Manual Para Técnicas de Biología Molecular

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Técnicas de Lab usadas en

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COMPARACI+ôN DE TRES

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Universidad Autónoma de iudad !u" Instituto de iencias $iomédicas lase% $iología molecular &ro'esor% !osé Luis astellanos

Alumno% Luis Luis Roberto Roberto (edrano (edrano )ine#, )ine#, *

(anual de uso de técnicas de biología molecular.

Master your semester with Scribd & The New York Times Special offer for students: Only $4.99/month.

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Agradecemos Agradecemos al pro'esor pro'esor !osé !osé Luis astellan astellanos os por inculcar inculcar las técnicas y la importancia de a/ biología molecular a generaciones de 'uturos médicos. 0 Luis Roberto et al.



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Agradecemos Agradecemos al pro'esor pro'esor !osé !osé Luis astellan astellanos os por inculcar inculcar las técnicas y la importancia de a/ biología molecular a generaciones de 'uturos médicos. 0 Luis Roberto et al.



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una pentosa 3deso2irribosa en el ADN y ribosa en el ARN4, una base nitrogen 3adenina, guanina, citosina, timina y uracilo4 y un grupo 'os'ato. &ara &ara mane7a mane7arr muestr muestras as con la 'inali 'inalidad dad de e2trac e2tracci ción ón de "cidos "cidos nuc e2isten precauciones 8ue se deben tomar dentro del laboratorio. Precauciones:

&ara traba7ar con "cidos nucleicos es importante mantener un "rea limpia p

evitar cual8uier tipo de contaminación. contaminación. 9e recomienda recomienda usar "cido clor6ídrico 3*:;4

etanol 3=:;4 para limpiar las super'icies de su "rea de traba7o *. Al igual, se re8uie

usar guantes para protección personal y usar instrumentos estériles *. 9e recomie

someter el material a radiación ultravioleta para degradar "cidos nucleicos presentes Objetivo:

12traer "cidos nucleicos 3en 'orma de ADN4 de la muestra obtenida. Procedimiento(s): Extracción de ADN por Lisis Alcalina 2.

*.0recimiento de bacterias%

Master your semester with Scribd 0 9e agreg agregan an de >: ?L de bacteri bacterias as de & The New York Times



ReadupFree Foron 30this Days to vote titlepor el pl"sm trans'ormadas E. Sign coli trans'ormadas 

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Cancel anytime. p$R p$R@>> @>> 3mol 3moléc écul ula a con con ADN circ circul ular ar44 y se depo deposi sita tara ran n en @ ml de med med Special offer for students: Only $4.99/month.

supleme suplementad ntado o con ampicilin ampicilina a 3*:: ?L
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6ielo 'rapé durante  minutos y agregar *: ?L de acetato de sodio, mantener e 6ielo. Agitar en vorte2 y regresar al 6ielo  minutos. 0 entri'ugar a *C,::: g por @ minutos. Agregar :. mL de etanol, agitar

inversión y mantener a 0=: para precipitar el ADN. entri'ugar a *C,::: g por

minutos y decantar el sobrenadante para poder lavar el pelletH con * mL de eta 3=:;4.

0 entri'ugar a *C,::: por  minutos, decantar el sobrenadante y elimina

etanol por aspiración con vacío. Al pelletH se le agrega >:0: ?L de E1 pG : 3 aporta a la estabilidad del ADN para conservación a largo pla#o. Corte del plásmido con enzimas de restricción 3:

Las en#imas de restricción son en#imas 8ue cortan la cadena de ADN con tipos de cortes, co6esivos 3es un corte asimétrico4 y romos 3corte recto4.

0 &reparar la solución con ADN, RNAsa A, 1n#ima de restricción, $u''er You're Reading a Preview digestión y ddG >F. Incubar sin agitación a @= por lo menos @: minutos. Agregar * Unlock full access with a free trial.

d e:.> ( 1DEA para desactivar la en#ima de restricción.

Download With FreeelTrial 0 Eomar la muestra de digestión y agregarle bu''er, al igual agregar bromuro

sodio. 9e prepara e8uipo para electro'oresis. 1n los po#os del gel se coloca A

cortado y ADN sin cortar, al reali#ar la electro'oresis se obtiene bandas para compa Master your semester with Scribd  Read Free Foron 30this Days Sign up to vote title unas con ausencia y otras con presencia de en#imas.  & The New York Times  Useful  Not useful NFEA% el bromuro de sodio es un compuesto altamente reactivo y canceríge Special offer for students: Only $4.99/month.

se debe mane7ar con protección.

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An"lisis%

*.0 &ara determinar el nmero de c 6ec6os por la en#ima, se obs resultado de las bandas despué electro'oresis. >. 0 La suma de los pesos molecu debe dar apro2imadamente igua ADN intacto.

Purificación de ADN por centrifuación en columna !.

*. 0 &reparación de la columna% You're Reading a Preview *.0 Desprender la tapa del tubo para Unlock full access with a free trial. microcentrí'uga de *. mL al ras. Download With >. Free Trial 0 Desprender la tapa del tupo del


microcentrí'uga de :. mL y con una 6acer un ori'icio en el 'ondo del mism 

Read Free Foron 30this Days Sign up to vote title @. B La punta amarilla deber" tener  Useful Not useful   empa8uetado 'ondo un peda#o de Cancel al anytime. algodón. 9e coloca el tubo de :. mL

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de restricción en el ori'icio m"s amplio de la punta amarilla. ongelar dispositiv

0=: por * minutos.

0 entri'ugar por *>,::: g por *: minutos y recuperar el lí8uido obtenido e tubo tipo 1ppendor' de *. mL. &ara precipitar el ADN, medir el volumen del lí8uido

una micropipeta. Agregar un volumen de acetato de sodio @( igual a la décima p

del volumen medido y * mL de etanol absoluto. Agitar por inversión y congelar el tub 0=:  por *:0@: minutos.

0 entri'ugar el tubo a *C,::: 2 g por *: minutos. 9e descarta el sobrenada por aspiración con vacío. Resuspender el precipitado en *:0: con E1 para cargar gel de agarosa. 0 1lectro'oresis. Resultado:

&ara observer AND puri'icado, s You're Reading a Preview ver las bandas , + y = en donde Unlock full access with a freeuna trial.banda bien de'inida. La ban para control de peso molecular, Download With Free Trial 8ue el carril C y  no tienen mue


1l carril > y @ es ADN no puri'ica 6ace la comparación entre el pu  Read Free Foron 30this Days Sign up to vote title

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1n#imas 8ue modi'ican "cidos nucleicos. La unión internacional de bio8uímica y biología molecular crea un sistem

nomenclatura para en#imas, agrup"ndolas por reacción 8ue catali#an. &or e7emplo, *.*. 3en#ima o2idoreductasa4  *.0 1 *.0.0, F2ido0reductasas, 0 1l código 1 * se re'iere a en#imas 8ue catali#an reacciones de reducción. A8uellas en#imas 8ue catali#an la trans'erencia de electrones ent donante y un receptor. 1ntre las en#imas principales est"n +, =%

J Des6idrogenasas% sustraen "tomos de 6idrógeno y los trans'ieren a receptor 8ue no es

o2ígeno. You're Reading a Preview Unlock full access with a free trial.

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J Amino o2idasa% o2idan sustratos mediante el o2ígeno, recep

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J Gidro2ilasas% catali#an 'unciones 6idro2ilo en sustratos utili o2ígeno como el donante.

>.0 1 >.0.0, Erans'erasas, 0 1l código 1 > se re'iere a en#imas 8ue catali#an la trans'erencia de un 'uncional de un donante a un receptor. 1ntre las en#imas principales est"n

+, =

%

J Kuinasas% catali#an reacciones de trans'erencia de grupos 'os'atos. You're Reading a Preview Unlock full access with a free trial.




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@. 0 1 @.0.0, Gidrolasas,

0 1l código 1 @ se re'iere a en#imas 8ue catali#an la ruptura de enlaces co participación de moléculas de G >F.

C.

0

1

C.0.0,

Liasas,

0 1l código 1 C se re'iere a en#imas 8ue catali#an reacciones las cua Reading a Preview producen la adición o sustracciónYou're de grupos 8uímicos con doble enlaces. Unlock full access with a free trial.

J Gidratasa% a8uellas 8ue adicionan G >F con enlaces dobles. Download With Free Trial



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+. 0 1 +.0.0, Ligasas

0 1l código 1 + catali#an reacciones de unión de sustratos 8ue re8uieren energía aportada por el AE&.

You're Reading a Preview Unlock full access with a free trial.




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Concepto:

0 )el de agarosa % polisac"rido 'ormado por galactosas al'a y beta 8ue se e2 de algas. Procedimiento: - &reparar agarosa al *; en amortiguador N1E, adicionar >. mg
$encimida. undir agarosa a ebullición y de7ar en'riar.

0 )otear con una pipeta de &asteur la agarosa en un portaob7etos 6asta cub completamente y de7ar 8ue soldi'i8ue. &reparar muestras de ADN en di'er

concentraciones y gotear * ml de las muestras y de7ar apro2imadamente * 6r. observa 'inalmente la luminiscencia ba7o lu# ultravioleta.



Master your with "inciónsemester del ADN en los eles Scribd de aarosa. & The New York Times Concepto: Special offer for students: Only $4.99/month.


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0 $romuro de etidio -% el método m"s usado, el bromuro de etidio es un color

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"#cnica alternati$a para tinción del ADN% &'tains ALL(. Concepto:

You're Reading a Preview

Unlock full access with a free trial. ARN y proteínas 8ue con'orman la muestra. - unciona para colorear ADN,

Procedimiento:


0 9e prepara la concentración de 9tains ALLH al :.*; del colorant

'ormamida con un pG de =.@ a =.C. 9e de7a el gel en la solución y se de7a por * 6ora Master your semester with Scribd  Read Free Foron 30this Days Sign up to vote title 'inal, se destiMe con agua destilada.  & The New York Times  Useful  Not useful Cancel anytime.

Special offer for)ane*o students: de Onlymuestras $4.99/month.de ADN en eles nati$os de acrilamida.

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procedimiento

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derec6o

es

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tinción

por

medio



de

bromuro de etidio, procedimiento i#8uierdo es tinción por tinción de plata.

Electroforesis de prote+nas enYou're elesReading de poliacrilamida a Preview ,PA-E. Concepto:

Unlock full access with a free trial.

se 'orma - La matri# de poliacrilamida Download Withmediante Free Trial polimeri#ación de acrilamid bis0acrilamida, ocurriendo con un agente iniciador 3E1(1D4 y un catali#ado

proteínas del gel sometidas a un campo eléctrico en el estudio de electro' Master your semester with Scribd  Free Foron 30this Sign up to vote title presentan movimiento en base a su pesoRead molecular yDays carga  net & The New York Times useful  Useful  Not 0 1l it de traba7o di'iere a uno de electro'oresis con gel de agarosa, ya 8u Special offer for students: Only $4.99/month.

material de traba7o se presenta de

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1lectro'oresis. Concepto%

0 La electro'óresis *> es el estudio del movimiento de polímeros bioló

cargados sometidos a una carga eléctrica. 9e 6ace por medio de soporte de ge

principalmente el gel de agarosa , *@, producto obtenido de algas marinas 8ue 'uncio como matri# gelatinosa. 0 La separación de los 'ragmentos se debe a su peso molecular, su carga n

con'ormación del polímero. Los 'ragmentos con carga negativa se arrastran 6aci

carga positiva y los 'ragmentos pe8ueMos atraviesan con mayor velocidad5 al igua

se tiMe la muestra se ve como bandas *C. Usualmente, para obtener un apro2imado

peso molecular de la muestra se aplica en el primer po#o y al correr se compara con marcador de tamaMo molecular *.





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moverse el


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se

el

matri#

tiMe

se



del

e8uipo

puede

observa

bandas luminiscentes ba7o lu# UO. Una línea de ADN se llama banda.

Resultados:





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Concepto:

0 Eécnica en la 8ue se aplica un campo eléctrico a un soporte estabili#ante

ve# de 'luido4 y la muestra se deposita en una reducida #ona del mismo. 9e utili#a p separar componentes comple7os.

0 1l método tiene resultados 'avorables al aplicar una cantidad pe8ueMa You're Preview proteína a una #ona estrec6a y tiene unReading campoapara correr de mayor longitud. Unlock full access with a free trial.




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&R 3&olymerase 6ain Reaction4. Concepto:

0 La Reacción en adena de la &olimerasa *+ es una técnica de la biol

molecular 8ue sirve para 6acer mltiples copias de una determinada región del A Depende de un ADN polimerasa termoestable 3Ea8 polimerasa4 y re8uie cebadores de ADN diseMados para cierta región de ADN.

0 &or lo general, se usa para reproducir su'iciente ADN de la región para po

anali#ar. 1l ADN ampliado por el &R se puede secuenciar, visuali#ar por electro'or en gel o clonar en un pl"smido.

0 Ea8 polimerasa *=% !"ermus a#uaticus, polimerasa obtenida de una bac

tolerante al calor en donde es utili#ado el &R. &or e2plicación vista en clase, se us

polimerasa de la bacteria ya 8ue al reali#ar todas las reacciones se genera mu

calor. Al tener una polimerasa resistente al calor, no se desnaturali#a el ambien sigue la reacción sin problemas. You're Reading a Preview

0 ebador *% la Ea8 polimerasa re8uiere untrial. cebador. 9e agregan secuen Unlock full access withde a free 8ue 6ar"n 8ue se unan cadenas

opuestas

al


molde de ADN solo en

Master your semester los e2tremos de lawith Scribd regiónYork a copiar. & The New Times Special offer for students: Only $4.99/month.


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3-+4% la reacción se calienta para separar las cadenas de ADN. &roporciona mo para

la

Ea8

polimerasa

y

poder

agregar

el

cebado

0 Eemplado 30+4% la reacción se en'ría para 8ue los cebadores se una las

secuencias. 0 12tensión 3=>4% la temperatura de la reacción se eleva para 8ue el

polimerasa e2tienda los cebadores y sintetice ADN.





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PC1 en tiempo real ,1"  PC1. Concepto%& : - 9e 6a desarrollado debido a la necesidad de cuanti'icar di'erencias

e2presión del ARN mensa7ero. La disponibilidad de cantidades pe8ueMas de mensa7ero en algunos procedimientos.

0 &ermite cuanti'icar el "cido nucleico >*. 1l &R permite evaluar y registra todo momento la cinética de la reacción y sus productos. &R 0 RE es una variante

obtiene ADN complementario a partir del ARN. 1l ADNc es luego usado para obse la cantidad de ARN mensa7ero presente. PC1 anidada. Concepto%:

0 Oariante de &R, el producto es una ampli'icación es utili#ado como mo

para reali#ar una segunda ampli'icación con iniciadores 8ue se ubican dentro d You're Reading a Preview primera secuencia ampli'icada. Unlock full access with a free trial.

PC1 in situ.


Concepto%% :

Una &R 8ue se reali#a en preparaciones 'i7adas sobre un portaob7eto, e Master your0 semester with Scribd  Read Foron 30this Days Sign to ampli'icación. vote title 9e usa p debido a 8ue el producto se puede visuali#ar el sitio deupFree la  & The New York Times  Useful  Not useful detectar cantidades pe8ueMas de material genético. Special offer for students: Only $4.99/month.

Cancel anytime.

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Aplicaciones de PC1. Concepto%:

0 &R 6a sido aplicado en la pr"ctica para la detección de en'ermed in'ecciosas. 9e obtiene una muestra y se reproduce con el ob7etivo de encontrar un

especí'ico o material genético de una patología, así determinando una in'ecc 17emplo% se usa para el diagnóstico de OIG y O&G, e7emplos vistos en clase. 0 lonar un gen. 0 Guella digital. 0 &ruebas de paternidad.

0 Detección de en'ermedades dermatológicas como lo es lepra, oncocercos leis6maniasis.





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Nort6ern P 9out6ern 'outer 4lot ,detección de secuencias espec+ficas de ADN. Concepto% :

0 La trans'erencia de 'ragmentos producto de electro'oresis a una membrana

soporte, resultando en la inmovili#ación de esos 'ragmentos de ADN. Una ve# obte la 'alta de movilidad, se puede 6acer un an"lisis de 6ibridación a la muestra.

0 Las membranas 8ue proveen de la inmovilidad es nylon o nitrocelulosa, al ig 8ue se usa radiaciones UO.

0 La 'unción principal de un 9out6er blot es encontrar una secuencia de A especí'ica dentro de una me#cla comple7a. 0 Eécnica inventada por 1dQin 9out6ern, cientí'ico y biólogo inglés.





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0 12iste una 6ibridación con una sonda especí'ica, para después remover

partes de la molécula 8ue no 6an ad6erido. Una ve# 8ue se tiene la muestra 6ibrida

se coloca al lado de rayos  para poder aislarlas con la lu#. Lo resultante es conoc como autorradiogra'ía.


Download With Free Trial Nortern 4lot ,detección de secuencias espec+ficas de A1N.

Concepto : Master your semester with Scribd  Read Free Foron 30this Days Sign up to vote title  el c 0 A continuación se provee una tabla de los tipos de técnicas de blottingH & The New York Times  Useful  Not useful %

las $4.99/month. preparaciones y resultados 8ue se obtienen. Special offer forcompara students: Only

Cancel anytime.

0 9e observa como para una muestra de Nort6ern blot no se re8uiere de una



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Concepto%$:

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Oectores pl"smidos. Concepto'& :

0 Los pl"smidos son moléculas circulares de ADN 8ue se replican de man

independiente al cromosoma de la célula 6ospedadora. 9e usa como vector par

clonación debido a 8ue tiene un sitio de clonación mltiple para insertar ADN antígen



Master your semester with Scribd & The New York Times Proceso : '

Special offer for students: Only $4.99/month.


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)eneración de ADN recombinado% se digiere un vector pl"smido 3contien

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identi'ican

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las

células

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con



genes

resistentes a ampicilina, lo 8ue 6ace a la célula resistente. - Para la identificación de los clones, el sustrato X-gal se convierte en un producto azul si el gen está intacto y blanco si el gen muestra aspectos recombinantes.





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*:,::: muestras por cm >4. 9on una 6erramienta biológica y su principal aplicació para la in'ormación obtenida de la secuenciación de los genomas completos. 0 12isten dos tipos principales de microarreglos, los de contacto 38u impresos depositando las muestras 6aciendo contacto con la super'icie4 pie#oeléctricos 3se usa un aplicador ultrasónico para depositar la muestra4.

muestras son depositadas en membranas de nylon, laminillas de vidrio, o nitrocelulo

Las muestras depositadas son controladas por un robot 8ue se mueve en e7e , S y 0 Las super'icies contienen recubrimientos como poli0sina, aminas y alde6ídos permiten la unión 8uímica con las muestras de ADN.

Procedimiento'': You're Reading a Preview - 9e Unlock full access with a free trial.

e2trae el ARN de la mue




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6ibridi#ación y se de7a por * 6ora. inalmente, se lava para poder eliminar ADN

ad6erido y se cuanti'ica. &ara la cuanti'icación se somete a 'luorescencia y se cue por medio de l"seres con'ocales 8ue cuentan la cantidad de luminiscencia prueba.



'ecuenciación del ácido nucleico.

Master your semester with Scribd Concepto & The New York: Times '

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- &roceso 8ue determina la secuencia de bases de los nucleótidos 3As, Es, 

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Procedimiento' :

- &rimero se calienta la me#cla para desnaturali#ar el molde de ADN 3separar

cadenas4 y luego se en'ría para 8ue el cebador pueda unirse al molde de cad

sencilla. Una ve# 8ue se 6a unido el cebador, se eleva la temperatura para 8ue la A polimerasa

pueda

sinteti#ar

ADN

nuevo

a

partir

del

cebad

0 La ADN polimerasa aMadir" nucleótidos a la cadena 6asta 8ue aleatoriame

agregue un nucleótido dideso2i en lugar de uno normal. A partir de ese momento, no posible agregar m"s nucleótidos y la cadena termina con el nucleótido dideso2i.





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Procedimiento'* :

- onsiste en 'ragmentar un segmento de ADN grande en peda#os pe8ueM

obtener blancos para la inserción de un vector de clonación y 'inalmente obse

segmentos traslapados5 se repite el ciclo 6asta obtener la molécula original de ADN.



Master your semester with Scribd & The New York Times Shotgun sequencing. Special offer for students: Only $4.99/month. ',


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*. 0 12tracción de "cidos nucleicos% *

6ttp%<
>

6ttp%<
@

6ttp%<
C

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