas en cada mesa de trabajo Proporcionar 5 cajas en cada mesa de trabajo 59

Cantidad 50 ml

50 ml 50 ml

SUSTANCIAS Nombre Y Descripción Medio de cultivo de Staphyloccocus 110 Medio de cultivo de Manitol sal y agar Medio de cultivo de Gelosa sangre


Fórmula Química


1 equipo

Olla de esterilizacion o autoclave.

7 equipos

Balanza granataria

Proporcionar 1 equipo por cada mesa de trabajo

MATERIAL PROPORCIONADO POR EL ALUMNO: Material biológico: Para cultivos de: exudados de úlceras, fístulas, heridas y alimentos diversos etc.., debe tenerse en cuenta lo siguiente: Tomar muestras en condiciones asépticas para evitar contaminaciones. Debe obtenerse una cantidad suficiente de material, sobre todo en aquellos casos en que se requieran varios exámenes; por ejemplo: estudios de rutina para investigar cocos gram positivos La muestra deberá ser tomada, si es posible, directamente de la lesión. El producto deberá obtenerse antes de que se inicie el tratamiento. a) Heridas: Las heridas a menudo se infectan por cocos piógenos. Otros gérmenes aislados con frecuencia son pseudomonas, proteus y otras enterobacterias. Las heridas infectadas por clostridia son fácilmente reconocidas, sobre todo si se trata de alguna gangrena gaseosa. Es muy importante obtener el producto de la parte más profunda de la herida para aislar los organismos etiológicamente interesantes. b) Huesos y Articulaciones: Se aislan también cocos piógenos aerobios y anaerobios, M. tuberculosis, salmonellas y brucellas y en ocasiones hongos. Esos son los gérmenes que con más frecuencia causan las osteomielitis. c) Ojos: Los organismos que se aislan con más frecuencia son: Bacilos difteroides. Neisseria. Bacilos Gram negativos (haemophilus, klebsiella). Estafilococos, estreptococos aerobios y anaerobios. d) Oído: Los gérmenes causantes de otitis media y mastoiditis provienen generalmente de las infecciones de la garganta. Estreptococo. Etafilococo. Neumococo. Proteus. Pseudomonas. Klebsiella. VO1/08/13

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Hongos: Aspergillus. Mucor sp.

PROCEDIMIENTO 1.- Tome la muestra en condiciones asépticas con hisopo y deposítela en un tubo estéril. 2.- Haga frotis. 3.- De acuerdo con el sitio de la lesión y el diagnóstico presuntivo hasta la tinción correspondiente. 4.- Realizar la siembra en el medio correspondiente 5.- Meter a incubar las muestras de 48 a 72 horas en la estufa bacteriológica. 6.- Realizar el antibiograma correspondiente. C. Medidas de Seguridad y Control: Las generalidades para efectuar las pruebas de microbiología. INFORME. Será presentado en forma individual en el formato de la UVE de Gowin al titular. CUESTIONARIO 1. ¿Cuáles son las afectaciones que se pueden tener al realizar un muestreo de manera incorrecta?

2. Señale las características resultantes de la bacteria identificada

3. Mencione los errores que se produjeron en esta práctica y la forma de evitarlos

CONCLUSIONES.




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FIRMA DEL PROFESOR

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El Cuadernillo de Prácticas de la Capacitación de Laboratorista Clínico del:

MÓDULO II

PROCESAR LAS TÉCNICAS PARA EL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

PROGRAMA TEÓRICO – PRÁCTICO

SUBMODULO I PROCESAR TÉCNICAS BACTERIOLÓGICAS BASICAS

Se elaboró en el Departamento de Docencia y Apoyo Académico con la valiosa participación de los docentes del Área de Química del Colegio de Bachilleres de Quintana Roo.

Docentes Q.F.B. Emma Gallego Cuevas. Lic. Q.C. Emilia Preza Ríos

Plantel Cancún I Jefa de Materia del área de Química.

Mayo de 2011

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procesar tecnicas bacteriologicas

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