Analises Fisico-Quimicas e Bacteriologicas Da Agua_Apostila

UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA QUÍMICA PROGRAMA DE CONTROLE DE QUALIDADE DE ALIMENTOS E ÁGUA PAVILHÃO TECNOLÓGICO

ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS E E DA Á ÁGUA BACTER IOLÓGICAS D

PROF. DR . VICTOR ELIAS MOUCHREK FILHO PROFA. DRA. ADENILDE R IBEIRO IBEIRO NASCIMENTO

SÃO LUÍS - MA 2005

PROGRAMA DE CONTROLE DE QUALIDADE DE ALIMENTOS E ÁGUA PAVILHÃO TECNOLÓGICO - UFMA

LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA Profa. Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento  [email protected]

LABORATÓRIO DE BROMATOLOGIA Prof. Dr. Victor Elias Mouchrek Filho  [email protected]

PAR TE A: ................................................................................................................................................4 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DA ÁGUA ................................................................................................5 1 GENERALIDADES ..................................................................................................................................5 2 IMPORTÂNCIA DA ANÁLISE DE ÁGUA ................................................................................................10 3 PROPRIEDADES FÍSICO -QUÍMICAS ....................................................................................................11 3.1 TEMPERATURA ................................................................................................................................11 3.2 COR ..................................................................................................................................................11 3.3 ODOR E SABOR .................................................................................................................................12 .................................................................................................................................12 3.4 TURBIDEZ ........................................................................................................................................13 3.5 CONDUTIVIDADE ELÉTRICA ...........................................................................................................14 3.6 DUREZA ............................................................................................................................................15 3.7 ALCALINIDADE ................................................................................................................................16 3.8 PH .....................................................................................................................................................16 3.9 CLORO RESIDUAL LIVRE .................................................................................................................17 3.10 CLORETO .......................................................................................................................................17 4 AMOSTRAGEM ....................................................................................................................................18 4.1 QUANTIDADE DE AMOSTRA ............................................................................................................18 4.2 TOMADA DA AMOSTRA ....................................................................................................................18 5 LEGISLAÇÃO .......................................................................................................................................19 6 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS ..............................................................................................................19 6.1 DETERMINAÇÃO DA ALCALINIDADE – T.A., – T.A., T.A.T.......................................................................19 T.A.T. ......................................................................19 6.2 DETERMINAÇÃO DE CA2+ ................................................................................................................22 6.3 DETERMINAÇÃO DE MG2+ ...............................................................................................................23 6.4 DUREZA TOTAL ...............................................................................................................................23 6.5 DETERMINAÇÃO DE CLORETOS ......................................................................................................24 6.6 DETERMINAÇÃO DE P H...................................................................................................................25 6.7 DETERMINAÇÃO DA CONDUTIVIDADE ELÉTRICA .........................................................................25 6.8 DETERMINAÇÃO DA COR ................................................................................................................26 6.9 DETERMINAÇÃO DA TURBIDEZ ......................................................................................................26 6.10 DETERMINAÇÃO DE CLORO RESIDUAL ........................................................................................26

PAR TE B ................................................................................................................................................27 ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DE ÁGUAS...............................................................................................28 1. CONSIDERAÇÕES INICIAIS ................................................................................................................28 2 ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS ...........................................................................................................30 2.1 COLIMETRIA (POTABILIDADE ).......................................................................................................30 2.1.1 BACTÉRIAS DO GRUPO COLIFORME ...............................................................................................30 2.1.2 COLETAS DE AMOSTRAS PARA ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS DA ÁGUA .......................................30 2.1.3 PROCEDIMENTO DE COLETA ..........................................................................................................31 2.1.4 TÉCNICAS DE COLETA DE AMOSTRA ..............................................................................................32 2.1.5 TÉCNICA DOS TUBOS MÚLTIPLOS (NMP/100ML).........................................................................35 2.1.5.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS ...........................................................................................................35 2.1.5.2 MATERIAL ..................................................................................................................................35 2.1.5.3 METODOLOGIA ...........................................................................................................................37 2.1.6 MÉTODO PARA DETECÇÃO DE COLIFORMES TOTAIS E ESCHERICHIA COLI USANDO MEIOS COM ONPG E MUG ............................................................................................................................................41

DE E NTEROCOCCUS SP. ...................................................................44 3 ENUMERAÇÃO DO NMP /100ML DE E DE PSEUDOMONAS SP...............................................................................46 4 TESTE PARA A PRESENÇA DE P

5 BALNEABILIDADE DAS PRAIAS ..........................................................................................................48 APÊNDICES ............................................................................................................................................50 R EFERÊNCIAS EFERÊNCIAS ........................................................................................................................................58

PAR TE A:

A NÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DA ÁGUA

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ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DA ÁGUA

1 GENERALIDADES Visto pelo lado de fora, o planeta deveria se chamar água. Com algumas “ilhas” de terra firme, cerca de 2/3 de sua superfície são dominados pelos vastos oceanos. Os pólos e suas vizinhanças estão cobertos pelas águas sólidas das gigantescas geleiras. A pequena quantidade de água restante divide-se entre a atmosfera, o subsolo, os rios e os lagos. Estimam-se em cerca de 1,35 milhões de quilômetros cúbicos o volume total de água na Terra.

- Prof. Dr. Victor Elias Mouchrek Filho -


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Onde está a água no planeta? Todos sabem que o Planeta Terra é formado por muita água, mas...

Ou, ainda, distribuída como veremos a seguir.

Geleiras - 1,979%

Oceanos - 97,50%



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Rios e Lagos - 0,006%

Subterrâneas - 0,514%

Atmosfera - 0,001%

A situação da água no Brasil

O Brasil detém 13,7% da água doce superficial do mundo. Os 70 % da água disponível para uso estão localizados na Região Amazônica. Os 30% restantes distribuem-se desigualmente pelo País, para atender a 93% da população.



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A generosidade da natureza fazia crer em inesgotáveis mananciais, abundantes e renováveis. Hoje, o mau uso, aliado à crescente demanda pelo recurso, vem preocupando especialistas e autoridades no assunto, pelo evidente decréscimo da disponibilidade de água limpa em todo o planeta. Recurso natural de valor econômico, estratégico e social, essencial à existência e bem estar do homem e à manutenção dos ecossistemas do planeta, a água é um bem comum a toda a humanidade. A água é um poderoso solvente, sendo assim ela dissolve algumas porções de quase tudo com o que entra em contato. Na cidade a água é contaminada por esgoto, monóxido de carbono, poluição, produtos derivados de petróleo e bactérias. O cloro utilizado para proteger a água pode contaminá-la ao reagir com as substâncias orgânicas presentes na água, formando os nocivos trihalometanos. A agricultura contamina a água com fertilizantes, inseticidas, fungicidas, herbicidas e nitratos que são carregados pela chuva ou infiltrados no solo, contaminando os mananciais subterrâneos e os lençóis freáticos. A água subterrânea também é contaminada por todos estes poluentes que se infiltram no solo, atingindo os mananciais que abastecem os poços de água de diversos tipos. A água da chuva é contaminada pela poluição que se encontra no ar, podendo estar contaminada com partículas de arsênio, chumbo, outros poluentes e inclusive ser uma chuva ácida. A indústria contamina a água através do despejo nos rios e lagos de desinfetantes, detergentes, solventes, metais pesados, resíduos radioativos e derivados de petróleo.

Os contaminantes da água podem ser: •

Biológicos - a água é um excelente meio para o crescimento microbiano.

•

Dissolvidos - fazendo parte de sua composição química.

•

Em suspensão - fazendo parte da composição física: sedimentos, partículas, areia, barro, etc. - Prof. Dr. Victor Elias Mouchrek Filho -


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Formas de contaminação da água: Uso de fertilizantes, inseticidas, nitratos, herbicidas e fungicidas utilizados nas plantações e que se infiltram na terra, atingindo os mananciais subterrâneos. Detergentes, desinfetantes, solventes e metais pesados que são descarregados no esgoto (e muitas vezes nos rios) pelas indústrias. Lixo e detrito que são jogados nos rios e lagos. Produtos derivados de petróleo que vazam e são arrastados pela água da chuva. Restos de animais mortos. Chuva ácida.

Problemas mais comuns na água são: •

Turbidez - A turbidez é a presença de partículas de sujeira, barro e areia, que retiram o aspecto cristalino da água, deixando-a com uma aparência turva e opaca.

•

Gosto e cheiro estranhos - Gostos e cheiros indesejáveis, como de bolor, de terra ou de peixe, são causados pela presença de algas, húmus e outros detritos que naturalmente estão presentes nas fontes de água como rios e lagos.

•

Cor estranha - A presença de ferro e cobre pode deixá-la amarronzada. Além do aspecto visual, essa água pode manchar pias e sanitários. A água que causa manchas pretas possui partículas de manganês.

•

Cheiro de ovo podre - Este cheiro é causado pela presença de hidrogênio sulfídrico, produzido por bactérias que se encontram em poços profundos e fontes de águas estagnadas por longos períodos.

•

Gosto de ferrugem/gosto metálico - O excesso de ferro e de outros metais alteram o sabor e aparência da água. O sabor da água pode se apresentar metálico, mesmo que visualmente a coloração esteja normal, pois a coloração enferrujada só aparece depois de alguns minutos em contato com o ar. - Prof. Dr. Victor Elias Mouchrek Filho -

A NÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DA ÁGUA •

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Gosto e cheiro de cloro - O cloro é usado pelas estações de tratamento para desinfetar a água. Porém, a presença de cloro prejudica o sabor e o cheiro da água que vai ser utilizada para beber ou na culinária em geral.

2 IMPORTÂNCIA DA ANÁLISE DE ÁGUA A água para ser consumida pelo homem não pode conter substâncias dissolvidas em níveis tóxicos e nem transportar em suspensão microrganismos patogênicos que provocam doenças. A forma de avaliar a sua qualidade é através das análises físico-químicas e microbiológicas (bacteriológicas) realizadas por laboratórios especializados. No Brasil, existem padrões de potabilidade regidos por portarias e resoluções legais, que dão subsídios aos laboratórios na expedição de seus laudos. O importante, no entanto, é a conscientização do cidadão da necessidade de manter um programa de monitoramento da qualidade da água que ele consome. A necessidade do monitoramento deve-se ao fato de possíveis mudanças em algumas características da água que podem ocorrer com o tempo ou devido a condições externas que possam vir a contaminar o manancial com substâncias tóxicas, sal, ou bactérias. A água utilizada na irrigação e na indústria também precisa ser de boa qualidade. Na irrigação a água não pode conter sais em excesso para não prejudicar as plantas e o solo, e nem conter substâncias dissolvidas que possam causar danos aos equipamentos. Na indústria, dependendo de algumas características físico-químicas, a água quando não submetida ao devido tratamento pode ocasionar incrustação e corrosão dos equipamentos, diminuindo sua vida útil. É necessário o conhecimento da qualidade da água também em outras atividades, como: criação de peixes, camarões, galinha, gado, etc.

Essas análises classificam a água em: •

Potável - adequada para o consumo humano (dentro dos padrões de potabilidade estabelecidos pelos órgãos especializados);



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Contaminada - contém microrganismos patogênicos e, para tornar-se potável,

•

precisa sofrer desinfecção ou ser submetida a fervura;

Poluída - apresenta qualquer espécie de poluição e pode estar também

•

contaminada. Mesmo isenta de microrganismos patogênicos, a água poluída é imprópria para o consumo, pois pode conter tanto substâncias tóxicas, como grande concentração de substâncias químicas (magnésio, cálcio, metais em forma de bicarbonatos, sulfatos, cloretos e outros), o que a torna dura ou corrosiva.

3 PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS 3.1 TEMPERATURA Variações de temperatura são parte do regime climático normal, e corpos de água naturais apresentam variações sazonais e diurnas. A temperatura superficial é influenciada por fatores tais como latitude, altitude, estação do ano, período do dia, taxa de fluxo e profundidade. A elevação da temperatura em um corpo d’água geralmente é provocada por despejos industriais. As águas têm uma amplitude térmica pequena, variando de 1 a 2°C em relação ao ambiente.

3.2 COR A cor de uma água é conseqüência de substâncias dissolvidas. Quando pura, e em grandes volumes, a água é azulada. Quando rica em ferro, é arroxeada. Quando rica em manganês, é negra e, quando rica em ácidos húmicos , é amarelada. A medida da cor de uma água é feita pela comparação com soluções conhecidas de platina-cobalto ou com discos de vidro corados calibrados com a solução de platina-cobalto. Uma unidade de cor corresponde àquela produzida por 1mg/L de platina, na forma de íon cloroplatinado – Unidade Hanzen (mg Pt Co/L). - Prof. Dr. Victor Elias Mouchrek Filho -


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Especial cuidado deve ser tomado na anotação do pH em que foi realizada a medida, pois sua intensidade aumenta com o pH. Da mesma forma a cor é influenciada por matérias sólidas em suspensão (turbidez), que devem ser eliminadas antes da medida. Para águas relativamente límpidas a determinação pode ser feita sem a preocupação com a turbidez. Neste caso a cor obtida é referida como sendo aparente. Para ser potável uma água não deve apresentar nenhuma cor de considerável intensidade. Segundo a Portaria 518, de 25 de março de 2004 – ANVISA – MS o índice máximo permitido deve ser 15 mg Pt Co/L ou 15 UH.

3.3 ODOR E SABOR Odor e sabor são duas sensações que se manifestam conjuntamente, o que torna difícil sua separação. O odor e o sabor de uma água dependem dos sais e gases dissolvidos. Como o paladar humano tem sensibilidade distinta para os diversos sais, poucos miligramas por litro de alguns sais, como ferro e cobre são detectávis, enquanto que, várias centenas de miligramas de cloreto de sódio não são percebidas. Em geral as águas são desprovidas de odor sendo não objetável. Algumas fontes termais podem exalar cheiro de ovo podre devido ao seu conteúdo de H2S (gás sulfídrico). Da mesma maneira águas que percolam matérias orgânicas em decomposição (turfa, por exemplo) podem apresentar H2S. A Tabela 1A apresenta a relação de alguns sais dissolvidos e as sensações causadas ao paladar humano.



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Tabela 1A. Sais dissolvidos com suas respectivas sensações. Sais dissolvidos

Sensações

Cloreto de sódio (NaCl)

Salgado

Sulfato de Sódio (Na2SO4)

Ligeiramente salgado

Bicarbonato de Sódio (NaHCO 3)

Ligeiramente salgado a doce

Carbonato de Sódio (Na 2CO3)

Amargo e salgado

Cloreto de Cálcio (CaCl2)

Fortemente amargo

Sulfato de Cálcio (CaSO 4)

Ligeiramente amargo

Sulfato de Magnésio (MgSO 4)

Ligeiramente amargo em saturação

Cloreto de Magnésio (MgCl 2)

Amargo e doce

Gás Carbônico (CO2)

Adstringente e picante

3.4 TURBIDEZ É a medida da dificuldade de um feixe de luz atravessar uma certa quantidade de água. A turbidez é causada por matérias sólidas em suspensão (argila, colóides, matéria orgânica etc.). A turbidez é medida através do turbidímetro de Jackson, comparando-se o espalhamento de um feixe de luz ao passar pela amostra com o espalhamento de um feixe de igual intensidade ao passar por uma suspensão padrão. Quanto maior o espalhamento maior será a turbidez. Os valores são expressos em Unidade de Turbidez (UT). A cor da água interfere negativamente na medida da turbidez devido à sua propriedade de absorver luz.



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Segundo a Portaria 518, de 25 de março de 2004 – ANVISA - MS o limite máximo de turbidez em água potável deve ser 5 UT. As águas normalmente não apresentam problemas devido ao excesso de turbidez. Em alguns casos, águas ricas em íons Fe, podem apresentar uma elevação de sua turbidez quando entram em contato com o oxigênio do ar.

3.5 CONDUTIVIDADE ELÉTRICA A condutividade é uma expressão numérica da capacidade de uma água conduzir a corrente elétrica. Depende das concentrações iônicas e da temperatura e indica a quantidade de sais existentes na coluna d’água, e, portanto, representa uma medida indireta da concentração de poluentes. Em geral, níveis superiores a 100 µS/cm indicam ambientes impactados. A condutividade também fornece uma boa indicação das modificações na composição de uma água, especialmente na sua concentração mineral, mas não fornece nenhuma indicação das quantidades relativas dos vários componentes. À medida que mais sólidos dissolvidos são adicionados, a condutividade da água aumenta. Altos valores podem indicar características corrosivas da água. A medida é feita através de condutivímetro e a unidade usada é o MHO (inverso de OHM, unidade de resistência). Como a condutividade aumenta com a temperatura, usa-se 25ºC como temperatura padrão, sendo necessário fazer a correção da medida em função da temperatura se o condutivímetro não o fizer automaticamente. Contudo, para as águas as medidas usuais de condutividade são dadas em microMHO/cm.



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Nota: No Sistema Internacional de Unidades, adotado pelo Brasil, a unidade de condutância é Siemens, abreviando-se S (maiúsculo). Para as águas o correto seria nos referirmos a microsiemens por centímetro (µS/cm).

3.6 DUREZA A dureza é definida como a dificuldade de uma água em dissolver (fazer espuma) sabão pelo efeito do cálcio, magnésio e outros elementos como Fe, Mn, Cu, Ba etc. Águas duras são inconvenientes porque o sabão não limpa eficientemente, aumentando seu consumo, e deixando uma película insolúvel sobre a pele, pias, banheiras e azulejos do banheiro. A dureza pode ser expressa como dureza temporária, permanente e total.

Dureza temporária ou de carbonatos É devida aos íons de cálcio e de magnésio que sob aquecimento se combinam com íons bicarbonato e carbonatos, podendo ser eliminada por fervura. Em caldeiras e tubulações por onde passa água quente (chuveiro elétrico por exemplo) os sais formados devido à dureza temporária se precipitam formando crostas e criando uma série de problemas, como o entupimento.

Dureza permanente É devida aos íons de cálcio e magnésio que se combinam com sulfato, cloretos, nitratos e outros, dando origem a compostos solúveis que não podem ser retirados pelo aquecimento.

Dureza total É a soma da dureza temporária com a permanente. A dureza é expressa em miligrama por litro (mg/L) ou miliequivalente por litro (meq/L) de CaCO 3 (carbonato de cálcio) e segundo a Portaria 518, de 25 de março de 2004 – ANVISA - MS o limite máximo de dureza total em água potável é de 500 mg/L.



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3.7 ALCALINIDADE É a medida total das substâncias presentes na água capaz de neutralizarem ácidos. Em outras palavras, é a quantidade de substâncias presentes numa água e que atuam como tampão. Se numa água quimicamente pura (pH = 7) for adicionada pequena quantidade de um ácido fraco seu pH mudará instantaneamente. Numa água com certa alcalinidade a adição de uma pequena quantidade de ácido fraco não provocará a elevação de seu pH, porque os íons presentes irão neutralizar o ácido. Em águas a alcalinidade é devida principalmente aos carbonatos e bicarbonatos. Alcalinidade total é a soma da alcalinidade produzida por todos estes íons presentes numa água. Águas que percolam rochas calcárias (calcita = CaCO 3) geralmente possuem alcalinidade elevada. A alcalinidade de uma água é expressa em mg/L de CaCO 3 e deve apresentar isenção de alcalinidade cáustica.

3.8 PH É a medida da concentração de íons H + na água. O balanço dos íons hidrogênio e hidróxido (OH -) determinam quão ácida ou básica ela é. Na água quimicamente pura os íons H + estão em equilíbrio com os íons OH - e seu pH é neutro, ou seja, igual a 7. Os principais fatores que determinam o pH da água são o gás carbônico dissolvido e a alcalinidade. Segundo a Portaria 518, de 25 de março de 2004 – ANVISA - MS os limites permitidos variam entre 6,0 a 9,5.



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3.9 CLORO RESIDUAL LIVRE Conhecer o teor de cloro ativo que permanece após a desinfecção (cloração) da água, permite garantir a qualidade microbiológica da água, ou seja, se ela está em condições de uso. Segundo a Portaria 518, de 25 de março de 2004 – ANVISA - MS os limites permitidos de cloro residual na água são de 0,2 a 2,0 mg Cl 2/L.

3.10 CLORETO O cloreto é o ânion Cl - que se apresenta nas águas subterrâneas através de solos e rochas. Nas águas superficiais são fontes importantes as descargas de esgotos sanitários, sendo que cada pessoa expele através da urina cerca 6 g de cloreto por dia, o que faz com que os esgotos apresentem concentrações de cloreto que ultrapassam a 15 mg/L. Diversos são os efluentes industriais que apresentam elevadas concentrações de cloreto como os da indústria do petróleo, algumas indústrias farmacêuticas, curtumes etc. Nas regiões costeiras, através da chamada intrusão da língua salina, são encontradas águas com níveis altos de cloreto. Nas águas tratadas, a adição de cloro puro ou em solução leva a uma elevação do nível de cloreto, resultante das reações de dissociação do cloro na água. Para as águas de abastecimento público, a concentração de cloreto constitui-se em padrão de potabilidade. Segundo a Portaria 518, de 25 de março de 2004 – ANVISA - MS o limite máximo permissível para cloreto na água é de 250 mg/L. O cloreto provoca sabor “salgado” na água, sendo o cloreto de sódio o mais restritivo por provocar sabor em concentrações da ordem de 250 mg/L, valor este que é tomado como padrão de potabilidade.



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4 AMOSTRAGEM 4.1 QUANTIDADE DE AMOSTRA A amostragem da água para análise físico-química é feita coletando-se 1,5-2,0 litros da água numa garrafa plástica ou de vidro, nova ou que só tenha sido utilizada com água.

4.2 TOMADA DA AMOSTRA Lava-se o recipiente três vezes com a água do local que se deseja analisar, e na quarta vez enche-se, identifica-se com dados sobre o interessado, a procedência, local da coleta, data da coleta e envia-se o mais rápido possível ao laboratório. Caso não seja possível enviar no mesmo dia, colocar sob refrigeração até o momento do envio.Cuidar para no momento da coleta não deixar as mãos entrar em contato com a água. É importante também observar alguns procedimentos que dependem do local da coleta:

a) Tomada de amostra de rio ou lago Para encher os vidros com água de rio ou lagoa tem que se procurar a amostra a 2 cm da margem e obtê-la de 20 a 30 cm abaixo do nível da água, a fim de não ficar contaminada, e que seja representativa. A boca do vidro deve estar na mesma direção da corrente, para que não entre água superficial.

b) Tomada de amostra de uma torneira Para análise bacteriológica, abrir a torneira e deixar sair a água por 3 a 4 minutos; fechar a torneira e flambá-la com um swab embebido em álcool (esterilização direta); em seguida, deixar correr água por 2 a 3 minutos, encher o vidro e fechar rapidamente.

c) Tomada de amostra de água de piscina ou de caixa de água Geralmente a água ingressa pela parte superior e sai pela parte inferior. Devemos tomar duas amostras: quando a água ingressa e quando a água egressa. O objetivo é determinar se a fonte de contaminação está depositada no tanque reservatório. Nas piscinas ou em tanques de água similares, devemos tomar uma amostra da zona em que supõe que o fluxo de água é menor onde a água é mais parada. - Prof. Dr. Victor Elias Mouchrek Filho -


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d) Tomada de amostra de água de poço Geralmente efetua-se por um sistema de roldanas, com um balde na extremidade da corda. A técnica correta é esterilizar o balde queimando 30 a 40 mL de álcool etílico, em seguida coletar a amostra de água.

5 LEGISLAÇÃO Foi publicada pelo Ministério da Saúde a nova Portaria nº 518 de 25 de março de

2004 que estabelece os procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade, e dá outras providências, e a Resolução RDC nº 54 de 15 de junho de 2000 , que dispõe sobre o Regulamento Técnico para Fixação de Identidade e Qualidade de Água Mineral Natural e Água Natural.

6 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS 6.1 DETERMINAÇÃO DA ALCALINIDADE – T.A., T.A.T. O conhecimento das alcalinidades permite determinar a quantidade de OH – , CO 32– e HCO3 – contidos em uma amostra de água. Em geral não existem hidróxidos, restando os carbonatos que aparecem com pouca freqüência e o bicarbonato sempre existindo. Sabe-se que não pode coexistir OH – e HCO3 – . O título alcalimétrico T.A. é efetuado em presença de fenolftaleína, correspondendo à quantidade de hidróxidos e carbonatos; o título alcalimétrico total T.A.T. é efetuado em presença de metil orange e corresponde à quantidade de hidróxidos, carbonatos e bicarbonatos. Processo analítico: 1. Pipetar 100 mL da amostra para um erlenmeyer de 250 mL. 2. Juntar 2 gotas de fenolftaleína indicador. Se não aparecer coloração rósea, o T.A. é nulo, isto é, não existe OH – nem CO32– , neste caso omite-se o terceiro passo deste processo analítico. - Prof. Dr. Victor Elias Mouchrek Filho -


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3. Titular com solução de H 2SO4 0,04 até descoramento, anotando o gasto como F mL, onde F é o volume gasto de ácido usando fenolftaleína. 4. Juntar ao mesmo erlenmeyer, 2 gotas de metil orange indicador. 5. Titular com o H2SO4 até coloração rosa (salmão), anotando o gato como M mL (M = gasto de ácido usando metil orange; T = volume total do ácido gasto com os dois indicadores).

Cálculo completo dos diferentes casos de alcalinidade Tomando por base os volumes gastos com fenolftaleína e o volume total (fenolftaleína + metil orange) o cálculo de alcalinidade vai se enquadrar nos casos a seguir.

► 1º

Caso: T = F

CO32– = zero HCO3 – = zero OH – = 2 x F x 3,398 mg L -1 em CaCO3. ► 2º

Caso: F > ½ T

HCO3 – = zero OH – = 2 (2 x F – T) x 3,398 mg L -1 em CaCO3. CO32– = 4 (T – F) x 5,995 mg L -1 em CaCO3. ► 3º

Caso: F = ½ T

OH – = zero HCO3 – = zero CO32– = 2 x T x 5,995 mg L -1 em CaCO3. ► 4º

Caso: F < ½ T

OH – = zero CO32– = 4 x F x 5,995 mg L -1 em CO3Ca HCO3 – = 2 (T – 2 x F) x 12,2 mg L -1 em CO3Ca. - Prof. Dr. Victor Elias Mouchrek Filho -

A NÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DA ÁGUA ► 5º

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Caso: F = 0

OH – = zero CO32– = zero HCO3 – = 2 x T x 12,2 mg L -1 em CaCO3.

Os títulos alcalimétricos também podem ser expressos em graus franceses. Nas determinações de Ca 2+ e Mg2+ e dureza total lança-se mão dos métodos complexométricos (Complexometria). O preparo de alguns indicadores usados nas determinações está descrito a seguir. •

Murexida (sal amoniacal do ácido purpúrico)

Preparo:

Indicador sólido  Mistura-se bem homogêneo 1g de murexida com 199g de NaCl cristalizado por análise Merck. A mistura é realizada em um grau de porcelana.

Indicador líquido

 Prepara-se

como indicador uma solução aquosa saturada, que

se prepara no momento, dissolvendo aproximadamente 0,17g do murexida em 100mL de água destilada.

Ácido calconcarboxílico

 Solução

0,4% de ácido calconcarboxílico Merck em

metanol para análises Merck. Este indicador é específico do cálcio e permite determina-lo em presença de grandes quantidades de magnésio. O final da dosagem se dá quando há mudança de cor de vermelho-vinho para azul límpido. Este indicador se conserva por tempo limitado, o ideal é prepará-lo semanalmente. Os indicadores citados são utilizados na determinação do Ca 2+, o ácido calconcarboxílico é mais usado por ter a viragem mais nítida, isto é, de vermelho vinho para azul límpido. Enquanto que a virada com a murexida é confusa, passando de rosa vivo para roxo claro. •

Eriocromo black T (Negro de eriocromo T): indicador utilizado na determinação do magnésio. Pode ser sólido ou líquido:



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Preparo:

Indicador sólido  Tritura-se, mistura-se em um grau de porcelana 1g do indicador com 99% de ClNa cristalizado para análise.

Indicador líquido

 O

indicador não é estável em solução aquosa, em caso de

necessidade, pode-se dissolver 0,2% em álcool. Entretanto, uma maneira mais estável é a que se segue: 0,2g do corante em uma mistura de 15mL de trietanolamina pura Merck e 5mL de C2H5OH absoluto para análise. A virada desse indicador também é de vermelho vinho para azul límpido. Para os indicadores líquidos utiliza-se 6 a 7 gotas, enquanto que para os sólidos se usa pitadas. •

Solução tampão pH = 10

Preparo: A 200 mL de água destilada se dissolve 54 g de NH 4Cl; a esta solução se agrega 350 mL de amoníaco líquido d = 0,910 e se completa para um litro de água destilada.

6.2 DETERMINAÇÃO DE CA2+ Numa alíquota de 50 mL, juntar 2 mL de KOH a 10% (para tornar o pH alcalino), uma pequena quantidade do indicador murexida ou ácido calconcarboxílico e titular com solução Na2EDTA 0,02 N. O ponto final de titulação se dá quando há a passagem de vermelho vinho para azul, no caso de se usar o ácido calconcarboxílico como indicador, e de rosa vivo para roxo claro se utilizar murexida como indicador. Utiliza-se as equações: Ca 2 + =

Bx400xf ppm Ca 2 + mL da amostra

B = mL de Na2EDTA 0,02 N gastos na titulação. Ca 2 + =

Bx1000 ppm CaCO 3 mL da amostra



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6.3 DETERMINAÇÃO DE MG2+ Em uma alíquota de 50 mL adicionar 3 mL de solução tampão, 6 a 7 gotas do indicador Eriocromo black T e titular com solução Na 2EDTA 0,02 N, até a virada do indicador Eriocromo. Titular com solução Na 2EDTA 0,02 N, até virada de vermelho vinho para azul límpido. Nesta operação se determina cálcio e magnésio conjuntamente; por diferença se tem o magnésio. A equação é a seguinte: (A - B)x243xf ppm Mg 2+ mL da amostra

Mg 2 + =

A = volume em mL gasto de Na 2EDTA 0,02 N na titulação. B = volume em mL gasto na titulação de Ca 2+. Mg 2+ =

(A - B)x1000 ppm CaCO 3 mL da amostra

6.4 DUREZA TOTAL A dureza total é expressa pela fórmula: DT =

•

Ax1000xf ppm mL da amostra

Na2EDTA ou titriplex III (sal dissódico do ácido etilenodiamin tetracético)

Preparo: Peso molecular do Na 2EDTA: 372,24g Eq. grama = mol/2 = 186,12 Dissolve-se 3,722 g em um pouco de água destilada e se completa a 1000 mL em balão volumétrico.



24

6.5 DETERMINAÇÃO DE CLORETOS Neste processo analítico, os cloretos são determinados por precipitação usando-se uma solução padrão de AgNO 3 e o indicador K 2CrO4.

•

Solução padrão de AgNO 3 0,0141 N

Preparo: Dissolve-se 2,3970 g de nitrato de prata em água destilada e completar o volume para 1 litro em balão volumétrico. Homogeneizar. Dissolve-se 50 g de K 2CrO4 em pequena quantidade de água destilada; adicionar a solução de nitrato de prata até que se firme um precipitado vermelho. Deixar em repouso por 12 horas. Filtrar e diluir o para 1 litro. Reação: K 2CrO4 + 2AgNO3



Ag2CrO4 + 2KNO3

Processo analítico: 1. Pipetar 50 mL da amostra de água para uma cápsula de cor branca. Se a água for muito colorida, juntar um pouco de Al(OH) 3, filtrar e lavar com água destilada. 2. Colocar aproximadamente a mesma quantidade de água destilada em uma segunda cápsula, para servir de comparador de cor. 3. Juntar a cada cápsula 1 mL do indicador cromato de potássio. 4. Titular lentamente com solução padrão de AgNO 3 agitando sempre com um bastão, até ligeira coloração vermelha (comparar com a cápsula contendo água destilada), anotar o volume gasto com A mL. 5. Se o gasto A mL de AgNO 3 ultrapassar a 8 mL, deve-se utilizar menor quantidade da amostra de água e depois diluir a 50 mL com água destilada. - Prof. Dr. Victor Elias Mouchrek Filho -


25

Cálculo dos cloretos : Utiliza-se a seguinte equação. (A - 0,2)x0,5x1000xf = mgL-1Cl − mL da amostra A subtração de 0,2 mL corresponde ao volume do indicador necessário para precipitar o AgCrO4 em quantidade suficiente para avermelhar a solução.

6.6 DETERMINAÇÃO DE PH A determinação é realizada em um pH-metro. Retira-se a proteção do eletrodo de vidro, lava-se o mesmo com água destilada. Em seguida calibra-se o pH-metro da seguinte forma: •

Coloca-se o eletrodo em uma solução tampão pH 6,86 calibrando-se em seguida.

•

Coloca-se o eletrodo em uma solução tampão pH 4,01 calibrando-se em seguida.

•

Coloca-se o eletrodo em na solução na solução amostra e lê-se o pH em seguida.

6.7 DETERMINAÇÃO DA CONDUTIVIDADE ELÉTRICA A determinação é realizada em um condutivímetro: Fórmulas: X=

1.000.000

Y=

V (lido)

0 ,935 X



26

6.8 DETERMINAÇÃO DA COR A determinação é realizada em um espectrofotômetro da seguinte forma: •

Ajusta-se o aparelho para um comprimento de onda de 455 nm;

•

Coloca-se a célula com água destilada e calibra-se;

•

Em seguida coloca-se a célula com a amostra.

6.9 DETERMINAÇÃO DA TURBIDEZ A determinação é realizada em um espectrofotômetro da seguinte forma: •

Ajusta-se o aparelho para um comprimento de onda de 860 nm;

•

Coloca-se a célula com água destilada e calibra-se;

•

Em seguida coloca-se a célula com a amostra.

6.10 DETERMINAÇÃO DE CLORO RESIDUAL Coloca-se 200 mL de amostra em erlenmeyer de 250 mL. Adiciona-se alguns cristais de KI, 1 mL de CH3COOH concentrado, e 1 mL da solução de amido a 1%. Titula-se com solução de Na 2S2O3 0,001 N, até que a cor azul desapareça. Calcula-se o cloro residual pela expressão: ppm de cloro residual = mL Na2S2O3 x 0,1773


PAR TE B

A NÁLISES BACTERIOLÓGICAS DA ÁGUA

28

ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS DA ÁGUA

1. CONSIDERAÇÕES INICIAIS A água é um elemento essencial à vida,

conseqüentemente sua potabilidade e qualidade são importantes para o bem estar e saúde da população. A microbiologia da água compreende no estudo das bactérias, vírus, algas, protozoários e fungos microscópicos. Alguns desses microrganismos são próprios do habitat local e outros são lançados nas fontes hídricas pela ação do ar, solo ou ainda provenientes de processos industriais e domésticos. Os despejos de resíduos industriais e domésticos nas fontes hídricas proporcionam a sua contaminação trazendo agentes etiológicos de caráter infeccioso ou parasitário, sendo responsável pela alta incidência de doenças que afetam a população (principalmente crianças com enterites e diarréias). Os agentes veiculados pela água e causadores de doenças podem ser de natureza biológica ou química. As doenças causadas por contaminantes biológicos presentes na água (bactérias, vírus ou protozoários) constituemse nos problemas de saúde pública mais comum em nosso país. Essas doenças são transmitidas por excrementos humanos e de animais despejados nas fontes de água, tornando-a imprópria para o consumo. A transmissão dessas doenças ocorre de forma direta ou indireta: com a ingestão da água, no preparo de alimentos, na higiene pessoal, na agricultura ou no lazer. Os principais microrganismos presentes na água contaminada e responsáveis pelas numerosas doenças são Salmonella sp, Shigella sp, Escherichia coli, Vibrio cholerae. As espécies bacterianas existentes nas águas naturais são principalmente espécies dos gêneros Pseudomonas , Chromobacterium, Proteus, Micrococcus, Bacillus, Enterococcus, Enterobacter

e Escherichia coli. É provável que as três últimas bactérias sejam

contaminantes. - Profa. Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento -


29

Mas existem ainda outros tipos de contaminação relacionada com a água é a presença de protozoários causadores de infecções parasitárias no homem como a amebíase ( Entamoeba hystolitica ), giardíase ( Giardia lamblia) e a balantidíase ( Balantidium coli).

Outro fator importante da água é a transmissão de algumas doenças endêmicas como a malária, dengue e febre amarela (a Tabela 1A mostra algumas doenças veiculadas pela água). A água é um ambiente propício para a evolução do ciclo de vetores responsáveis por essas doenças. A água é o maior veículo de contaminação humana, portanto, a água distribuída à população deve ser de boa qualidade com todas as características determinadas pela legislação vigente (Portaria n.º 36/MS/90, do Ministério de Saúde).

Tabela 1B. Algumas doenças de transmissão hídrica. Organismos Typhi Salmonella sp.

Salmonella

Shigella sp.

BACTÉRIAS

Escherichia coli patogênica Vibrio cholerae Lagionella pneumophila Leptpspira Enterovirus

VÍRUS

Rotavírus Vírus da hepatite A Adenovírus Entamoeba histolytica

PROTOZOÁRIOS

Giárdia Lamblia Cryptosporidium Ascaris lumbricóides

Doenças Febre Tifóide Salmonelose Shigelose (desinteria bacilar) Gastrenterites Cólera Doença dos legionários Leptospirose (contato) Poliomelite, gatroenterites Gastroenterites Hepatite A Doenças respiratórias, conjuntivites. Amebíase Giardíse Criptpsporidiose Verminoses

Enterobius vermicularis

HELMINTOS

Strongyloides stercolaris Trichuris trichiura Schistosoma mansoni

Esquistossomose

Nota: Há uma serie de outros microrganismos patogênicos que, se presentes, poderão ser veiculados através de águas de esgoto. - Profa. Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento -


30

2 ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS 2.1 COLIMETRIA (POTABILIDADE) 2.1.1 BACTÉRIAS DO GRUPO COLIFORME As bactérias do grupo coliforme constituem o indicador de contaminação mais utilizado em todo o mundo, sendo empregado como parâmetro bacteriológico básico na definição de padrões para monitoramento da qualidade das águas destinadas ao consumo humano, bem como para caracterização e avaliação da qualidade das águas em geral. Os coliformes são definidos como bacilos gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, que fermentam a lactose com produção de ácido e gás em 48 horas a 35ºC. Neste grupo estão incluídos os gêneros: Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella,

Escherichia ,

etc., sendo que as bactérias do gênero Escherichia são

exclusivamente de origem fecal e os demais membros do grupo coliforme podem ocorrer às vezes com relativa abundância no solo e mesmo em plantas. Uma grande vantagem da utilização dos coliformes como indicador de contaminação, é o fato de serem facilmente isolados da água e identificados. As técnicas bacteriológicas para a sua detecção são simples, além de rápidas e econômicas, o que pode permitir a sua aplicação em exames rotineiros para a avaliação da qualidade bacteriológica da água.

2.1.2 COLETAS DE AMOSTRAS PARA ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS DA ÁGUA As coletas de amostras para análises microbiológicas devem sempre anteceder a coleta de qualquer outro tipo de análise que não exija esterilidade (físico-química, por exemplo), a fim de evitar o risco de contaminação local de amostragem por frascos e amostradores não estéreis.

a) Amostragem: A coleta de amostras líquidas deve ser efetuada conforme recomendações técnicas e com assepsia; sendo requerido um volume mínimo de 100mL, o qual deve ser coletado em frascos de vidro neutro ou plástico autoclavável, não tóxico, com capacidade mínima de 125mL, boca larga e tampa a prova de vazamentos. - Profa. Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento -


31

b) Identificação: As amostras devem ser identificadas com as seguintes informações: número da amostra, data da coleta, local, pH, temperatura, cloro residual e outras informações necessárias para que os resultados possam ser interpretados corretamente.

c) Agente neutralizador de cloro residual: Para amostras de água tratada (piscina, etc.), deve-se adicionar ao frasco de coleta, antes de sua esterilização 0,1mL de uma solução a 1,8% de Tiossulfato de sódio para cada 100mL da amostra, para neutralizar a ação do cloro residual.

2.1.3 PROCEDIMENTO DE COLETA a) Coleta em sistemas de abastecimento de água para consumo: Antes das coletas das amostras, verifique se o ponto de coleta recebe água diretamente do sistema de distribuição e não de caixas, reservatórios, cisternas, etc. A torneira não deve conter filtros. Inicialmente, abre-se a torneira e deixa-se escorrer a água durante 3 a 5 minutos, um tempo suficiente para eliminar impurezas e águas acumuladas na canalização. Na desinfecção da torneira, utiliza-se uma solução de hipoclorito de sódio ou álcool a 70% para eliminar qualquer contaminação externa. No caso da desinfecção com hipoclorito, o mesmo deve ser completamente removido antes da coleta. Abre-se a torneira a meia secção para que o fluxo seja pequeno e não haja respingos. Remove-se a tampa do frasco com todos os cuidados e assepsia, tomando precauções para evitar a contaminação da amostra pelos dedos, luvas ou outros materiais. Segura-se o frasco verticalmente próximo à base e efetua-se o enchimento deixando um espaço vazio de aproximadamente 2,5 à 5 cm do topo, para posterior homogeneização da amostra antes de iniciar a análise. Fecha-se imediatamente o frasco após a coleta, fixando-se bem a tampa; identifica-se adequadamente a amostra no frasco ou na ficha de coleta. As amostras devem ser acondicionadas em caixas isotérmicas contendo gelo (resfriamento temporário) e encaminhadas ao laboratório. O tempo entre a coleta e entrega da mostra no laboratório não deve exceder 12 horas. - Profa. Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento -


32

b) Coleta em poços freáticos: Em poços equipados com bombas manuais ou mecânicas, bombeia-se deixando escorrer durante aproximadamente 5 minutos. Realiza-se a desinfecção da saída da bomba, deixando-se escorrer novamente a água antes da coleta das amostras. Em poços sem bombas, a amostragem deve ser feita diretamente no poço, utilizando-se frascos estéreis. As amostras não devem ser coletadas da camada superficial da água, para evitar contaminação com espumas ou com materiais das paredes do poço.

c) Coletas de águas superficiais (rios, lagos etc.): Quando as amostras forem coletadas diretamente de um corpo receptor, procura-se selecionar pontos de amostragem representativos, evitando-se a coleta de amostras em áreas ou locais próximo às margens. A coleta em águas superficiais pode ser feita manualmente ou através de equipamentos.

2.1.4 TÉCNICAS DE COLETA DE AMOSTRA As técnicas de coleta para as diversas amostras de água de torneira e de poço estão descritas a seguir.

- Profa. Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento -


33

a) Água de torneira

►

Caso a torneira apresente alguma sujidade na sua parte

exterior, limpar a mesma.

►

Abrir a torneira, deixando correr bastante água. Isto é

necessário, porque alguns coliformes podem se multiplicar na água retida durante algum tempo na canalização ou se multiplicar nas fibras de juta que servem para vedar a canalização.

► Abrir

a torneira à meia seção (tempo de operação 1 minuto).

► Rapidamente

abrir o frasco esterilizado e, no menor tempo

possível, coletar a amostra. Nesta operação é muito importante não tocar no bocal do frasco e não deixar que a tampa do frasco toque em qualquer superfície (tempo de operação 30 segundos).

► Ao

coletar, encher o frasco com ¾ de seu volume, para poder

tornar possível no laboratório a homogeneização da amostra.

► Após

a coleta da amostra, fechar o mais rapidamente possível

o frasco esterilizado e levar ao laboratório para a realização das análises.



34

b) Água de poço Se houver torneira ou outra canalização, proceder como item anterior. Quando não houver, amarrar um barbante no frasco de coleta, tendo sempre todos os cuidados de assepsia, ou flambar um balde interno e externamente antes de coletar a água.

►

Descer lentamente o cordão sem permitir que o frasco toque nos lados do poço.

Submergir o frasco, permitindo que se obtenha amostras mais profundas. ►

c) Mananciais superficiais

► Observar

o sentido da correnteza e a

profundidade mínima de 30 cm.

Após as coletas, as amostras devem ser processadas em tempo adequado.



35

2.1.5 TÉCNICA DOS TUBOS MÚLTIPLOS (NMP/100ML) 2.1.5.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS A determinação do Número Mais Provável (NMP), de coliformes em uma dada amostra é efetuada a partir da técnica de tubos múltiplos. Esta por sua vez consiste na inoculação de volumes decrescentes da amostra, em meio de cultura adequado ao crescimento dos microrganismos pesquisados, sendo cada volume inoculado em uma série de tubos. A técnica do Número Mais Provável (NMP) é um meio de estimar a densidade de microrganismos viáveis em água e alimentos. O NMP está diretamente relacionado à freqüência de ocorrência de uma série de resultados positivos que são mais prováveis ocorrer quando um certo número de organismos estão presentes numa amostra. A técnica está baseada no conhecimento do tipo de distribuição das bactérias em uma amostra e na teoria das probabilidades. O NMP é aquele número de organismos por unidade de volume que segundo a teoria estatística teria maior probabilidade de representar o número real de microrganismos do que qualquer outro número de amostra analisada. São várias as aplicações da técnica do NMP. A principal é a utilização na pesquisa de coliformes na água e alimentos. Por essa esta técnica, pode-se obter informações sobre a população presuntiva de coliformes (Teste Presuntivo), sobre a população real de coliformes (Teste Confirmativo) e sobre a população de coliformes de origem fecal (Coliformes Fecais ou Termotolerantes). A determinação do NMP de coliformes totais e fecais e Escherichia coli, segue o método recomendado pelo Standard Methods for the Examination of water and Wastewater -APHA/American Public Health Association (1992).

2.1.5.2 MATERIAL a) Meios de Cultura Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial de microrganismos. Estes meios fornecem os princípios nutritivos indispensáveis do crescimento microbiano. As exigências nutricionais estão relacionadas a uma fonte de carbono, de energia e de sais minerais. Alguns microrganismos também necessitam de outros fatores de crescimento que são substâncias que eles não podem sintetizar, tais como: vitaminas, aminoácidos, etc. E ainda o pH e o grau de umidade devem ser observados nos meios de cultura. - Profa. Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento -


36

Os meios de cultura usados para a colimetria de água para consumo são: •

Caldo Lactosado.

•

Caldo Verde Brilhante e Bile (CVBB)

•

Caldo E.C.

Para a identificação bioquímica das colônias suspeitas de Escherichia coli utiliza-se: •

Agar EMB (Agar Eosina Azul de Metileno) – plaqueamento seletivo;

•

Agar TSA (Agar Triptona Soja) para o isolamento das colônias;

•

Agar Citrato de Simmons;

•

Caldo VM – VP (Teste do Vermelho de Metila e Voges-Proskauer);

•

Água Triptonada (Teste do Indol);

As soluções usadas para a realização dos testes bioquímicos: •

Teste de Voges-Proskauer ( α- Naftol e Hidróxido de Potássio - KOH);

•

Teste do Indol (Reagentes de Kovacs - p – Dimetilaminobenzaldeído);

•

Teste do Vermelho de Metila (Reagente Vermelho de Metila).

b) Equipamentos e vidrarias •

Estufa bacteriológica a 35°C;

•

Banho-maria regulado a 45°C;

•

Bico de Bunsen;

•

Alça de platina ou níquel cromo;

•

Frascos de coleta esterilizados;

•

Tubos de ensaio;

•

Tubos de Durham;

•

Pipetas esterilizadas (10mL e 1mL).



37

2.1.5.3 METODOLOGIA a) Teste Presuntivo Visa detectar a presença de fermentadores de lactose, especialmente do grupo coliforme. Células estressadas por tratamentos térmicos, congelamentos, etc., podem ser recuperadas nessa fase.

Princípio: o teste consiste na semeadura de volumes determinados da amostra em séries de tubos contendo Caldo Lactosado (CL), onde a lactose é utilizada como fonte de carbono. Os tubos inoculados são incubados a uma temperatura de 35 ± 0,5ºC, durante 48horas, ocorrendo um enriquecimento de organismos fermentadores da lactose. A acidificação, com a produção de gás, que é evidenciado no tubo de Durhan, é prova presuntiva positiva para a presença de bactérias do grupo coliformes (Apêndice A).

b) Teste Confirmativo Consiste na transferência de cada cultura com resultado presuntivo positivo para tubos contendo o Caldo Verde Brilhante e bile 2% (CVBB) com o auxílio de uma alça de platina. A incubação será efetuada também a uma temperatura de 35 ± 0,5°C durante 48 horas. O meio utilizado possui dois inibidores (sais biliares e verde brilhante) do crescimento da microbiota acompanhante dos coliformes e a lactose como o único carboidrato. Então, a produção de gás, a partir da fermentação da lactose presente neste meio, é prova confirmativa para a presença de bactérias do grupo coliforme (coliformes totais) (Apêndice A).

c) Determinação de Coliformes Fecais ou Termotolerantes O teste baseia-se na transferência de cada cultura com resultado positivo para coliformes totais (acidificação do meio com produção de gás, após 48 horas a 35 ± 0,5°C), no Caldo Verde Brilhante, para tubos contendo o caldo E.C., que serão incubados durante 24 horas a 44,5 ± 0,2ºC em banho-maria. O resultado será positivo quando houver produção de gás a partir da fermentação da lactose contida no meio (Apêndice A). O Número Mais Provável de coliformes totais e fecais é dado através da Tabela do NMP/100mL (Apêndice B). - Profa. Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento -


38

d) Escherichia coli (Identificação) Todas as culturas positivas no caldo E.C. são repicadas para Agar EMB, com auxilio da alça de platina ou de níquel cromo, fazendo estrias (por esgotamento). Cada tubo positivo em caldo E.C. corresponderá a uma placa de EMB, identificada, para perfeita correspondência. Incubar a 35ºC por 24 horas. Passado este período, verificar o crescimento de colônias típicas de E. coli, isto é, colônias de 2 a 3mm de diâmetro, com brilho metálico esverdeado ou com centro escuro abrangendo praticamente toda a colônia.

Agar EMB com colônias típicas de Escherichia coli◄ De cada placa, correspondente a cada tubo, repicar de duas a três colônias para tubos contendo o Agar Tripticase Soja (Agar TSA) inclinado. Incubar por 24 horas a 35 ºC. Efetuar em cada cultura em Agar TSA (cepas), as seguintes provas bioquímicas: Indol, Vermelho de Metila (VM), Voges Proskauer (VP), Citrato de Simmons. Esta série de testes é chamada de IMVIC. Considerar a cultura positiva para E. coli, quando forem obtidos os seguintes resultados para o IMVIC. Considerar positivo o tubo de caldo E.C. para E. coli, quando pelo menos uma cultura dele proveniente for positiva no teste de IMVIC (Apêndice C). A Tabela 2B mostra a diferenciação dos coliformes em água.



39

Tabela 2B. Diferenciação dos coliformes da água. Indol

VM

VP

Citrato de Simmons

Tipo

+ -/+ +/-

+ + + +/-

+ +

+ + +

Escherichia coli Escherichia coli atípica Citrobacter Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae

Fonte: Jay, 2005.

Por fim, verificar na tabela o NMP (Tabela de Hoskin), correspondente aos tubos de caldo E.C. positivos para a presença de coliformes fecais e expressar o resultado em

NMP/100 mL. Nota: A Portaria Nº 518 de 25 de março de 2004 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), estabelece como padrão para potabilidade de águas para consumo, ausência de coliformes totais e fecais.

e) Contagem Padrão de Bactérias Heterotróficas A contagem das bactérias heterotróficas na água é definida como o número total de bactérias que podem crescer quando incubadas em Agar Plate Count a 37ºC por 48 horas. É importante que a densidade de bactérias heterotróficas seja mantida sob controle, pois densidades muito elevadas de microrganismos na água podem causar riscos à saúde dos consumidores, pois algumas bactérias podem atuar como patógenos oportunistas e deterioração da qualidade da água e alimentos, ocasionando odores e sabores desagradáveis, podendo produzir limo ou películas. Além disso, alguns desses microrganismos, quando presentes em número elevado, podem impedir a detecção de coliformes. A determinação da densidade de bactérias heterotróficas em águas é um importante instrumento auxiliar no controle bacteriológico para:


A NÁLISES BACTERIOLÓGICAS DA ÁGUA •

40

Avaliação das condições higiênicas e de proteção de poços, fontes, reservatórios, piscinas e sistemas de distribuição de água para consumo humano;

•

Avaliação da eficiência das diversas etapas de operação de estações de tratamento de água na remoção de bactérias;

•

Estimativa da biomassa de bactérias heterotróficas, presentes em corpos de água;

•

Determinação das possíveis causas de deterioração da qualidade de água;

•

Avaliação das condições higiênicas e da eficiência de operação de piscinas;

•

Avaliação das condições higiênicas e de sistemas de envasamento de águas minerais e potáveis de mesa.

Dentro deste grupo de bactérias estão espécies gram-negativas, aeróbias e anaeróbias facultativas pertencentes aos seguintes gêneros: Pseudomonas, Aeromonas, Klebsiella, Flavobacterium, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Acinetobacter, Proteus, Alcaligenes e Escherichia. Alguns membros deste grupo são patógenos oportunistas, mas pouco se conhece

o efeito das altas contagens de bactérias heterotróficas na saúde humana. Essas bactérias podem ainda interferir com a detecção de coliformes nas amostras de água.

Material: •

Meio de Cultura: Plate Count Agar (Agar Padrão para Contagem).

•

Equipamentos e vidrarias: Estufa bacteriológica; Contador de colônias; Bico de Busen; Placas de Petri esterilizadas; Pipetas (1mL e 2mL).

Princípio do método : A determinação da densidade de bactérias heterotróficas em uma amostra baseia-se no princípio de que, definindo condições de nutrição, temperatura e tempo de incubação, se houver células viáveis na água, que possam se desenvolver nas condições estabelecidas haverá formação de colônias, que serão visualizadas após o período de incubação determinado.



41

Para isso, volumes de 1mL da amostra devem ser pipetados assepticamente e inoculados em placas de Petri com posterior adição do meio de cultura fundido Agar Plate Count (Agar Padrão para Contagem / Agar PCA) através da técnica de Pour Plate (inoculação em profundidade). Após o período de incubação (35°C), é feita a contagem das unidades formadoras de colônias de bactérias, com auxílio de um contador de colônia, sendo o resultado expresso em UFC/mL.

Nota: Segundo a Portaria Nº 518 de 25 de março de 2004 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), o padrão estabelecido para potabilidade de águas para consumo em relação à contagem de bactérias heterotróficas é de 500 UFC/mL. Se ocorrer número superior ao recomendado, deverá ser providenciada imediata recoleta e inspeção do local; confirmada e/ou constatada a irregularidade, deverão ser tomadas providências para sua correção (desinfecção). O Apêndice D mostra o esquema para contagem padrão de placas em bactérias heterotróficas.

Nota: Na análise bacteriológica da água, além dos coliformes outros gêneros de bactérias são pesquisadas tais como: Pseudomonas e Enterococcus.

2.1.6 MÉTODO PARA DETECÇÃO DE COLIFORMES TOTAIS E ESCHERICHIA COLI USANDO MEIOS COM ONPG E MUG

A 19a edição do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA/AWWA/WEF, 1995) traz descrição de um método rápido para determinação de coliformes totais e E. coli usando substratos definidos. Este método utiliza substratos hidrolisáveis para a detecção simultânea de enzimas dos coliformes totais e E. coli. Quando assim procedemos, o grupo de coliformes totais é definido como todas as bactérias possuindo a enzima β-D-galactosidase, que cliva o substrato cromogênico ONPG (orto-nitrofenil-β-D-galactopiranosideo) resultando na liberação do cromógeno de cor amarela, denominado ortonitrofenol. A bactéria E. coli é aquela que dá uma resposta positiva igual para os coliformes totais e ainda possui a enzima β-glucoronidase, a qual cliva um substrato fluorogênico MUG - Profa. Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento -


(4-metilumbeliferil

β-D-glucoronídio),

42

resultando

na

liberação

do

fluorógeno-4-

metilhumbeliferona que fluoresce sob a luz ultravioleta. Estes testes podem ser usados nas provas de tubos múltiplos ou Presença/Ausência P/A (amostra única de 100mL).

Procedimento: A) Tubos múltiplos Assepticamente adicionar 10mL da amostra de água em cada tubo, tampar e agitar bastante para dissolver o meio. Incubar a 35 °C±0,5°C por 24 horas.

B) Presença/ausência (P/A) Assepticamente adicionar o substrato enzimático pré-pesado a 100mL da amostra de água num frasco de vidro não fluorescente. Em ambos os casos misturar completamente para dissolver. Incubar a 35 °C±0,5°C por 24 horas.

Interpretação: a) Bactérias coliformes totais Decorridos às 24 horas de incubação, examinar os tubos ou frascos, por uma mudança na cor. Quando o substrato é ONPG, este é hidrolisado pela enzima bacteriana para dar origem ao amarelo ortonitrofenol; esta resposta cromogênica é uma reação positiva para coliformes totais. As amostras são negativas para coliformes totais se a coloração amarela não for observada.

b) Escherichia coli Os tubos ou frascos positivos para coliformes totais serão examinados para fluorescência usando lâmpada de ultravioleta de longo comprimento de onda (366nm). A presença da fluorescência é um teste positivo para E. coli. No caso do procedimento do NMP, - Profa. Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento -


43

calcular o valor do NMP para coliformes totais e E. coli a partir dos tubos positivos, como feito pelo método tradicional. No caso do procedimento P/A, relatar os resultados como presente ou ausente em 100mL da amostra.

Resultados: A verificação da fluorescência deve ser procedida em área com pouca luz, pois o excesso de iluminação mascara a presença de fluorescência. Lâmpadas ultravioletas germicidas, por serem de pequenos comprimentos de onda, não são adequadamente para este propósito. A enzima β-glucoronidase é produzida por 97% do total de cepas de E. coli. Na família Enterobacteriaceae, somente E. coli e algumas espécies de Shigella sp. e Salmonella sp. e poucas do gênero Yersinia sp. produzem aquela enzima. Como o método que utiliza o MUG, não depende da produção de gás para uma leitura positiva, ele é útil para detectar cepas de E. coli anaerogênicas (não produtoras de gás).

►1º

passo: Adicione o reagente à amostra e leve a estufa bacteriológica por 24 horas a uma temperatura de 35ºC.

►2º

passo: Leia os resultados: Incolor = negativo Amarelo = coliformes totais Amarelo/fluorescente = E. coli



44

A Tabela 3B mostra dados referentes às análises microbiológicas para águas oriundas de diferentes fontes.

Tabela 3B. Análises microbiológicas para águas de diferentes fontes. Tipos de água

Técnica

Microrganismos pesquisados

Tubos Múltiplos

Coliformes Totais e Termotolerantes (NMP/100mL); Pseudomonas aeruginosa . (NMP/100mL) e Contagem Padrão em Placas (Agar PCA) (UFC/mL)

Torneira, cisternas e caixas d’água

Tubos Múltiplos

Coliformes Totais e Termotolerantes (NMP/100mL) e Contagem Padrão em Placas (Agar PCA) (UFC/mL).

Piscina

Tubos Múltiplos OBS: Adicionar 0,1mL de solução 1,8% de Tiossulfato de Sódio (Na2S2O3) aos frascos de coleta antes de autoclavar.

Coliformes Totais e Termotolerantes (NMP/100mL), Contagem Padrão em Placas (Agar PCA) (UFC/mL), Contagem de Staphylococcus aureus (UFC/mL), Pseudomonas aeruginosa .(NMP/100mL)

Poço

Mineral

Água de praia

Usar uma série de 10 tubos de Lactosado Duplo , inoculando 10mL da amostra em cada tubo.

Coliformes Totais e Termotolerantes (NMP/100mL); Pseudomonas aeruginosa . (NMP/100mL), Contagem Padrão em Placas (Agar PCA) (UFC/mL), Enterococcus sp. (UFC/mL) e Clostridium sp. (UFC/mL)

Diluir as amostras em água Coliformes Termotolerantes (NMP/100mL), marinha sintética e usar Contagem e identificação de Escherichia coli; Técnica de Tubos Enterococcus sp. (NMP/100mL) Múltiplos.

3 ENUMERAÇÃO DO NMP/100ML DE E NTEROCOCCUS SP. As bactérias do gênero Enterococcus são classificadas primariamente como cocos Gram positivos entéricos, catalase negativa. São encontradas no meio ambiente em diversos locais como: solo, alimentos, água, plantas, animais, pássaros e insetos. Enterococcus sp.◄



45

Em humanos e em outros animais, os enterococos fazem parte da flora bacteriana normal do trato gastrintestinal. As espécies mais comumente encontradas em humanos são: Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium.

Material: Meios de Cultura: Caldo azida dextrose para o cultivo e o Agar m- Enterococcus para o plaqueamento seletivo. O restante do material, equipamentos e vidrarias são idênticos ao usado para a determinação de coliformes totais.

Métodos: Prova Presuntiva: •

Homogeneizar a amostra de água com a agitação do frasco;

•

Inocular volumes de 10mL em uma série de três tubos contando o caldo azida em concentração dupla; em seguida inocular volumes de 1mL e 0,1mL em duas séries de três tubos contando o caldo azida em concentração simples respectivamente (Técnica dos tubos múltiplos).

•

Incubar os tubos inoculados a 35°C por 24 horas. Observar se há turvação nos tubos. Caso negativo, fazer nova leitura com 48 horas.

Prova Confirmativa: •

Submeter todos os tubos de caldo azida dextrose com turvação a prova de confirmação.

•

Estriar com auxílio de uma alça de platina uma porção do crescimento de cada tubo positivo sobre uma placa de Petri contendo o meio seletivo Agar m Enterococcus.

•

Incubar as placas invertidas a 35°C por 24 horas. Colônias pretas amarronzadas com halos marrons confirmam a presença de enterococos fecais.

Agar m- Enterococcus - colônias de Enterococcus sp.◄ - Profa. Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento -


46

Após o período de incubação, a partir dos tubos positivos (turvos), serão feitas estrias com auxílio de uma alça de platina (técnica de esgotamento) em placas contendo Agar m Enterococcus

(teste confirmativo). Colônias pequenas de cor marrom são típicas de

Enterococcus sp.

O Apêndice E mostra o esquema para pesquisa de Enterococcus sp. em água (NMP/100mL). Usa-se a Tabela do NMP para o cálculo do NMP/100mL de Enterococcus (Apêndice B).

4 TESTE PARA A PRESENÇA DE PSEUDOMONAS SP. É um gênero de microrganismos pertencentes à família Pseudomonadaceae, que compreende mais de 100 espécies. São bastonetes curtos e Gram-negativos, autóctones de ambientes aquáticos, são móveis, aeróbios estritos e não formadoras de esporos. Podem ser encontradas em vários ambientes diferentes, tais como solo, água, plantas e tecido de animais. Ocorre em freqüência baixa também na pele, garganta e fezes das pessoas sadias. Sobrevive a temperaturas que variam entre 4ºC e 42ºC. Em cultura produz um pigmento esverdeado. Pseudomonas sp.◄

A espécie Pseudomonas aeruginosa tem sido a responsável pela maioria dos casos de doença infecciosa no homem. Trata-se de um microrganismo oportunista, isto é, causa doença somente em condições especiais, quando o organismo humano está debilitado por algum motivo, como, por exemplo, processos cirúrgicos e queimaduras. Nesses casos, esse microrganismo pode causar bacteremias bem severas, infecções urinárias e respiratórias, pneumonias, meningites, endocardites, e diversos outros tipos de infecção. Além disso, Pseudomonas aeruginosa,

bem como outras espécies de Pseudomonas, apresentam grande

importância para a indústria de alimentos, pois são microrganismos causadores de deterioração (produção do muco superficial característico de carnes e produtos cárneos deteriorados). Usar Técnica dos tubos múltiplos para a determinação do NMP/100mL. - Profa. Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento -


47

Material: Meios de Cultura: Caldo Asparagina, Caldo Acetamida, Agar Asparagina, Agar Cetrimide.

Procedimento: Teste Presuntivo: •

Inocular 3 tubos com 10mL, 3 com 1mL e 3 com 0,1mL da amostra, em caldo asparagina em concentração dupla para 10mL da amostra e concentração simples para volumes de 1mL ou menos.Incubar os tubos a 35°C por 48 horas.

•

Após o período de incubação, examine os tubos num quarto escuro sob luz ultravioleta de comprimento de onda longo (não germicida). A presença de pigmento fluorescente esverdeado constitui um teste presuntivo positivo para Pseudomonas.

•

Confirmar os tubos positivos, inoculando 0,1mL da cultura em caldo acetamida. Uma reação positiva confirmatória é dada pelo desenvolvimento do alto pH indicado pela cor púrpura ou rosa intenso após 24-48 horas de incubação a 35°C.

•

Computar e registrar o NMP pela Tabela do NMP (Apêndice B).

O Apêndice F mostra o esquema para pesquisa de Pseudomonas sp. em água (NMP/100mL).



48

5 BALNEABILIDADE DAS PRAIAS O programa de monitoramento da balneabilidade das praias deve atender as especificações da Resolução N 375 de 17 de março de 2005 do Conselho Nacional do

Meio Ambiente (CONAMA), que define critérios para a classificação das águas destinadas a balneabilidade (recreação de contato primário). O monitoramento deve ser realizado nos pontos de coleta, distribuídos ao longo da faixa de praias litorânea das cidades, onde são coletadas amostras de água com freqüência semanal

para

posterior

análise

bacteriológica.

No

estabelecimento dos critérios para a escolha dos pontos ou estações, deve-se considerar entre outros: proximidade do deságüe de rios, riachos e galerias pluviais, densidade populacional e freqüência dos banhistas. Toda semana deve ser fornecido o Boletim de Balneabilidade das Praias, com dados de colimetria. Os dados obtidos durante certo período de tempo, servem para avaliar a evolução temporal da qualidade das águas das praias. A Resolução N ° 357 (CONAMA), estabelece critérios para a classificação das águas doces, salobras e salinas destinadas à balneabilidade (recreação de contato primário) terão sua condição avaliada nas categorias próprias e impróprias. As águas consideradas próprias poderão ser subdivididas nas seguintes categorias: a) Excelente: quando em 80% ou mais de um conjunto de amostras obtidas em cada uma das cinco semanas anteriores, coletadas no mesmo local, houver, no máximo,

250 coliformes fecais (termotolerantes) ou 200 Escherichia coli ou 25 Enterococcus por 100mL.

b) Muito Boa: quando em 80% ou mais de um conjunto de amostras obtidas em cada uma das cinco semanas anteriores, coletadas no mesmo local, houver, no máximo, 500 coliformes fecais (termotolerantes) ou 400 Escherichia coli ou 50 Enterococcus por 100mL.

c) Satisfatória: quando em 80% ou mais de um conjunto de amostras obtidas em cada uma das cinco semanas anteriores, coletadas no mesmo local, houver, no - Profa. Dra. Adenilde Ribeiro Nascimento -


49

máximo, 1000 coliformes fecais (termotolerantes) ou 800 Escherichia coli ou 100 Enterococcus por 100mL.

Nota: Os padrões referentes aos enterococos aplicam-se somente às marinhas.

As águas serão consideradas impróprias quando for verificada uma das seguintes ocorrências: a) Não atendendo aos critérios estabelecidos para as águas próprias; b) Valor obtido na ultima amostragem for superior a 2500 coliformes fecais (termotolerantes) ou 2000 de Escherichia coli ou 400 Enterococcus por 100mL. c) Incidência elevada ou anormal, na região, de enfermidades transmissíveis por via hídrica, indicada pelas autoridades sanitárias. d) Presença de resíduos ou despejos, sólidos ou líquidos, inclusive esgotos sanitários, óleos, graxas e outras substâncias capazes de oferecer riscos à saúde ou tornar desagradável a recreação. e) O pH< 6,0 ou pH>9,0 (águas doces), à exceção das condições naturais. f) Floração de algas ou outros organismos até que se comprove que não oferecem riscos à saúde humana.

Nota: Nas praias ou balneários sistematicamente impróprios, recomenda-se a pesquisa de organismos patogênicos. O Apêndice G mostra o esquema para determinação do NMP de Coliformes a 45ºC em águas de praia (balneabilidade).


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APÊNDICES

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Apêndice A. Enumeração (NMP/100mL) de coliformes totais e a 45ºC.

10ml

0,1ml

1ml

Caldo Lactosado

ESTUFA 35ºC/24-48h

2 alçadas

2 alçadas Teste Confirmativo coliformes totais (Caldo VB)

Teste Confirmativo coliformes a 45ºC (Caldo E.C.) BANHO-MARIA 45ºC/24h

Gás (+) Presença de coliformes a 45ºC

Gás (-) Ausência de coliformes a 45ºC

TESTE BIOQUÍMICO Teste API-20E

ESTUFA 35ºC/24-48h

Gás (+) Presença de coliformes totais

Gás (-) Ausência de coliformes totais

52

Apêndice B. Tabela do Número Mais Provável (NMP), para séries de três tubos.

Número de tubos positivas nas diluições

Número de tubos positivos nas diluições

10 mL

1 mL

0,1 mL

NMP/100mL

10 mL

1 mL

0,1 mL

NMP/100mL

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

0 1 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3

0 0 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

3 3 6 9 3 6.1 9.2 12 6.2 9.3 12 16 9.4 13 16 19 3.6 7.2 11 15 7.3 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3

0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

9.1 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 2400

Fonte: American Public Health Association (APHA, 1992).

53

Apêndice C . Identificação de Escherichia coli

Caldo E.C., presença de gás (+) para coliformes a 45ºC.

Agar Eosina Azul de Metileno (Agar EMB) com crescimento de E. coli.

Isolamento em Agar Tripcase Soja (Agar TSA)

Série Bio química

INDOL

E. coli

(+)

54

Apêndice D. Esquema para contagem padrão em placas de bactérias heterotróficas.

A M O S T R A

(Água)

1ml

1m l

P l at e C o u n t A g a r (Agar PCA)

INCUBAÇÃO 37ºC/48H

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Apêndice E. Esquema para pesquisa de Enterococcus sp. em água (NMP/100mL).

TESTE PRESUNTIVO

Amostra de água

10ml

1ml

0,1ml Caldo Azida (concent. simples e dupla)

(D)

(S)

(S)

ESTUFA 35ºC/48 horas

TESTE CONFIRMATIVO

10ml

1ml

0,1ml

Tubos (+) (Turvos)

Agar m- Enterococcus

ESTUFA 35°C/24 horas

Identificação Bioquímica

Isolamento das colônias típicas

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Apêndice F. Esquema para pesquisa de Pseudomonas sp. em água (NMP/100mL)

Amostra de água

10ml

1ml

0,1ml Teste presuntivo Caldo Asparagina

Conc. ( D )

Conc. ( S )

Conc. ( S )

Teste presuntivo positivo (presença de uma fluorescência esverdeada na luz ultravioleta)

Teste confirmativo Caldo Acetamida

ESTUFA 37ºC/48 horas

Teste confirmativo positivo em caldo acetamida para a presença de Pseudomonas aeruginosa (cor púrpura ou rosa intenso)

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Apêndice G. Enumeração de Coliformes a 45ºC em Águas de Praia (Balneabilidade).

AMOSTRA 10 mL 90 mL Água Marinha Sintética

10mL

0,1mL

1mL

ESTUFA a 35ºC 24/48 horas Tubos positivos turvação com produção de gás no tubo de Durham 2 alçadas Caldo E.C.

Coliformes a 45ºC

Banho-Maria 45ºC/24 horas

Gás (-) Ausência de coliformes fecais

Gás (+) Presença de coliformes fecais

Analises Fisico-Quimicas e Bacteriologicas Da Agua_Apostila

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