KINETIKA ENZIM Analisis Rx kimia enzimatik mempunyai mempunyai beberapa beberapa tujuan karakteristik atau sifat-sifat enzim 1. Mengetahui karakteristik dalam suatu reaksi enzimatik 2. Meneliti tipe mekanisme kerja serta fungsi enzim 3. Menentukan hubungan hubungan antara enzim dengan substrat, serta sert a hubungan antara enzim dengan zat inhibitor
KINETIKA ENZIM
Kinetika enzim merupakan cabang dari ilmu enzimologi yang mempelajari fungsi-fungsi enzim dalam kecepatan reaksi serta s erta faktor-faktornya. Faktorfaktor tersebu tersebutt antara lain :
1. Konsentrasi Konsentrasi enzim 2. Konsentrasi senyawa ligan termasuk di dalam nya : substrat, produk, inhibitor, aktifator 3. pH lingkungan 4. Kadar ion 5. Temperatur lingkungan lingkunga n
KINETIKA ENZIM Persamaan MICHAELIS-MENTEN : Reaksi yang dikatalisis oleh suatu suatu enzim memiliki variasi kecepatan kecepatan reaksi apabila substrat yang digunakan mempunyai konsentrasi yang berbeda.
Kenaikan [S] akan diikuti peningkatan kecepatan reaksi sampai pada batas tertentu, yang kemudian reaksi tersebut akan mencapai konstan dan akhirnya mencapai titk dengan kecepatan maksimum (Vmax)
Michaelis-Menten
E bereaksi dengan S membentuk kompleks ES. Kemudian ES akan mengalami peruraian baik menjadi E dan S kembali atau membentuk sutu produk (P). Model :
E+S
ES
E+P
E+S
k1
ES
k3
E+P
k2
rapid reversible reaction
slow irreversible reaction
Laju konversi substrat menjadi produk (S P): V = k3 [ES] [ES] ………………………………(1)
Berdasarkan reaksi di atas dapat diasumsikan bahwa b ahwa senyawa produk tidak akan berubah kembali menjadi substrat (S). Tititk Titi tk tolak yang digunakan ialah ia lah bahwa laju katalisis sama dengan hasil perkalian konsentrasi kompleks ES dengan K3
V = K3 [ES] …………………………(1) [ES] harus dinyatakan dalam kuantitas kuantitas jumlah yang telah diketahui. Jaju pembentukan dan laju pemecahan ES diketahui dari : Laju pembentukan ES = K1 [E] [S] …………………..(2) Laju pemecahan ES = (k2+k3) [ES] ………………(3)
Dalam keadaan seimbang (steady state), konsentrasi Zat antara [ES] tidak tidak berubah, berubah, karena proses kecepatan pembentukan ES akan sama dengan proses kecepatan peruraian ES, sedangkan konsentrasi senyawa awal [S] dan konsentrasi produk [P] berubah. berubah . Dengan demikian : Laju pembentukan ES = laju pemecahan ES K1 [E] [S] = (K2+K3) [ES] ………………(4) Dari persamaan tersebut, [ES] dapat dihitung : [E] [S] [ES] = ………………………(5) (K2+K3)/K1
Persamaan ini dapat disderhanakan dengan memasukkan suatu tetapan baru, yaitu Km atau tetapan Michaelis Michaeli s : konsentrasi substrat yang yang menyebabkan kecepatan reaksi sama dengan separuh kecepatan maksimum. Dirumuskan : K2 + K3 Km =
………………………….(6)
K1
maka [E] [S] [ES] =
…………………….(7) Km
Jika konsentrasi konsentrasi enzim jauh lebih kecil kecil dari dari pada konsentrasi substrat ( [E] <<<<[S]), konsentrasi substrat yang tidak terikat [S] hampir sama d engan konsentrasi substrat seluruhnya. Konsentrasi E yang tidak terikat [E] = konsentrasi total enzim [ET] dikurangi konsentrasi [ES], maka persamaam menjadi : [E] = [ET] –[ES]………………..(8) Maka
([ET]-[ES]) [S] [ES] =
…………………………………………….(9) Km [S] /Km
[ES] = [E T]
……………………………………………….(10) 1 + [S]/Km
Atau
[S] [ES] = [ET]
………..(11) [S] + Km
Jika persamaan ini dimasukkan dimasukkan ke dalam persamaan (1) Untuk menggantikan [ES] V = K3 [Es] [S] V = K3 [ET] ……………………..(12) [S] + Km
Kecepatan maksimum V max dicapai bila seluruh situs aktif enzim jenuh dengan substrat, artinya bila [S] jauh lebih besar daripada Km. Akibatnya Akibatnya [S]/([S]+Km) [S]/([S]+Km) mendekati 1 (satu), sehingga : V max = K3 [ET] …………….(13) Bila persamaan (13) dimasukkan di masukkan ke dalam persamaan (12) diperoleh PERSAMAAN MICHAELIS-MENTEN max. [S] V max. V = ………………….(14) [S] + Km
Persamaan ini menerangkan grafik ketergantungan suatu kecepatan reaksi terhadap konsentrasi substrat. Kecepatan awal V merupakan fungsi dari konsentrasi substrat [S] dari suatu reaksi enzimatik yang juga merupakan inetika Michaelis-Menten. Michaelis-Menten. Satuan V adalah jumlah produk yang dihasilkan (mmolatau mol, dsb.) atau jumlah substrat yang mengalami perubahan per menit. Sedang satuan s atuan [S] adalah mmol atau mol/liter
Dari persamaan persama an (14) bila [S] jauh lebih rendah dari Km, maka kecepatan awal V mempunyai hubungan yang kuat dengan konsentrasi substrat [S], maka V max. [S] V = …………………..(15) …………………..(15) Km Pada konsentrasi substrat yang tinggi, sehingga [S] jauh lebih tinggi dari nilai Km maka : Vmax. [S] V = …………………….(16) …………………….(16) [S] V = V max. ………………………………….( ………………………………….(17) 17) Bila [S] = Km , maka V = ½ Vmax. Vmax. ……………………(18)
Penentuan kecepatan awal awal (V) ( V) Kecepatan awal suatu reaksi (V) dapat dihiunt secara kuantitatif dengan mengukur jumlah produk yang dihasilkan atau jumlah sisa substrat yang tidak bereaksi pada berbagai waktu inkubasi. Kecepatan awal merupakan koefisien koefisie n arah dari garis lurus lurus pada grafik antara konsentrasi produk atau konsentrasi sisa subsstrat dengan waktu inkubasi. inkubasi. Kecepatan awal awal dapat dihitung dengan jalan mengambil sampel s ampel pada waktu waktu yang berbeda berbeda setelah penambahan penambahan enzim. Untuk Untuk mendapatkan mendapatkan sampel dengan variasi waktu inkubasi yang berbeda, maka reaksi enzimatik harus dihentikan seawal mungkin setelah pengambilan sampel. Reaksi dapat dihentikan dengan beberapa cara : 1) Mendidihkan 2) Menambah senyawa asam/basa 3) Menambahkan alkohol
PENTINGNYA Km 1. Nilai Km memepunyai hubungan dengan konsentrasi substrat di dalam sel. Jika [S] di dalam sel <<< << < dari nilai nil ai Km, maka mak a kecepatan kecepatan awal awal (V) akan sensitif bila terjadi perubahan [S], sebalikknya jika [S]>>> dari nilai Km maka V tidak sensitif terhadap adanya perubahan konsentrasi substrat yang yang rendah. 2. Oleh karena nilai Km tetap, maka nilai tersebut ters ebut dapat digunakan untuk membandingkan memban dingkan Antara enzim
dari organisme berbeda Dari sel atau jaringan yang berbeda dalam satu organisme Dari satu sel atau jaringan yang sama pada fase pertumbuhan yang berbeda
3. Perubahan nilai Km karena pengaruh suatu senyawa
ligan (ligan-induced) dapat digunakan sebagai model dalam proses pengaturan enzim 4. Dengan mengetahui niai Km,maka dapat mengetahui metode analisis berikutnya, jika konsentrasi substrat [S]>>> Km, maka dengan menghitung V max sama dengan menghitung nilai konsentrasi enzim total [ET]. Nilai Konstanta Michaelis -Menten memberikan pengertian terhadap kesesuaian antara substrat dengan enzim. Hal ini berarti bahwa substrat dengan nilai Km terendah mempunyai aktifitas tinggi terhadap enzim. Susbstrat Susbstrat mempunyai reaksi reaksi terbaik dengan enzim apabila rasio Vmax/Km tinggi.
Menentukan nilai Km (konstanta Michaelis Michaeli s dan Vmax Gambar grafik dari data V pada beberapa konsentrasi substrat [S] akan membentuk grafik dengan tipe hiperbola. Melalui gambar tersebut ternyata mengalami kesukaran dalam menghitung nilai Vmax dan kecepatan awal V saat (pada) kondisi konsentrasi substrat sama dengan ½ Vmax, pada titik tersebut sering dikenal sebagai nilai Km. dengan demikian untuk mempermudah perhitungan nilai konstanta pada reaksi enzimatik, data yang didapat sebaiknya diplotkan dengan didasarkan pada persamaan garis lurus. Perubahan ini diperoleh dengan membalikkan kedua ruas daripersamaan dariper samaan (14)
Vmax .[S]
V
= [S] + Km
1 vo
K M V m a x
1 [ S ]
1 V m a x
y = m • x + b
Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Stryer, L. (2007.) L. (2007.) Biochemistry. (6th ed.) New York: W.H. Freeman and Company.
Penghambatan aktifitas enzim oleh inhibitor
Inhibitor Kompetitif yang menempel pada renzim menghasilkan reaksi k 1
k 3
k 2
E S E ES S E P k 1
k 2
E I E EI I k 3
Penambahan EI menurunkan menurunka n konsentrasi enzim bebas :
[ E ]tot [ E ]
[ E ] [ ES ] [ EI ]
[ E ]tot
[ ES ]
1 K I [ I ]
Compared to the formula for the unihibited enzyme enzym e v
d [ P ]
dt
k 2 [ ES ]
k 2 [ E ]tot [ S ]
[ S ]
k 1
k 2
v m ax [ S ]
[ S ] K M
v m ax
K M
k 2 [ E ]tot k 1
k 2
k 1
k 1
the apparant KM increases: v
d [ P ] dt
k 2 [ E ]tot [ S ]
k 2 [ ES ]
[ S ]
k 1
k 1
k 2
(1
[ I ] K I
v m ax[ S ]
)
[ S ] K M (1
Tradditionally, KI is defined as a dissociation dissociati on constant constant
K I
k 3 k
[ I ] K I
)
Competitive inhibitors compete with the substrate for an enzyme’s active activ e site.
Figure 7.08 Competitive enzyme inhibition.
INHIBITOR KOMPETITIF MENGUBAH KM TETAPI TIDAKMENGUBAH Vmax
A Lineweaver —Burk plot for competitive inhibition.
Competitive inhibitor alters KM but not Vmax
Figure 7.10.
Enzyme Inhibition product, dead-end substrate inhibited enzyme Competitive inhibition (C): A competitive inhibitor is a substance that combines with free enzyme in a manner that prevents substrate binding. binding. That’s, the inhibitor and the substrate are mutually exclusive, often because of true competition for the same site. site .
1/
[I]
1/A Slope change only Vmax is the same
Competitive inhibition (C):
Active site of enzyme
Substrate
Inhibitor
Products
Inhibitor prevents binding of substrate
Substrate and inhibitor can bind to the active site
“Mixed inhibition”, inhibition”, where the inhibitor does not compete with the substrate for the active site, but binds elsewhere on the t he enzyme, causing a conformational change that makes the active site less efficient.
A mixed inhibitor typically alters both Vmax and KM.
Figure 7.12.
Enzyme Inhibition Uncompetitive inhibition (UC): A classical UC inhibitor is a compound that binds reversibly to the enzyme-substrate complex yielding an inactive ESI complex. The I does not bind to free enzyme .
1/
E + S
K1 K2
ES
K3
P + E
+ I
[I] KI 1/S Intercept change Slope is the same
ESI
NO REACTIO
Enzyme Inhibition Noncompetitive inhibition (NC): A classical NC inhibitor has no effect on substrate binding and vice versa, S and I bind reversibly, randomly and independently at different sites.
1/
[I]
1/S Slope change Intercept change
Active site
Noncompetitive inhibition (NC):
Binding of inhibitor distorts the enzyme Inhibitor site
In the absence of inhibitor i nhibitor,, products are formed
Substrate and inhibitor can bind simultaneously
The presence of the inhibitor slows the rate of product formation
Effects of Inhibitors on Michaelis-Menten Reactions Michaelis-Menten Equation
Type of Inhibition
=
None
=
Competitive
Uncompetitive
Noncompetitive
=
=
=
1 + [I]/KI
Lineweaver-Burk Equation
Vmax A
1
Km + A
Vmax A
1
Km +
A
1
Vmax A
Km+ A ’A Vmax A
1
’A Km+ A
’
=
=
=
=
= 1 + [I]/K'I
Km Vmax A Km
Vmax A Km Vmax A Km
Vmax A
+
+
+
+
Effect of Inhibitor
1 Vmax 1
None
Increase Km
Vmax ’
Vmax ’
Vmax
Decrease Km and Vmax Decrease Vmax; may increase or decrease Km
